细胞外基质代谢

细胞外基质代谢（精选九篇）

细胞外基质代谢 篇1

1 氧化应激和抗氧化系统

氧化应激是指机体内ROS产生过多, 超出其清除能力,导致氧化/抗氧化失衡,造成组织细胞损伤的一种状态[8]。 ROS是一类由O2-衍生出来的氧自由基的总称,主要包括超氧阴离子(·O2-)、羟自由基(·OH)、氢化氧基(·HO2)、过氧基(RO2)和烷氧基(RO)以及由O2-衍生出来的非自由基成分如过氧化氢(H2O2)等。 线粒体是细胞内ROS的主要来源[5],此外,生物体内酶促反应过程中也伴有ROS的产生。 线粒体来源的超氧阴离子通过锰超氧化物歧化酶催化形成H2O2,在金属离子存在的情况下,产生高反应性的羟自由基能通过Fenton和/或Haber-Weiss反应造成细胞内蛋白质、脂质和DNA损伤[9]。生理情况下,ROS的产生量很少,不引起机体病理改变,而过量的ROS则会导致氧化应激,引起一系列疾病和毒理作用[8]。 机体存在由多种“抗氧化剂”组成的抗氧化系统,主要通过酶类和非酶类两大抗氧化系统来抵御氧化剂的毒性作用,使ROS的产生和清除处于动态平衡状态[10]。 酶类抗氧化系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、细胞色素氧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等,微量元素铜、铁、锌、硒、锰、镁参与构成这些酶的活性中心。 非酶抗氧化系统主要有维生素C、维生素E、褪黑素、α-硫辛酸、类胡萝卜素等[8]。 其中,GSH氧化还原系统、SOD和CAT在防御氧化应激损伤中起着重要作用。

2 ECM及其代谢相关因子

ECM是存在于细胞之间的动态网状结构, 由胶原、蛋白聚糖及糖蛋白等大分子物质组成。 这些大分子物质可与细胞表面的特异性受体结合,通过受体与细胞骨架结构直接发生联系或触发细胞内的一系列信号传导而引起不同的基因表达,从而导致细胞的粘附、迁移、增殖和分化[11,12]。 不同的组织ECM组成成分的种类和含量不同。 在ECM各组分中,胶原蛋白主要为组织提供基本骨架及强度,蛋白聚糖和透明质酸主要维持水和状态、力学特性以及建立与维持信号分子的浓度梯度以确保组织的发育、形式和功能[12,13]。 若改变ECM中蛋白、 透明质酸和蛋白聚糖等成分可能会使组织的性质和生物学功能发生变化,参与一系列疾病的病理过程。 ECM的合成与降解受机体内多种酶和细胞因子的调节, 以维持正常生理条件下ECM的动态平衡。 调控ECM降解的酶主要有丝氨酸蛋白酶类、半胱氨酸蛋白酶类、天冬氨酸蛋白酶类和基质金属蛋白酶类(MMPs)四大类,其中,MMPs被认为是最重要的一类。 ECM中胶原的代谢主要取决于MMPs及其抑制剂TIMPs的动态平衡[8]。 而细胞因子主要包括转化生长因子-β(TGF-β)、基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)、血小板衍生因子(PDGF)和结缔组织生长因子(CTGF)等。

3 氧化应激与ECM代谢异常相关疾病

3.1 骨关节ECM代谢异常疾病

多聚蛋白聚糖和胶原是构成软骨细胞ECM的主要生物大分子[14]。 研究[1]显示关节退行性疾病患者体内抗氧化酶表达减少,ROS水平升高且胰岛素样生长因子(IGF-1)及其受体和MMPs表达上调,表明氧化应激是退行性骨关节炎和风湿性骨关节炎等骨关节退行性疾病发生发展的重要因素。 致病因素所导致的氧化应激可通过调节PI3K/Akt信号通路使多聚蛋白聚糖生成减少、降解增加,关节软骨胶原过度降解和表型表达改变,使关节软骨含水量减少、弹性丢失,最终导致关节软骨的损毁和关节功能的丧失[14,15]。

3.2 心血管ECM代谢异常疾病

研究证实,动脉粥样硬化(AS)、高血压病、缺血性心脏病等多种心血管疾病与氧自由基引起的氧化应激有关[12,13]。 Zarkovic等[2]认为,氧化应激所致的脂质过氧化及其产物4-羟基壬烯醛(4-HNE)可使弹性蛋白合成与降解失衡,参与衰老和动脉粥样硬化所致的血管壁重构。Essick等[16]研究表明,采用血管紧张素Ⅱ (AngⅡ) 处理小鼠, 使ROS水平上升,MMP-2、MMP-9 表达减少,TIMP1、TIMP-2 表达增加, 促进心机肥大与心室重塑。

3.3 肾脏ECM代谢异常疾病

肾脏ECM主要为透明质酸、层黏连蛋白和IV型胶原,ROS能破坏ECM合成和降解的平衡,引起肾小球基底膜增厚、系膜区增宽和间质纤维化[17]。 在糖尿病高糖状态下,过量的ROS可以使胶原蛋白、纤连蛋白等合成增加[18,19]。 同时,高糖可以ROS为第二信使,上调系膜细胞内纤溶酶激活物抑制剂-1(PAI-1)的表达,而PA的表达却得以下调从而使得系膜细胞降解ECM的能力降低,从而参与糖尿病肾病的发生发展[3]。

3.4 肺ECM代谢异常疾病

氧化应激反应能加剧气道炎性反应,其中的氧自由基及活性氧可减弱黏膜功能, 增强内皮渗通性,减弱内皮细胞的黏附性, 影响细胞外基质的重建。 Yao等[4]证实,SOD3 可以通过抗氧化作用减少弹性蛋白酶的表达,抑制氧化损伤所致的弹性蛋白降解,缓解吸烟所致的慢性阻塞性肺疾病(COPD)和肺气肿。 且MMP-9 在COPD患者的支气管肺泡灌洗液、 痰液和血清中的含量增多,血清MMP-9 浓度高于正常组,与FEV1、FEV1/FVC呈负相关[20]。 此外,在肺纤维化患者组织研究中也发现,ROS生成增加, 抗氧化物酶(GSH、SOD、CAT) 表达水平明显减少,MMP-2、3、7、8、9 的表达水平增加[13,21]。

3.5 肝脏ECM代谢异常疾病

在慢性肝损伤时,TGF-β 和PDGF表达增加,导致ECM合成大于降解,Ⅰ、Ⅲ型胶原表达增加,晚期出现降解障碍,而损伤后的ECM又能调节基质金属蛋白酶的活性,进一步影响ECM代谢。Li等[5]研究表明,黄芪甲苷Ⅳ可通过清除ROS、上调GSH表达,抑制HSC活化及Ⅰ型胶原和纤连蛋白的表达,从而缓解肝纤维化。 此外,氧化应激可增加TIMP1、TNF-α 和TGF-β1表达,减少MMP-2 的表达,使HA、LN及Ⅲ、Ⅳ型胶原表达增加,促进肝脏胶原沉积,导致纤维化[22,23]。

3.6 盆底支持组织ECM代谢异常

盆底支持组织ECM的组成成分有胶原蛋白(Collagen)、 弹性蛋白(Elastin)、 蛋白聚糖、层粘连蛋白和纤连蛋白等。Chen等[24]研究发现子宫脱垂患者子宫骶韧带氧化应激相关线粒体融合蛋白Mfn2 与Ⅰ、 Ⅲ型前胶原蛋白呈负相关,提示氧化应激可通过影响胶原代谢参与子宫脱垂发生。Li等[7]的研究表明,耻骨宫颈筋膜中GPx1 表达与CTGF和TGF-β1呈负相关,提示盆底支持组织抗氧化能力下降可下调胶原代谢调节通路TGF-β1-CTGF、 抑制胶原代谢进而损伤盆底支持结构。 有研究证实氧化应激能影响MMPs的表达[25],但在子宫脱垂中尚无相关文献。 因此,氧化应激可能通过影响胶原、 弹性蛋白等代谢导致ECM重构导致盆底支持结构生物力学完整性丧失。

4 氧化应激调控ECM代谢的机制

相关文献提示多条细胞信号通路参与氧化应激调控ECM代谢和重构过程, 其中TGF-β1/Smad3、丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节蛋白激酶(MAPK/ERK)、 磷脂酰肌醇-3 - 激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、酪氨酸蛋白酶/信号转导子和转录激活子(JAK/STAT)、Nrf2/ARE、Wnt/β-catenin等经典信号通路以及其相关效应因子发挥着重要作用。

4.1 TGF-β1/Smad3 信号通路

TGF-β1/Smad3 信号转导通路是调控机体组织纤维化的最重要机制之一。Hagler等[26]研究发现,ROS可通过激活TGF -β1/Smad3 通路, 增加CTGF和MMP-2 的表达,促进ECM重构和纤维化,参与二尖瓣黏液瘤的发生发展。 此外,ROS可通过启动TGF-β1/Smad3 信号通路, 激活下游的PAI-1,PAI-1 可抑制纤维酶原向纤维蛋白酶转化,从而影响组织纤维化的过程[27]。

4.2 JAK/STAT信号通路

JAK/STAT信号通路参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等很多重要的生物学过程, 主要通过JAK2/STAT3 通路实现[28,29]。 有研究证实,ROS可激活JAK2/STAT3 信号转导通路, 上调TGF-β1和纤维结合素的表达,影响ECM代谢,与糖尿病肾病有极其密切的联系[19]。 Huang等[30]研究显示,N-乙酰半胱氨酸(NAC)可通过减少ROS生成,抑制JAK2/STAT3 信号通路减少Ⅳ型胶原及纤连蛋白的表达缓解肾小管上皮细胞肥大性增长。

4.3 PI3K/Akt信号通路

PI3K/Akt信号通路在ECM产生和降解过程中起到重要作用。 ROS可通过激活PI3K/Akt信号通路促进MMP-2 的表达,从而激活HSC合成ECM[31]。 Qin等[32]研究表明,ROS可通过激活PI3K/Akt信号通路,促进Ⅰ型胶原的表达,从而参与肾间质纤维化的病理过程。 Yu等[33]研究显示,通过醉茄素A处理兔软骨细胞使ROS水平升高,激活PI3K/Akt通过,导致Ⅱ型胶原表达减少,而加用PI3K/Akt抑制剂LY294002 处理后,胶原表达上升。 同时,Zhang等[34]证实,氧化应激可通过调节PI3K/Akt信号通路抑制IGF-1 的表达,减少软骨细胞ECM蛋白聚糖的生成。 提示氧化应激可通过PI3K/Akt通路影响ECM代谢,参与退行性骨关节炎的发生发展。

4.4 MAPK/ERK信号通路

Ras和MAPK/ERK激酶(MEK)等都可激活ERK,活化的ERK移位入胞核,参与调控一些转录因子和细胞周期蛋白D、E表达, 导致HSCs增殖和表型改变,一些细胞因子和刺激活化MAPK后,把信号传入细胞核,包括磷酸化和激活多个转录因子,引起一系列细胞应答, 如增殖分化和对特定代谢途径的调节。 Yin等[15]研究表明,氧化应激可通过激活MAPK/ERK信号通路抑制IGF-1 的表达, 减少软骨细胞ECM蛋白聚糖的生成。 此外,ROS可通过激活MAPK/ERK信号通路上调TGF-β1, 刺激血管平滑肌细胞表达与分泌MMP-9,调节ECM代谢[34]。

4.5 Nrf2/ARE信号通路

Nrf2/ARE信号通路是近年来被公认的机体抗氧化系统的核心机制。 Oh等[35]研究表明,氧化应激状态时,Nrf2/ARE通路活化, 可抑制TGF-β/Smad信号通路,减少Ⅰ型胶原、纤连蛋白以及TIMPs和PAI-1 的表达。 此外,去乙酰化酶1(Sirt1)可通过激活Nrf2/ARE通路减少ROS生成,进而下调纤连蛋白和TGF-β1 的表达,参与糖尿病肾病的发生[36]。 而Nrf2 敲除小鼠在紫外照射诱导氧化应激状态下,MMP-9 表达较野生型明显增加[37]。

