免疫层析

免疫层析（精选九篇）

免疫层析 篇1

1 胶体金的发展历史、概念及特点

1.1 胶体金的发展历史

早在一个世纪以前, 化学家就对胶体金进行了研究, 当时只是研究它的结构和性质。1939年, Kauselle等把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上, 在电子显微镜下观察呈高电子密度[2]。1857年, 英国著名物理学家、化学家迈克尔·法拉第用还原法从氯金酸水溶液中制备出了胶体金, 并发现在其中加入少量电解质后, 可使胶体金由红色变成蓝色, 最终凝集成无色;而加入明胶或其他大分子物质便可阻止这种变化。这一重大发现, 奠定了胶体金制备和应用的科学基础。1962年, Feldhen等首次提出将胶体金作为一种用于电子显微镜示踪标记物的观点。1971年, Faulk等将兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合成金标抗体, 用于检测细菌表面抗原的分布, 这标志着胶体金作为一种新型的有色标记物被应用于免疫学领域的研究。此后, 免疫胶体金技术在免疫化学领域被广泛应用。1974年, Romano等将胶体金标记在马抗人的Ig G上, 实现了间接免疫金染色法。1978年, Geoghegan等应用免疫胶体金技术检测了B淋巴细胞表面抗原的分布。1981年, Danscher用银显影液增强了在光镜下金颗粒的可见性。1983年, Holgate等建立了免疫金银染色法, 极大地提高了检测的灵敏度。1986年, Fritz等成功地进行了彩色免疫金银染色, 得到了更加鲜明的视觉效果。1989年, Spielbeig等通过检测抗HIV的斑点免疫金渗滤试验, 首次建立了斑点金免疫渗滤法。1990年, Beggs等在免疫渗滤技术的基础上, 建立了一种更加简易快速的免疫学检测技术, 即胶体金免疫层析法 (GICA) , 用于检测人尿和血清中的HCG。目前为止, 常用的免疫金检测方法包括肉眼下的斑点免疫金染色、光镜下的免疫金染色、电镜下的免疫金染色等技术[3]。

1.2 胶体金的概念

胶体金, 又称金溶胶, 是指分散相粒子直径在1—150 nm之间的金溶胶, 属于多相不均匀体系, 颜色呈桔红色到紫红色。它是由氯金酸在如抗坏血酸、柠檬酸三钠、鞣酸等还原剂作用下还原形成的金颗粒悬液。

胶体金颗粒由一个基础金核 (11个金原子构成一个二十面体的金核) 及包围在金核外的双离子层构成, 紧联在金核表面的是内层负离子 (Au C12-) , 又称为zeta电位, 正是zeta电位使得胶体金颗粒之间互相排斥, 从而使得胶体金悬液能够保持稳定[4] (胶体金颗粒结构示意图如图1所示) 。

由于胶体金价格低廉, 易制备, 反应较灵敏, 能够快速检测诊断, 很适合基层使用, 所以目前成为了很多科研单位的研究热点。

1.3 胶体金的特点

1.3.1 胶体金易于制备、存储, 价格低廉;

1.3.2 胶体金可供检测多种物质, 应用范围广;

1.3.3 胶体金具有高度的特异性和灵敏性, 对组织细胞的非特异性吸附作用小;

1.3.4 胶体金检测结果有鲜明的颜色显示, 肉眼即可判断, 无需借助其他仪器设备, 特别适用于基层组织;

1.3.5 检测步骤少, 检测便捷, 检测速度快, 可靠性很高。

2 胶体金免疫层析技术的原理

胶体金免疫层析技术 (GICA) 是在九十年代兴起的, 它是建立在胶体金标记技术、单克隆抗体技术、免疫层析技术基础上的一种快速诊断技术。

层析技术原理是将待测液体滴于样品垫上, 由于毛细管虹吸作用, 待测液体沿下图中层析方向进入含有游离胶体金颗粒的金标垫上, 随后带有游离胶体金颗粒的待测液进入T线, 由于T线中含有抗原或抗体, 与待测液中的抗体或抗原会发生特异性结合, 使得游离的胶体金不断被富集, 慢慢显色, 当待测液到达C线后, 由于C线中含有抗待测液中的抗体或抗原, 因此又会发生特异性结合使之显色, 以此来达到检测目标物质和质量控制的目的。

3 胶体金免疫层析技术的分类

3.1 夹心法

3.1.1 双抗体夹心法。

用免疫金标记针对待测抗原某一表位的单抗, 针对另一表位的单抗包被在T线上, 常被用来检测抗原样品, 常见的例如检测HCG的早孕检测试纸条。

3.1.2 双抗原夹心法。

用免疫金标记已知抗原, 另一已知抗原包被于T线上, 常被用来检测血清样品。常见的例如乙型肝炎病毒表面抗体诊断试剂盒。

3.2 间接法

用免疫金标记二抗, 未标记的特异性一抗与已知抗原结合, 并固定于T线上, 常被用来检测血清样品, 常见的例如梅毒诊断试剂盒。

3.3 竞争法

采用“抗原+抗体+抗原”的方式实现, 用金标抗体与相对应的抗原结合, 固定在T线上。该结果与前2种原理相反, 即阳性结果仅有C线显色, 而阴性结果T线与C线都显色。常被用来检测小分子的抗原, 例如吗啡。

4 胶体金免疫层析技术在动物医学中的应用

4.1 犬瘟热病毒方面

房超等[5]将从水貂中分离出来的犬瘟热病毒 (CDV) HB株经培养和纯化后免疫小鼠, 制备分泌抗CDV-HB的杂交瘤细胞株, 并用采用柠檬酸三钠还原法制备出的胶体金颗粒标记, 获得检测貂犬瘟热病毒抗原的胶体金免疫层析试纸。经鉴定证明制备的检测CDV的胶体金试纸条具有良好的特异性。

4.2 狂犬病病毒方面

王铁成等[6]用醋酸锌沉淀法沉淀狂犬病病毒CVS11, Sepharose 4FF进行层析纯化, 并用采用柠檬酸三钠还原法制备出的胶体金颗粒标记, 组装成试纸条。经过检测, 制备的狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸条对检测犬血清抗体具有特异、便捷、快速的特点, 并能检测出狂犬病病毒中和抗体大于0.5IU的血清。

4.3 猪圆环病毒2型方面

王贵华等[7]采用柠檬酸三钠还原法制备出的胶体金颗粒标记PCV-2抗原于玻璃纤维膜上, 在硝酸纤维膜的T线和C线上分别固定PCV-2抗原与PCV-2单抗, 制成猪圆环病毒2型抗体胶体金检测试纸。经检测, 该试纸条具有方便、快捷、直观等优点, 与猪圆环2型抗体酶联免疫检测试剂盒对比, 合格率在94.7%, 具有良好的应用前景。

5 结语

由于胶体金免疫层析技术所具有的众多特性使得其实现快速检测成为可能。目前, 该技术已被众多科研机构高度关注, 成为了多种领域研究和应用的热点。并且, 该技术的发展为基层兽医进行动物疫病临床诊断提供了一种新的快速诊断方法, 若能够在不损失其众多优点的前提下, 进一步提高检测的特异性和灵敏度, 减少假阴性和假阳性, 实现定量检测, 必能够在基层临床检测中发挥更大的作用[8]。

参考文献

[1]Faulk W, Taylorn GM.An immune colloidal gold method for the electronm icroscope.Immunoch emistry, 1971 (08) :1081-1087.

[2]赵玉龙, 焦玉兰, 郁宏伟, 等.胶体金免疫层析快速诊断试纸条研究进展.河北保定:兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛论文集, 2010.

[3]林彤, 独军政, 丛国正等.胶体金标记免疫层析技术的最新应用进展.安徽农业科学, 2010 (16) :8429-8430.

[4]高明华.狂犬病毒GN基因的表达、单克隆抗体制备与胶体金免疫层析检测试纸的研制.吉林:吉林大学博士论文, 2007.

[5]房超, 张泉, 易海华, 等.检测犬瘟热病毒的单克隆抗体胶体金试纸条的制备.中国动物传染病学报, 2011 (02) :26-30.

[6]王铁成, 张涛, 杨松涛, 等.狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸的制备.生物工程学报:2011 (05) :799-804.

[7]王贵华, 王美君, 汤波, 等.猪圆环病毒2型抗体胶体金检测试纸条的研制.中国兽药杂志, 2012 (07) :41-43.

