鸡源致病性大肠杆菌（精选四篇）
鸡源致病性大肠杆菌 篇1
研究对邢台地区分离的鸡源大肠杆菌进行了耐药性检测, 以便筛选出有效药物并为防治当地鸡大肠杆菌感染提供合理有效的抗菌药使用规范提供理论参考数据。
1 材料
1.1 病料来源
在邢台地区5个养鸡场以无菌器皿操作采集疑似大肠杆菌病病死鸡的粪便、心脏、肝脏样品40份, 用灭菌棉拭子插入患腹泻病鸡的粪便或脏器中, 旋转后取出, 接种到装有无菌生理盐水的5 m L离心管中, 4℃保存。标准质控菌株ATCC25922, 购自中国药品生物制品检定所。
1.2 试验动物
体重和周龄相当的小鼠, 购自河北省实验动物中心, 随机编号。
1.3 主要试剂及培养基
M.R.试剂、V-P试剂、微量生化发酵管购自杭州微生物公司;猪胆盐、牛肉膏、蛋白胨购自北京奥博星生物技术有限责任公司;革兰染液、麦康凯培养基、1%蛋白胨培养基、靛基质试剂、三糖铁琼脂培养基、硫化氢试验培养基按有关资料配制。
1.4 药敏纸片
11种药敏纸片名称、纸片含药量和药敏试验判断标准见表1。
2 方法
2.1 细菌分离纯化
每批次所采集病料每份取0.5 g, 加适量稀释液研磨, 10倍稀释后过滤、离心, 取上清液在无菌工作台中将样品用接种环接种于普通培养基上, 37℃恒温培养18 h, 观察细菌生长情况、菌落特征。然后挑取单个菌落接种于麦康凯琼脂平板, 37℃恒温培养24 h后挑取可疑、红色、中等大小、光滑菌落进行革兰染色、镜检。革兰染色情况、形态、大小等均符合大肠杆菌特征的菌株初步确定为大肠杆菌。对疑似大肠杆菌进行菌种保存。
2.2 生化鉴定
大肠杆菌可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖, 产酸、产气;可形成靛基质;V-P试验阴性、甲基红试验阳性, 根据以上生化特性进行糖发酵试验、靛基质形成试验、V-P试验和甲基红试验检验。
2.3 动物试验
为鉴定所分离的大肠杆菌是否具备致病性, 用小白鼠进行动物试验。首先将纯化大肠杆菌菌株接种普通营养琼脂培养18~20 h, 然后用无菌生理盐水洗下制成菌悬液 (约20×108~50×108/m L) , 用菌悬液腹腔注射健康小白鼠0.5 m L/只, 小白鼠死亡后剖检, 将病变明显组织接种于麦康凯培养基, 挑取可疑菌落进行镜检、生化鉴定。
2.4 药敏试验
从细菌纯培养物上, 选择形态完整的菌落接种于5 m L肉汤培养基中, 37℃培养6~8 h后, 肉汤呈混浊状。振荡摇匀, 用灭菌棉拭子蘸取菌液, 均匀涂布于营养琼脂平板上, 分别记录、编号。将镊子于酒精灯火焰上略停灭菌, 取药敏片贴到平皿培养基表面, 在平皿中央贴一片, 外周可等距离贴4片。置于37℃培养18~24 h后观察结果, 用游标卡尺测量抑菌圈直径。
2.5 血清学鉴定
采用玻片凝集试验的方法对分离菌株进行玻片凝集实验。将经过18 h培养的新鲜菌液90℃以上煮沸1 h, 破坏细菌荚膜, 然后用微量移液器于洁净的玻片上滴加1~2滴血清, 然后取少量煮沸后的被检菌与血清混匀, 轻轻摇动玻片, 于1 min内呈现明显凝集者为阳性, 呈均匀浑浊的为阴性。阳性时以生理盐水做空白对照试验。
3 结果
3.1 细菌分离结果
在普通琼脂上出现灰白色、圆形隆起、光滑湿润、边缘整齐的中等大小菌落 (直径1.5~2.0 mm) ;在麦康凯培养基上长出砖红色、圆形隆起、光滑湿润、边缘整齐的菌落。营养肉汤中均匀浑浊, 管底有灰白色沉淀, 振荡呈云雾状散开。将以上培养物涂片, 革兰染色镜检均为阴性中等大小的杆菌。
3.2 生化试验结果
对分离到的29株大肠杆菌进行特定的生化试验, 均符合大肠杆菌的生化特性, 可分解乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖, 产酸产气, 靛基质试验阳性, 甲基红试验阳性, M.R.试验阴性。