4.6 Wnt/β-catenin信号通路

Wnt是一种细胞间分泌的糖蛋白,与细胞表面受体结合将信号传至细胞内, 减少 β-catenin的降解并将之转位到核内,与转录因子T细胞因子/淋巴增强因子相结合,改变目的基因的表达(如MMPs、c-MYC、cyclin Dl和CD44 等),调节细胞的增殖和分化[38]。 Hsu等[39]通过动物实验发现,一氧化氮供体处理糖尿病模型小鼠,可通过下调内皮一氧化氮合酶,缓解糖尿病介导的氧化应激和氮化应激, 抑制Wnt/β-catenin信号通路,减少纤连蛋白和TGF-β1的表达,进而减轻小鼠肾脏ECM聚积,缓解糖尿病肾病的发生。

5 小结与展望

细胞外基质代谢 篇2

一、选择题

（一）A 型题 ． 组成糖蛋白分子中聚糖的单糖不包括

A ． 葡萄糖 B ． 半乳糖 C ． 甘露糖 D ． 岩藻糖 E ． 果糖 2 ． 糖蛋白糖链合成场所为

A ． 细胞膜 B ． 细胞核 C ． 细胞浆 D ． 高尔基体与内质网 E ． 溶酶体 ． N-连接糖基化位点特定序列不可能是 A ． Asn-GLY-Ser/Thr B ． Asn-Ala-Ser/Thr C ． Asn-Val-Ser/Thr D ． Asn-Leu-Ser/Thr E ． Asn-Pro-Ser/Thr 4 ． 不带有硫酸的糖胺聚糖是

A ． 硫酸软骨素 B ． 肝素 C ． 硫酸角质素 D ． 硫酸皮肤素 E ． 透明质酸 5 ． 胶原中最多的氨基酸是

A ． Ser B ． Thr C ． Tyr D ． Gly E ． Val 6 ． 细胞外基质中不含下列哪种蛋白

A ． 胶原蛋白 B ． 纤维蛋白 C ． 蛋白聚糖 D ． 纤连蛋白 E ． 清蛋白 ． 下列关于糖蛋白叙述错误的是

A ． 糖链所占分子的重量百分比一般在 2%—10% B ． 组成糖蛋白分子中聚糖的单糖有 7 种 C ． 合成糖蛋白糖链必须有长萜醇参与

D ． N-连接糖蛋白与 O-连接糖蛋白合成的场所均是内质网和高尔基体 E ． 糖链为分支糖链 ． 下列关于蛋白聚糖的叙述，错误的是 A ． 蛋白聚糖由糖胺聚糖与核心蛋白共价连接 B ． 蛋白聚糖分子中蛋白百分比小于聚糖

C ． 蛋白聚糖分子中也含有 N-或 O-连接聚糖 D ． 聚糖为直链型不分支

E ． 先合成 二 糖单位，再延长糖链 9 ． N-连接聚糖合成时所需糖基供体为

A ． UDP 或 GDP 衍生物

B ． UDP 或 CDP 衍生物 C ． ADP 或 GDP 衍生物

D ． TDP 或 GDP 衍生物 E ． ADP 或 TDP 衍生物 ． 胶原分子结构的叙述错误的是

A ． 结缔组织的主要蛋白质成分 B ． 由 3 条右手 α 螺旋肽链合成 C ． 分子组成中甘氨酸占 1 ／ 3 D ． 三股螺旋的形成与脯氨酸和羟脯氨酸有关 E ． 胶原中重复出现的模序有 Gly-Pro-X 11 ． 下列有关纤连蛋白（Fn）的叙述，错误的是 A ． 血浆中 Fn 主要来自肝细胞 B ． Fn 为二聚体

C ． Fn 的一级结构由三种不同内在序列同源结构重复出现而构成 D ． Fn 主要为 N-连接糖蛋白 E ． Fn 对细胞的作用 通过与胶原结合来完成 12 ． 下列关于层粘连蛋白（Ln）的叙述错误的是

A ． Ln 是由三条多肽链通过盐键连接而成的 B ． Ln 是一种糖蛋白 C ． 具有 Ⅳ 型胶原结合的区域 D ． 含有能与细胞表面受体结合的 RGD 模序 E ． 主要存在于各组织的基底层

（二）B 型题

A ． 长萜醇 B ． 糖醛酸 C ． 三股螺旋 D ． 核心蛋白 E ． 甘露糖 1 ． 糖胺聚糖含有 2 ． 蛋白聚糖含有 3 ． 胶原蛋白含有 ． 糖蛋白中聚糖的单糖有

A ． 五糖核心 B ． 核心蛋白 C ． 核心二糖

D ． 由葡萄糖和半乳糖构成的二糖单位 E ． 甘油醛 5 ． N-连接寡糖有 6 ． O-连接寡糖有

A ． 三股螺旋 B ． 双螺旋 C ． 二条多肽链 D ． 三条多肽链 E ． 一条多肽链 7 ． 胶原蛋白含有 8 ． 层粘连蛋白含有 9 ． 纤连蛋白含有

（三）X 型题 ． 胶原分子结构特点有

A ． 含有三股右手螺旋 B ． 甘氨酸占 1/3、脯氨酸占 1/ 4 C ． 无色氨酸 D ． 半衰期短 E ． 胶原中重复出现的模序有 Gly-Pro-X 2 ． 下列属于糖蛋白的有

A ． 血型抗原 B ． 凝血酶原 C ． 胶原蛋白 D ． 纤连蛋白 E ．层粘连蛋白 3 ． 叙述糖胺聚糖正确的是

A ． 包括透明质酸、肝素、硫酸软骨素 B ． 由二糖单位重复连接而成 C ． 与核心蛋白共价结合 D ． 含有糖醛酸 E ．可分支

二、是非题 ． 糖蛋白的聚糖主要有 N-连接和 O-连接型方式。． 不同种属、组织的同一种糖蛋白的 N-连接聚糖的含量和结构是相同的。3 ． 聚糖只能影响蛋白部分的构象、聚合、溶解及降解，不能参与糖蛋白的相互识别和结合。． 糖胺聚糖是由二糖单位重复连接而成，其二糖单位可以不含有糖胺。5 ． 体内的糖胺聚糖有 6 种，除透明质酸外都带有硫酸。． 凝集素是一类非抗体的糖蛋白，能专一地识别糖类，并以共价键的方式相结合。． 胶原是结缔组织的主要蛋白质成分，不同胶原有截然不同的形态和功能。8 ． 不同组织来源的纤连蛋白，其分子量、基本空间结构及生物学性质各不相同。． 聚糖的延长和加工修饰是先合成二糖单位，再逐个加上单糖。10 ． 具有功能的糖蛋白二聚体，往往依靠糖糖相互作用维系亚基的聚合和构象。

三、填空题 ．糖复合物主要包括 ________、________、________。2 ．糖蛋白和蛋白聚糖都是由 ________ 键连接的 ________ 和 ________ 两部分组成。．糖蛋白聚糖与蛋白质的连接方式有 ________、________。4 ． N-连接聚糖分为三型 ________、________、________。5 ．蛋白聚糖主要由 ________ 共价连接于 ________ 所组成。另外还含有一些 ________ 或 ________ 连接聚糖。．硫酸软骨素的二糖由 ________ 和 ________ 组成。7 ．透明质酸的二糖单位为 ________ 和 ________。8 ．细胞外基质（ECM）由三类成分组成 ________、________、________。9 ． ECM 中专一蛋白有 ________、________、________ 等 ．胶原的氨基酸组成特征是占 1/3 的是 ________，占约 1/4 的是 ________。尚特有 ________ 和 ________。． O-连接寡糖链的核心二糖由 ________ 和 ________ 构成，连接于蛋白质 ________ 的羟基。12 ． N-连接寡糖链以 ________ 为糖链载体，在 _______ 和 ________ 中进行合成、加工。． 蛋白质 ________ 糖基化是可逆的单糖修饰，主要发生于 ________ 和 ________。

四、名词解释 ． glycoprotein 2 ． Glycosaminoglycan(GAG)3 ． fibronectin（Fn）4 ． laminin（Ln）5 ． N-linked glycan 6 ． O-linked glycan 7 ． glycomics 8 ． glycoconjugate 9 ．糖基化位点

六、问答题 ． 简述糖蛋白中聚糖的功能。2 ． 简述蛋白聚糖的生理功能。3 ． 简述细胞外基质的成分与功能。． 常见的糖胺聚糖有哪几种？各有何结构特征？

参考答案

一、选择题

（一）A 型题 ． E 2 ． D 3 ． E 4 ． E 5 ． D 6 ． E 7 ． C 8 ． E 9 ． A 10 ． B 11 ． E 12 ． A

（二）B 型题 ． A 2 ． B 3 ． C 4 ． E 5 ． A 6 ． C 7 ． A 8 ． D 9 ． C

（三）X 型题 ． ABCE 2 ． ABCDE 3 ． ABCD

二、是非题 ． A 2 ． B 3 ． B 4 ． B 5 ． A 6 ． B 7 ． A 8 ． B 9 ． B 10.A

三、填空题 ． 糖蛋白 蛋白聚糖 糖脂 2 ． 共价 聚糖 蛋白质 3 ． N-连接 O-连接 ． 高甘露糖型 复杂型 杂合型 5 ． 糖胺聚糖 核心蛋白 N-O-6 ． N-乙酰半乳糖 葡萄糖醛酸 7 ． 葡萄糖醛酸 N-乙酰葡萄糖胺 8 ． 结构蛋白 专一蛋白 蛋白聚糖 9 ． 纤连蛋白 层粘连蛋白 纤维蛋白 ． 甘氨酸 脯氨酸 羟脯氨酸 羟赖氨酸 ． N-乙酰半乳糖 半乳糖 丝氨酸（或苏氨酸）12 ． 长萜醇 内质网 高尔基体 ． β-N-乙酰氨基葡萄糖 膜蛋白 分泌蛋白

四、名词解释 ． 糖蛋白，是由糖链与蛋白质共价连接的糖复合物。聚糖为分支糖链，不但影响蛋白质部分的构象、聚合、溶解及降解，还参与糖蛋白的相互识别和结合等。2 ． 蛋白聚糖，由糖链与蛋白质共价连接的糖复合物。聚糖占分子量的 50% 以上，含有一种或多种糖胺聚糖，并由二糖单位重复连接而成，不分支。蛋白聚糖主要功能是构成细胞间的基质。． 纤连蛋白，是一类多功能糖蛋白，由两条肽链组成为单一基因产物，主要由成纤细胞合成，血浆中的主要来自于肝细胞，功能具有多样性。． 层粘连蛋白，是一种由多结构域构成的糖蛋白，由一条 A 链和两条 B 链通过二硫键连接而成，存在于所有组织基底层，主要介导上皮细胞及内皮细胞粘着于基底膜。． N-连接糖蛋白，聚糖中的 N-乙酰葡萄糖胺和多肽链中天冬酰胺残基的酰胺氮以共价连接称之。6 ． O-连接糖蛋白，多肽链中的丝氨酸或苏氨酸残基的羟基与聚糖中的 N-乙酰半乳糖胺以共价连接称之。．糖组学，是后基因组时代的重要研究领域之一，包括聚糖种类、结构鉴定、糖基化位点分析、蛋白质糖基化的机制和功能研究，是对蛋白质和聚糖间的相互作用和功能的全面分析。8 ．糖复合物，是由糖与蛋白质、脂等分子结合形成的一类生物大分子，在体内发挥着其它分子不可替代的作用；主要包括：糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂。9 ．糖基化位点，指 N-连接糖蛋白聚糖中具有特定的氨基酸序列，即 Asn-X-Ser/Thr 3 个氨基酸残基组成的序列子才可连接聚糖，这一序列子被称为糖基化位点。