免疫层析 篇2

水产品中氯霉素的快速检测

胶体金免疫层析法

（KJ201905）

范围

本方法规定了水产品中氯霉素的胶体金免疫层析快速检测方法。

本方法适用于水产品中氯霉素的快速测定。

原理

本方法的测定以竞争抑制免疫层析原理为基础。样品中的氯霉素经有机试剂提取，固相萃取小柱净化，浓缩复溶后，氯霉素与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和微孔膜检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线颜色深浅比较，对样品中氯霉素含量进行定性判定。

试剂和材料

除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为

GB/T

6682

规定的二级水。

3.1

试剂

3.1.1

正己烷。

3.1.2

丙酮。

3.1.3

乙酸乙酯。

3.1.4乙腈

3.1.5磷酸二氢钠，NaH2PO4·2H2O。

3.1.6磷酸氢二钠，Na2HPO4·12H2O。

3.1.7

氯化钠

3.1.8

复溶液：称取0.12

g磷酸二氢钠

(3.1.5)置于100

mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液A；称取磷酸氢二钠7.16

g

(3.1.6)置于100

mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液B。取溶液A

2.8

mL、溶液B

7.2

mL、氯化钠(3.1.7)0.85

g，用水溶解并稀释至100

mL，得磷酸盐缓冲液，即为复溶液。

3.1.9丙酮-正己烷（1+9）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比1：9混匀。

3.1.10丙酮-正己烷（6+4）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比6：4混匀。

3.2

标准物质

氯霉素标准物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分之式、相对分子质量见表1，纯度≥98.6%。

表1

氯霉素参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子量

氯霉素

Chloramphenicol

56-75-7

C11H12Cl2N2O5

323.13

注：或等同可溯源物质。

3.3标准溶液配制

3.3.1

氯霉素标准储备液（1

mg/mL）：精密称取氯霉素标准物质（3.2）10

mg，置于10

mL容量瓶中，用乙腈（3.1.4）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1

mg/mL的氯霉素标准储备液。4℃避光保存，有效期6个月。

3.3.2

氯霉素标准中间液A（10

μg/mL）：精密量取氯霉素标准储备液（1

mg/mL）（3.3.1）0.1

mL，置于10

mL

容量瓶中，用乙腈（3.1.4）稀释至刻度，摇匀，制成10

μg/mL的氯霉素标准中间液A。4℃避光保存，有效期3个月。

3.3.3

氯霉素标准工作液（0.01

μg/mL）：精密移取氯霉素标准中间液A（10

μg/mL）（3.3.2）0.01

mL分别置于10

mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.01

μg/mL的氯霉素标准工作液。临用新配。

3.4材料

3.4.1固相萃取小柱：Cleanert

Silica，200

mg/6mL。LOT：0170198。

3.4.2免疫胶体金试剂盒（在2～30℃、干燥阴凉条件下保存，在产品有效期内使用）。

3.4.2.1

金标微孔。

3.4.2.2

试纸条或检测卡。

仪器和设备

4.1

移液器：200

μL、1

mL和5

mL。

4.2

涡旋混合器。

4.3

离心机：转速≥4000

r/min。

4.4

电子天平：感量分别为

0.01

mg和

0.01

g。

4.5

样品浓缩仪：如有需要。

4.6

环境条件：

温度：15～25℃，相对湿度：≤60%。

5分析步骤

5.1试样制备

取具有代表性样品约500

g，充分粉碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记，于常温保存。

5.2试样提取和净化

准确称取试样6

g（精确至0.01

g）置于50

mL具塞离心管中，依次加入1

mL水和8

mL乙酸乙酯（3.1.3），涡旋提取5

min，以4000

r/min离心5

min。转移全部乙酸乙酯层于50

mL具塞离心管中，加入正己烷25

mL，氯化钠1

g涡旋混匀，4000

r/min

离心1

min，上清液待净化。5

mL丙酮-正己烷（1+9）（3.1.9）淋洗LC-Si硅胶小柱，弃去淋洗液，将待净化溶液转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，用5

mL丙酮-正己烷（6+4）（3.1.10）洗脱，收集洗脱液，洗脱液于40℃氮气吹干，精密加入600

µL复溶液（3.1.8），涡旋混合1

min，作为待测液。

5.3

测定步骤

5.3.1

检测卡与金标微孔测定步骤

吸取150

µL样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸

5～10次使混合均匀，室温温育3

min；温育结束后，将金标微孔中溶液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育5～8

min，对结果进行判定。

5.3.2

试纸条与金标微孔测定步骤

吸取150

µL样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸5～10次使混合均匀，室温温育3

min；温育结束后，将检测试纸条（3.4.2.2）吸水海绵端垂直向下插入反应微孔中，室温温育3

min，从微孔中取出试纸条，去掉试纸条下端的吸水海绵，并于5

min内进行结果判定。

5.3.3

检测卡测定步骤

吸取150

µL样品待测液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育5～8

min，对结果进行判定。

5.4质控试验

每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。

5.4.1

空白试验

称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。

5.4.2

加标质控试验

准确称取空白样品6

g或适量（精确至0.01

g）置于15

mL具塞离心管中，加入180

μL氯霉素标准工作液（0.01

μg/mL）（3.3.3），使氯霉素浓度为0.3

μg/kg，一式2份，按照

5.2和5.3步骤与样品同法操作。

结果判定要求

通过对比控制线和检测线的颜色深浅进行结果判定。由于长时间放置会引起检测线颜色的变化，需在规定时间内进行结果判定。目视结果判读依据如图1所示。

6.1

无效

控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。

6.2

阳性结果

检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅，表明样品中氯霉素含量高于方法检测限，判定为阳性。

6.3

阴性结果

检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表明样品中氯霉素含量低于方法检测限，判定为阴性。

6.4质量控制要求

空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。

结论

如被测样品中氯霉素检测结果为阳性时，应采用确证方法进行确证检测。

性能指标

8.1

检测限

氯霉素为0.1

μg/kg。

8.2

灵敏度

灵敏度应≥98%。

8.3

特异性

特异性应≥90%。

8.4

假阴性率

假阴性率应≤1%。

8.5

假阳性率

假阳性率应≤10%。

注：性能指标计算方法见附录A

9其他

本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。

本方法参比标准为GB/T

22338-2008

动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定

(包括所有修改单)。

附录

A

定性方法性能计算表

样品情况a

检验结果b

总数

阳性

阴性

阳性

N11

N12

N1.=N11+N12

阴性

N21

N22

N2.=N21+N22

总数

N.1=N11+N21

N.2=N12+N22

N=N1.+N2.或N.1+N.2

显著性差异(χ2)

χ2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1

灵敏度（p+）

p+=N11/N1.特异性（p-）

p-=N22/N2.假阴性率(pf-)

pf-=N12/N1.=1-灵敏度

假阳性率(pf+)

pf+=N21/N2.=1-特异性

相对准确度

（N11+N22）/(N1.+N2.)

注：N:任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

a由基准方法检验得到的结果；

b由本方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。

本方法负责起草单位：山西省食品药品检验所。

验证单位：陕西省食品药品检验所、广东省药品检验所、四川省食品药品检验检测院。

免疫层析 篇3

【摘要】人群中的HBV感染普遍存在,我院多年来使用酶联吸附法(ELISA)检测HBV血清标志物。今年,我们对ELISA法和免疫层析法(GICA)测定乙肝两对半的血清标本进行了比较研究,研究发现少数HBsAg阳性的血清标本免疫层析法测定呈现阴性结果(实际为假阴性)。虽然这种情况的比率只有1.25%,但是仍然应该引起足够的重视。因此,免疫层析法的准确度、灵敏度也受到临床医学的广泛重视。免疫层析法能否代替ELISA法也成为检验医学一个十分关注的问题。

【关键词】乙肝二对半;酶联吸附法;免疫层析法

1 材料与方法

1.1 标本来源:我们将免疫层析法和ELISA法试剂同时检测同一个血清标本乙肝两对半的试验,试验结果报告如下

2008年3月1日～2008年9月10日期间,在我院门诊和住院患者中依次选取2000份患者空腹抽取的静脉非抗凝血3~5ml,2000转/min离心5min,留取血清备用。

1.2 试剂和仪器:乙型肝炎病毒标志物(乙肝两对半)酶联免疫法体外诊断试剂盒为上海科华生物技术有限公司产品。

乙型肝炎病毒标志物(乙肝两对半)免疫层析法试剂盒艾康生物技术(杭州)有限公司产品。

仪器为郑州安图生物工程有限公司的anthos fluido自动洗板机,安图2010酶标仪。

1.3 方法:2000份血清标本同时用ELiSA法和GICA法平行检测乙肝二对半,均严格按操作说明进行操作.对于两种方法检测均为阴性标本,再次应用ELiSA法进行2孔重复测定后确认为阴性;对于用ELiSA法检测为阳性,而GICA法检测为阴性的血清标本,再用ELiSA法进行2孔以上复查,进一步确认是否为阳性。其中任意一孔s/co≥2.1即可确定为阳性,而GICA法阴性的血清标本同样经过2次复查后才可确认为阴性。