3.3 血清学鉴定
采用大肠杆菌“O”抗原诊断血清, 将分离到的29株鸡源性大肠杆菌进行血清学鉴定, 结果10株大肠杆菌血清型为O78, 4株为O88, 5株O1, 8株O2, 2株未鉴定出血清型。结果与马兴树等[2]的结果相一致。
3.4 动物试验结果
对29株菌株进行了小鼠接种试验, 其中10株的试验鼠于接种9 h后死亡, 6株的试验鼠于接种12 h后死亡, 9株的试验鼠于接种30 h后死亡, 4株接种后试验鼠精神沉郁, 体温升高, 而对照组均健康存活。从死亡小白鼠的心血、肝脏、脾脏都能分离到接种菌。由此证明这29株菌为致病性大肠杆菌。
3.5 药敏试验结果
从抑菌圈直径大小来判断, 分离的菌株对头孢噻肟的敏感性最强, 无一株呈现耐药, 氟苯尼考次之, 只有一株耐药, 表现出高敏的分别占75.9%和79.3%。抑菌试验结果表明, 养鸡场分离的致病性大肠杆菌已经对大部分常用的抗菌药物分别产生了不同程度的耐药性。由表2可以看出, 分离的29株鸡源大肠杆菌对甲砜霉素的耐药率最高为100%, 其次是环丙沙星, 耐药率为79.3%。对其余药物的耐药率分别为:氯霉素75.9%, 庆大霉素62.0%, 左旋氧氟沙星65.5%, 黏菌素70.0%, 安普霉素20.7%, 乙酰甲喹和阿米卡星17.2%。
29株大肠杆菌的多重耐药现象也比较常见, 这说明田间流行的大肠杆菌菌株已经对常用的抗菌药物产生了普遍的耐药性。
4 讨论
大肠杆菌为临床常见的病原菌, 本次试验证实邢台地区多致病性大肠杆菌同一场一次流行存在多种血清型, 且无明显优势血清型的存在, 给防治工作增加了难度。在分离的29株大肠杆菌中, 有2株不能定型, 占整个致病性菌株的6.8%, 意味着可能有新的病原性大肠杆菌血清型出现, 这也会增加大肠杆菌病的预防难度。因此在大肠杆菌的免疫预防中, 应充分考虑其血清型的多样性、易变性, 以便有针对性地进行免疫。
本次药敏试验结果表明, 邢台地区大肠杆菌病在治疗时应尽量选用氟苯尼考、头孢噻肟、阿米卡星和头孢拉定等敏感性较高的药物, 少用或不用青霉素、庆大霉素、环丙沙星等耐药程度较高的药物。同时, 在选择抗菌药物上最好考虑采取联合用药、交叉用药、轮换用药的方式, 一方面可以充分发挥抗菌药物之间的协同作用, 增加疗效;另一方面可以避免因细菌长期与某一种药物接触而增强耐药性。大肠杆菌耐药性的出现可能与菌株长期处于多种抗生素选择的环境中, 其耐药基因通过染色体或耐药质粒在菌群间广泛传播或扩散有关[3]。本次调查的五个养鸡场都有在饲料中添加抗生素的行为, 这无疑是耐药性大肠杆菌出现的主要原因之一, 应予避免。
中草药、溶菌酶、抗菌肽、防御素等一系列新型的可作为食品、饲料添加剂或直接服用的产品, 它们具有纯天然、无残留, 活性强, 抗菌谱广, 不易产生耐药性的特点, 应当鼓励尝试[4]。
总之, 鸡大肠杆菌病流行病学具有极其复杂的特征, 这也是鸡大肠杆菌病难以根除的关键所在。只有定期对本地区鸡场的大肠杆菌进行分离鉴定, 配以药敏试验用药, 同时加强管理等综合措施, 才能收到良好的防控效果。
参考文献
[1]李荣誉, 张国祖, 刘永录, 等.鸡致病性大肠杆菌耐药性检测[J].郑州牧业工程高等专科学校学报, 2012, 32 (2) :5-8.
[2]马兴树, 朱美霞, 王斌, 等.河北省南部鸡肝周炎大肠杆菌的分离及血清型鉴定[J].中国农学通报, 2009, 25 (01) :12-16.
[3]WHITE D G, HUDSON C, MAURER J J, et al.Characterization of chloramphenicol and florfenicol resistance in Escherichia coli with bovine diarrhea[J].J Microbioligy, 2000, 38 (12) :4593-4598.