五、问答题 ． 简述糖蛋白中聚糖的功能。

答：糖蛋白中聚糖不但能影响蛋白部分的构象、聚合、溶解及降解，还参与糖蛋白的相互识别和结合等。

（1）聚糖可影响糖蛋白生物活性。

（2）糖蛋白聚糖加工可参与新生肽链折叠。（3）糖蛋白聚糖可参与维系亚基聚合。

（4）聚糖对蛋白质在细胞内的分拣、投送和分泌中起作用。（5）糖蛋白聚糖具有分子间的识别作用。2 ． 简述蛋白聚糖的生理功能。答：蛋白聚糖的主要功能是：

（1）维持组织的正常形态，抵抗局部压力，促进物质交换，阻止细菌通过。（2）参与生物活性物质的储存和释放。（3）调节细胞生长和分化。

（4）参与细胞间信息通讯和细胞与细胞的识别。3 ． 简述细胞外基质的成分与功能。

答：细胞外基质由三种成分构成，结构蛋白，如胶原；专一蛋白，如纤连蛋白、层粘连蛋白；蛋白聚糖。这些成分以不同比例形成多种类型基质成分，各自发挥特定功能。

（1）胶原是结缔组织的主要成分，不同的胶原有不同的形态和功能。（2）纤连蛋白（Fn）是由两条多肽链组成的糖蛋白，功能与其分子中含许多抗蛋白水解酶的结构域直接相关。主要介导细胞基质间相互作用，参与血小板凝集，组织损伤修复与细胞增殖，对修复有一定的作用。（3）层粘连蛋白（Ln）的功能主要是介导上皮细胞及内皮细胞粘着于基底膜，从而影响细胞的生长、分化和运动，目前认为 Ln 对肿瘤细胞的浸润、转移可能有一定的作用。

（4）蛋白聚糖的主要功能是细胞间基质的重要成分。4 ． 常见的糖胺聚糖有哪几种？各有何结构特征？

细胞外基质代谢 篇3

摘要：以雄性Wistar大鼠为研究对象，进行“一次性大强度离心运动”，一次性离心运动实验为16°下坡跑台跑，定量大负荷间歇性运动，跑速为26.8 m/min，运动5 min×10组，组间歇1 min。离心运动后不同时段取大鼠后肢腓肠肌外侧头进行分析大强度离心运动后大鼠骨骼肌细胞骨架蛋白含量的变化特点；与延迟性骨骼肌损伤时血清酶升高的关系；探讨细胞骨架蛋白在骨骼肌纤维中存在的特点和作用。

关键词：离心运动；细胞外基质蛋白；骨骼肌微损伤；膜完整性

中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1007-3612(2008)05-0618-05

骨骼肌细胞膜连接了细胞内骨架与细胞外基质（ECM），在维持骨骼肌细胞的结构和功能中发挥了重要作用。在骨骼肌中基膜（细胞外基质）—肌细胞膜—细胞骨架中的一些连接蛋白的缺失导致了骨骼肌疾病从而使人们对它们连接的重要生物作用有了认识［1］。细胞外基质（ECM）决定组织的形态和结构，ECM不同成分之间相互作用形成立体骨架结构，对细胞起着支持作用。细胞只有通过ECM连接才构成组织，ECM决定组织的牵张强度。细胞外基质蛋白在维持肌细胞的结构以及力的传导过程中发挥了重要作用。

对于运动后骨骼肌微损伤的发生及恢复过程中肌细胞的细胞内骨架、肌细胞膜在结构、功能方面的变化的研究已经相对比较成熟，但对于骨骼肌细胞外基质在运动后结构、功能方面变化的研究目前还较少，因此本研究的目的是探讨运动后骨骼肌微损伤后ECM中的重要蛋白laminin-2，collagenIV蛋白含量的异同及离心方式运动对其影响；探讨损伤发生过程中基质蛋白laminin-2基因表达的变化特征，为今后能够更加深入全面的研究运动后骨骼肌微损伤发生的机制提供理论基础和依据。

1研究方法

1.1实验对象与分组雄性Wistar大鼠42只，分为7组，每组6只，体重300～360 g，由北京维通过利华实验动物技术有限公司提供，国家标准啮齿类动物饲料，分笼饲养，自由饮食，室温17～23℃，相对湿度60%～75%，保持12 h光照。

正式实验前3 d，所有动物进行5～10 min跑台运动，以熟悉跑台，速度为5～10 m/min，坡度为0°。大鼠跑台为杭州段氏制作BCPT-98型。

一次性离心运动的实验大鼠采用Armstrong(1983)［2］、田野［3］所设计的-16°下坡跑台跑，模型略有改进，以更适合模拟离心方式运动造成的损伤。定量大负荷间歇性运动，跑速为26.8 m/min，相当于最大摄氧量的80％～90%［4］，运动5 min，间歇1 min，共进行10组。给以少量声、光、电刺激，以激励大鼠运动。

实验组在一次性离心运动后即刻、运动后4 h、12 h、24 h、48 h、72 h，取材为每组6只，分别取大鼠后肢腓肠肌外侧头进行分析。安静对照组取材与实验组相同部位。

1.2测试样本的采集与处理1） 大鼠血清的采集：大鼠称重后，用20%的乌来糖(或称乌拉坦)按0.01 mL/g体重腹腔注射麻醉，心脏取血置于离心管中，倾斜静置2～3 h后进行常规血清分离（2 000转/min，15 min），-20℃冰箱保存待测。

2） 用于匀浆的样本采集：取血后速取左侧腓肠肌外侧头,切约为4 min×4 min×4 mm3，用锡纸包好、标记后放入液氮中冰冻保存，留做匀浆用。

3） 用于冷冻切片的样本采集：大鼠称重后，颈椎脱位法处死，取血后小心剪取约3 min×3 min×5 mm的腓肠肌（切勿牵拉）投入用液氮预冷的装有正已烷（-70℃）的小烧杯中速冻，之后用锡纸包好放入液氮中保存，用于冷冻切片。

4） 组织匀浆总蛋白测试：10%匀浆，总蛋白（TP）的测试采用Bradford法［5］（即考马斯亮蓝法）法。

5） 血清CK、LDH的测试方法：测试采用酶动力法，试剂盒购自北京北控中生生物科技股份有限公司，测试严格按照操作步骤进行，仪器为MD-100半自动生化分析仪。

6） 羟脯氨酸（hydroxyproline）测试。原理：羟脯氨酸在胶元蛋白中占13.4%,在弹性蛋白中占极少量，其他蛋白中均不存在，因此羟脯氨酸能反映胶元代谢情况。羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色，根据其呈色的深浅可推算出其含量。

试剂盒购自南京建成生物制品公司，测试严格按照操作步骤进行，仪器为721分光光度计。

7） laminin-2原位杂交测试。大鼠Laminin-2基因的寡核苷酸探针序列设计参考Maher,J.J等［6］，用Blast在NCBI的RGD（Rat Genome Database）中验证其定位，使用Oligo 6.0验证其不含稳定的二聚体和发夹结构。其序列为： 5' AGGAGGTTGTCAGCAACAGCGGTCTTGACATGGACAACGA 3' ，由北京奥科生物技术有限公司合成，3'端地高辛标记。

8） 组织切片的图像分析。组织切片染色后，显微镜观察，通过Panasonic WV-CP410/G摄像头和BOSER BS602A图像采集卡进行图像采集，之后用Scion Image (National Institutes of Health, USA)进行分析。用Scion Image分别测量不同类型肌细胞膜染色的光密度，以此反映其含量。每样本测量上、下、左、右、中部5个视野。

9） 肌肉匀浆方法：秤取腓肠肌肉样品，迅速剪碎后放入玻璃匀浆器中，以1:10的比例加入匀浆液进行匀浆。

10） 冷冻切片：在SLEE冷冻切片机上进行切片，厚度为15μm，切片恒温-20℃。将实验组贴于一张切片上，以便于比较［7］。

1.3指标测试与方法11） 肌肉匀浆测SOD、MDA方法：SOD的测试采用黄嘌呤氧化酶法，MDA的测试采用硫代巴比妥酸（TBA）法，试剂盒均购自南京建成生物制品公司，测试严格按照操作步骤进行，仪器为721分光光度计。

冷冻切片。固定：切片自然干燥，浸入新鲜配制的4%多聚甲醛中2 min。消化：胃蛋白酶，一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30～180 min，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。

1.4数据统计方法对观察分析结果用统计学分析软件SPSS11.5进行ANOVA单因素方差分析。

2结果

2.1离心方式运动后血清CK、LDH 以及羟脯氨酸的变化┎馐越峁见表1。

血清CK、LDH的变化呈现相似的趋势，在离心运动后即刻最高随后呈现下降的趋势到12 h后达到最底点，然后呈现上升的趋势到48 h后又呈现下降趋势(图1)。ANOVA分析表明：运动后即刻CK与其它各时段均有非常显著性差异，玃<0.01;LDH除24 h外的各时段和即刻组均有显著性差异,玃<0.05;CK 4 h组高于12 h组、72 h组，差异显著，玃<0.05;12 h最低，与除24 h外的各段均有显著差异，玃<0.05；肌组织中SOD值从离心运动后即刻开始升高，到12 h达最高，48 h又有一次高峰，随后下降。运动后肌组织SOD含量，在12 h显著高于安静对照、72 h含量，玃＜0.05(表2)。

肌组织中MDA变化规律与SOD相似(表2，图3)，在运动后即刻开始升高，12 h达最高，在48 h又有一次高峰趋势，其后下降。其中12 h肌组织MDA含量与安静对照、运动后48 h、72 h差异显著，玃＜0.05。图3，肌组织MDA扩大十倍显示。

2.2运动后细胞外基质蛋白含量变化与骨骼肌内容物泄漏及自由基代谢变化的相关分析(表3，图4)。

图5，图6。测量每张切片中5个视野（左上、左下、中、右上、右下）的蓝紫色颗粒的光密度值，结果见表4和图7。

离心运动即刻laminin-2基因表达水平明显下降与对照组差异显著，玃＜0.05；随后逐渐升高，在48 h达到最大，在4 h后直至72 h均处于较高水平，对照组与4 h组至72 h组差异显著玃＜0.05(图7)；

腓肠肌外侧头，冷冻切片，15 μm厚；寡核苷酸探针，地高辛标记，碱性磷酸酶系统显色，杂交阳性信号为蓝紫色颗粒(图8)。

腓肠肌外侧头，冷冻切片，15μm厚；寡核苷酸探针，地高辛标记，碱性磷酸酶系统显色，杂交阳性信号为蓝紫色颗粒(图9)。

3分析与讨论

3.1离心运动后大鼠肌纤维中细胞外基质蛋白laminin-2,cllagenIV含量的变化根据对腓肠肌组织切片的观察来看，我们观察到离心运动后腓肠肌更为明显。ECM的量受到身体活动的影响，一定形式的慢性负荷练习可以增加胶元的含量，只不过是胶元合成的类型以及胶元合成的程度情况不同。这些变化可以改变组织的粘弹性以及机械特性，使组织更易抗拉。［8-9］在laminin-2基因缺失大鼠的研究中发现［10-11］，伴随着laminin-2的减少而CollagenIV含量呈增加趋势，而本研究却发现离心运动后laminin-2含量增加伴随着CollagenIV含量的减少，laminin-2蛋白和CollagenIV之间是否存在着动态平衡，二者之间的增加和减少是否存在着因果关系？需要进一步研究的证实。

3.2运动后骨骼肌内容物泄漏、羟脯氨酸、自由基代谢变化以及骨架蛋白含量变化的相关分析羟脯氨酸是胶元蛋白的一种主要氨基酸，是反映体内胶元代谢的生化标志物，在胶元蛋白中占13.4%,在弹性蛋白中占极少量，其他蛋白中均不存在，因此羟脯氨酸能反映胶元代谢情况。血清羟脯氨酸与血清LDH呈负相关；而血清羟脯氨酸与collagenIV没有相关性，可能和collagenIV本身的特殊性有关系，collagenIV作为细胞外基质蛋白的一种，在细胞外基质中含量很少并且是基膜的框架结构，也是基膜特有的胶原，在组织中细胞排列和骨骼肌中维持力的稳定性中发挥着重要的作用［12-13］，在运动过程中可能没有对胶元的代谢产物羟脯氨酸的增加作出贡献有关,本研究证实了这一点，即羟脯氨酸虽然是胶元的代谢产物但主要是I、III型胶元的代谢产物，也有相关文献报道羟脯氨酸主要是I、III型胶元的代谢产物［14］；肌组织中MDA水平与SOD水平相关；肌组织中SOD与血清LDH水平负相关；

本研究发现细胞外基质蛋白collagenIV与血清CK呈正相关；而Mackey, Donnell y（2004）［15］在以人为研究对象进行一次性离心运动后也同样发现了collagenIV与血清CK的明显的相关关系提示可能骨骼肌的离心收缩影响了IV型胶元的代谢更新。