2 结果

本次研究检测的2000份血清标本中,ELiSA法检测出HBsAg阳性的血清236份,阳性率为11.8%,GICA法检测出HBsAg阳性的血清有219份,阳性率为10.95%,两种方法检测均为阴性的血清标本1764份。GICA法有17份血清标本漏检,二者检测符合率为98.75%。GICA法血清标本漏检率为1.25%。

这说明在检测HBsAg中,GICA法较ELiSA法敏感性低,容易造成假阴性结果。在检测乙肝两对半时其它项目的结果如下:

ELiSA法检测出HBsAb阳性768份,阳性率384%;GICA 法检测HBsAb阳性707份,阳性率为35.35%,两者符合率为96.95%。ELiSA法检测出HBeAg阳性76份,阳性率38%,GICA法检测出HBeAg阳性81份,阳性率为45%,二者符合率为99.75%。ELiSA法检测出HBeAb阳性93份,阳性率为4.6%,GICA法检测出HBeAb阳性99份,阳性率为499%,二者符合率为99.85%;ELiSA法检测出HBcAb阳性318份,阳性率为15.9%,GICA法检测出HBcAb阳性333份,阳性率16.65%,二者符合率99.25%。

由此可见,ELiSA法和GICA法在检测乙肝二对半时,存在着一定的差异。以下是两种方法的检测结果报告,见表1。

3 讨论

免疫层析法和ELiSA法均属于免疫学检测范畴,方法特异,敏感度好,尤其是固相载体酶免技术与胶体金技术等的结合,使市场上出现了一大批适于家庭及床旁检测的快速试剂盒,在很大程度上方便了人们的自我保健和临床的快速诊断[1]。然而,有报道称GICA的敏感度低于ELiSA法[2]。应用两种方法同时检测HBsAg的临界值血清为1ng/ml和5ng/ml,GICA均为阴性,ELiSA均为阳性。两者符合率为9000%[2]。低于其它文献[3]报道的98.8%的符合率。又有报道称GICA的敏感度可达1ng/ml[4]。本组两种方法检测HBsAg的符合率为98.75%,与有关文献报道基本一致(9894%)[5]。尽管两种方法的符合率较高,GICA还是有漏检存在。在17份HBsAg阳性的漏检标本中,有一份血清是S/CO=208的强阳性标本。其它16份标本S/CO值均小于4。这是一份非常明显的HBsAg漏检标本,所以,GICA还是有漏检存在的,漏检率为1.25%,与有关文献报道基本一致(106%)[5]。另外,本次在HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb四项的对照研究中,GICA法和ELiSA法相比较,既存在ELiSA法检测阳性,而GICA法检测为阴性的现象,也存在着ELiSA法检测为阴性而GICA法检测为阳性的现象。所以,在应用ELiSA法和GICA法同时检测HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb时,两种方法确实存在显著差异.综上所述,GICA方法有其局限性,是不能代替ELiSA法的,也不能用于献血人员筛查。GICA五连扳可用于大规模普查人群乙肝感染情况,也适于临床急症标本等快速检测需要。尤其适于标本量少的一些个体医院和个体诊所的初筛实验。随着医疗节奏的逐渐加快,我们更应该高度重视GICA法与ELiSA法之间的显著差异。在我院,对于ELISA检测HBsAg阳性的标本,再用免疫层析五连板复查。有效地保证了两对半结果的可靠性,同时也方便了工作。

随着免疫学及免疫学技术的飞速发展,乙肝两对半诊断实验不论是方法学还是临床应用,都取得了日新月异的进展,但每一种方法都有其各自的优缺点,特别是在临床普及以及结果可比性方面,我们期待着尽快改善GICA法的局限性,缩小ELiSA法和GICA法的差异。

参考文献

[1] 王兰兰.临床免疫学和免疫学检验(第3版).北京:人民卫生出版社,2004:97

[2] 王健,闵福援.乙肝病毒血清标志物的检测方法及临床意义[J].中华检验医学杂志,2005,28(1):113-115

[3] 骆铁桥.胶体金免疫层析法不宜用于献血员乙型肝炎表面抗原检测[J].上海医学检验杂志,2001,16(5):267

[4] 陈向阳.胶体金免疫层析法与ELiSA检测HBsAg的比较[J].上海医学检验杂志,2001,16(5):305

[5] 王良玲.胶体金免疫层析法与ELiSA法检测HBsAg结果比较[J].中国基层医药,2005,12(11):1569



作者单位:113006 辽宁省抚顺市中心医院1

免疫层析 篇4

1 GICA技术的发展进程

英国著名物理学家、化学家迈克尔?法拉第在1857年首次制备出胶体金,并发现胶体金由红色变为蓝色;这一重大发现,奠定了胶体金制备和应用的科学基础[2]。继1962年Feldherr等[3]首次提出将胶体金作为一种用于电子显微镜示踪标记物的观点后,1971年,Faulk等[4]首次将胶体金作为一种新型的有色标记物被应用于免疫学领域的研究,建立了一种以胶体金为显示信号的免疫标记技术。免疫胶体金技术一直是国内外学者的研究重点,并得到了飞速发展。1974年建立了间接免疫金染色法,1989年建立了斑点金免疫渗滤法,1990年Beggs等在免疫渗滤技术的基础上,建立了简易、快速的GICA法[5]。随着纳米技术的兴起和单克隆技术的成熟,GICA逐渐得到了有效完善和长足发展,现在在生物分子识别等生物医学、临床医学诊断和兽医领域已被广泛应用,现在已有实力强劲的商品化胶体金诊断试剂盒国际化生产商,例如专业生产动物诊断检测试剂的韩国安捷(Bionote),生产早孕试纸条的瑞士可丽蓝(Clearblue),生产食品安全检测试纸的台湾尖端等。

2 GICA技术原理

胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在不同性质和浓度的还原剂(如鞣酸、柠檬酸三钠、白磷、硼氢化钠和抗坏血酸等)作用下还原而成不同粒径的胶体金颗粒悬液,又称金溶胶。GICA技术的原理是先将已知的抗原或抗体以条带状包被到硝酸-纤维素(NC)膜载体上;点样后,样品溶液通过滤膜的毛细作用向前移动;同时,样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(抗体或抗原)发生高特异性、高亲和性的免疫反应,层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测线),通过可直接目测的胶体金颗粒在短时间内聚集而得到可目测的显色条带。GICA和ELISA一样可以根据胶体金标记物和包被物(捕获材料)的不同,原理上可以细分为双抗夹心法、间接法和竞争法等。

3 GICA在兽医临床中的应用

3.1 细菌性病原的检测

在兽医领域细菌性疾病很多并且很复杂,给临床诊断和实验室诊断都带来了很多麻烦,所以学者们也将GICA技术应用到针对细菌性病原引起的动物疾病检测方法的研究中。检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、猪链球菌、布鲁氏菌和牛分枝杆菌等细菌的GICA检测方法已研制成功[6],下面笔者将着重介绍布鲁氏菌病和牛结核病两种疾病的胶体金诊断技术。

布鲁氏菌病(Brucellosis)是一种由布鲁氏菌(Brucella)引起的主要侵袭生殖系统的人畜共患传染病。该病是世界动物卫生组织(OIE)规定必须报告的动物疫病之一,我国也将其列入二类动物疫病中。近年来布鲁氏菌病在我国一些地区呈现上升趋势,特别是现在人民生活对奶制品需求的提高,促使奶牛和奶制品的贸易流通量增大,进一步扩散了疫情。有效控制布病的关键就是快速准确的对患病动物做出诊断并及时采取措施,所以国内外学者开展了布病GICA检测技术的研究,并且已有兽医技术人员在临床上使用进口的商品化试剂盒作为现场诊断布病的依据。中国兽医药品监察所和地方的动物疫病预防控制中心、动物卫生监督所等动物疫病监测机构对GICA技术与ELISA或其他血清学检测方法进行了试验对比,试验结果显示GICA有很好的敏感性和特异性,较ELISA和其他血清学检测方法更为快捷简便,完全能作为现场诊断布病的有效工具[7,8,9]。

牛结核病(Bovine Tuberculosis,bTB)是由牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的一种慢性消耗性传染病,能感染人和多种动物,严重危害畜牧业和人类健康。牛结核病的诊断方法以结核菌素皮试试验为主,该方法不仅耗时长、费人力还存在很在检测人员的判定误差和非致病性分枝杆菌的非特异性影响;结合我国现在牛结核病防控的现状,所以很有必要研制出一种快捷简便、准确特异的牛结核病GICA检测方法。2007年,张书环[10]原核表达出牛结核分枝杆菌的特异性抗原蛋白MPB83和MPB70并分别作为胶体金标记抗原和检测线捕获抗原,制备出牛结核病抗体检测试纸条;此试纸条在应用中也表现出了优异的性能,与牛结核分枝杆菌培养符合率为85%,与韩国进口试纸条符合率为98.75%,与结核菌素皮试试验符合率也高达80%。GICA技术运用到牛结核病的常规监测中,对我国人结核病的防治也具有积极作用。