鸡源致病性大肠杆菌 篇2
近年来,聊城地区肉鸡大肠杆菌病时有发生,给禽类养殖业造成了严重的经济损失。在2012—2013年度,山东省动物疫病预防与控制中心发布的山东省各地动物门诊病例诊疗情况汇总中,大肠杆菌病排在禽类患病中第4位,有的地区发病率高达50% ,死亡率6% 。已有很多文献指出: “经验性用药以及饲养环境导致鸡源致病性大肠杆菌对抗菌药物的敏感性存在着地域差别”[2,3],通常认为来自禽类的多数致病性大肠杆菌只对禽类有致病作用,而人和其他动物不会感染。然而,2004年有试验证明该类菌也可引起包括人在内的哺乳动物发病,表明大肠杆菌病亦是人兽共患病的潜在病原体[4,5]。所以耐药性的监测工作应当是一项长期的经常性的工作,合理使用耐药性较小的药物,可以提高治疗效果,减少费用,从而增强治疗的目的性与针对性。
1材料
1.1菌株来源
用来测试的27株致病性大肠杆菌是从山东聊城4个县市的几个规模化养鸡场采集的鸡大肠杆菌病病料中分离纯化得出的。
1.2培养基
LB培养基、普通营养肉汤培养基,均购于国药集团化学试 剂有限公 司,批号分别 为69075760, 69026061。
1.3试剂及仪器
药敏纸片购于上海金穗生物科技有限公司,共计6大类,13种药物。其中 β - 内酰胺类4种: 氨苄西林,阿莫西林,头孢噻肟,头孢羟氨苄; 氨基酸糖苷类4种: 庆大霉素,链霉素,大观霉素,新霉素; 氟喹诺酮类2种: 诺氟沙星,环丙沙星; 四环素类1种: 四环素; 磺胺类1种: 磺胺甲唑; 氯霉素类1种: 氯霉素。
仪器: 恒温培养箱,高压灭菌锅,游标卡尺。
2方法
2.1菌种复苏
将保留的菌种无菌操作于LB培养基中过夜培养,隔天挑取菌落接种于营养肉汤培养液中,37 ℃ 增殖培养6 h,制成浓度适宜的大肠杆菌菌液[6]。
2.2涂布平板
移液枪吸取100 μL的菌液均匀涂布平皿培养基上,盖上培养皿的盖子,室温静置5 min。
2.3药敏试验
用无菌眼科镊子将药敏纸片平贴于平板上,静置15 min后将平板置于37 ℃ 恒温箱中倒置培养,24 h后观察并测量抑菌圈直径大小[7]。13种药物判断标准参考美国临床实验室标准委员会( NCCLS) 药敏纸片扩散法( 见表1) ,并统计耐药菌株百分率及进行耐药图谱分析。
3结果与分析
3.1药敏试验
对分离纯化的27株病原菌用13种抗生素药物进行了药物耐药性试验,结果见表2及图1。分离病原菌菌株对氨苄西林、阿莫西林、链霉素、磺胺甲恶唑及氯霉素这5种药物已经有较高的耐药性,其中对氨苄西林的耐药率最高,已经达到85. 2% ,另外4种的耐药率分别为81. 5% 、77. 8% 、77. 8% 、74. 1% 。在所试验的菌株中没有菌株对头孢噻肟有耐药性,其敏感率达100% 。另外对大观霉素、头孢羟氨苄、四环素、诺氟沙星的敏感度也较高,均达80% 以上,可以作为推荐药物应用于本地鸡大肠杆菌病的治疗。
3.2耐药图谱及多重耐药分析
分离的27株病原菌对13种抗生素药物有13种抗药表型,结果见表3所示。多重耐药分析结果见图2所示,最多的为6耐。
4讨论
整体上看试验结果,聊城地区27株致病性大肠杆菌对13种抗生素药物的敏感度各不相同,对头孢噻肟和大观霉素的敏感度最高,头孢羟氨苄、四环素、 诺氟沙星的敏感度也较高,均为81. 5% ,这5种药物即可作为推荐药物用于本地大肠杆菌病的防治。耐药性较高的有氨苄西林、阿莫西林、链霉素、磺胺甲恶唑及氯霉素,这5种药物已经有较高的耐药性,其中对氨苄西林的耐药性最高,已经达到85. 2% ,并且产生了不同程度的多重耐药,比例最高的为6耐。试验结果与泰安、济宁、德州及北京密云[8,9,10,11]等4处的致病性大肠杆菌耐药性分析的结果都略有差别,这可能与不同地区养殖户的用药习惯存在差异有关,但都显示了该类病原菌严重的耐药性。目前,聊城地区养殖场注重经济效益,泛用、滥用、超剂量使用抗生素的情况普遍存在,使本地致病性大肠杆菌耐药性不断增强。另有报道指出: 耐药菌群的耐药基因可以通过食物链传递,进而威胁人类健康,已成为公共卫生问题[12],同时抗生素的不合理使用对生态环境造成了影响,应引起广泛关注。
注: 1 耐指某菌株对一种药物有耐药性,依此类推。
参考文献
[1]马兴树,范翠蝶,夏玉龙.禽致病性大肠杆菌研究进展[J].中国畜牧兽医,2013,40(2):169-174.
[2]AHMED N,DOBRINDT U,HACKER J,et al.Genomic fluidity and pathogenic bacteria:applications in diagnostics,epidemiology and intervention[J].Nat Rev Microbiol,2008,6(5):387-394.
[3]DZIVA F,STEVENS M P.Colibacillosis in poultry:unravelling the molecular basis of virulence of avian pathogenic escherichia coli in their natural hosts[J].Avian pathology,2008,37(4):355-366.
[4]TIVENDALE K A,ALLEN J L,GINNS C A,et al.Association of iss and iucA,but not tsh,with plasmid-mediated virulence of avian pathogenic Escherichia coli[J].Infect Immun,2004,72(11):6554-6560.
[5]Ron R Z.Host specificity of septicemic Escherichia coli:Human and avian pathogens[J].Current Opinions in Microbiology,2006,9(1):28-32.
[6]梁宏儒.黑龙江部分奶牛场大肠杆菌耐药性和耐药基因检测分析[D].大庆:黑龙江八一农垦大学,2013.
[7]王春华,张成立.辽西地区鸡源大肠杆菌超广谱β-内酰胺酶的检测[J].畜牧与兽医,2012,44(4):85-87.
[8]彭彤彤.泰安地区鸡源大肠杆菌病的病原分离、鉴定及耐药性分析[D].泰安:山东农业大学,2012.