3.3研究骨骼肌在损伤过程中laminin-2基因表达的变化特征细胞外基质蛋白laminin-2基因mRNA的原位杂交结果代表了laminin-2基因表达水平。如图10所示，离心运动即刻laminin-2基因表达水平明显下降与对照组差异显著玃＜0.05，随后逐渐升高，在48 h达到最大，在4 h后直至72 h均处于较高水平，对照组与4 h组至72 h组差异显著；本研究观察到了即刻laminin-2基因水平的降低但是没有观察到蛋白水平的下降，可能和实际蛋白水平有下降的趋势但是没有设置相应的时相观察到相应的实验结果，也有可能离心运动后即刻laminin-2基因表达水平的下降激活了laminin-2基因的调控过程使得laminini-2基因表达水平提高从而增加laminin-2蛋白的合成，laminin-2蛋白的升高也有可能和其本身就有较强的修复能力有关，从图11我们可以看到laminin-2基因和蛋白变化有大致相同的趋势。

4结论

1） 离心运动后基质蛋白laminin-2在24 h处于最高水平，24 h与其它各组组差异显著,其它组间的变化无显著性差异,说明了laminin-2是有较强调整和修复能力的蛋白，其变化有可能是因为其相邻蛋白的减少而代偿性的增加以维持机体的功能。

2） 本实验发现肌细胞外基质蛋白含量collagenIV的变化与血清CK相关，提示可能骨骼肌的离心收缩影响了collagenIV的代谢更新；

3） 离心运动即刻laminin-2基因表达水平明显下降与对照组差异显著；随后逐渐升高，在48 h达到最大，laminin-2基因和蛋白的表现了基本相同的变化趋势。

参考文献：

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细胞外基质代谢 篇4

已有研究证实,晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)及其受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)能通过直接或经由不同的细胞内信号转导通路参与包括类风湿性关节炎、糖尿病肾病、骨质疏松、阿尔茨海默病以及冠状动脉粥样硬化性心脏病等多种疾病的发生、发展[4]。但RAGE在OA的发生、发展中起到何种作用,尚不十分清楚,有研究认为这可能与AGEs/RAGE触发活化促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase,MAPK)信号转导通路有关[5]。P38信号转导途径是MAPK途径的一种,研究显示,P38MAPK信号转导通路与软骨细胞表型维持和细胞分化,软骨细胞的肥大、钙化和凋亡,软骨细胞基质金属蛋白酶的合成以及炎症因子的产生等密切相关。S100蛋白被认为是一组钙离子传感器,通过钙离子信号转导途径在细胞增殖、分化、黏附、运动、基因表达及凋亡过程中发挥重要作用。其家族成员S100A4、S100A6和S100A13等已被证实可促进骨肉瘤的侵袭、转移[6,7,8]。S100蛋白的另一家族成员S100A11则参与多种细胞内的活性调节[9],在胃癌、结肠癌和乳腺癌等肿瘤的发生、发展中的作用已有较多研究[9,10,11]。研究显示,当软骨细胞受到白细胞介素1等促炎症因子刺激时S100A11会释放到软骨细胞外与RAGE结合,从而促进软骨细胞肥大。本研究旨在通过外源性S100A11及P38MAPK信号转导通路相关抑制剂,作用于小鼠软骨细胞后对MMP-13、ADAMTS-5及Ⅱ型和Ⅹ型胶原蛋白表达的影响,以探明S100A11-RAGE和P38MAPK信号转导通路对小鼠软骨细胞肥大和细胞外基质代谢的调控,旨在揭示OA的发病机制,为研发有效的防治药物开辟新的思路,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

RMIP 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclone公司,美国),Ⅱ型胶原蛋白酶(Gibico公司,美国),S100A11、anti-RAGE、anti-P38(Santa Cruz公司,美国),MMP-13、ADAMTS-5以及Ⅱ型、Ⅹ型胶原蛋白单克隆抗体、非免疫性山羊血清、荧光二抗(Santa Cruz公司,美国),TRIzol(Invitro-gen公司,美国),PCR试剂盒(Ta Ka Ra公司,日本),逆转录试剂盒(ABI Applied Biosystems公司,美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠软骨细胞的培养

无菌条件下,麻醉后取小鼠髋关节和膝关节处软骨,剪成1 mm3小块,转移至培养瓶内,加入0.25%的胰蛋白酶,5%二氧化碳CO2、37℃培养箱中孵育1 h,弃去胰蛋白酶,加入0.2%的Ⅱ型胶原蛋白酶,继续孵育消化。2 h后,收集消化液,1 000 r/min离心5 min,所得细胞接种于含10%FBS的RMIP 1640P培养基,5%二氧化碳CO2、37℃培养箱中培养。实验用细胞为1~3代。

1.2.2 实验分组与干预

在小鼠软骨细胞中加入不同浓度的外源性S100A11(0、1.25、2.50、5.00及10.00μg/ml),孵育48h后,检测MMP-13和ADAMTS-5以及Ⅱ型和Ⅹ型胶原蛋白的表达,以筛选作用最显著的S100A11浓度。

在小鼠软骨细胞中加入Anti-P38(0、1.25、2.50、5.00及10.00μg/ml),孵育12 h后,再加入前面筛选出的作用最显著的SA00A11浓度(10μg/ml)。孵育48 h后,检测MMP-13和ADAMTS-5以及Ⅱ型和Ⅹ型胶原蛋白的表达,以观察阻断P38MAPK信号转导通路后,对小鼠软骨细胞肥大和细胞外基质代谢的影响。

1.2.3 PCR检测MMP-13和ADAMTS-5 m RNA表达

提取总细胞总RNA,逆转录成c DNA。参照文献[4],设计MMP-13、ADAMTS-5以及G3PDH的引物,由上海吉玛制药技术有限公司合成。MMP-13正向引物:5'-CTTGATGCCATTACCAGTC-3',反向引物:5'-GGTTGGGAAGTTCTGGCCA-3'。ADAMTS-5正向引物:5'-TATGACAAGTGCGGAGTATG-3',反向引物:5'-TTCAGGGCTAAATAGGCAGT-3'。GAPDH正向引物:5'-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3',反向引物:5'-CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG-3'。PCR扩增参数:94℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s、共32个循环,最后72℃延伸7 min。

1.2.4 蛋白免疫印迹法(Western b l ot)检测MMP-13和ADAMTS-5蛋白表达

收集各组细胞,PBS淋洗后加入放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液裂解30 min,刮离细胞转移至离心管,20 000 r/min离心30 min,取上清液置入-20℃冰箱冷冻保存备用。分别以50μg等量总蛋白上样,经8%SDS-PAGE电泳分离,转至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,TBST淋洗,5%脱脂奶粉室温封闭1 h;加入一抗,4℃孵育过夜;TBST淋洗,加入辣根过氧化物酶标记的荧光二抗,37℃孵育1 h;TBST淋洗,DAB显色。

1.2.5免疫细胞化学检测Ⅱ型和Ⅹ型胶原蛋白表达

取对数生长的小鼠软骨细胞按1×105的密度接种于6孔板中,将2%多聚赖氨酸包被处理的玻片置于孔中以进行细胞爬片;培养24 h后,待细胞紧贴玻片,取出玻片,PBS淋洗,95%酒精固定;PBS淋洗,加过氧化酶阻断剂,37℃孵育30 min;PBS淋洗,加非免疫性山羊血清,37℃封闭30 min;PBS淋洗,加一抗,4℃孵育过夜;PBS淋洗,加二抗,37℃孵育30 min;PBS淋洗,DAB染色,苏木精复染,95%酒精脱水,透明,封片,每张切片任选5个视野,采用Image Pro plus 6.0软件进行半定量分析,测量每张切片阳性染色灰度值[5]。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,并行t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度S100A11对MMP-13和ADAMTS-5表达的影响

不同浓度外源性S100A11孵育48 h后,小鼠软骨细胞MMP-13和ADAMTS-5 m RNA及其蛋白的表达较对照组显著上调(P=0.031,0.022和0.009),且其表达呈浓度依赖性增加,以S100A11为10μg/L时表达最强。见图1。

2.2 不同浓度S100A11对Ⅱ型和Ⅹ型胶原蛋白表达的影响

Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色灰度值随S100A11浓度增大而增大,且明显低于对照组(P=0.000)(见图2A);Ⅹ型胶原蛋白灰度值随S100A11浓度增大而减小,且明显高于对照组(P=0.026)(见图2B)。提示随S100A11浓度增大,Ⅱ型胶原蛋白表达逐渐减少,明显低于对照组(P=0.007);而Ⅹ型胶原蛋白表达逐渐增加,明显高于对照组(P=0.018)。

A:MMP-13 m RNA和蛋白的表达;B:ADAMTS-5 m RNA和蛋白质的表达

A:Ⅱ型胶原蛋白(×100);B:Ⅹ型胶原蛋白(×50)

2.3 Anti-P38对MMP-13和ADAMTS-5表达的影响

不同浓度Anti-P38孵育12 h后,再加入SA00A11(10.00μg/ml)孵育48 h,检测MMP-13和ADAMTS-5的表达。结果显示,MMP-13和ADAMTS-5的m RNA及蛋白的表达随Anti-P38浓度的增加而减少,且明显低于S100A11单独处理组(P=0.004)。见图3。

2.4 Anti-P38对Ⅱ型和Ⅹ型胶原蛋白表达的影响

不同浓度Anti-P 38孵育12 h后,再加入SA00A11(10.00μg/ml)孵育48 h,检测Ⅱ型和Ⅹ型胶原蛋白的表达。结果显示,Ⅱ型胶原蛋白的表达随Anti-P38浓度的增加而减少,且明显低于S100A11单独处理组(P=0.001);Ⅹ型胶原蛋白的表达随AntiP38浓度的增加而增加,且明显高于S100A11单独处理组(P=0.002)。见图4。

3 讨论

OA的病理生理过程主要表现为关节软骨细胞的分解代谢明显大于合成代谢,导致软骨基质进行性丢失。OA发病时,各种基质金属蛋白酶的表达和含量明显增高,加剧细胞软骨基质的分解,其中基质金属蛋白酶MMP-13对于Ⅱ型胶原蛋白具有强烈的裂解作用,在OA的发生、发展中起着十分重要的作用[12]。ADAMTS-5是细胞软骨基质蛋白聚集蛋白聚糖Aggrccan的降解酶,研究发现,OA患者骨关节中存在Aggrccan被大量降解破坏的现象[13]。Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖Aggrccan是软骨基质中的主要成分,Ⅱ型胶原蛋白是构成纤维网架结构的主体,具有很强的抗张性,而聚集蛋白聚糖Aggrccan对于关节的抗压力和分散负荷等具有重要作用,两者的表达和凋亡情况是反应软骨退变程度的最好指标[14]。当软骨细胞分化到增生末期时,Ⅹ型胶原蛋白的合成达到顶峰,提示Ⅹ型胶原与软骨骨化相关;而在OA中,观察到软骨基质退化后期Ⅹ型胶原蛋白表达的增加[15]。所以本研究选择MMP-13、ADAMTS-5及Ⅱ型和Ⅹ型胶原蛋白作为反映OA病变的主要检测指标。

年龄是引起OA发病和进展的最重要的危险因素之一。有研究认为,随着年龄的增加体内大量AGEs的产生和堆积是导致和加速年龄相关性OA病变的主要原因之一[16]。其机制可能与AGEs与RAGE特异性结合并激活细胞内一系列信号转导通路相关。

RAGE配体除了AGEs外还包括β淀粉样蛋白、高迁移率族蛋白1等等,而S100A11也是RAGE的配体。为探明S100A11-RAGE和P38MAPK信号转导通路对小鼠软骨细胞肥大和细胞外基质代谢的调控,本研究首先采用不同浓度的外源性S100A11作用于体外培养的小鼠软骨细胞,结果发现随着S100A11浓度的增加,小鼠软骨细胞MMP-13、ADAMTS-5和Ⅹ型胶原蛋白的表达较对照组显著上调,而Ⅱ型胶原蛋白的表达却逐渐减少。研究证实,外源性S100A11能通过与RAGE结合调控小鼠软骨细胞肥大和细胞外基质代谢。进一步的研究发现,小鼠软骨细胞MMP-13、ADAMTS-5和Ⅱ型胶原蛋白的表达随Anti-P38浓度的增加而显著减少,而Ⅹ型胶原蛋白的表达却随Anti-P38浓度的增加而增加。提示P38 MARK抑制剂Anti-P38可以显著抑制由外源性S100A11诱导的软骨细胞肥大和基质代谢增加。