3.2 病毒性病原的检测

在畜牧行业往往引起动物出现疫情的病原很多,其中很大一部分是由病毒性疾病引起的,如引起初生仔猪严重腹泻死亡的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、引起禽鸟和人感染的禽流感病毒(AIV)、引起犊牛腹泻的轮状病毒(RV)等等。如何在众多病原中做出科学、精确的诊断不仅需要临床兽医的扎实技术和丰富经验,还需要我们广大科研学者提供更加准确、便捷的诊断工具,此时GICA技术就是一个有效补充,例如:规模化猪场在防治仔猪腹泻中采取初乳管理方案时,就会采用PEDV胶体金检测卡进行病原筛查。

口蹄疫(FMD)被OIE排在A类疫病之首,我国畜牧业深受其害,现在有可以鉴别野毒和疫苗抗体的FMD GICA试纸条在市面上流通,为FMD的检测防治提供了可靠手段。蒋韬等[11]还建立了O型、A型、Asia1型FMDV定型诊断胶体金免疫层析方法,该方法不与口蹄疫临床症状类似的猪水泡病病毒、水泡性疹病毒、水泡性口炎病毒发生交叉反应,能检测到7.8×104LD50的病毒量,具有良好的特异性和敏感性。

王向鹏等[12]建立了快速、简便检测猪瘟病毒(CSFV)野毒的GICA方法,所制备的试纸条用于检测CSFV野毒感染的PK-15细胞培养物,该试纸条不与猪瘟兔化弱毒(HCLV)、猪细小病毒(PPV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、伪狂犬病病毒(PRV)、PEDV和RV反应,具有良好的特异性、敏感性和重复性,初步达到了区分检测CSFV野毒株和弱毒株的目的。

李雪松等[13]建立了检测PRRSV的具有良好特异性、敏感性、重复性和实用性的GICA方法,为我国蓝耳病的快速诊断和防制提供了技术手段。Joon T Y等[14]研制了PRV的胶体金试纸条,该试纸条检测时只需25μL样品,整个检测过程仅需5min,并且与常见猪病不发生交叉反应。Kameyama K等[15]建立了快速检测BVDV的GICA试纸条,该方法与病毒分离鉴定的敏感性和特异性分别为100%和97.2%。

在禽类疾病方面,Zhang等[16]建立了检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)抗体的GICA法,彭伏虎[17]采取双抗夹心的方法研制了新城疫病毒(NDV)GICA试纸条。徐一鸣等[18]以胶体金标记AIV H3和H7亚型单克隆抗体,以纯化的马抗H3和H7亚型AIV多抗、山羊抗鼠二抗分别包被在检测线和质控线,制备成试纸条。该试纸条在试验中与血凝和血凝抑制试验、RT-PCR等检测方法结果相符,具有良好的特异性不与其它禽类病原和AIV其它血清亚型发生交叉反应。

3.3 寄生虫的检测

因为大多数寄生虫病是人兽共患疾病,所以对畜禽寄生虫病的诊断具有重要的公共卫生学意义。目前,文献报道弓形虫病、隐孢子虫病、日本血吸虫病、鞭虫病、旋毛虫病、片形吸虫病、猪带绦虫病、奶牛肝片吸虫病、羊东毕吸虫病、犬心丝虫病和犬弓首蛔虫病等疾病的胶体金检测试纸条已研制成功并应用于临床检测中。

张少华等[19]以胶体金标记猪带绦虫六钩蚴TSOL18重组蛋白抗原,制成了猪带绦虫GICA诊断试纸条。该试纸条与剖检计数法的相比敏感性为80.0%,与全囊虫抗原ELISA的相比敏感性和特异性分别为75.0%和95.2%。王艳华等[20]研制出敏感性高于IHA,与ELISA相当的检测弓形虫抗体的GICA试纸条,该试纸条能检出多种动物的弓形虫抗体IgG和IgM,具有良好的特异性。秦银霞等[21]建立的旋毛虫抗体检测试纸条,能检出多种动物感染旋毛虫后的阳性血清,且不与其他寄生虫病的阳性血清产生交互反应。

4 展望

GICA技术从首次报道以来,一直成为国内外学者研究的热点,通过几十年来不断的发展,GICA技术已广泛应用于各个领域中,其检测的范围也在不断扩大,现在GICA技术已用于检测疫病、激素、毒品、药物、重金属等方面。兽医领域现在使用GICA技术最多的是宠物医院,兽医对于犬瘟病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬心丝虫等疾病的临床诊断主要都是参考商品化胶体金试剂盒的检测结果。随着兽医检测要求的不断提高,未来GICA技术还应该向增大检测范围、提高检测灵敏度、具有定量或半定量的功能、采用多联方式的方向发展。现阶段市面上已有AIV和H7或H9亚型AIV合在一起的检测试纸条,即一条试纸上拥有两条检测线;还有能根据检测线条带颜色深浅参照比色卡比对,起相对定量功能的试纸条。相信GICA技术依靠其快速、灵敏、特异、简便、稳定和不需要专业设备和专业技术人员的优点未来必将成为兽医技术人员现场诊断的首要参考工具。

摘要：胶体金免疫层析技术自上个世纪面世以来就以其简便、特异、敏感、快速无需设备和专业人员的优点被广泛应用于生物医学和临床诊断等领域,文中介绍该技术在兽医临床诊断和现场快速检测上的发展进程,展现了巨大的发展潜力和广阔的应用前景。

荧光免疫层析试条定量检测仪的研制 篇5

急性心肌梗死 (Acute Myocardial Infarction, AMI) 是一类由于冠状动脉急性闭塞, 导致血流骤减而引起心肌细胞缺氧性坏死的疾病, 其发病率和死亡率在全球居高不下。每年由AMI引起的死亡人数占心血管疾病死亡人数的一半以上。近年来研究发现AMI患者在发病前一周左右, 血液中的心肌标志物浓度会产生变化:如肌钙蛋白 (CTn-I) 、心型脂肪酸结合蛋白 (H-FABP) [1,2]。AMI的治疗时间十分重要, 早发现并实施院前急救是降低死亡率极为重要的环节, 也是提高再灌注率和成功率的关键[3]。

目前, 用于心肌标志物的即时检验方法主要是胶体金免疫检测技术:使用胶体金作为标记物, 标记物与待测物的络合物被相应的配体捕获而浓集显色, 以纤维膜上显色带的有无进行定性检测[4]。但胶体金标记利用静电吸附, 在液相中稳定性较差, 已标记上的蛋白质分子容易脱落, 并且具有产品质量相差大, 不宜质控, 不能确保质量等缺点[5]。

近几年出现的荧光免疫层析技术, 结合纳米技术, 定向标记技术、生物膜技术、横向流体技术及荧光检测技术, 采用化学偶联方法标记抗体, 具备了胶体金检测产品原有的优势, 也克服了其固有缺陷, 其灵敏度高、特异性强、且能够定量反应血液中心肌标记物的浓度。目前, 福建泰普生物科学有限公司已成功研制出针对该心肌标志物检测的荧光免疫层析试条, 本文针对该试条研制了一款可在现场进行快速、准确、定量检测的仪器。

1 试条检测原理

试条结构如图1所示。本文主要对荧光免疫层析试条进行检测。其工作原理为:将一定量患者的血液滴加在样品垫上, 血液通过层析作用向前移动, 溶解结合垫上固化的标记试剂后与之反应。当血液移动至抗原的检测带时, 待测物和试剂的复合物与之发生特异性结合后被截留, 结合物在检测线上富集, 附着的结合物含量与样品中待测物含量成正比。该结合物具有如下特性:在紫外光的激发下, 能激发产生615 nm的红光。当激发光波长为330 nm时, 激发效率最高, 反应结合物的激发光谱及荧光光谱如图2所示。激发光饱和时, 激发产生的荧光强度与试条上富集的反应结合物数量成正比。

往试条样品垫滴入血液样品后, 在330 nm激发光激发下, 试条产生的荧光情况如图3所示。图3 (a) 为样品中待测物质含量较高时的发光情况;图3 (b) 为样品中待测物质含量较低时的发光情况;图3 (c) 检测带无荧光, 质控带发荧光, 为样品中无待测物质的发光情况;图3 (d) 检测带发荧光, 质控带无荧光, 为试条失效的情况。在试条有效的情况下 (图3 (a) ~图3 (c) ) , 可以通过检测质控带和检测带中反应生成的结合物的数量, 即检测质控带的荧光发射强度 (OD质控带) 与检测带的荧光发射强度 (OD检测带) , 通过二者的比值定量检测血液样品所含心肌标志物的浓度。

