致病机理（精选四篇）
致病机理 篇1
1 公猪出现繁殖障碍的现象
(1) 性器官发育不良或者受损。由于正常状态的公猪能够在交配时通过阴茎勃起插入到母猪的生殖道中, 并且其射精可以持续超过5分钟。而性器官发育不良时公猪的阴茎无法勃起, 其阴茎表现为发软或者短小, 导致射精时间短, 射精量也比正常少。造成这种现象的原因是长时间缺乏营养物质, 如缺乏维生素A和维生素E及矿物质等成分。而公猪的性器官受到损伤, 睾丸肿大或者萎缩也会导致公猪的繁殖性障碍疾病的发生, 这主要是由于感染病菌侵染了公猪睾丸导致发炎, 使得公猪的生精能力减弱[1]。
(2) 性欲减弱或有性欲也不能交配。一旦配种的公猪出现性欲减退, 表现为对母猪反应迟钝、不愿意交配等症状, 能够引起这种现象的原因有多种, 如公猪的老龄化、营养缺乏、高温湿热, 而且甲状腺功能退化或者先天性不全也是主要原因。而性欲良好的公猪也可能会出现不能交配的现象, 表现为阴茎不能够延伸或者包皮红肿等, 主要是打斗、机械损伤造成了阴茎和包皮发炎。但是这种繁殖障碍病是暂时的, 可以通过药物治疗而达到痊愈。
2 导致公猪繁殖障碍的原因
(1) 传染性因素。猪乙型脑炎是一种急性传染病, 主要发生在夏季, 传播媒介主要是蚊子, 当公猪受到蚊虫叮咬感染后, 导致睾丸受到乙脑病毒的侵染, 而后睾丸发生明显的炎症, 最终使公猪的产精能力下降。猪布鲁氏菌病则是一种慢性传染病, 主要是通过被污染的水源、饲料等引起公猪的致病。受到传染的公猪主要是病菌的毒力因子侵染消化道和呼吸道等, 进而严重影响产精能力。而且该菌对抗生素不敏感, 无法使用抗生素进行治疗[2]。
(2) 非传染性因素。最主要的非传染性因素是营养不良, 当公猪的必要营养成分缺乏时, 会影响到公猪性器官的发育和性欲, 进而影响到产精能力, 从而影响母猪的产仔率。比如赖氨酸能够直接参与精子细胞的产生, 使公猪保持正常的性功能;锌离子主要是在精与卵结合时起到介导作用, 促进受精过程;维生素A和E的缺乏同样也会影响睾丸的生精功能。对公猪的饲养管理也会引起非传染性繁殖障碍的发生, 如果饲养的面积太小, 公猪的活动量减少, 体质下降, 进而性欲减退。能否养好公猪决定了是否能搞好养猪生产, 但是在实际生产中常常会出现公猪繁殖障碍病, 而且有多种表现形式, 最终导致母猪的受孕率和产仔率下降。引起公猪出现繁殖障碍的原因有很多, 因此致病机理不同, 通常情况下需要做好相应的防治措施, 重中之重就是做好防范[3]。
3 结论
对于预防传染性因素所引起的公猪繁殖障碍, 需要工作人员做好科学免疫, 给公猪进行专业的疫苗接种, 搞好养猪场的卫生和消毒工作。对于非传染性因素引起的公猪繁殖障碍, 主要配好公猪的饲料, 保证公猪获得充足的营养。还要使公猪的饲养环境得到改善, 安排干燥宽敞的场所, 便于公猪的运动。最后, 尽可能地弄清楚引起公猪繁殖障碍的机理, 从而可以提高公猪的繁殖性能。
参考文献
[1]金升藻, 孙立军, 童庆平, 童战伟.猪伪狂犬病的临床诊断与防治[J].上海畜牧兽医通讯, 2013 (05) 23-24.
[2]张立, 胡成波.八种公猪繁殖障碍性疾病防治经验[J].科学种养, 2013 (09) 90-91.