细胞外基质代谢 篇5

1 资料与方法

1.1 实验动物

8~9周龄清洁级昆明小鼠,雌性,体重18~24 g,由广东药学院实验动物中心提供。

1.2 仪器与试剂

IX51倒置荧光 显微镜(OLYMPUS),Hera cell150细胞培养箱(Thremo),超净工作台(苏州净化实验仪器厂),多功能酶标仪(Thremo)。IMDM培养基和胎牛血清购自Hyclone,MTT购自Sigma,SDS购自Amresco。

1.3 骨髓单细胞悬液制备

参考文献[9],脱颈处死小鼠,70%乙醇浸泡5 min,无菌条件下取小鼠股骨,除去股骨上的肌肉组织,眼科剪剪掉股骨两头,暴露骨髓腔,用1 ml IMDM(10% FBS)冲出骨髓细胞,滤网过滤后,300 g,离心5 min,弃上清液,用IMDM(10% FBS)重悬制备骨髓单细胞悬液。

1.4 条件培养基制备

取小鼠骨髓单细胞悬液调细胞密度至1×107个 /ml,后接种细胞培养皿,37℃、5%CO2饱和湿度下培养,培养24 h,取上清,300 g,离心5 min,上清即为条件培养基[CM-IMDM(10% FBS)],-20℃分装保存。

1.5 细胞生长状态检测

改良MTT法检测细胞数目[10],基质细胞培养7d后,按10∶1(v/v)的比例每孔加入MTT(5 mg/ml),细胞培养箱孵育4 h,直接加入改进的SDS溶液对Formazan进行溶解,24 h后用酶标仪测570 nm OD值。

1.6 骨髓基质细胞培养

取骨髓单细胞悬液接种96孔板,每孔最终接种细胞数目为1×105个 / 孔、3×105个 / 孔、5×105个/ 孔,每种接种密度又分100、150、200μl培养体系组,每组重复5个复孔,37℃、5%CO2饱和湿度下培养,每隔3.5 d换液,培养7 d后倒置显微镜观察骨髓基质细胞生长状态,MTT法检测细胞数目。

1.7 自分泌检测

取骨髓细胞接种96孔板,每孔接种细胞数目3×105个 / 孔、5×105个 / 孔,每种接种密度又分正常IMDM(10% FBS)和CM-IMDM(10% FBS)组,每组重复5个复孔,37℃、5%CO2饱和湿度下培养,每隔3.5 d换液,培养7 d后倒置显微镜观察骨髓基质细胞生长状态,MTT法检测细胞数目。

1.8 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用方差分析进行两两比较,P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞接种数目对骨髓基质细胞体外生长状态的影响

骨髓基质细胞体外培养7 d后,培养体系100μl组(图1A,D,G),接种1×105个 / 孔的培养孔基本无基质细胞生长,接种3×105个 / 孔细胞的基质细胞贴壁约30%左右,接种5×105个 / 孔细胞的基质细胞贴壁达90%左右。以上结果表明接种细胞密度太低骨髓基质细胞不能在体外生长,5×105个 / 孔组基质细胞生长状态明显好于其他两组,这一方面可能与基质细胞体外培养时相互之间的接触依赖性有关,也有可能与基质细胞接种密度太低造成自身分泌的胞外因子浓度过低有关。

为了进一步研证以上假设,设计同样细胞接种数目,不同培养基体积组来进行实验,如果自身分泌的胞外因子对自身生长影响不大,那么随培养基体积的增多,基质细胞的体外生长状态应不受影响。结果表明3×105个 / 孔体系组 (图1D,E,F;表1),150μl和200μl培养体系孔骨髓基质细胞的贴壁数目明显低于100μl体系孔(P <0.05),而接种细胞数目为5×105个 / 孔时(图1G,H,I;表1),各培养体系组骨髓基质细胞贴壁数目无明显差异。此结果进一步提示骨髓基质细胞在体外培养时自身会分泌胞外因子来促进自身的生长或者贴壁,而当分泌的胞外因子达到一定浓度后促生长作用将达到平台期。

A 、 B 、 C:细胞接种数目 1 × 105个 / 孔;D 、 E 、 F:细胞接种数目 3 × 105个 / 孔;G 、 H 、 I:细胞接种数目 5 × 105个 / 孔;A 、 D 、 G:培养体系是 100 μl;B 、 E 、 H:培养体系是 150 μl;C 、 F 、 I:培养体系是 200 μl

2.2 条件培养基促骨髓基质细胞体外增殖能力

高密度体外培养骨髓基质细胞来制备条件培养基,此培养基与普通培养基的唯一区别在于包含骨髓基质细胞自身分泌的胞外因子。当细胞接种密度为3×105个 / 孔时(图2A,B;表2),条件培养基组与普通培养基组相比能明显促进骨髓基质细胞的生长(P <0.05),而细胞接种数目为5×105个 / 孔时,条件培养基组细胞贴壁数目与普通培养基组无明显差异(图2C,D;表2)。结果表明条件培养基包含有促骨髓基质细胞体外生长所必须的生长因子来促进自身的生长,并且当胞外因子的浓度达到一定浓度后促生长作用达到平台,因此可以利用条件培养基来进行骨髓基质细胞的体外低密度培养。

注:†与 100μl 组相比,P <0.05

(n =5, ± s)

注:†与 IMDM(10%FBS)组相比,P <0.05

A 、 B:细胞接种数目 3 × 105个 / 孔;C 、 D:细胞接种数目 5 × 105个 / 孔;A 、 C:IMDM(10% FBS)培养基;B 、 D:条件培养基

3 讨论

在骨髓造血的过程中,骨髓基质细胞可通过与造血干、祖细胞直接相互通讯、分泌多种正负性造血调控因子和构筑良好的空间微环境来参与造血的调控过程[11,12,13]。为了更好的研究骨髓基质细胞在调控骨髓造血中的作用机理,必须建立骨髓基质细胞的体外培养方法,同时由于骨髓基质细胞是一群复杂细胞,因此在体外培养时必须最大程度上保留基质细胞的组分和其生物学特性。

已有研究表明,骨髓基质细胞体外接种数目太低时不能生长。原因可能是:1骨髓基质细胞体外培养时相互之间的接触依赖性有关,已有研究表明不同基质细胞存在相互依赖的关系[14];2骨髓基质细胞体外培养时自身会分泌一定的胞外因子来促进自身的生长。为了解释基质细胞低密度接种不能生长的原因以及如何做到在体外低密度培养,笔者设计了相同细胞接种数目,不同培养基体积实验组。结果表明当细胞接种数目3×105个 / 孔时,随培养基体积的增大,骨髓基质细胞贴壁数目明显减少,因此可以推测基质细胞体外培养时自分泌的胞外因子对自身在体外的生长起重要作用。当细胞接种数目5×105个 / 孔时,培养基体积对基质细胞贴壁数目和生长状态无影响,推测基质细胞自分泌的胞外因子有一定的饱和效应浓度。具体是何种胞外因子起作用,以及这种胞外因子在动物体内起何种作用还需后续实验验证。

进一步验证上述结论和探讨体外进行骨髓基质细胞低密度培养的方法。首先体外高密度培养骨髓细胞,培养24 h后离心制备条件培养基,后利用条件培养基来培养基质细胞,发现条件培养基与普通培养基相比能够明显促进基质细胞贴壁数目。条件培养基与普通培养基的区别在于条件培养基中含有骨髓基质细胞自身分泌的胞外因子,结果表明:基质细胞自分泌的胞外生长因子对自身的贴壁生长有促进作用。如果要进行体外骨髓基质细胞的低密度培养可以考虑采用条件培养基进行。

细胞外基质代谢 篇6

1 试验

1.1 钛片的制备和碱活化

均匀剪出1 cm×1 cm的钛箔片若干;配制5 mol氢氧化钠溶液:分析天平称取200 g氢氧化钠, 溶解倒入容量瓶定容至1 L, 摇匀。钛片的碱活化处理:采用碱活化的方法在钛表面形成多孔结构, 取部分干燥清洁的钛片浸没在5 mol氢氧化钠溶液中, 60℃反应24 h, 用去离子水超声清洗后在80℃去离子水中再反应24 h, 最后用去离子水超声清洗, 干燥。

1.2 人脐静脉内皮细胞的培养

无菌条件下取健康剖宫产产妇的新鲜脐带 (长度约20 cm) ;将切去针尖的不锈钢注射器针头插入脐静脉一端, 用止血钳固定;注入生理盐水冲洗脐静脉直至冲洗液清亮;在脐静脉的另一端用同样的方法固定另一个注射器针头;两端用一次性注射器封闭。脐静脉内注入适量的0.1%II型胶原酶 (约10 m L/20 cm) , 37℃消化15~20 min后收集消化液;用含15%新生牛血清的F12培养液冲洗脐静脉1次, 收集冲洗液, 同消化液一起离心 (1 200 r/min, 8 min) 。弃上清, 加入F12完全培养液 (含20%FBS、20μg/m L ECGS、2 mmol/L-谷氨酰胺) 4 m L, 反复吹打重悬细胞, 移入塑料细胞培养瓶, 37℃、5%CO2条件下静置培养。隔日换液, 直至细胞融合度达80%~90%即可传代。

1.3 人脐静脉内皮细胞外基质的构建

抛光钛片和碱活化的钛片经高温高压灭菌后置于24孔板中, 每孔中加入1 m L密度为1×106cells/m L的HUVECs细胞悬液, 该接种密度基本可以保证HUVECs在钛片形成融合的单层。37℃、5%CO2条件下继续静置培养7 d后, 加入含20 mmol氨水和0.5%Triton X—100的PBS缓冲液, 脱去细胞成分, 暴露细胞外基质。20 min后用PBS冲洗5次, 每次3 min。

1.4 光滑和碱活化钛片上的HUVECs细胞外基质改性的表征

脱去细胞外基质的样品在3%的戊二醛溶液常温固定30 min, PBS清洗后经过梯度酒精脱水 (50%、70%、80%、90%、100%两次, 每次15 min) , 醋酸异戊酯脱醇 (不少于1 h) , 临界点干燥后喷金, 扫描电镜 (SEM, QUANTA 200, FTI, Holland) 观察。测定细胞外基质改性前后钛表面的水接触角来反映材料的亲疏水性。碱腐蚀前后的钛片表面通过漫反射红外光谱 (DR-FTIR, IR 550, Nicolet, Madison, USA) 表征钛表面的基团变化情况。千万分之一天平 (Sartorius ME5, German, Sartorius AG) 称量细胞外基质改性前后样品的质量。

1.5 HUVECs细胞外基质改性的光滑和碱活化钛片上的细胞相容性

无菌的碱活化钛片及HUVECs细胞外基质改性后的钛片置于24孔板中, 加入300μL的F12完全培养液37℃孵育1 h, 随后吸去孵育的培养液, 每孔中分别加入1 m L密度为5×104cells/m L的HU-VECs (2×104cells/m L的HUASMCs) 细胞悬液, 37℃、5%CO2条件下继续静置培养, 贴壁8 h后将样品转移至新的培养板, 加入1 m L新F12完全培养液。分别培养1 d, 3 d后各取出三个样品, PBS清洗后用2.5%戊二醛固定。细胞骨架蛋白F-actin免疫荧光染色的方法来定位和观察细胞, 荧光显微镜下观察。

将各组无菌的样品置于24孔板中, 加入400μL的F12完全培养液37℃孵育1 h, 随后吸去孵育的培养液, 每孔中分别加入1 m L密度为5×104cells/m L的HUVECs细胞悬液 (2×104cells/m L的HUASMCs) , 37℃、5%CO2条件下继续静置培养, 分别在培养1 d和3 d后弃去旧的培养液, 然后每孔加入CCK-8反应液400μL (含有15%FBS和10%CCK-8试剂的F12培养基) , 37℃孵育4 h, 轻轻摇匀后吸出200μL反应液于新的96孔板中, 450 nm测光密度值 (OD值) , OD值大小可以反映样品上黏附的HUVECs (HUASMCs) 的数目。