2 系统设计

2.1 检测原理及仪器整体设计

仪器要求:将定量的患者血液滴加在试条的样品垫上后, 将试条插入检测仪器中, 便可得到患者心肌标志物的浓度, 对患者的病情做出判断。

仪器的本质:检测质控带及检测带的荧光强度。选择合适的激发光源, 设计相应的激发光路, 将激发光聚焦在试条上, 测试带及质控带产生的荧光通过荧光收集光路, 聚焦在线阵CCD上, 将光信号转换为电信号。通过建立测试数据与被测样品浓度一一对应的数学模型, 将荧光密度的比值转换为患者血液中该心肌标志物的浓度, 并显示输出。

该仪器的组成主要包括以下三个部分:光学单元 (包括紫外激发光路、荧光采集光路) 、光电转换单元、信号处理及显示单元。下面将对以上三个单元具体说明。

2.2 光学单元设计

光学系统所要完成的功能是:波长为330 nm的紫外光通过激发光路聚焦于试条上的检测带和质控带, 使反应结合物产生荧光, 受激产生的荧光通过荧光收集光路聚焦于线阵CCD上。激发及荧光收集光路的效率、灵敏度直接决定着检测结果的准确性。

2.2.1 激发光路要求

如图1所示, 荧光免疫层析试条的规格如下:检测带、质控带宽1 mm, 长4 mm, 检测带与质控带之间间隔2 mm。只需用一个波长为330 nm, 尺寸略大于4 mm×4 mm, 有足够光强的紫外光斑照射该试条, 便能使试条的检测带和质控带被完全覆盖, 二者被完全激发, 产生荧光。

由于LED具有功耗低、发光寿命长、光强稳定 (在恒流供电的情况下) 等优点, 仪器选用中心波长为330 nm的紫外LED作为激发光源。其发光功率为0.2 W, 发射角度为120°, 发光晶片规格为1 mm×1 mm。由于所选用的紫外LED功率较小 (高功率的紫外LED价格十分昂贵) , 且发射角度较大, 此紫外激发光路具有高效的聚光能力。

2.2.2 荧光检测光路要求

检测带、质控带受激产生的荧光强度较弱, 且是根据二者的荧光相对强度来判断病情, 因此, 要求荧光收集光路要高效的收集效率、高灵敏度及一定的空间分辨率。

2.2.3 光路设计

设计的光路如图4所示。光路由椭球透镜L1, 石英平凸透镜L2, L3, L4, 二向色镜L5、滤光片L6组成。二向色镜L5将紫外激发光路 (由L1, L2, L5, L3构成) 和荧光收集光路 (由L3, L5, L4, L6构成) 结合起来, 整个光路更紧凑, 缩小了光学单元的体积。

光路说明:椭球反射镜L1起聚光作用。选择合适的椭球反射镜, 将紫外LED放在椭球反射镜L1的第一焦点F1上, 则LED发出的大部分光可聚焦在椭球反射镜的第二焦点F2上[6];平凸透镜L2起准直作用。其焦距为f2, F2即是椭球透镜的第二焦点, 也是平凸透镜L2的焦点, 透过L2的光将平行出射;二向色镜起分光作用。选择分光波长为350 nm的二向色镜, 小于350 nm的波长将发生反射, 大于350 nm的波长将透过。在此光路中二向色镜可将紫外激发光反射, 将红色荧光透射;透镜L3对紫外激发光的聚焦作用。其焦距为f3, L2, L3两块透镜构成一个比例成像光路, 该光路的放大比例K由L2, L3的焦距决定, 即K=f3f2。选择合适焦距的透镜, 便可得到所需的光斑大小。同时, 在荧光收集光路中透镜L3起聚光及准直的作用。L3与L4也在荧光收集光路中构成一个比例成像光路。

2.3 光电转换单元

2.3.1 光电转换器件的选取

图像采集单元的主要作用是将荧光收集光路所采集到的光信号转换为电信号。仪器要求光电转换单元拥有较高的灵敏度及一定的空间分辨率, 因此选用东芝的TCD256ED线阵CCD作为光电转换单元, 该线阵CCD具有以下特点:具有256个像素, 有效长度为4.8 mm, 每个像元的尺寸为18μm×18μm, 像元尺寸较大, 适合弱光检测;光谱响应的峰值为560 nm, 615 nm波长光的相对敏感度大于90%, 因此对收集的荧光可高效地进行光电转换;质控带及检测带大小约4 mm×4 mm, 而线阵CCD的有效成像长度为4.8 mm, 因此上述荧光收集光路采用1∶1的比例成像光路。

2.3.2 线阵CCD的驱动及数据采集模块

采用三星公司生产的ARM9芯片S3C2440作为主控芯片, 对数据进行采集及处理, 采用CPLD产生脉冲信号作为线阵CCD的驱动, 原理图如图5所示。

数据采集以帧为单位进行。单帧读入及处理过程如下[7,8,9]:S3C2440接收到键盘输入的采集信号时, S3C2440发送帧启动脉冲给CPLD;CPLD接收到帧启动脉冲信号, 产生线阵CCD驱动信号和A/D转换器的采样信号, 使CCD与A/D转换器开始工作;从线阵CCD出来的模拟信号较微弱, 经放大电路放大后, 通过8位精度的A/D转换电路转换为数字信号;从A/D出来的数字信号存入SRAM;一帧图像采集完毕, 发送INT信号给S3C2440, S3C2440读取SRAM, 处理信号。

线阵CCD驱动电路是使用硬件描述语言在CPLD (可编程逻辑器件) 内部产生满足驱动时序要求的脉冲信号。驱动东芝TCD1024ED线阵CCD共需要5路驱动信号[5], 分别为:光积分脉冲SH, 两相电荷转移脉冲P1、P2, 复位信号RS, 钳位信号CP, 五个驱动信号只有彼此之间满足一定的时序和相位关系, X1024A才能正常工作。驱动电路原理如图6所示[10,11]。

由于CPLD输出3.3 V的电平, 而CCD需要5 V的驱动电压, 因此采用TI公司生产的带三态输出的、8位电平转换芯片SN74ALVC4245, 进行3.3 V电压向5 V电压的转换。

由于荧光比较微弱, 在编写驱动时, 可以通过延长积分时间, 使每个CCD像元可以累积更多的电荷, 提高系统检测弱光的能力。

2.4 信号处理及输出单元

S3C2440同时作为信号的采集芯片及处理芯片。信号处理流程图如图7所示。

2.5 系统标定

数据经ARM9处理后, 得到检测带与质控带荧光发射密度的比值。采用实验的方法对仪器进行标定, 建立检测结果与心肌标志物浓度的对应关系, 通过曲线拟合的方法, 得到荧光密度比与心肌标志物浓度的关系曲线, 如图8所示, 从而得到二者一一对应关系的数学模型。由检测得到的荧光比值便可确定出心肌标志物的浓度。

3 实验结果及分析

本文采用福建泰普生物科学有限公司的荧光免疫层析试条以及厦门大学医学院提供的心肌标志物标准品, 并将所述标准品稀释成400 m IU/m L, 350 m IU/m L, 300 m IU/m L, 250 m IU/m L, 200 m IU/m L, 100 m IU/m L等不同等级浓度的标准试液。取等量的试液分别滴加在试条上, 并连续对每个试条进行3次测量, 测试结果见表1。

由表1可知, 随着标志物浓度的增强, 仪器检测的相对误差增大, 通常AMI患者心肌标志物的浓度小于350 m IU/m L, 因此该仪器的测量误差小于2.77%, 满足临床检测的要求。

4 结语

本文采用线阵CCD对荧光信号进行定量检测, 设计了高效的紫外聚焦光路、荧光收集光路, 采用CPLD产生5路脉冲对线阵CCD进行驱动, 并且采用ARM9处理器采集及处理数据。最后通过系统标定, 实现了样品中特定心肌标志物浓度的定量检测, 为医学诊断提供了科学的依据。

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免疫层析 篇6

关键词：丙型肝炎病毒,双抗原夹心法,快速诊断,免疫层析

全球约1.7亿人感染丙型肝炎病毒 (HCV) , 危害十分严重[1]。我国HCV的感染率约为3.2%, HCV抗体携带者达4千万[2]。我国将HCV抗体检查列为我国法定的血源性筛查项目。当前最为常用的HCV抗体检测方法是ELISA法, 将C22-3、C33C、C100-3和NS5作为包被抗原, 标记抗人Ig G进行检测[3]。免疫胶体金技术是新型的免疫学检测方法, 具有检测简便、稳定性好、适于现场检测等特点, 但运用免疫层析技术对HCV抗体检测具有一定的技术难度。本文报道一种以双抗原夹心胶体金法研制HCV抗体诊断试剂盒的方法, 及其对临床性能分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

HCV抗原:为HCV NS3、Core融合抗原, 来自美国和军事医学科学院, 用于试剂的包被和标记;氯金酸BSA, PEG20000, 水解酪蛋白:Sigma试剂:Sigma试剂, NC膜:Millipore公司。其他常用试剂均为分析纯试剂。