致病机理 篇2
1 感染猪发病机制
PRRSV可以通过呼吸道、口腔或生殖道侵入机体, 主要侵害猪肺部组织和淋巴结组织。病毒通过呼吸道首先与猪肺泡巨噬细胞 (PAM) 和肺血管巨噬细胞 (PIM) 上的受体结合[1], 经胞吞作用进入细胞。PRRSV在PAM中进行复制, 造成PAM被大量破坏, 并引发细胞凋亡[2]。感染猪的PAM显著减少, 其比例可由正常的90%降至50%甚至更少。在PAM中增殖的PRRSV还可转移到局部淋巴组织的巨噬细胞和单核细胞内进一步增殖[3]。随着PAM的大量崩解, PRRSV进入血液循环及淋巴循环, 并在血液巨噬细胞和单核细胞内增殖, 分布到全身各组织器官的巨噬细胞内, 导致病毒血症的出现及全身淋巴结的肿大和相应器官不同程度的损伤, 病毒滴度迅速增加。
有试验表明感染PRRSV后3~14 d内血液中的淋巴细胞及单核细胞显著降低。接种后24 h可出现病毒血症, 平均持续约28 d, 最长可达56 d, 血清、淋巴结和肺脏中病毒滴度的最大峰值出现在第7~14 d。
随着病毒在PAM、淋巴结等处的大量增殖, 可在数小时至数天内造成肺、淋巴结的损伤和微循环障碍, 血管通透性增强, 血液中的部分液体成分外渗, 造成血管周围水肿[4]。主要表现为特征性间质性肺炎和淋巴结的肿大, 支气管坏死和肺的广泛性出血, 下颌淋巴结、肠淋巴结及扁桃体弥散出血及水肿, 脑和脊髓实质出血[5,6]。在微循环障碍和肺循环障碍的联合作用下, 可能出现耳、四肢发绀等症状。这些变化与临床所见的沉郁、厌食、体温升高甚至死亡密切相关。
PRRSV还可感染公猪生殖系统, 导致睾丸内精子数量减少, 公猪表现繁殖性能降低, 并通过精液将PRRSV传染给母猪, 引起母猪的繁殖障碍[7]。
目前, 对感染PRRSV的怀孕母猪引起子宫内胎儿感染的机制仍未清楚, 因抗体和病毒等大分子物质不能通过胎盘屏障, PRRSV可能由单核细胞和巨噬细胞携带穿过胎盘屏障, 进入胎儿体内导致胎儿感染, 从而引起妊娠后期母猪流产等繁殖障碍[8]。对繁殖母猪进行攻毒试验, 发现母猪感染PRRSV后可导致胎儿脐带出血、扩张, 呈现坏死性脐动脉炎病变, 使得脐带血管的正常血液循环受损, 胎儿由于缺氧死亡。对流产胎儿进行病理组织学检查发现, 在血管周围出现以巨噬细胞和淋巴细胞浸润为特征的动脉炎、心肌炎和脑炎[9,10]。
2 细胞损伤机制
PRRSV在肺脏和淋巴组织巨噬细胞中的复制可以导致细胞损伤和临床症状的出现, 在体外细胞培养时也可以诱导细胞损伤和死亡[11,12]。PRRSV感染猪的肺和淋巴组织泛发细胞凋亡, 凋亡同时发生在感染细胞和未感染细胞, 但大部分凋亡细胞是未感染PRRSV的细胞[12,13,14]。引发细胞损伤的机制包括感染细胞的凋亡、邻近非感染细胞的程序性死亡 (间接凋亡) 、诱发炎性细胞因子的产生、诱导多克隆B细胞的活化以及巨噬细胞噬菌和杀菌作用的减弱。
直接和间接凋亡是PRRSV感染过程中细胞死亡的主要原因。PRRSV复制导致抵抗和促进细胞凋亡通路的激活。在病毒感染早期, 抵抗和促进细胞凋亡的平衡趋向抗凋亡, 而在病毒复制后期, 平衡趋向于促进细胞凋亡[15]。研究表明, 在PRRSV感染Marc-145细胞后期, 多达75%的感染细胞死于凋亡;并且证明病毒感染Marc-145细胞后诱导凋亡通过线粒体通路介导[16]。在病毒滴度较高的急性感染期, 病灶附近只有一小部分的巨噬细胞被感染[9], 但却有大量凋亡的单核细胞散在分布[7]。并且在感染PRRSV后10~14 d发生凋亡的单核细胞最多。这表明PRRSV可诱导与感染细胞相邻的非感染细胞发生凋亡。