1.6 HUVECs细胞外基质改性的光滑和碱活化钛片上的血液相容性

富血小板血浆 (PRP) 的制备:志愿者的新鲜静脉全血, 加入含3.8wt%枸掾酸钠 (Na3C6H5O7·2H2O) 的抗凝剂, 全血与抗凝剂的体积比为9∶1, 充分混匀后离心 (1 500 r/min, 15 min) , 取上层淡黄色的液体即为PRP。

血小板在材料上的黏附和SEM检测:将光滑钛片 (Ti) 和碱活化后的多孔钛片 (Ti-OH) , 以及HU-VECs细胞外基质改性后的钛片 (Ti-ECM和Ti-OH-ECM) 分别置于干净24孔聚苯乙烯的细胞培养板中, 每孔加入200μL PRP覆盖实验样品, 37℃, 5%CO2条件下孵育1 h后吸出PRP, 加入PBS后轻轻震荡, 3次洗涤以排除非特异性吸附的血小板。黏附血小板的样品用3%的戊二醛溶液室温固定30 min, PBS洗涤, 然后常规脱水脱醇处理, 临界点干燥后喷金, SEM观察。

2 结果与讨论

2.1 光滑和碱活化钛片上的HUVECs细胞外基质改性的SEM形态学观察

高密度接种的HUVECs在抛光钛片及碱活化钛片上连续培养7 d后, 加入脱细胞液后, 样品表面已无可见细胞成分, 细胞外基质得以暴露。光滑钛片上细胞外基质与基底的结合力较弱, 局部区域出现了脱落的现象 (图1B) , 高放大倍数下残留的细胞外基质呈现出颗粒状的分布, 无明显纤维结构。但在碱活化的粗糙表面, 细胞外基质呈现均匀的分布, 除了颗粒状物质存在外, 还有均匀的纤维网络状结构, 与基底的多孔结构有着明显区别, 高倍镜下细胞外基质的纤维清晰可辨 (图1D) 。

2.2 光滑和碱活化钛片上的HUVECs细胞外基质改性的接触角测量和DR-FTIR检测

HUVECs在光滑和多孔钛片上分泌和沉积细胞基质后, 引起钛片表面亲水性的明显改变 (图2) 。在抛光的钛片上, 细胞外基质改性后接触角均值有所升高, 但这种差异并不具有统计学意义。细胞外基质改性后的光滑钛片上不同部位的接触角差异较大, 最高为84.5°, 而最低仅为22.5°, 这种接触角的不均匀可以进一步证明细胞外基质在光滑钛片上部分脱落的情况。相反, 细胞外基质改性后的碱活化钛片的接触角有显著的增高, 这种增高有统计学意义 (P<0.01) 。

HUVECs细胞外基质改性前后的抛光钛片和碱活化钛片的DR-FTIR图谱表明, 由于细胞外基质在抛光钛片上的脱落, 使其DR-FTIR图片上并没有出现明显的新的吸收峰, 而2 365 cm-1处的共同的吸收峰则可能是空气中CO2吸收峰。钛表面暴露在空气中能迅速形成一层氧化物薄膜, 表面含有少量的羟基[7], 除了碱活化所产生的3 405 cm-1处的-OH吸收峰之外, 还有许多新的吸收峰出现, 包括2 960 cm-1和2 916 cm-1处的C-H吸收峰, 1 650cm-1处的C=O吸收峰, 以及2 916 cm-1处的N-H吸收峰, 进一步证明了细胞外基质在碱活化表面的成功构建 (图3) 。

2.3 光滑和碱活化钛片上的HUVECs细胞外基质改性的细胞外基质分泌量

如图4所示, 细胞外基质在光滑钛和碱活化钛上构建后, 后者的细胞外基质质量明显高于前者, 光滑钛上细胞外基质的质量不均一, 最高可达0.06 mg, 最低只有0.02 mg, 进一步补充说明细胞外基质在光滑钛表面有部分脱落现象, 而碱活化钛片构建细胞外基质更具有质量稳定性。一方面, 钛的粗糙度能够影响蛋白质在钛表面的吸附, 随着粗糙度增大, 表面积增加, 蛋白质的吸附总量也是增加的[8—10], 另一方面, 钛表面的羟基越多, 与蛋白的反应活性越高[11]。

2.4 光滑和碱活化钛片上的HUVECs细胞外基质改性的细胞黏附及增殖

体外接种HUVECs的CCK测定结果表明 (图5) , 不论是培养1 d或者3 d, 碱活化的钛片上HU-VECs黏附数量的平均值与光滑钛片上相比较有一定程度的降低, 但两者间没有统计学差异。不论是在抛光的钛片还是碱活化的钛片上构建细胞外基质后, HUVECs黏附的数量均有明显的增加, 且这种增加有统计学差异。碱活化后使得钛片粗糙度增加, 而粗糙表面往往会对内皮细胞的生长起到抑制作用[12,13], 细胞外基质改性后的碱活化钛片上细胞黏附的平均数量比同样经细胞外基质改性后的光滑钛片上的数量相比有一定的提高, 但没有显著差异。

HUASMCs在各组样品上黏附1 d、3 d的荧光显微结果和细胞毒性检测结果 (图5) 显示, 各组样品均促进平滑肌细胞的黏附与增殖, 细胞外基质改性后的Ti和Ti-OH的表面更有利于平滑肌细胞的生长, 且碱活化组钛经细胞外基质改性后表面的平滑肌细胞增长与改性前相比有统计学意义 (P<0.05) , 研究表明平滑肌细胞在血管内的正常生长对控制内皮细胞的形态和表型有重要作用。

2.5 光滑和碱活化钛片上的HUVECs细胞外基质改性的血小板黏附及激活

体外血小板黏附实验结果表明 (图7) , 在抛光的钛片上有大量的血小板黏附, 血小板团聚并伸出大量的伪足, 说明血小板激活程度很高;由HUVECs构建细胞外基质后, 血小板黏附的数量有一定程度上的减少, 但血小板的团聚和激活程度 (形态上) 与光滑钛片基本相似。碱活化处理可以明显减少血小板在钛片上的黏附[5,14], 血小板的团聚程度没有明显改变, 但血小板伸出的伪足有明显减少;在碱活化钛片上进一步沉积细胞外基质, 使得血小板黏附数量进一步降低, 血小板团聚程度降低, 大部分血小板呈圆形, 只有少数伸出伪足[1]。

3 结论

细胞外基质代谢 篇7

关键词：小窝蛋白1,TGF-β,细胞外基质,信号传导,肺纤维化

急性肺损伤 (acute lung injury, ALI) /急性呼吸窘迫综合征 (acute respiratory distress syndrome, ARDS) 是ICU常见的且死亡率高的一种急症状态, 近年来随着机械通气、表面活性物质替代疗法等新技术应用, 其存活率已显著提高。然而, 长时间吸入高浓度氧, 幸存者易发生肺部氧化应激损伤。目前, 高氧肺损伤及肺纤维化已成为ICU最为棘手的问题之一和慢性肺疾病的最常见形式, 但目前高氧肺损伤及肺纤维化的确切机制尚未完全阐明。已知细胞外基质 (extracellular matrix, ECM) 的重塑参与了高氧肺损伤的整个病理过程, 若ECM重塑正常, 则损伤完全修复, 肺结构正常;若ECM重塑紊乱, 将导致肺纤维化。因此, ECM重建是关系高氧肺损伤结局的关键因素。

目前已知在Ⅰ型肺泡上皮细胞、内皮细胞及成纤维细胞等细胞质膜上存在约50~100 nm大小的囊性凹陷结构——小窝 (caveolae) , 而小窝蛋白 (caveolin, cav) 1是小窝胞浆面包被的一种21~24 k D的膜蛋白, 是许多信号分子如TGF-β活性状态的重要调节者。TGF-β是一种多效生长因子, 可以调控细胞生长、分化、程序性死亡及ECM产生。研究发现, cav1可以通过调节TGF-β受体表达从而调控TGF-β信号转导[1,2]。在变异原诱发的急性肺损伤小鼠模型中, cav1对肺间质纤维化、肺泡支气管化及气道重塑有重要作用, 并且发现TGF-β信号增强, 胶原分泌增加[3,4,5]。有研究报道, cav1基因敲除小鼠出现肺泡腔狭窄、肺泡壁增厚及细胞过多现象[6]。故推测cav1可以通过介导TGF-β信号转导以此调控ALI/ARDS时的ECM重塑水平。本研究应用cav1-/-小鼠模型探讨Cav1对ECM重塑作用及其具体信号机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型、主要试剂及分组

本实验分为两组: (1) 实验组:实验动物为1周龄C57BL/6J cav1-/-小鼠, 购自美国Jackson实验室; (2) 对照组:实验动物为1周龄野生型C57BL/6J小鼠, 购自南京医科大学实验动物中心。每组均为15只小鼠。主要试剂:Sircol胶原测定盒购自北京友谊中联生物科技有限公司。RNeasy RNA试剂盒购自美国QIAGEN试剂公司。细胞裂解液购自美国Sigma试剂公司 (含1 m M DTT、1×蛋白酶抑制剂混合物、5 m M EDTA) 。

1.2 肺机械性测量

动态顺应性及弹性回缩力参数通过强迫振荡法flexi Vent呼吸功能研究系统获得。小鼠按体重予以氯胺酮 (100 mg/kg) 及甲苯噻嗪 (10 mg/kg) 静脉麻醉后插气管套管后连接flexi Vent仪器通畅, 参数设定如下:PEEP设定为2 cm H2O, 呼吸频率为150次/min, 潮气量为7.5 m L/kg。气道阻力、顺应性及弹性回缩力测定15次, 应用单室腔模式进行数据分析。数据测定后处死小鼠, 支气管肺泡灌洗后取肺组织标本, 以进行RNA及蛋白提取。

1.3 组织学检查及胶原沉着测定

肺组织标本固定于4%多聚甲醛, 包埋切片后予以天狼星红染色, 在光镜下观察组织标本, 利用Image Pro图像分析仪测定肺实质及气道周围的胶原含量。

取肺组织冰冻后应用Sircol胶原测定试剂盒测定胶原沉着水平。50 mg肺组织均匀搅碎于500μL的提取液并4℃搅拌过夜, 组织匀浆在4℃高速离心 (15 000 g) 1 h, 按照试剂盒说明操作, 用分光光度仪在540 nm波长测定光密度, 对比标准胶原含量曲线图得出胶原含量。

1.4 肺血管渗出测定

对小鼠行支气管灌洗术后取灌洗液, 在20℃时1000 g低速离心10 min后取上清液储存于-80℃环境, 测定肺组织渗出总蛋白及白蛋白含量。总蛋白含量采用Bradford法测定, 白蛋白测定应用小鼠白蛋白ELISA试剂盒方法测定。

应用伊文思蓝注射后计算伊文思蓝含量来评价肺血管通透性。取3月龄小鼠麻醉后按20 mg/kg剂量尾静脉注射伊文思蓝, 注射1 h后处死小鼠, 开胸后左心室灌注5 m L PBS。取出肺组织, 搅碎成组织匀浆固定于10%甲酰胺60℃孵育12~18 h, 5000 g离心30 min后收集上清液, 测定620 nm和720 nm吸收率。伊文思蓝含量 (每克肺组织中伊文思蓝毫克含量) 按下列公式计算:A620- (1.426×A720+0.030) , 结果对比伊文思蓝标准曲线得出伊文思蓝含量。

1.5 支气管灌洗液 (BAL) 中细胞含量及细胞因子水平

两组BAL在20℃1000 g离心10 min后收集细胞沉积, 在100μL的PBS中打匀, 使用标准血细胞计数板来计算总细胞数。分别应用小鼠Th1/Th2细胞因子ELISA试剂盒测定BAL中细胞因子IL-2、TNF-α及IFN-γ。

1.6 弹性纤维沉着测定

利用免疫组化方法检测弹性纤维, 切片用5%山羊血清封闭1 h, 用弹力蛋白一抗4℃孵育过夜, 在PBS及0.05%Tween-20清洗3次, 再与Alexa Fluor 568标记的二抗孵育过夜, 细胞核用DAPI复染。切片包被后在荧光显微镜下观测。

1.7 RNA及蛋白表达分析

应用RNeasy RNA试剂盒从肺组织标本中提取RNA, 按试剂盒说明操作。RNA标本在20℃与0.05 U/m L DNaseⅠ孵育15 min, 应用定量RT-PCR法测定Ⅰ型胶原α2链 (col1α2) 及弹性蛋白原 (eln) m RNA水平。