1.1.2 干扰样本

包括高血脂、溶血、黄疸血清, 含抗凝剂肝素、EDTA和枸椽酸钠血浆, 含相关传染病抗体阳性血清, 由本公司在相关医院收集、验证并保存, HCV抗体阴性。

1.1.2 HCV抗体国家血清盘

中国药品生物制品检定所研制。

1.1.4 HCV抗体ELISA试剂盒

意大利Sorin和美国Ortho、Murex和公司商业化检测试剂盒。

1.1.5 临床样本

共581例, 由中国药品生物制品检定所收集, 为献血员和HCV患者样本。

1.2 方法

1.2.2 HCV重组抗原的包被

用0.01mol/L p H7.2 PBS将HCV重组抗原稀释成适当适当浓度, 喷膜包被, 包被完成后将NC膜在干燥间干燥6~8h, 备用。

1.2.1 HCV重组抗原的胶体金标记

以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备胶体金, 用K2CO3将溶液调到p H8.0。按每1m L溶液加入10μg重组抗原将蛋白缓慢滴加到胶体金溶液中, 继续搅拌1h, 再以BSA和PEG20000进行封闭, 离心, 弃上清, 沉淀按原体积复溶至胶体金稀释液中。然后将标记胶体金溶液涂抹在无纺布载体上, 制成胶体金垫。按同样方法标记鼠Ig G, 制备的鼠Ig G胶体金垫用于试剂质控。

1.2.3 试纸组装

在干燥间内准备好吸水滤纸、PVC板、上样垫、在PVC板帖包被好的NC膜, NC膜下缘粘贴胶体金垫, 胶体金垫下缘粘贴上样垫, NC膜上缘粘贴吸水滤纸, 再切成4mm宽的试纸条。密封于铝箔袋中, 组装成成品。

1.2.4 性能分析评估

将公司保存的含不同抗凝剂肝素、EDTA和枸椽酸钠血浆, 高血脂、溶血、黄疸血清;关传染病HAV、HIV、HBV、HP和TP抗体阳性血清取出, 用试剂进行检测。

1.2.5 稳定性分析

(1) 将快速诊断试剂置于37℃、50℃条件下, 每隔7d取出部试剂, 进行测试。 (2) 将快速诊断试剂在室温条件下保存。 (3) 在实际保存状态下每天至6个月取出试剂, 进行测试。

1.2.6 国家参考品血清盘的检测

取出HCV抗体国家参考品, 平衡到室温后, 将快速诊断试剂条平放, 在上样垫上滴加50~100μL被检测样品, 在30min根据检测线是否出现判定结果。

1.2.7 临床样本分析

581份临床样本同时用Ortho、Murex和Sorin 3种ELISA试剂和快速诊断试剂进行检测, 计算并统计本试剂的临床性能。

2 结果

2.1 分析特性能

检测结果试剂对高血脂、溶血、黄疸血清检测均为阴性;HAV、HBV、HIV、TP和HP抗体阳性样本;不同抗凝剂测均为阴性, 对以上物质没有非特异性反应。

2.2 稳定性分析

在室温条件下, 6、9、12、18个月检测均能通过HCV国家血清盘测试。37℃条件共检测到6周, 50℃条件下共检测到3周, 均能通过HCV国家血清盘测试。根据加速破坏试验结果, 快速诊断试剂的稳定性较好, 室温条件下稳定性达到18个月。

2.3 国家血清盘检测

以国家参考品作为样品进行测试, 检测结果和规定标准完全一致, 并且敏感度样本全部检出, 见表1。

2.4 对临床样本分析

对581份临床样本进行检测, 均检测出样本中有300份以上的HCV抗体阳性样本, 但并不完全一致, 见表2。

3种试剂间共有61份样本存在部分检测结果不一致现象, 相互间的符合率为91%至96%。

由于单个试剂可能存在一定的假阳性和假阴性, 以3种ELISA试剂中的2种检测一致结果作为标准分析更能反应样本的真实情况, 对比分析, 统计结果如下, 见表3。

阴性符合率=304/315=96.5%, 阳性符合率=259/266=97.4%

3 讨论

HCV抗体检测一直存在难度, 需要检测抗多种抗体联合包被以提高检测的敏感度[4]。多种诊断用抗原增加了试剂研制的复杂性, 对于HCV抗体快速诊断试剂成功的研究报道有限。HCV抗体诊断ELISA试剂由于的Core抗原的特殊性, 虽然已发展到第3代, 但一直采用间接法进行检测。由于蛋白和胶体金的标记为物理吸附[5], 所以抗原可能和胶体金标记并保持其活性, 实现双抗原夹心法快速检测。双抗原夹心法存在两次特异性抗原-抗体的结合, 同时双抗原夹心法能检测出样本中Ig M, 亦能增加检测的敏感度, 特别对于HCV, Ig M经常出现[6]。

本研究采用了双抗原夹心法对HCV抗体进行检测。研究过程中经不断试验和优休。对国内外数个不同来源抗原进行筛选, 最后得到了理想的抗原和工艺技术, 研制出理想的试剂, 性能稳定性良好。临床样本分析表明, 和高质量ELISA相比, 阴性符合率为97.4%, 阳性符合率为96.5%, 说明研制的快速诊断试剂和ELISA无显著性差异, 性能相似。由于免疫快速诊断试剂具有稳定性好检测方便、快速等特点, 高性能的HCV抗体免疫快速检测试剂和ELISA试剂互补, 能在临床上特别是中小医院得到广泛运用, 辅助诊断丙型肝炎, 具有重要的社会意义。

参考文献

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免疫层析 篇7

目前, 国内外关于万古霉素检测的研究主要集中于医学方面, 检测方法包括微生物法[3]、高效液相色谱法[4,5]和液相色谱-串联质谱法[6,7];关于动物源性食品中万古霉素的残留检测国外未见报道, 国内也较少, 且是与其他多肽类抗生素采用高效液相色谱-串联质谱法 (HPLC-MS/MS) 同时检测[8,9]。试验的目的是建立一种快速、灵敏地检测牛奶中万古霉素残留的胶体金免疫层析法, 为我国抗生素残留的现场监控提供理论依据, 现报道如下。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

万古霉素 (纯度≥99%) 、各种交叉反应药物 (纯度≥99%) 、牛血清白蛋白、卵清蛋白, 购自Sigma公司;氯金酸、柠檬酸三钠, 购自国药集团化学试剂有限公司;分泌万古霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 北京勤邦生物技术有限公司制备、保存。

复溶缓冲液, 由含牛血清白蛋白0.1%～0.3%、吐温-20 0.05%～0.2%及pH值为7.2的0.02 mol/L 磷酸盐缓冲液混合而成。

1.2 仪器与设备

PVC背板, 购自上海金标生物科技有限公司;硝酸纤维素膜、吸收垫、样品垫, 购自普利来基因技术公司;2000SBL电子天平, 购自美国Setra公司;90-2磁力搅拌器, 购自上海振荣科学仪器有限公司;LGJ-50C冻干机, 购自北京四环科学仪器厂有限公司;CT300数控切条机, 购自上海金标生物科技有限公司;Isoflow点膜仪, 购自Biodot公司;752S分光光度计, 购自上海棱光技术有限公司。

1.3 万古霉素半抗原的合成

0.50 g万古霉素、0.40 g琥珀酸酐和2 mL吡啶在10 mL二甲基亚砜中混合, 在80 ℃搅拌反应10 h, 蒸除溶剂, 柱层析后在乙醇-水体系中重结晶得到万古霉素单琥珀酸酰胺, 即为万古霉素半抗原。

1.4 万古霉素半抗原-卵清蛋白耦联物的制备

取15 mg半抗原, 溶解于1 mL N, N-二甲基甲酰胺中, 取碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺各30 mg, 用0.2 mL水充分溶解后加入半抗原溶液中, 室温下搅拌24 h, 即可得到反应液A;称取卵清蛋白50 mg, 使之充分溶解在3.8 mL、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液中, 将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中, 并于室温搅拌24 h;用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液4 ℃透析3 d, 每天换3次透析液, 以除去未反应的小分子物质;分装, 于-20 ℃保存, 备用。

1.5 胶体金的制备

用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01% (质量分数) , 置磁力加热搅拌器上搅拌煮沸, 每100 mL 0.01%氯金酸加入2.5 mL 1%柠檬酸三钠, 继续搅拌加热反应至液体呈红色时停止加热, 冷却至室温后补足失水, 4 ℃保存, 备用。制备好的胶体金通过肉眼观察其外观、颜色, 并采用电镜检测胶体金颗粒大小。