有人证明PRRSV的GP5蛋白可以诱导猴体外COS-1细胞系的凋亡, 并且也可能是体内巨噬细胞凋亡的原因, 表现为细胞收缩、DNA断裂, 最终导致细胞死亡。PRRSV诱导细胞间接凋亡的原因还不明确, 可能是由于感染巨噬细胞分泌致细胞凋亡因子、活性氧或者一氧化氮导致的[12]。
3 PRRSV的复制和细胞受体
PRRSV是由受体介导的内吞作用入侵靶细胞[17,18]。研究表明, PAM表面存在三种PRRSV受体, 唾液酸黏附素 (Sn) [18,19]、硫酸乙酰肝素 (HS) [18,20]和CD163分子[21,22,23]。介导的过程分为两个连续的步骤:M蛋白或M-GP5蛋白复合物结合靶细胞膜表面的硫酸乙酰肝素, 然后病毒囊膜的唾液酸结合细胞膜的唾液酸黏附素[17,19];CD163可能协助唾液酸粘附素内吞、病毒脱衣壳和将基因组RNA释放到细胞质中[24]。受体介导的内吞侵入病毒的脱衣壳过程发生在内质网, 在该部位酸性环境激活病毒囊膜与内质网膜的融合, 但也已有PRRSV与内质网膜直接融合的报道[25,26]。E蛋白被认为是包埋在病毒囊膜的离子通道蛋白, 便于病毒在细胞浆内脱衣壳和释放病毒基因组[27]。病毒由穿过光面内质网的出芽获得病毒囊膜, 成熟病毒粒子通过胞吐作用从细胞释放出来[28]。
最近的研究结果表明, Marc-145细胞拥有与PAM细胞不同的膜受体。该受体能被GP5识别并结合, 它不同于HS或Sn, 而是一种未知的新受体。Marc-145细胞表面表达的一种波形纤维蛋白可能是PRRSV受体复合物中的一个重要组成成分, 它在PRRSV结合宿主细胞的过程中发挥重要的作用。据推测, 这种波形蛋白能与PRRSV的N蛋白结合而介导病毒的感染过程[29]。
目前, 已经从感染猪体的多个脏器及组织中检测到了病毒抗原或是病毒核酸, 在肺脏和淋巴结中观察到的数量最大, 在心脏、脑组织、肾脏的内皮细胞或周围的巨噬细胞、上皮生殖细胞、精细胞及血清、血浆、骨髓等其他组织的血管周和血管内巨噬细胞中也可以经常观察到, 说明PRRSV感染没有组织限制。但在猪体内PRRSV增殖只发生在巨噬细胞、单核细胞和小神经胶质细胞[30,31], 其中PAM是病毒复制的主要靶细胞。小于6周龄的仔猪的PAM细胞是PRRSV感染最敏感的细胞, 特别是尚未成熟的PAM细胞最适合PRRSV繁殖, 这种对未成年猪PAM的偏好与PRRS严重发病常见于仔猪的情况相一致[9]。
4 免疫抑制
研究表明, PRRSV对猪的免疫系统具有免疫抑制作用。PRRSV在巨噬细胞内迅速增殖, 导致猪只肺部细胞 (包括肺泡巨噬细胞、血管内巨噬细胞和单核细胞等) 发生凋亡 (PRRSV除直接造成感染的肺泡巨噬细胞凋亡外, 还通过释放致细胞凋亡因子造成大量邻近的非感染肺泡巨噬细胞的“旁观者”凋亡) , 巨噬细胞比例明显下降。同时, PRRSV还能降低肺泡巨噬细胞的功能, 使PAM的非特异性吞噬作用减弱, 释放超氧负离子的能力降低, 导致PAM依赖超氧负离子所发挥的非特异性杀菌作用的功能下降[32]。