肺冰冻标本用冰PBS液冲洗3次后, 组织匀浆加入0.5 m L细胞裂解液直接煮沸5 min, 冰上冷却后, 12 000 rpm离心15 min, 取上清液, 按照Western blot试剂盒的说明操作, 分别加入小鼠anti-Smad2抗体及小鼠anti-ERK1/2抗体后, 4℃摇摆过夜。漂洗3次后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠Ig G多克隆抗体避光室温孵育2 h, 按照发光试剂盒的说明操作, X线曝光后应用NIH Image凝胶图像处理系统分析净光密度值。

1.8 统计学处理

采用SPSS 11.5软件对所得数据进行统计分析, 计量资料用 (±s) 表示, 组间比较用t检验或ANOVA分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组肺机械性变化测定结果的比较

实验显示, 实验组小鼠的肺顺应性较对照组明显降低, 与此相反实验组小鼠的肺弹性回缩力及气道阻力较对照组均明显增加 (P<0.05) 。结果表明, 实验组小鼠肺的僵硬度明显增加, 见表1。

*与对照组比较, P<0.05

2.2 肺组织胶原纤维沉着检测

实验组小鼠的气道周围及肺实质胶原纤维沉着较对照组均明显增加 (P<0.05) , 见图1。并且在应用Sircol法对组织匀浆测定胶原纤维含量结果显示, 实验组的胶原纤维含量为 (41.2±5.4) μg/mg, 而对照组小鼠为 (27.7±3.1) μg/mg, 表明实验组较对照组明显增加 (P<0.05) 。说明实验组小鼠肺的胶原纤维沉着明显增加, 也是肺僵硬度增加的病因之一。

2.3 肺血管蛋白渗出及伊文思蓝含量测定

肺血管渗出过多也是肺僵硬度增加的病因之一, 故检测BAL中蛋白渗出水平及肺实质伊文思蓝积聚可以反映肺血管渗出状况。实验组小鼠BAL中总蛋白及白蛋白水平较对照组均明显增加 (P<0.05) , 且静脉注射伊文思蓝在肺组织含量也较对照组明显增加 (P<0.05) , 见图2。

注:A表示实验组, B表示对照组 (×400) , 箭头所指为胶原纤维染色

注:A图中浅色柱形图代表总蛋白含量, 深色柱形图代表白蛋白含量, B图肺组织中伊文思蓝含量为注射后1 h进行检测

2.4 两组BAL中细胞含量及细胞因子水平测定结果的比较

在对BAL中细胞含量检测显示两组无明显差异 (P>0.05) , 并且两组中细胞因子如IL-2、TNF-α及IFN-γ也无明显差异 (P>0.05) , 见表2。结果表明, cav1-/-小鼠与野生型小鼠肺组织无明显炎症差别。

2.5 col1α2及eln的m RNA水平与弹性纤维沉着测定

实验组小鼠肺组织中I型胶原α2链 (col1α2) 及弹性蛋白原 (eln) m RNA水平均明显高于对照组标本水平 (P<0.05) , 见图3。荧光显微镜下观测显示, 实验组的肺实质及肺泡壁的弹性纤维分布较对照组均明显增加。结果表明实验组小鼠的肺组织弹性纤维沉着明显增加。

2.6 TGF-β信号转导系统表达水平测定

已知cav1-/-小鼠缺乏cav1会上调TGF-β信号转导, 而TGF-β是ECM基因转录活性主要的调节因子。TGF-β下游的信号通路主要为Smad2和ERK1/2, 故本研究应用Western blot法检测肺组织中Smad2和ERK1/2水平。结果显示, 实验组中Smad2和ERK1/2水平较对照组均明显升高 (P<0.05) , 见图4。结果说明TGF-β信号转导系统Smad2和ERK1/2在cav1-/-小鼠上调。

注:浅色条柱为col1α2m RNA, 深色条柱为eln m RNA

注:浅色条柱为Smad2含量, 深色条柱为ERK1/2含量

3 讨论

长期以来, 有关小窝蛋白1 (cav1) 的研究主要集中在胆固醇代谢、肿瘤转移、膜物质转运、信号转导等方面, 而在急性肺损伤 (acutelung injury, ALI) /急性呼吸窘迫综合征 (acute respiratory distress syndrome, ARDS) 所致肺纤维发病机制的研究较为少见。研究发现, cav1广泛存在于肺泡Ⅰ型上皮细胞膜, 对于形成囊性凹陷结构——小窝 (caveolae) 至关重要, 而小窝内含有多种信号受体, 其中TGF-β信号通路对于ECM沉着、肺内皮细胞分化及相关病理状态至关重要[3]。为了解cav1对肺的生理功能及结构影响, 本研究探讨了肺功能、TGF-β信号通路及ECM重塑间关系。已有研究显示, cav1缺乏或降低可以上调TGF-β水平, 而体外培养肺成纤维细胞时予以外源性TGF-β则可以上调数个ECM基因转录[3,7,8,10]。cav1-/-小鼠的肺功能出现有害改变, 因而了解TGF-β信号系统改变是否也会造成ECM重塑成了需要解决的问题。Ⅰ型胶原纤维和弹性纤维是ECM重要成员, 也是决定肺顺应性重要因素[11], 因而本研究选取I型胶原纤维和弹性纤维作为研究ECM重塑对象。研究中发现, cav1-/-小鼠相比与野生型小鼠, 其肺顺应性下降, 而肺弹性回缩力及气道阻力增加, 表明肺的僵硬度增加, 这与肺的ECM增加及肺血管渗出增加相关[12,13]。实验中分别对肺组织的Ⅰ型胶原纤维和弹性纤维含量检测, 显示cav1-/-小鼠产生ECM是明显升高, 这一点不论从组织切片还是转录水平都得到了证实。

同时研究中显示, cav1-/-小鼠的支气管灌洗液蛋白渗出也明显增加, 并且在应用伊文思蓝静脉注射后渗透至肺组织含量明显增加也证实cav1-/-小鼠的肺血管通透性增加。在毛细血管内皮细胞中, 30%细胞表面存在小窝, 因而cav1缺陷会增加肺血管通透性, 促进渗出[14]。已知在正常人的血管内皮细胞内TGF-β可以上调NO合成酶的活性, 而NO合成酶产生的NO会增加血管通透性, 故TGF-β被认为是直接导致肺水肿的关键调节物[15,16]。而cav1可以下调TGF-β信号水平, 因而可以推测cav1-/-小鼠肺组织中血管渗出增加是因TGF-β过度激活而致使NO合酶活性过强所致。

本研究从以上两方面证实cav1可以调控肺组织ECM重塑水平, 进而影响肺的顺应性变化。已知cav1可以调节TGF-β表达水平, 但为进一步了解cav1是否通过TGF-β信号系统来调控ECM重塑, 研究选取了TGF-β的两个重要下游信号因子Smad2和ERK1/2作为研究对象。有研究表明, 各种的TGF-β下游信号途径如Smads、ERK1/2及p38 MAPK等对调控弹性纤维m RNA及转录后稳定有重要作用, 比如Smad3缺乏则会导致肺弹性纤维表达抑制进而出现肺气肿[17,18]。研究结果显示, cav1-/-小鼠的Smad2和ERK1/2表达明显增加, 证实cav1介导TGF-β信号系统调控肺ECM重塑。

细胞外基质代谢 篇8

1 Materials and methods

1.1 Materials

A total of 101 specimens of prostate cancer tissues were kindly provided by NO.1 People′s Hospital of Guangzhou and the Biological Research Center in the Fourth Military Medical University.Patients from whom the specimens came from had an average age of73.5.All clinical and pathology diagnosis of the patients were kept on file.Of the 101 cases,58 had the tumors confined inside the cyst,43 penetrated the cyst.53 had Gleason score<7,and the remaining≥7.Divided in TNM phases,5 were in phaseⅠ,30 in phaseⅡa,38 in phaseⅡb,and 28 in phaseⅢ.Judging by pathology grading,2 were tumorous hyperplasia,12 highly differentiated,48 medium differentiated and 45 slightly differentiated.

1.2 Methods

1.2.1 Reagents

HAb18G/CD147 monoclonal antibodies were developed by the Biological Research Center in the Fourth Military Medical University.Ultrasensitive TM SP kit were manufactured by Fuzhou Maixin Biotechnology Co.Ltd.

1.2.2 Methods

CD147 was detected using supersensitive immunolohistochemical staining.CD147-expressing liver cancer specimen was used as positive control.Antibodies raised by replacing first antibody with PBS was used as negative control.

1.3 Benchmark for SPI analysis

Positively stained CD147,mainly located in plasmic membrane and cytoplasm,exhibited yellowish or brown color.Under high magnification field,each slide of specimen is examined individually by three pathology doctors and graded according to varying staining states in plasmic membrane and the cytoplasm.Unstained,weakly stained,moderately stained and deeply stained specimens were given 0,1,2 and3 points,respectively,designated as score A.Ratios of stained cell number to unstained cell number,when≤5%,between 6%～25%,between 26%～50%or>51%received 0,1,2 or 3 points,respectively,designated as score B.Final score is the product of A multiplied by B.Specimens that had final scores between0 to 1,between 2 to 3,or≥4 were termed negative,weak positive or strong positive,respectively.

1.4 statistical analysis

SPSS12.0 software package were used to process data.Results were analyzed using rank-sum test(obvious difference when P<0.05)

2 Results

2.1 Expression of CD147 in tissues

CD147,mainly expressed in cytoplasm and cytoplasmic membrane,was stained yellow or brown.CD147 expression in the 15 embryonic tissues was negative(Figure 1).Two of the 36 normal prostate tissues had weak positive expression(2/36;5.6%).21 of the 90 prostatic hyperplasia showed positive expression(21/90;23.3%),among them 1 was strong positive(1/90;1.1%).51 of the 101 prostate cancer tissues exhibited positive expression(68/101;67.3%),among them 19 were strong positive(25/101;24.8%)(Figure3).Rank-sum test of all possible combinations in two of the four sets showed obvious difference(P<0.05)in all but the combination between embryonic and normal prostate tissues.

(Left to right:embryonic;normal;hyperplasia;carcinoma)

2.2 CD147 expression in prostate cancer tissues

51 out of 101 specimens showed positive expression(68/101;67.3%).More significantly,19 of them were strong positive specimens(25/101;24.8%).Strong relationship between CD147 expression and cyst invasion,TNM phase,pathology grading were found,with obvious differences observed(P<0.05).However,to date expression of CD147 had not been found to be correlated to Gleason score(Table 1).

Note:dif for differentiation

3 Discussion

Prostate cancer had extremely high incidence in European and Latin American countries.In aged people its incidence ranked second,right behind lung cancer.In recently years with the changes in life style,diet as well as aging population,prostate cancer has only been fiercer than ever.Franks et al found in biopsy that prostate cancer was detected in up to 38%of the deaths of patients aged more than 50[5].However,clinically determined prostate cancer cases were merely 8%among males,while only 3%of male deaths were attributed to prostate cancer.In other words,30%of prostate cancer-carrying patients were not detected clinically.Around 24%of patients when verified as having prostate cancer have already complicated with osseous metastasis[6～8].XIAO XUREN et al[9]analyzed 317 cases of prostate cancer patients and found that prognosis of those patients varies greatly due to different clinical phases and pathology grading.Five-year-survival rate for T1-T4patients were 100%,84.1%,77.1%and 43.9%,respectively.10-year-survival rate forⅠ-Ⅲpatients were 77.4%75.3%and 26.5%,respectively.Thus,prostate cancer was a slow,recalcitrant tumor that could be effectively suppressed by incretion treatment.The task thus became extremely important that we were capable o making accurate prognosis to guide clinical treatment.Currently,commonly used prostate cancer antigen(PSA)was inadequate in specificity.The level of PSA could rise in response to benign physiological changes(such as prostate hyperplasia or prostatitis)or even clinical practices(like urethral catheterization,digital rectal examination)[10,11].Moreover,PSA only reflected the size of the tumor.It was thus highly desirable that a reagent with high specificity and sensitivity,capable of showing metastasis and predicting prognosis o prostate cancer be made.