[9]吴利锋.济宁地区鸡源致病性大肠杆菌分离鉴定与耐药性分析[D].泰安:山东农业大学,2010.
[10]蔺慧.德州地区鸡源致病性大肠杆菌流行病学调查与耐药性分析[D].泰安:山东农业大学,2011.
[11]许梓杨,门硕,王迁红,等.密云地区禽类大肠杆菌流调情况及防治措施[J].当代畜牧,2013(27):12-14.
鸡源大肠杆菌的耐药性监测与分析 篇3
近年来, 埃希氏大肠杆菌的耐药性呈上升趋势。20世纪50年代禽致病性埃希氏大肠杆菌几乎没有耐药性产生, 而60年代的分离株对链霉素、四环素产生了耐药性, 20世纪70年代对氨苄西林、氯霉素、磺胺甲基异恶唑等产生了耐药性, 80年代至90年代初对阿莫西林、庆大霉素、卡那霉素、萘啶酸、头孢塞吩等产生了耐药性。随着时间的推移, 埃希氏大肠杆菌的耐药率大幅度上升, 多重耐药菌株剧增, 耐药谱增宽, 临床上分离的埃希氏大肠杆菌对环丙沙星的耐药性已居耐药性的首位。据报道, 微生物对大多数喹诺酮类药物的耐药率达10%以上, 而在欧美等发达国家, 埃希氏大肠杆菌对喹诺酮类药物均很敏感, 耐药率一般只有5%左右;在我国部分地区埃希氏大肠杆菌对大多数喹诺酮类药物的耐药率却高达40%以上。产超广谱β-内酰胺酶 (ESBLs) 的埃希氏大肠杆菌现已分布全球各个角落, 它们的流行呈增长趋势, 也导致埃希氏大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性遍及全世界。
大肠杆菌抗原性复杂、血清型多样, 特别是在规模化养鸡业的迅速发展下, 鸡源大肠杆菌新的血清型又在不断出现, 且其不同的菌株对同一种抗菌药物的敏感性也不相同, 使得抗菌药物的防治效果越来越差, 兽医工作者不能很好地掌握药物对其的敏感程度。因此, 对鸡源大肠杆菌的耐药性进行监测与分析, 对于指导临床合理用药及控制本病的流行非常重要。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 培养基:
普通营养琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基, 北京双旋微生物培养基制品厂生产。
1.1.2药敏试纸片:
由鹤壁市山城区动物疫病预防控制中心提供。
1.1.3菌株:
由鹤壁市动物疫病预防控制中心提供 (20株) 。
1.1.4 器材:
恒温培养箱、培养皿、接种环、酒精灯、显微镜、移液器、滴头、镊子、标签、记号笔、直尺。
1.2 试验方法
1.2.1 培养基的制备
称取普通营养琼脂45克、麦康凯琼脂23克, 分别置于两个洁净三角烧瓶中, 然后各加入灭菌蒸馏水1000毫升、500毫升, 加热煮沸溶解后放入高压蒸汽锅内121℃灭菌20分钟;当琼脂温度降到55℃时, 在超净工作台上分别均匀地倒入灭菌的平皿内, 每个灭菌的平皿倒入15毫升, 待凝固后置37℃恒温箱中培养18小时;放入4℃冰箱保存备用。
1.2.2 菌株的培养
用接种环钓取少许菌株, 常规划线接种于普通营养琼脂培养基上, 进行纯培养。而后钓取纯培养的菌落接种于麦康凯琼脂培养基上, 37℃培养24小时, 见生长出砖红色菌落;再挑取纯培养的菌落涂片、革兰氏染色、镜检, 呈单个散在或成对的革兰氏阴性红色小杆菌。根据上述细菌培养特性和染色镜检, 可初步验证为大肠杆菌, 纯培养菌落备用。
1.2.3 试验操作方法———药敏片法
药敏试验:按WHO推荐的药敏片法进行。本法是根据抑菌环直径大小来判定细菌对抗菌药物的高敏、中敏、耐药的方法。该方法的优点是操作简单、易于掌握;缺点是费时, 只能进行半定量测定。
用接种环钓取l环纯培养的大肠杆菌, 置于1毫升灭菌生理盐水中, 充分混匀后用灭菌吸管吸取此液, 均匀的布满于普通营养琼脂培养基的整个表面;待营养琼脂表面稍作干燥后, 用灭菌镊子取各种药敏纸片均匀贴到营养琼脂表面, (为保证药敏纸片与营养琼脂培养基表面完全接触, 各个药敏纸片都应用灭菌镊子轻压一下) 每个平板放6张药敏试纸片, 37℃培养24小时;观察结果, 用直尺测定抑菌圈的直径。整个操作过程都应注意无菌操作, 避免杂菌污染。
1.2.4 判定标准
按抑菌圈的直径大小作为敏感性高低的判断标准。抑菌圈大表明细菌对该药物的敏感性高, 耐药性低;反之, 则表明细菌对该药物的敏感性低, 耐药性高。药敏纸片的种类及判定标准见表1。
2 试验结果与分析
2.1 20株鸡源大肠杆菌菌株来源情况见表2
2.2 20株鸡源大肠杆菌对12种药物的耐药情况见表3