许多研究表明PRRSV感染后Th2型细胞因子IL-10基因表达上调和蛋白产量增加, 可以认为病毒通过调节IL-10表达对感染宿主免疫系统进行抑制。引起外周淋巴细胞中T细胞亚群发生异常改变, 影响B细胞功能和体内细胞因子的产生[33,34]。有研究表明猪感染PRRSV后, 血液白细胞总数和淋巴细胞数显著下降, CD4+、CD2+和CD8+等T细胞亚基也短暂下降, 而CD8+细胞的增殖对于清除病毒感染的靶细胞有重要作用[35]。
病毒迅速向局部淋巴器官、全身组织扩散, 并在巨噬细胞和单核细胞持续繁殖、复制, 淋巴结、淋巴小结和副皮质区及脾白髓都受到了广泛性的破坏, 机体粘液屏障保护力降低, 体液免疫和细胞免疫能力降低, 造成免疫抑制。增加了其它细菌或病毒感染的易感性[36], 并使疾病的症状加重, 如PRRS患猪可继发感染猪伪狂犬病、副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪圆环病毒2型等, 这是PRRS常和其它疾病同时存在的根本原因。
5 抗体依赖性增强作用
抗体依赖增强作用 (ADE) 是PRRSV重要的生物学特征之一[37,38]。PRRSV在感染猪体内能诱发中和抗体的产生, 但低滴度的中和抗体 (亚中和水平抗体) 不但不能有效清除血液中的病毒, 反而与病毒形成病毒抗体复合物, 增强了病毒的复制。
ADE的产生是由于GP5蛋白上的抗原表位诱导产生的中和抗体和PAM上存在的Fc受体互相作用的结果[39,40]。病毒借助抗体的Fc片段与Fc受体所在细胞 (如PAM等) 结合, 促进病毒进入细胞而建立感染[39]。在妊娠后期的胎儿已出现主动免疫应答, 产生的抗体对经胎盘感染的PRRSV出现ADE效应, 这可能是PRRSV感染以妊娠母猪在怀孕后期流产为特征的主要原因之一[41]。
但另据报道, 不同PRRSV分离株对ADE的敏感也不一样, 因此, ADE有可能促进某些病毒的增殖, 而对另一些病毒则不起作用[42]。PRRSV的ADE现象在体内和体外都已被证实, 在PAM培养物中加入一定滴度的PRRSV抗体, 可使PRRSV增殖滴度提高10~100倍;在病毒中加入一定的PRRSV抗体, 再注射妊娠中期的胎儿, 结果致病性显著高于单独注射PRRSV, 表明ADE对PRRSV的致病性有重要影响, 也说明PRRSV抗体在不同水平时所起的作用完全不同, ADE妨碍了PRRSV的免疫防制和根除。
研究结果表明, PRRSV的ADE是由ORF5所编码的26 ku囊膜糖蛋白E介导的, 而这种糖蛋白也能诱导机体产生中和抗体, 也许是在其诱导的抗体处于亚中和水平时产生了ADE效应[43]。
6 持续性感染
PRRSV的持续性感染是其流行病学的一个重要特点, 即感染猪只体内病毒的持续性存在和污染猪场内感染猪群的持续性存在。病毒在猪体内持续存在, 但不表现临床症状, 可持续数月甚至更长时间, 猪群常通过各种机制如持续病毒血症及单个猪只排毒的方式持续感染PRRSV达数年[44]。
持续性感染是PRRSV在猪群内长期存在的关键。研究结果表明, PRRSV引起的病毒血症在猪群中可持续6~7周, 甚至达16个月[45]。处于亚临床感染的猪常伴有病毒血症, 这常被人们所忽视, 尽管病毒血症持续时间长短不一, 但亚临床感染的猪已成为PRRSV的主要携带者和重要的传染源, 不仅有向外界排毒的可能, 且在孕后感染胎儿, 产下病毒血症的仔猪, 感染健康猪, 导致PRRSV在猪群中的循环传播, 成为PRRSV持续性感染的重要原因。