CD147 was a new star in cancer research lately.Its structural features was identified with highly glycosylated mono-transmembrane glycoprotein in the IgSF family.It was located in endothelial cells,and comprised of two IgSF domains[12].CD147 was a newly disclosed cell surface adhesion molecule,also termedExtracellularMatrixMetalloproteinases Inducer(EMMPRIN).It stimulated metalloproteinases(MMP)production in matrix cells around tumors.MMPs degraded basal membrane and extracellular matrix and was highly associated with metastasis[13,14].CD147 expressed by tumor cells interacted with neighboring cells and stimulated MMP release that degraded matrixes and hydrolyzed adhesion molecules on tumor cell surfaces,further aggravating metastasis[15,16].CD147 also affected VEGF expression and facilitated angiogenesis on both RNA and protein level[17].In a word,CD147 played vital role in metastasis of prostate cancer.In the three step mechanism proposed by Liotta,tumor proliferation starts from adhesion,then degradation and finally metastasis[18].Surpassingly,CD147 was found to be involved in all three steps.To date it had been proved that CD147 was highly expressed in breast cancer,liver cancer,laryngeal squamous cell carcinoma and many other malignant tumors.Thus CD147 was an important indicator of metastasis and tumor progression[19～24].However,expression pattern of CD147 in prostate cancer tissues has not been reported thus far.

Our results showed that expression of CD147 in the four sets had obvious difference using statistical analysis.15 embryonic prostate tissue showed no CD147 expression(0%).In 36 normal prostate tissues positive expression is only 5.6%.In 90 prostate hyperplasia cases positive expression is 23.3%.However,in 101 prostate cancer tissues,positive expression was up to 67.3%,with strong positive being 24.8%.This strongly demonstrates that CD147 expression was up regulated in prostate cancer tissues(Fig.4).There was no statistical difference between expression in embryonic and normal prostate cancer tissues.In clinical analysis,expression of CD147 was not found t to correlate with Gleason score.However,CD147 level and strong positive expression rate was elevated when cyst was penetrated by tumor cells.Similar pattern was found with the increase in TMN phase,WHO grade.All these demonstrated that CD 147 expression was linearly correlated with the level of severity and metastasis of prostate cancer.Therefore,CD147 had the potential to become an important laboratorial marker for early state diagnosis of prostate cancer.At the same time,prostate cancer patients also benefited from more accurate prognosis predicted by CD147 examination.This could serve as valuable guide for clinical doctors aiming to crack down prostate cancer With the pattern unveiled it now became interesting to investigate how CD147 inhibitor may at least hal prostate cancer progression in patients.

摘要：目的研究细胞外基质金属蛋白酶诱导分子(CD147)在前列腺癌组织中的表达情况,探讨其临床意义。方法应用免疫组织化学S-P法检测101例前列腺癌,90例前列腺增生组织,36例正常前列腺组织和15例胚胎前列腺组织中CD147的表达情况,并对CD147与前列腺癌临床病理的关系进行统计学分析。结果胚胎组织,正常前列腺组织,前列腺增生及前列腺癌CD147阳性率分别为:0%,5.6%,23.3%,67.3%。前列腺癌CD147阳性率最高,与其他3组在统计学上存在差异(P<0.001)。CD147蛋白的表达与肿瘤的TNM分期、WHO分级和包膜侵犯呈正相关。结论CD147检测有助于提高前列腺癌的早期诊断率,希望成为反映肿瘤恶性程度及预后判断的标记物。

细胞外基质代谢 篇9

1材料

SD雄性大鼠60只,体重160 ~ 180 g,鼠龄2 ~ 3月,购自首都医科大学实验动物科学部[动物的合格证号: SCXK( 京) 2006-0009]。加味消渴康由生黄芪10 g、山茱萸30 g、生薏苡仁30 g、水蛭6 g、葛根30 g、丹参10 g、决明子10 g组成,所需药材购自北京祥威药业公司; 氯沙坦钾片( 购自杭州默沙东制药有限公司,生产批号: 100438) ,链脲佐菌素( 购自美国Sigma公司) ,大鼠TGFβ-1ELISA试剂盒( 购自上海蓝基生物科技有限公司) ,大鼠Smad-4 ELISA试剂盒( 购自上海蓝基生物科技有限公司) ,大鼠MMP-9 ELISA试剂盒( 购自上海蓝基生物科技有限公司) ; 大鼠TIMP-1 ELISA试剂盒( 上海蓝基生物科技有限公司) 。

2方法

2. 1动物模型制备及分组

本实验采用单侧肾切除加腹腔注射链脲佐菌素的方法制作DN大鼠模型: 将造模大鼠适应性饲养1周后,行右侧肾脏切除术。术后2周,禁食12小时,按50 mg /kg的剂量进行单次腹腔内注射链脲佐菌素。72小时后,尾静脉采血,用稳步血糖仪测定大鼠血糖,用尿糖试纸测大鼠随意尿糖,血糖浓度≥16. 7 mmol/L,尿糖定性> + + + ,确定DN造模成功［5］。将造模成功的50只大鼠随机分为模型组、氯沙坦组( 5. 2 mg /kg·d) 、加味消渴康小剂量组( 13. 125 g /kg · d) 、加味消渴康中剂量组( 26. 25 g/kg·d) 、加味消渴康大剂量组( 52. 5 g/kg·d) 灌胃,此外,另取10只大鼠作为正常对照组,每日1次,连续灌胃12周,正常组及模型组每日灌服2 ml蒸馏水。

2. 2标本采集和观察指标检测

各组大鼠于第12周末进行肝脏取材,每只取下150 ~ 200 mg肝组织,加入生理盐水,肝组织重量与生理盐水量比例为1∶ 7。在冰浴中制备匀浆后4℃ 3000 r离心20分钟,取上清液0. 1 ml,放入4℃ 冰箱备用。取出大鼠TGF-β1,Smad-4,MMP-9和TIMP-1 Elisa试剂盒,于室温( 25 ~ 30℃ ) 放置30分钟。取出酶标板,按照标准品的次序分别加入50 μl的标准品溶液于空白微孔中。空白微孔中加入50 μl的样品,空白对照加入50 μl的蒸馏水。在各孔中加入100 μl的酶标记溶液( 不含空白对照孔) 。将酶标板用封口胶密封后,37℃ 孵育反映1小时( 在孵育箱中保持稳定的温度与湿度) 。充分清洗酶标板5次, 保持各孔有充足的水压( 浓缩洗涤液以1∶ 100的比例与蒸馏水稀释) 。酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干。 各孔加入显色剂A、B各50 μl后37℃避光反映10 ~ 15分钟。各孔加入50 μl终止液,终止反应。

2. 3统计学处理

采用SPSS 13. 0进行统计处理,各组计量数据均以均数 ± 标准差( ± s) 表示,采用单因素方差分析法考查显著性,组间两两比较采用LSD检验。以P < 0. 05作为显著性差异,P < 0. 01作为极显著性差异。

3实验结果

各组大鼠肝组织TGF-β1与Smad-4表达的测定结果见表1。

与正常组相比,各组大鼠TGF-β1,Smad-4和TIMP-1的含量明显升高,差异具有统计学意义( P < 0. 01或P < 0. 05) 。而MMP-9的含量明显降低,差异具有统计学意义( P < 0. 01) 。与模型组相比,各治疗组TGF-β1和Smad-4的含量明显降低,差异具有统计学意义( P < 0. 01或P < 0. 05) 。而TIMP-1的表达具有降低的趋势,MMP-9的表达则具有升高的趋势,本实验并未发现两者具有统计学差异。

4讨论

“肝肾同源”是中医的经典理论之一,它最早起源于《黄帝内经》。《素问·阴阳应象大论》云: “北方生寒,寒生水,水生咸,咸生肾,肾生骨髓,髓生肝。”本实验在基于该理论的前提下对DN大鼠肝脏进行了相关的研究。在此,笔者主要从以下四点进行分析。

4. 1肝与肾在生理上关系密切

肝属东方甲乙木,主疏泄,调畅气机,调节气血津液的代谢,疏泄情志,肝藏血,以生发为特性。肾属北方壬癸水,主闭藏,主水,通过蒸腾气化调节人体水液的代谢,肾藏精,主生长发育和生殖。肝肾在生理方面密切相关,首先,在五行之中,水生木, 木为水之子,故肝肾为子母关系,其气相通,肝木得到肾水的滋养才能得以维持正常的生理功能。其次,肝藏血,肾藏精,而精血同源,故肝中之血与肾中之精可以相互化生,肝血可以下达于肾以滋养肾精,使肾精化而有源; 同样肝血也有赖于肾精的滋生。与此同时,肾藏精,主骨生髓,骨中精髓与血液也可相互化生［6］,此外,肝与肾在经脉上的循行上密切相关,足厥阴肝经与足少阴肾经都循行于身体内侧,并交会于“三阴交”,同时也通过奇经八脉而相互关联,经气互通。若肝肾的经气不利,势必会导致肝肾的相关功能紊乱。因此,肝肾在生理上相互依存,关系密切。

注: 与正常组相比aP < 0. 01,bP < 0. 05与模型组相比cP < 0. 01,dP < 0. 05.

4. 2肝与肾在病理上相互影响

肝与肾不仅在生理上关系密切,通过实验研究发现,其在病理上也相互影响。本实验以糖尿病肾病大鼠为模型,试图探讨在大鼠肾脏发生损伤时的肝损伤情况。实验结果显示,模型组大鼠肝脏中的TGF-β1,Smad-4和TIMP-1的表达与正常组相比具有显著性的升高,MMP-9的表达则具有显著性的降低。此结果说明,从该指标的层面上来看,DN大鼠的确存在肝损伤。而在针对DN大鼠进行治疗后,肝中TGF-β1与Smad-4的表达明显下调,且TIMP-1和MMP-9也不同程度的降低和升高的趋势。这说明在针对DN大鼠肾脏治疗的同时,肝损伤也得到了一定的修复,即两脏“一荣俱荣,一损俱损”,这与中医的“肝肾同源”理论相符。中医理论认为,若肾水亏竭不能涵养肝木; 或肝阳过亢,劫耗肾阴; 或肾精亏耗,肝血不足,最终都可以导致肝肾双方阴血的不足,会因为“母病及子”或“子盗母气”而引发肝肾阴虚,肝阳上亢, 肾精亏虚等病理表现。基于此,笔者推断TGF-β1 / Smad通路及TIMP-1 / MMP-9对ECM代谢调节的紊乱可能也是上述中医理论在微观层面的体现之一,同时,该实验也说明了肝与肾在病理上的可以相互影响。

4. 3加味消渴康对DN大鼠肝脏具有保护作用

本实验通过选取糖尿病肾病大鼠肝脏内TGFβ1 ,Smad-4 ,MMP-9和TIMP-1进行研究,治疗方药采用了耿建国教授治疗糖尿病肾病的验方加味消渴康。该方由黄芪、山茱萸、生薏苡仁、 葛根、决明子、丹参、水蛭组成,全方具有健脾益肾,祛瘀化浊的功效［7］。治疗12周后,各治疗组与模型组相比,TGF-β1,Smad-4和TIMP-1水平均有不同程度降低,MMP-9有一定的升高趋势, 且TGF-β1,MMP-9,TIMP-1的变化趋势与其在肾脏中的水平变化趋势一致［8-9］。说明加味消渴康针对DN大鼠肝中TGFβ1和Smad-4水平升高的结果,起到了正向调节作用,其通过降低肝中TGF-β1和Smad-4的表达,起到保护肝损伤的作用。由此可知,加味消渴康在针对DN大鼠肾脏治疗的同时,肝损伤也得到了一定的修复,此结果也为中医的“肝肾同源”理论相符提供了一定的实验依据。

5展望

研究发现,在糖尿病肾病大鼠中,肝脏也存在损伤,且针对大鼠的糖尿病肾病进行治疗后,肝损伤有所减轻,这是“肝肾同源”理论在病理和治疗上的具体体现。而中医对糖尿病肾病的治法颇多,因此在下一步的研究中,可以根据不同的辨证要点, 选用不同种类治法的方剂进行探讨,从而可以更有效的指导临床实践。

“肝肾同源”的内容非常广泛,笔者目前仅在肾损伤的同时探索肝脏的损伤情况。今后可以通过建立肝损伤的模型来探讨肾脏的相关状态,或者根据“肾主骨,生髓,通于脑”的理论来研究脑的状态。 通过对各个不同的角度的探讨,“肝肾同源”理论的实验依据将会日趋完善。