由表3可以看出, 20株鸡源大肠杆菌对12种抗菌药物都有不同程度的耐药性。青霉素、四环素对其完全没有作用, 全部耐药;红霉素、利福平对其作用也很小, 没有对其产生高敏;而阿米卡星、头孢曲松和头孢唑啉的敏感性较高。具体统计结果见表4。
由表4可以看出:对鸡源大肠杆菌产生严重耐药性的药物依次是青霉素、四环素、林可霉素、环丙沙星、红霉素、蒽诺沙星, 这6种药物的耐药率都大于50%, 耐药最为严重的是青霉素, 达到了100%;对大肠杆菌中度敏感的药物依次是:头孢唑啉、诺氟沙星、卡那霉素, 中敏率分别是60%、55%、50%;高敏的药物分别是:氟苯尼考、头孢曲松、阿米卡星, 高敏率分别是70%、65%、60%。
2.3 不同地区分离菌株耐药性比较见表5
由表5中可以看出, 不同地区鸡源大肠杆菌的耐药情况不同, 敏感药物也不一样, 因此应根据各地的实际情况合理用药。
3 讨论
从试验结果看, 大多数鸡场的大肠杆菌存在着广泛的耐药性, 这给药物治疗带来了很大的难度, 造成这种局面与下列因素有关:养殖户用药过程中选药、剂量、疗程不当;存在严重滥用药物现象, 常常在未确定病因的情况下, 大量使用各种各样的抗菌药;目前兽药市场相当混乱, 同一有效成分命名五花八门, 误导了专业户;假冒伪劣兽药产品充斥市场, 个别兽药厂家产品的有效成分含量不足, 标记的剂量、疗程常不能达到治疗效果。
3.1 大肠杆菌耐药性产生的机制
3.1.1 一是先天性获得, 主要是由于其细胞壁的结构特点决定, 先天性获得耐药性的变化一般不大。
3.1.2 二是后天性获得, 主要是由于耐药性质粒的产生, 如:R质粒。R质粒的主要特征:一是能通过细菌与细菌间的接触, 由耐药菌株转移到敏感菌株, 从而使原来的敏感菌株获得耐药性;另一特征是有自我复制的功能, 在细胞分裂时, R质粒也同时进行复制从而使子细胞也带有耐药质粒。R质粒的耐药机制有:质粒基因编码产生各种钝化酶分解抗生素;耐药性质粒控制一些细菌的细胞膜通透性, 使抗菌药物不能进入细菌体内, 从而使细菌具有耐药性;耐药质粒的基因编码产生一些特殊的酶, 阻止抗生素与细胞内靶子结合而产生抗药性。R质粒的传播是细菌产生耐药性的重要原因之一, 特别是在规模化养殖条件下, R质粒更易在细菌之间传播, 造成耐药菌株的广泛产生。
3.2 解决其耐药性的对策
3.2.1 合理用药、谨慎用药和正确使用抗菌药物
在临床选用抗菌药物治疗鸡大肠杆菌病时, 要考虑本场的用药习惯, 选择少用或未曾用过的药物, 避免单一和长期重复使用同一种抗菌药物。一旦选定了正确的抗生素, 下一步就要确定准确的药物剂量、频率和疗程。最好在分离病原菌的基础上先做药敏试验, 选用高敏药物, 这样才能达到理想的治疗效果。
另外, 在选择高敏药物进行治疗时, 还要考虑这些高敏药物的吸收途径, 因为我们所做的药敏试验是药液直接和细菌接触, 而在给鸡用药时, 必须通过机体的吸收才能使药物达到一定的效果, 所以在给鸡用药时, 高敏药物一定要配合适宜的给药途径, 这样才能达到最好的治疗效果。
3.2.2 联合用药
主要是利用抗菌增效剂与某些药物的协同作用。通过联合用药可以扩大抗菌谱, 增强疗效、减小药物用量、降低或避免毒副作用, 进而减少或延缓耐药菌株的产生。
3.2.3 应用中草药治疗
许多中草药具有抑制和杀灭细菌作用, 清热解毒类中药也广泛用于防治感染类疾病, 并具有较好疗效和较低毒副残留及抗药性等优点。
3.2.4 应用微生态制剂治疗
微生态制剂可以促进鸡体内正常微生物菌群的建立, 使得正常菌群占据整个消化道, 而后进入的致病菌就难以在消化道壁上找到附着点, 从而竞争性地抑制了致病性大肠杆菌的生存。
4 小结
4.1 对鹤壁市动物疫病预防控制中心提供的20株鸡源大肠杆菌菌株进行药敏试验结果表明:
青霉素、四环素、林可霉素、环丙沙星、红霉素、蒽诺沙星严重耐药;头孢唑啉、诺氟沙星、卡那霉素中敏;氟苯尼考、阿米卡星、头孢曲松高敏, 因此, 临床上应选择上述高敏药物进行治疗。
4.2 近年来, 由于人们对抗生素的广泛大量应用, 使得一些药物过去有效而现在无效;
鸡源致病性大肠杆菌 篇4
鸡源大肠杆菌是我国家禽养殖过程中主要病原菌之一, 本试验通过测定添加抗菌脂肽提取物对鸡源大肠杆菌O2生长曲线的影响、观测抗菌脂肽提取物对鸡源大肠杆菌O2细胞膜通透性的影响等方法来研究抗菌脂肽提取物对鸡源大肠杆菌O2的抑制作用, 为抗菌脂肽作为抗生素替代品在肉鸡饲料中的应用提供科学依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株试验菌株:枯草芽孢杆菌S2, 由中国微生物菌株保藏中心提供;指示菌株:鸡源大肠杆菌O2。