致病机理 篇3
1 猪繁殖与呼吸综合征的致病机理
猪感染猪繁殖与呼吸综合征病毒后, 该病毒首先侵入猪肺泡巨噬细胞, 在入侵2 d后即可危害猪肺部, 7 d即可将全部肺尖叶损伤至呈多中心病状, 导致猪只出现严重的间质性肺炎。该病毒在细胞内可以不断增殖, 导致巨噬细胞破裂、溶解最终崩溃, 这样就减少了猪体内的巨噬细胞数量;同时还为其他细菌和病毒危害猪肺泡巨噬细胞提供便利。另外, 该病毒的毒株还可以发生变异, 从而减弱免疫细胞的识别能力, 避开抗体作用, 轻易和其他疾病并发或者继发, 导致猪只的病情复杂, 难以诊断, 增加其死亡几率。
2 主要危害
猪繁殖与呼吸综合征的传播途径有水平传播和垂直传播2种[2], 其中, 水平传播主要通过呼吸道、精液, 垂直传播主要通过生殖道。其主要传染源是感染猪只以及康复猪只, 由于其排毒时间比较长, 因此病毒可以在猪群中反复地传播, 很难根治。其危害主要表现为母猪繁殖障碍和仔猪大量死亡, 其中母猪繁殖障碍主要表现为流产和产死胎、弱胎以及滞产、不发情、假发情等, 需延迟1个发情周期才能对其进行配种。该病还可以降低猪只的抵抗力, 导致各种疫苗的免疫效果不达标, 容易与猪瘟混合感染, 或者诱发喘气病、传染性胸膜炎、流行性感冒、萎缩性鼻炎、猪肺疫等呼吸道疾病, 因此一旦感染该病将造成重大经济损失。
3 防控措施
3.1 加强管理
规模养殖场宜坚持自繁自养、全进全出的原则, 必须引进种猪或商品猪时, 应慎重选择, 严禁在猪感染猪繁殖与呼吸综合征疫区引种[3]。引进后, 首先要进行逾30 d的隔离, 并进行检测, 合格后方可混入猪群中养殖。保持环境的安全卫生, 及时清理猪的粪尿, 并进行无害化处理;适时进行带猪消毒, 以每周4~6次为宜, 场区每周至少消毒1次;注意保持猪舍通风良好、温度适宜。加强免疫, 定期开展免疫抗体监测工作, 按照免疫程序和免疫抗体的消长规律合理进行免疫, 主要针对猪瘟、气喘病、伪狂犬病、口蹄疫、细小病毒等病。对于病死猪和患病母猪产的胎衣、胎盘要进行无害化处理, 主要采取深埋、焚烧和消毒方式。为了防止疫情扩散, 严禁病死猪流动, 并保证运输工具的消毒工作及时到位。
3.2 加强检测
猪繁殖与呼吸综合征疑似发生时, 应采取措施尽快确诊[4]。对全部猪群进行检疫, 对病猪实行隔离饲养, 在做好饲养管理的同时加强卫生消毒工作。在未发病的地区和检测结果为阴性的地区, 母猪和公猪要用猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫, 按照基础免疫程序采取肌注方式, 免疫2次, 每次份量为4 m L/头, 间隔21 d, 以后每隔5个月免疫1次即可;一般哺乳猪、育肥猪和保育猪无须免疫。在猪繁殖与呼吸综合征发生地区及其周围, 母猪和公猪采用以上方法进行免疫;3~10周龄的仔猪可以接种弱毒疫苗1 m L/头;10~18周龄的仔猪可以肌注弱毒疫苗2 m L/头。
3.3 对症治疗