1.6 单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下, 用0.2 mol/L碳酸钾调胶体金溶液的pH值至7.0, 按1 mL胶体金溶液中加入10 μg的标准向其中加入万古霉素单克隆抗体, 搅拌混匀, 室温静置10 min;加入10%牛血清白蛋白使其在胶体金溶液中的体积分数为1%, 静置10 min;12 000 r/min、4 ℃离心20 min;弃上清液, 沉淀用复溶缓冲液洗涤2次, 用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬, 置4 ℃保存, 备用。

1.7 微孔试剂的制备

向微孔条中加入50 μL万古霉素单克隆抗体-胶体金标记物, 放入冷冻干燥机中, 在-50 ℃条件下预冻3 h, 再真空干燥15 h, 即可取出, 得到冻干有万古霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂, 密封, 保存。

1.8 硝酸纤维素膜的制备

利用磷酸缓冲液将万古霉素半抗原-卵清蛋白耦联物与羊抗、鼠抗抗体分别进行不同倍数稀释, 并制备成试纸条检测, 根据测试结果确定硝酸纤维素膜上检测线 (T) 和质控线 (C) 的使用浓度及喷量。用点膜仪将所选浓度的万古霉素半抗原-卵清蛋白耦联物与羊抗鼠抗抗体喷在硝酸纤维素膜上, 在37 ℃烘箱中干燥2 h, 备用。

1.9 样品吸收垫的制备

将样品吸收垫置于含0.5%牛血清白蛋白 (体积分数) 、pH值为7.2的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡5～10 min, 37 ℃烘干2 h, 备用。

1.10 试纸条的组装

将样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜依次按顺序粘贴在底板上;样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连, 反应膜的末端与吸水垫的始端相连, 样品吸收垫的始端与底板的始端对齐, 吸水垫的末端与底板的末端对齐;在组装好的试纸上粘贴保护膜, 保护膜上印有MAX标记线的一端粘贴在样品吸收垫上。试纸条组装好后切成4 mm宽, 与冻干有万古霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂配合使用。

1.11 检测方法

用微量移液器吸取200 μL待检牛奶样品溶液于微孔中, 缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀, 室温 (20～25 ℃) 孵育5 min后, 将标记好的试纸条插入微孔中 (印有MAX线端朝下) , 使之充分浸入溶液中。再次室温 (20～25 ℃) 孵育5 min后, 液体会沿着试纸条垂直向上依次通过检测线 (T) 和质控线 (C) , 此时如果检测线和质控线上均出现红色条带, 说明样品呈阴性 (-) ;如果质控线上出现红色条带, 检测线上没出现红色条带, 说明样品呈阳性 (+) 。

1.12 评价试验

1) 样本检测限。

在空白牛奶样本中分别添加万古霉素标准品至质量浓度为0, 20, 50, 100 μg/L, 按照1.11所述方法用3批试纸条进行检测, 每个浓度重复5次, 根据试验结果确定样本检测限。

2) 特异性。

分别向空白牛奶样本中添加其他药物 (纳他霉素、三甲氧苄氨嘧啶、恩诺沙星、磺胺甲唑等) 至质量浓度为0, 10, 50, 100, 500, 1 000 μg/L。用试纸条进行检测, 不同药物每个浓度重复3次, 根据试验结果判定试纸条的特异性。

3) 准确性。

根据农医发[2005]17号文件, 胶体金免疫层析法是一种定性方法, 准确性以假阳性率和假阴性率表示。取空白牛奶样品和添加50 μg/L万古霉素的阳性牛奶样品各50份, 用试纸条进行检测, 计算假阳性率和假阴性率。

4) 重复性。

分别从3个批次中随机抽取试纸条, 对空白牛奶和添加50 μg/L万古霉素的阳性牛奶样品进行多次重复测定, 根据试验结果判定试纸条的重复性。

5) 稳定性。

将足量的试纸条保存于2～8 ℃环境中, 每隔1个月取出适量, 分别检测空白牛奶样品、添加50 μg/L万古霉素的阳性牛奶样品各10份, 重复测定2次, 根据试验结果判定试纸条的稳定性。

2 结果与分析

2.1 试纸条条件的确定

通过对抗体标记pH值、万古霉素半抗原-卵清蛋白耦联物浓度及羊抗、鼠抗抗体浓度等条件进行反复试验及调整, 最终确定最佳条件:抗体标记pH值为7.0、万古霉素半抗原-卵清蛋白耦联物的使用浓度为1 mg/mL (喷量为1.0 μL/cm) 、羊抗鼠抗抗体的使用浓度为200 μg/mL (喷量为1.0 μL/cm) 。

2.2 胶体金质量分析

用肉眼观察制备的胶体金, 颜色为酒红色, 均匀度较好, 无杂质, 透明度较高, 说明胶体金质量较好;对其进行电镜扫描, 结果显示, 所制备的胶体金粒径均匀, 随机测量100个颗粒, 胶体金粒径约为20 nm, 见193页彩图1。

2.3 样本检测限

在空白牛奶样本中分别添加不同质量浓度的万古霉素标准品, 按照1.11所述方法用试纸条进行检测, 观察结果, 确定检测限。以只出现C线时的最低标准品质量浓度作为试纸条的检测限, 结果见表1和193页彩图2。

注:+表示阳性, -表示阴性。

肉眼观察, 万古霉素质量浓度为0时, 检测线出现很深的红色条带, 随着质量浓度的增加, 检测线条带逐渐减弱, 当增加至50 μg/L时检测线完全消失。由此判断, 该试纸条对牛奶样本中万古霉素的检测限为50 μg/L。

2.4 特异性

对选取的其他4种药物进行检测, 结果表明, 该试纸条特异性强, 在0～1 000 μg/L范围内与其他药物无交叉反应, 结果见表2。

2.5 准确性

50份空白牛奶样品中有1份为阳性, 其余均为阴性, 试纸条假阳性率低于5%; 添加50 μg/L 万古霉素的50份阳性牛奶样品的检测结果均为阳性, 试纸条假阴性率为0。说明试纸条准确性较好, 适用于牛奶样本中万古霉素的检测。

注:+表示阳性, -表示阴性。

2.6 重复性

多次重复测定结果一致, 表明试纸条批内、批间测定差异小, 重复性良好。

2.7 稳定性

试纸条从生产之日起至第12个月, 空白牛奶样品的检测结果均为C线和T线显色, 为阴性;阳性牛奶样品的检测结果均为C线显色, T线不显色, 为阳性;随后试纸条检测出现了假阳性和失效现象。由此可见, 试纸条稳定性较好, 在2～8 ℃至少可以保存12个月。

3 结论与小结

试验应用胶体金免疫层析技术, 成功研制出了万古霉素快速检测试纸条, 适用于牛奶样本的检测, 检测限为50 μg/L。方法操作简单, 牛奶样品无需前处理, 可直接用于检测, 整个过程10 min内就能判定结果, 而且具有稳定性好、灵敏度高、结果准确、易于判定、经济实用等优点, 适合于大批量样品的现场快速检测。

试验所建立的胶体金免疫层析方法, 是将胶体金标记的单克隆抗体直接冻干在微孔试剂中, 这样在检测过程中, 能够使金标抗体与待检样品液充分接触, 充分反应, 从而减少误差, 增加整个体系的反应灵敏度, 易于对样品中的药物残留情况进行分析。但由于胶体金免疫层析法主要通过目测颜色来判断结果, 比较主观, 可能出现假阳性;因此对阳性样本还需用仪器方法进行确证。

1～4.万古霉素的质量浓度依次为0, 20, 50, 100μg/L。

参考文献

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免疫层析 篇8

目前大多数国家对食品、谷物、饲料中的玉米赤霉烯酮含量都有十分严格的规定。例如澳大利亚规定谷物中玉米赤霉烯酮的含量不能超过0.05mg/kg;意大利规定在谷物和谷类产品中玉米赤霉烯酮的含量不能超过0.1mg/kg;而在法国, 植物油和谷类当中玉米赤霉烯酮的含量必须低于0.2mg/kg。中国则规定配合饲料、玉米中的玉米赤霉烯酮含量不得超过500ng/g。

玉米赤霉烯酮的分析测定一般采用薄层色谱法 (TLC) 、酶联吸附免疫法 (ELISA) 和高效液相色谱法 (HPLC) [3,4,5,6,7,8,9]。TLC法繁琐费时, 且灵敏度、特异性较差, 提取过程中所需有机溶剂品种多且量大, 易污染环境, 对人体有较大危害。常规的HPLC法虽然比TLC灵敏度高, 但由于样品前处理手续繁琐, 操作复杂, 不宜推广。以上包括ELISA法在内的几种方法均耗时较长, 而随着商品经济的发展, 人们对时间概念的加强, 无论是商家还是政府部门对检测时间的要求越来越高, 因此, 胶体金试纸条作为一种快速检测技术, 能很好的解决这个问题, 提高检测效率, 缩减检测时间。

1 材料与方法

1.1 试验材料

饲料样品购自市场;玉米赤霉烯酮标准品购自美国Sigma公司;玉米赤霉烯酮快速检测试纸条来自北京勤邦生物技术有限公司;微量移液器购自美国Thermo公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试样制备