1.1.2培养基LB培养基 (用于种子培养) 、Landy培养基 (发酵用) 、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、LB固体培养基。
1.2方法
1.2.1种子菌液培养将保存的枯草芽孢杆菌S2菌株转接至LB平板上, 32℃培养20 h;用接种环取活化的单菌落, 接种于装有50 m L LB培养液的250 m L三角瓶中, 32℃, 180 r/min条件下培养20 h, 4℃冰箱保存、备用。
1.2.2发酵液的制备将鸡源大肠杆菌O2转种至LB平板上, 37℃培养20 h;用接种环取活化的单菌落, 接种于装有50 m L LB培养液的250 m L三角瓶中, 37℃, 180 r/min条件下培养20 h, 并通过平板计数方式确定每毫升培养液中鸡源大肠杆菌O2菌数, 4℃冰箱保存备用。
1.2.3枯草芽孢杆菌S2菌株脂肽的制备取枯草芽孢杆菌S2菌株接种到装有500 m L Landy培养液的3 000 m L三角瓶中, 接种量为5%, 32℃, 180 r/min条件下培养30 h;取发酵30 h后的S2发酵液, 10 000 r/min离心, 弃去菌体, 加入3%的大孔吸附树脂XAD-16, 室温置于摇床震荡, 120 r/min, 24 h。吸附后的树脂用蒸馏水清洗至树脂表面无抗菌脂肽发酵液残留, 然后置于200 m L具塞三角瓶中, 加入60 m L无水乙醇, 室温下, 置于摇床 (120 r/min) 振荡洗脱24 h, 然后减压干燥, 即为抗菌脂肽粗提物。
1.2.4抑菌质量浓度最小值 (MIC) 测定采用倍比稀释法进行测定。用LB液体培养基将抗菌脂肽粗提物倍比稀释, 分成8个梯度。取培养液的时期很关键, 应当在鸡源大肠杆菌O2对数生长期。将其菌体浓度稀释, 数值应为106CFU/m L, 依次添加在不同质量浓度的抗菌脂肽LB液体培养基中, 在37℃, 转数为150r/min条件下培养, 20 h后观察鸡源大肠杆菌的培育状况, 以鸡源大肠杆菌O2不能培育为标准, 它在最小稀释浓度情况下, 抗菌脂肽质量浓度即抗菌脂肽粗提物MIC (最小抑菌浓度) 。
1.2.5抗菌脂肽对鸡源大肠杆菌O2生长曲线影响测定取活化状态的鸡源大肠杆菌O2液体菌种, 按5%接种量接种于LB培养基中, 试验共5组, 培养液体积均为100 m L, 在37℃, 转数为180 r/min条件下培养, 在不同的培养时间, 分别取样和加入不同浓度的抗菌脂肽, 测定OD600nm值, 绘制生长曲线。分组见表1。
1.2.6抗菌脂肽对鸡源大肠杆菌O2细胞膜通透性的影响观测将鸡源大肠杆菌O2培养到对数生长期, 可以使用LB液体培养基, 用离心的方法收集菌体, 转速为5 000 r/min, 时间为10 min, 然后用灭菌生理盐水洗涤3次, 最后用生理盐水稀释, 将菌体浓度调节到107CFU/m L。将菌悬液稀释, 再加入抗菌脂肽, 终浓度达到1 MIC。在37℃, 100 r/min的振荡器中培养, 依次在0、15、30、45、60、75、90、105和120 min取出菌悬液5 m L。用纤维素酯微孔膜过滤, 其规格为0.22μm, 然后用紫外分光光度计在260 nm处测定其吸光值, 绘制吸光度变化曲线图。
1.2.7抗菌脂肽对鸡源大肠杆菌O2显微特征影响的观测培养鸡源大肠杆菌O2种子液, 在对数生长期时, 按5%接种量接种至LB培养基中, 试验共3组, 培养液体积均为100 m L, 分为2个处理组和1个对照组, 分别添加脂肽粗提物和水, 处理方式见表2。37℃150 r/min条件下培养, 在培养3 h及4 h后分别取样, 按照以下说明的操作方法, 制备扫描及透射电镜标本。
1.2.7.1制备扫描电镜标本将处理组1和处理组2与对照组培养的鸡源大肠杆菌O2菌液用戊二醛 (2.5%) 固定2 h后涂片, p H 7.2的磷酸盐缓冲液洗涤3次, 待其自然风干, 将标本保存在高真空蒸发器中, 喷金镀膜, 置扫描电子显微镜下观察, 拍照。