猪繁殖与呼吸综合征发生时, 容易继发猪链球菌、猪嗜血杆菌等细菌感染, 因此在治疗时, 要对症诊治, 以抗病毒、防继发、重保健为原则。针对比较常见的细菌病, 要结合采取适当的措施, 做好免疫和药物预防工作, 并尽量采用中药制剂, 添加电解多维, 提高机体免疫力, 促进机体健康。抗病毒方面, 暂未发现特效药, 目前主要使用干扰素或干扰素诱生剂, 如干扰素、聚能核肽、转移因子、免疫球蛋白、黄芪多糖等抑制病毒的复制。防继发和退热方面, 可以采用青霉素+柴胡+复合维生素B混合肌注;或头孢噻呋钠+复方氨基比林;或清宁 (对乙酰氨基酚) +泰诺康 (复方氟苯尼考) 等配方, 按照疗程进行用药。重保健方面, 主要是加强饲养管理, 做好卫生消毒工作, 防止疫病进一步蔓延;在饲喂上, 可向饲料中加入瑞特奇1~2 kg/t+维多利0.5~1.0 kg/t, 或热毒清 (黄连+黄苓+黄柏) +电解多维;在饮水方面, 可向猪只饮水中加入葡萄糖250 g/L+食盐5 g/L。
参考文献
[1]查日华.安徽省芜湖地区猪瘟及猪繁殖与呼吸综合征混合感染情况的调查[J].畜牧与饲料科学, 2011 (4) :88-89.
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[3]郭金梅.猪繁殖与呼吸综合征的防控[J].畜牧与饲料科学, 2011 (1) :90.
致病机理 篇4
1 致病机理学研究
病理学上发病羔羊呈典型的胸膜肺炎病变, 与其他病原引起的肺炎的病理学变化相同。肺脏病变开始时在萎缩部位呈暗红色, 并伴有呼吸道支气管炎, 接着灰红的部位固结, 持续2~3周, 然后固结区呈灰白色, 且经常可见粘着在胸膜上, 一般持续几个月, 在新西兰已从早期亚急性病灶和延迟的病灶中分离到了MO。
大多数的陈旧性病变可见支气管上皮细胞增生, 腮淋巴结增生和支气管纤维样变性。这些变化是非特异性的;临床上它表现急性呼吸道感染症状。通过透射和扫描电镜观察在感染MO的羔羊的呼吸道的纤毛上也观察到了MO的粘附现象。AI-kaissi and Alley (1983) and AI-Kaissi (1986) 等研究了MO和尘细胞间的相互作用, 他们发现这种微生物能粘附到浆细胞膜表面, 而不引起它的溶解, 除非是有特异性抗体存在。
Niang等也研究了羊的巨噬细胞对MO的作用。他们发现MO能抑制吞噬细胞消化葡萄球菌并抑制Ig G受体和抗体依赖性细胞的细胞毒性的表达。他们也研究了MO对绵羊气管的组织的细胞病理作用, 并证实了Ionas等早期的研究结论, 发现受感染组织的纤毛的运动力降低, 另外, 他们还发现MO有多糖荚膜, 它可能与支原体粘附在纤毛上有关, 且能够抑制吞噬细胞溶解。
许多报道表明支原体存在荚膜, M.pneumoniae, M.dispar, M.hyopneumoniae, M.gallisepticum, M.pulmonis I研究认为荚膜可促进其在呼吸道的寄生能力。最近报道, M.dispar的荚膜可引起牛和小鼠的免疫反应。荚膜的存在可能与支原体粘附和寄生在呼吸道引起的免疫失败有关。人们认为荚膜可能是一种重要的毒力因子。且机体能产生针对荚膜的抗体。
就我们所知, Niang等是关于MO有荚膜的首次报道, 也是在荚膜特征的基础上确定支原体同种的菌株荚膜多样性的首次报道, 依据以前的研究, 他们使用阳性电荷电子密度成分钌红和聚阳离子铁蛋白来确定MO上荚膜的存在, 因为它们可于微生物表面的酸性糖蛋白反应。荚膜使MO长期的存在于宿主的组织中, N-乙酰基-D-氨基葡糖苷或D-甘露糖是细胞上与荚膜互补的最优势糖残基。