样本前处理方法:称取5.0±0.05g粉碎的饲料样品至50ml聚苯乙烯离心管中, 加入5ml甲醇, 将瓶塞盖紧, 振荡5min;室温 (20~25℃) , 3000r/min以上离心5min;移取0.1ml上清液至盛有0.9ml样本复溶液的2ml聚苯乙烯离心管中混匀, 涡动30s。阴性饲料样品:空白饲料样品经前处理后, 配制成浓度分别为0和该试纸条检测限下限的1/2。阳性饲料样品:空白饲料样品经前处理后, 配制成浓度分别为该试纸条检测限和检测限的2倍。

1.2.2 试纸条的使用步骤

用吸管吸取稀释后的待检样品溶液垂直滴加3滴于加样孔;液体流动时开始计时, 反应5~10min, 判定结果。

1.2.3 结果判定

如果C线和T线都显色, 无论颜色深浅, 均表示饲料样品中玉米赤霉烯酮浓度低于检测限, 为阴性结果;如果C线显色, T线不显色, 表示饲料样品中玉米赤霉烯酮浓度等于或高于检测限, 为阳性结果;如果未出现C线, 表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效 (如附图) 。

附图玉米赤霉烯酮快速检测试纸条示意图

1.2.4 检测限的测定

用玉米赤霉烯酮试纸条分别对添加不同浓度的阴性饲料、阳性饲料进行检测, 每个样品做2个重复, 记录每种呈现阳性的最低浓度值。如果检测限下限浓度的阳性饲料样品不呈现阳性, 则根据检测限 (检测限有下限和上限的则在检测限内选择更高的浓度进行检测) 配制浓度更高的阳性饲料样品进行检测, 直至出现阳性结果为止。

1.2.5 假阳性率的测定

取空白的饲料样品50份, 制备B1、B2、B3、……、B50等100份阴性饲料样品。对阴性饲料样品用试纸条检测, 每个样品做2个重复, 统计假阳性数, 按照下面的公式计算假阳性率。

假阳性率=阳性样品数/样品总数×100%

1.2.6 假阴性率的测定

取空白的饲料样品50份, 制备B1、B2、B3、……、B50等100份阳性饲料样品, 对阳性饲料样品用试纸条检测, 每个样品做2个重复, 统计假阴性数, 按照下面的公式计算假阴性率。

假阴性率=阴性样品数/样品总数×100%

2 结果

用玉米赤霉烯酮试纸条对饲料进行了检测限、假阳性率、假阴性率验证, 结果如附表。

3 讨论

玉米赤霉烯酮试纸条的检测限为500ng/g, 符合GB13078.2-2006《饲料卫生标准饲料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允许量》。同时, 国内外对于快速检测技术的一个基本原则是:绝不能有假阴性, 但允许有假阳性, 按照农业部兽药残专家委员会《兽药残留检测试纸条 (条、卡) 备案技术资料要求及审查工作程序》, 快速试纸条的假阳性率应小于5%。本试纸条符合国家标准和该备案技术要求。

玉米赤霉烯酮试纸条操作简便, 结果容易观察, 不需要任何设备, 整个操作时间仅需5~10min, 相对与仪器等方法, 具有工作量小, 成本低的明显优势, 十分适用于我国基层检测实验室、政府部门的市场监控检测、临时抽检、排查工作, 能够实现生物技术在食品安全流通消费领域的方便、快速检测[10]。

摘要：本试验旨在利用胶体金免疫层析技术对饲料中的玉米赤霉烯酮药物残留进行检测, 经过测试, 该试纸条对饲料样本的检测限为500ng/kg;假阳性率、假阴性率均为0%。该试纸条适用于现场大量检测饲料样本的快速检测。

关键词：胶体金免疫层析法,玉米赤霉烯酮,饲料

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免疫层析 篇9

1 材料与方法

1.1 病历资料

肺结核组:为我院临床诊断为肺结核的住院患者112例, 其中包括痰涂片阳性组32例, 痰涂片阴性组80例, 男性67例, 女性45例, 年龄16～73岁, 平均41.3岁。肺结核诊断标准见文献[1]。

实验对照组:门诊无结核病史的健康体检者96例。

结核性胸膜炎组:为我院临床诊断为结核性胸膜患者52例, 男性27例, 女性25例;年龄18～70岁, 平均43岁。

1.2 方法

(1) 结核抗体检测采用胶体金免疫层析法, 试剂盒由兰州雅华生物技术有限公司提供, 严格按说明书操做。

(2) 痰厚涂片及胸水涂片抗酸染色, 油镜观察100个视野, 发现3～9条抗酸菌为阳性, 观察300个视野无抗酸菌为阴性[2]。

(3) 统计学方法:应用spss软件对检测结果进行统计学分析。

2 结果

1) 检测了112例肺结核患者血清中的结核抗体, 敏感性为60.7%, 菌阳性肺结核敏感性为81.2%, 菌阴性肺结核敏感性为52.5%, 菌阳组与菌阴组血清结核抗体统计学比较x2为6.76, p﹤0.05, 有显著性差异, 见表1。

2) 本法检测结核抗体的特异性为95.83%, 准确性为79.2%, 诊断指数为156.53%, 阳性预期值为94.44%, 阴性预期值为67.6%。

3) 在52例结核性胸膜炎病人的胸水中, 结核抗体阳性22例, 敏感性为42%;抗酸染色阳性8例, 敏感性为15.3%。经统计学分析, 胸水结核抗体敏感性和胸水抗酸染色敏感性比较有显著性差异x2为9.18, p﹤0.05, 见表2。

3 讨论

1) 在诸多的结核病实验室诊断方法中, 抗酸染色阳性率仅30%左右;PPD阳性率约为75%, 但存在假阳性。结核菌培养时间较长大约3～8周。PCR技术虽有敏感、特异、简便的特点, 但需要特殊设备。而胶体金免疫层析法具有简便、快速、特异等特点。我们检测了112例肺结核患者血清中的结核抗体, 敏感性为61.20%, 特异性为95.53%, 准确性为78.07%。

2) 痰菌阳性是肺结核活动期的重要指标之一, 本文痰菌阳性的血清结核抗体的敏感性为81.2%, 结果表明, 结核抗体对活动性结核诊断具有意义。

3) 菌阴性肺结核诊断缺乏“金标准”, 只有通过结核杆菌培养或正规抗结核治疗来确定, 无法早期诊断, 本文痰菌阴性的血清结核抗体阳性率为52.5%, 与菌阳性组比较x2为6.76, P<0.05;具有显著性差异, 因此, 对菌阴性肺结核也具有辅助诊断的意义。

4) 结核性胸膜炎诊断主要靠症状、体征、X线索件及抗酸染色、细菌培养等实验室检查。抗酸染色阳性率低易误诊, 而细菌培养时间长。本文胸水结核抗体阳性率为42%, 与胸水抗酸染色比较x2分别为9.18, P<0.01;具有显著性差异。对结核性胸膜炎的诊断具有重要的临床参考价值。

5) 评价一个实验在临床的诊断价值依赖其阳性预期值和阴性预期值[3]。在结核病低流行区, 阴性预期值高, 如检测结果为阴性就可以排除结核病。在结核病高流行区, 阳性预期值高, 阳性检测结果有利于临床可疑病人的诊断[4]。本文结核病占53.8%, 结核抗体检测的阳性预期值是94.44%, 我国是结核病高流行的国家[5], 结核抗体的检测阳性结果, 有助于菌阴性肺结核及结核性胸膜炎患者的确诊。

摘要：目的:探讨用胶体金免疫层析法检测血清及胸水中结核抗体, 评估其在结核病快速诊断试验的相关指标。方法:应用免疫层析技术来检测血清及胸水中的结核抗体。检测临床诊断肺结核患者112例 (其中分菌阳组、菌阴组) 和96例无结核病史的健康体检者的血清结核抗体水平;52例结核性胸膜患者胸水中的结核抗体水平, 同时对胸水进行抗酸染色镜检。计算诊断试验的相关指标。结果:该检测方法临床诊断肺结核的敏感性为60.7%, 特异性为95.83%, 准确性为79.2%, 诊断指数为156.53%, 阳性预期值为94.44%, 阴性预期值为67.6%;胸水中结核抗体阳性22例, 敏感性为42%, 胸水结核抗体阳性率和胸水抗酸染色阳性率结果有显著性差异p (0.05。结论:血清结核抗体检测具有较高的敏感性和特异性, 可用于临床肺结核的辅助诊断, 对评价肺结核的疗效有较高的实用价值。胸水中结核抗体检测对结核性胸膜炎的诊断也具有重要的临床参考价值。

关键词：分枝杆菌,结核,结核抗体,胶体金免疫层析,诊断

参考文献

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