1.2.7.2制备透射电镜标本分别对3组培养的鸡源大肠杆菌O2菌液用戊二醛 (2.5%) 固定2 h后离心取菌体, p H 7.2的磷酸盐缓冲液重复洗涤3次。然后用29%、51%、76%、94%乙醇顺序脱水1次, 时间为10 min, 再用无水乙醇脱水2次, 时间为10 min, 进行包埋, 59℃聚合50 h, 使用超薄切片机切片, 切片放在无载膜铜网上 (400目) , 用醋酸双氧铀染29 min, 再用柠檬酸铅进行复染29 min, 用蒸馏水冲洗, 38℃烘干, 在透射电子显微镜下观察和拍照。1.2.8抗菌脂肽对鸡源大肠杆菌代谢活力影响确定试验条件:确定甲瓒 (INT) 的最大吸收波长、氯化碘硝基四唑紫 (INT) 的最佳反应浓度以及最佳反应时间;将鸡源大肠杆菌培养至对数生长期, 在转速为4 999 r/min, 时间为10 min的条件下离心收集菌体。反复3次洗涤, 使用的是灭菌生理盐水洗涤, 然后用无菌生理盐水稀释, 调整菌体浓度到108CFU/m L, 分装于6~7个无菌试管中, 依次加入抗菌脂肽, 并使其终浓度达到0.125、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 mg/m L, 在温度为38℃恒温培养60 min, 10 000 r/min离心5 min, 收集菌体, 再用灭菌生理盐水反复洗涤3次, 用生理盐水将细菌浓度调节到108CFU/m L, 添加终浓度为1 mmol/L的氯化碘硝基四唑紫 (INT) , 并于37℃下作用55 min, 然后测定630 nm处吸光值, 判断不同浓度抗菌脂肽对鸡源大肠杆菌在不同时间孵育下菌体细菌代谢活力的影响。
2结果与分析
2.1 MMIICC测定结果通过倍比稀释法, 观察抗菌脂肽粗提物对鸡源大肠杆菌O2的抑制效果 (表3) , 结果显示, 其MIC (最小抑制浓度) 为0.5 mg/m L。
2.2抗菌脂肽对鸡源大肠杆菌抗菌O2生长曲线影响观察S2菌株产生的抗菌脂肽化合物粗提物对鸡源大肠杆菌生长曲线的影响 (图1) , 结果显示, 在细菌培养0 h及6 h时分别加入0.8 MIC抗菌脂肽, 对鸡源大肠杆菌O2的生长有抑制作用;6 h后, 鸡源大肠杆菌O2处于培育的高峰期, 而且细菌浓度很高, 加入抗菌脂肽, 抗菌脂肽的抑制作用就会大大降低。在对数期末 (12 h) 加入抗菌脂肽, OD540nm不会持续变小。另外, 伴随添加的脂肽浓度由1.0 MIC增加到3.0 MIC时, OD540nm减小幅度增大;当菌体浓度较大时, 抗菌脂肽的溶菌作用随其浓度的增加而增强。说明抗菌脂肽化合物对鸡源大肠杆菌O2具有明显的抑菌效果, 其效果存在浓度依赖效应。
通过透射电镜照片观察 (图4) , 可以看出, 对照组菌体边缘清晰、平整、密度高、透射度低, 无缺陷和断裂现象 (图a) 。而试验组则可以明显的看到菌体表面密度不匀、粗糙不平, 菌体边缘整齐度差、密度低、透射度高 (图b、c、d、e、f) , 有的细胞已经有一个小孔洞, 胞壁缺陷、菌体残缺不全。这些结果进一步说明脂肽化合物能够导致鸡源大肠杆菌细胞壁破裂或者孔洞形成, 导致内容物泄漏, 细胞代谢无法正常进行, 最终导致细菌细胞的死亡。
2.5抗菌脂肽对鸡源大肠杆菌O2新陈代谢的影响根据某种脱氢酶对鸡源大肠杆菌O2的活细胞作用, 并能够生成一种活化的[H]+, 而次活化的[H]+能够将INT (氯化碘硝基四唑紫) 中的四唑还原, 形成一种甲瓒的物质, 利用这种甲瓒生成的速率来推测和判断菌体细胞的代谢活力。产生[H]+ (氢离子) 增多说明菌体细胞活力越强, 还原产生的甲瓒物质越多, 颜色越红;反之, 产生[H]+ (氢离子) 越少说明菌体细胞活力越弱、还原产生的甲赞物质越少, 颜色越浅, 则OD630nm值越小。
确定甲瓒物质的最大吸收波长为630 nm (图5) , 确定INT (氯化碘硝基四唑紫) 最佳浓度为l mm, 最佳反应时间为55 min (图6) 。
鸡源大肠杆菌O2菌体细胞代谢活力的观察结果 (图7) 显示, 随着抗菌脂肽化合物质量浓度的增加, 其对鸡源大肠杆菌O2菌体细胞代谢活力的抑制作用逐渐增强;当抗菌脂肽质量浓度达到0.5 MIC以上时, 其对鸡源大肠杆菌O2菌体细胞代谢活力的抑制作用非常显著。说明随着抗菌脂肽化合物作用于鸡源大肠杆菌O2菌体细胞, 造成了细胞膜通透性增大, 细胞内部一些大分子物质发生了泄漏, 使菌体细胞代谢受阻, 活力下降。
3讨论