总之, 支原体的致病机制包括:
(1) 支原体有吸附性:绵羊肺炎支原体能吸附到气管绒毛和肺泡细胞表面。这种吸附作用可能与其胞膜表面的绒毛有关, 与此相同作用的还可见于肺炎支原体的顶端吸附蛋白。
(2) 绵羊肺炎支原体能利用宿主细胞成分并分泌有毒产物。多数支原体为黄素终端呼吸途径, 其形成过氧化物毒害宿主细胞, 绵羊肺炎支原体可使呼吸道纤毛脱落, 妨碍宿主细胞对炎性渗出物的清除, 引起呼吸道疾病。
(3) 绵羊肺炎支原体与宿主细胞膜间相互融合, 这可干扰细胞间的物质和信息的交流, 引起免疫学上的“误伤”。
2 绵羊肺炎支原体感染诊断技术进展
2.1 病原学培养诊断
支原体营养要求高于细菌, 其细胞中主要成分——胆固醇和蛋白质均来自培养基中, 必须补充血清、卵黄等成分, 在含5~10%C02和相对湿度80~90%的大气环境中生长最佳。常用Hayflick基础培养基来分离培养MO, 但生长缓慢, 一个分离过程需要20天左右。在固体培养基上绵羊肺炎支原体生长无中心脐的“桑椹状”菌落。
虽然分离培养出病原体是最准确的方法, 但是它不仅需要营养丰富的培养基, 而且培养周期长, 培养技术繁琐, 难以作为常规检查方法普及推广, 同时, 病原学培养不能作为早期迅速诊断MO的感染的方法。
2.2 血清学检测
2.2.1 补体结合试验 (Complement fixation test, CFT)
CFT是检测MO抗体最常用的方法。其原理为:抗原——抗体复合物通过补体作用, 在溶血素 (Hemolysin) 介导下使绵羊红细胞溶解, 从而测定血清MO抗体的滴度。一般说来, CFT检测抗体的特异性和敏感性较低, 参与CFT反应的抗原是MO糖脂半抗原, 而这种糖脂又存在于许多细苗、支原体、植物及许多宿主细胞膜内。由于糖脂抗原的非专一性。常导致CFT的假阳性反应。
2.2.2 间接血液凝集 (Indirect haemagglutination, IHA)
IHA是一项简便、快速的检测方法, 具有较高特异性和检出率, 但一般的IHA不能区分Ig G和Ig M抗体。IHA是流行病学调查常用方法。
2.2.3 间接酶联免疫吸附试验 (Indirect enzyme--linked immunosorbent assay, ELISA)
2.2.4 间接免疫荧光法、免疫印迹法 (Immunoblotting) 放射免疫沉淀法 (Radio--immunopredipitation, RIP) 等等。
其中ELISA和IFA的敏感性和特异性较低;RIP和免疫印迹法除技术较繁琐外, 还有放射污染等缺点, 不利于推广。
由于MO特异性抗体在发病后持续存在3个月以上, 因此, 虽然血清学检测是值得重视的早期诊断方法, 但有可能捡得的是持久存在的抗体。
另外, 由于MO可能与其它种类支原体、细菌存在着某些结构或功能相似的抗原蛋白, 产生性质相似的抗体, 导致血清免疫交叉反应。现已发现MO与结膜支原体、精氨酸支原体等存在交叉反应, 因此, 血清学检测易出现假阳性。
总的说来, 血清学方法虽然是比较常用的方法, 但存在以下缺点:
(1) 敏感性和特异性均低, 假阳性和假阴性比例高。
(2) 需双份血清, 抗体升高4倍以上才能做出准确诊断, 耗时至少I~2周, 这样往往属于回顾性诊断。
(3) 需要鉴定支原体分离株对应的特异的高免血清, 而这些血清并不易于得到的。