根据前期试验数据显示, 枯草芽孢杆菌S2菌株在24 h和48 h的发酵的代谢产物对细菌 (G+、G-) 抑菌圈差异明显, 而且24 h时的抑菌效果明显好于48 h;又根据本次试验结束, 30 h之前产生的抗菌脂肽化合物主要是以surfactins (表面活性素类) , 这与报道的surfactins (表面活性素类) 脂肽具有较好的抗菌效果相吻合, 表明S2菌株产生的抗菌脂肽在不同发酵阶段存在类型、浓度上的差异, 或者与发酵培养基成分有直接关系。因此, 关于S2菌株的进一步优化、发酵工艺筛选、稳定性及抗菌效果的提升改造等的研究, 对工业化生产及在畜牧上的应用具有重要的现实意义。
本试验初步探讨了抗菌脂肽粗提物对鸡源大肠杆菌O2的抑制机理, 在确定抗菌脂肽对鸡源大肠杆菌O2的MIC的基础上, 通过抗菌脂肽对鸡源大肠杆菌O2的生长曲线、菌体细胞膜通透性、菌体显微结构、菌体细胞代谢活力等诸多方面干扰的试验证实鸡源大肠杆菌对抗菌脂肽有很强的敏感性, 抑菌浓度最小值为0.5μg/m L。抑制细菌生长是抗菌物质对细菌的作用之一, 还有一方面就是杀灭细菌。杀菌作用方式又能分为2种, 一种是杀菌不能溶菌, 另一种就是杀菌且能溶菌[4]。抑制细菌的的生长曲线也分为2种, 抑菌和杀菌但不能溶菌的抗菌物质可以使细菌停止生长, 生长曲线变为停止生长曲线, 但也不会下滑, 维持在一个恒定的浑浊度;而杀菌且能溶菌的抗菌物质能造成菌体悬液浑浊度下降, 生长曲线下滑, 抗菌脂肽属于既能杀菌且能溶菌的抗菌物质。
根据“桶板模型理论”, 抗菌肽或抗菌脂肽插入质膜内并垂直于细孢膜方向, 在细胞膜上相木桶样排列, 其疏水侧链朝向外部的脂质环境, 极性侧链面向内构成跨膜孔道, 这些孔道足以使胞质大分子物质外漏而导致细胞死亡。通过抗菌脂肽对鸡源大肠杆菌O2菌体细胞结构的作用效果说明, 在该抗菌脂肽的作用下, 增大了鸡源大肠杆菌菌体细胞膜通透性, 很多离子、大分子蛋白质从细胞内丢失, 这种现象表明其抗菌作用是使其在菌体细胞膜上表面引起膜电荷改变, 造成膜结构紊乱, 形成孔道造成细胞内物质泄漏, 使细菌的渗透压失衡, 最终使细胞死亡[5,6]。
扫描、透射电镜显微的结构照片显示表明, 这种抗菌脂肽能够使鸡源大肠杆菌O2细胞壁破裂、细胞膜通透性增加, 主要表现为细胞膜形成孔洞导致细胞内一些物质泄漏, 从而使细胞的正常代谢无法进行, 使细胞生长受到抑制;严重的出现菌体断裂, 进而导致死亡, 起到了抑菌、杀菌和溶菌效果[7]。这一试验结果为如何更好的利用该脂肽、提高其杀菌效果提供了研究基础和理论依据。
相关研究表明[8], 某些脂肽抑制部分蛋白质的合成、可与细菌染色体DNA相互作用导致DNA正常结构的改变, 可能会进一步导致DNA的复制、转录、表达功能受抑制。而S2脂肽能否抑制部分菌体蛋白质的合成、能否进入到鸡源大肠杆菌细胞核内与细菌染色体DNA发生相互作用还有待进一步研究, 从而全面评价脂肽对鸡源大肠杆菌的抑杀作用。
参考文献
[1]刘向阳, 杨世忠, 牟伯中.微生物脂肽的结构[J].生物技术通报, 2005 (4) :18-27.
[2]陈萍, 冯芬, 杨恬, 等.脂肽类抗生素及其作用机制[J].微生物学杂志, 2015, 35 (5) :89-93.
[3]冯大兴.抗菌脂肽分离纯化的研究[J].现代畜牧兽医, 2015 (11) :9-14.
[4]Yoshida S., Hlradate S., Tsulamoto T., et al.Antimicrobial activity of culture filtrate of Bacillus amyloliquefaciens RC-2 isolated from mulberry leaves[J].phytoathology, 2001, 91:181-187.
[5]Yu G Y., Sinclair J., Hartman G, et al.Production of iturin A by Bacillus amylolique faciens suppressing Rhizoctonia solani[J].Soil Biol Biochem, 2002, 34:955-963.
[6]Chae G P., Makoto S., Hiroshi K.Suppressive effect of Bacillus subtilis and its productson phytopathogenic microorganisms[J].J Ferment Bioeng, 1990, 69:l-7.
[7]丁立孝.脂肽生物表面活性剂的发酵生产及其结构性质研究[D].杭州:浙江大学博士学位论文, 2004.