(4) 有些试验需特殊仪器如荧光显微镜等, 一般试验室无法具备。
(5) 各种支原体之间有交叉反应。血清学诊断需结合病原体的分离鉴定才能准确判定。
但是, 血清学的方法进行支原体感染的流行病学调查, 对于疾病的预防和监测有重要的意义。
2.3 抗原检测方法
2.3.1 ABC—ELISA
由于传统的血清学方法难以完全解决支原体早期诊断问题。一些学者试用不同方法直接检测支原体抗原。研究比较多的是Mp的诊断。例如, kok等以聚乙烯反应板为固相建立抗体夹心ELISA, 直接检测患者鼻咽抽提物或痰中的Mp抗原, 可检出104~105CFU/ml的支原体。国内俞康龙等用类似原理建立亲和素酶联免疫吸附试验 (ABC—ELISA) 检测Mp抗原, 其检出低限为104CFU/ml, 同时用血清学诊断及Mp培养作对照, 二者的总体符合率为83.9%。
2.3.2 单克隆抗体技术
膜蛋白是支原体的主要抗原之一, 应用其相应的单克隆抗体建立的单克隆抗体免疫印迹法具有特异性强, 灵敏度高的特点。单抗能提高血清学方法对抗原检出的特异性, 在竞争抑制试验中, 应用标记的Mcab较应用标准抗血清有诸多优点。Jocibs.E用ELISA捕获法以Mp抗P1蛋白单抗检测P1蛋白, 特异性强, 敏感性可达104CFU/mL。但该方法操作较复杂。而且有些单克隆抗体可与其它支原体有交叉反应, 这一点在诊断时应予以注意。
2.4 基因诊断技术
随着分子生物学技术的飞速发展, 基因诊断技术在支原体检测中的地位越来越显著。常用的方法有:核酸探针杂交技术和聚合酶链式反应 (Polymerase chain reaction, PCR) 技术。本文重点介绍一下PCR技术。
PCR是近年来建立的一种特定核苷酸体外扩增技术。该方法的特点是简便、灵敏、快速。但迄今为止, 国内外还没有绵羊肺炎支原体PCR检测方法的报道, 目前国内外研究应用PCR检测人的肺炎支原体 (Mp) 的工作取得突破性进展, 1989年Ceile和Bamet等首先应用PCR技术检测肺炎支原体, 应用引物Mp5—1和Mp5—2扩增到144bp的序列, 可测出102~103CFU/mL肺炎支原体, 引物特异性强, 其它支原体和呼吸道常见细菌未见阳性反应;1992年williamson等设计了扩增肺炎支原体P1蛋白基因序列的一对引物和16S r RNA基因的引物各一对, 扩增出DNA产物分别为543bp和290bp, 试验的敏感性达320个支原体;1992年Sasaki等根据等位基因特异的PCR原理从16S rRNA基因中设计了Mpn-1和Mpn-2一对引物该引物只对Mp里阳性反应, 与生殖道支原体无交叉反应, 可测出标本中100个肺炎支原体的存在。PCR方法的敏感性明显高于其它的诊断方法 (如ELISA) 。支原体的粘附蛋白 (例如, Mp的P1蛋白, Mhp的P46蛋白等) 和支原体的16S r RNA基因常作为PCR的模板。
在兽医方面Fan等根据16S r RNA基因序列设计两个引物检测鸡毒支原体证明PCR技术同其他方法具有明显的优势, 在临床上是一种可靠的诊断方法。Caron J等根据猪肺炎支原体的P36和P46基因设计引物成功的用于检测猪肺炎支原体。Katharina D C等用RT—PCR检测猪肺炎支原体进一步提高了PCR的灵敏度和特异性。