纯化工艺

纯化工艺（精选十篇）

纯化工艺 篇1

一般从材料中提取出来的粗多糖是多种不同性质多糖及其它杂质的混合物,要得到所谓的多糖纯品,即一定分子量范围内具有均一性的多糖,则需要进行纯化。

粗多糖纯化过程中游离蛋白杂质的去除很关键,常用的方法有Sevage法、三氯乙酸-正丁醇法等化学方法。近年来以吸附澄清剂作为澄清分离的方法在食品、医药方面得到了广泛深入的应用。它能很好的去除鞣质、蛋白、蜡质等胶体不稳定成份,对中草药有效成份如黄酮、生物碱、甙类、皂甙类、萜类、多糖、氨基酸、多肽、维生素、矿物质等不产生影响,安全无毒性,对胶体不稳定成份的一步清除率在70% 左右,二步清除率在90% 以上。ZTC1+1天然澄清剂是从食品中提取出的天然高分子物质,由A、B两种组分构成,一组份起主絮凝作用,另一组份则起辅助絮凝作用,采用最新“1+1”澄清技术,澄清效率高,适用范围广。本研究运用ZTC1+1天然澄清剂去除粗多糖中杂蛋白,取得了很好的效果。

纯化的方法还有色谱、超滤、电泳等。最常用的纯化多糖的方法是色谱法,包括离子交换色谱和凝胶色谱等,根据不同的多糖特性选用不同的色谱柱。柱层析法操作简便,分离效果好,重复性高,分离条件缓和,应用广泛。

本研究在蛹虫草多糖提取的基础上,采用乙醇沉淀、澄清剂除蛋白、离子交换层析、凝胶分离等方法对蛹虫草多糖进一步分离纯化,得到均一性多糖,为虫草多糖的结构研究和进一步应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

蛹虫草,由吉林省蚕业科学研究院提供,冷冻干燥,粉碎,过30目筛。

D-葡萄糖标品(批号:20130312)购自上海源叶生物科技有限公司。

ZTC1+1天然澄清剂,购自西安康之乐生物科技有限公司。由A、B两种组分构成,使用时均现配成质量分数为1%的溶液,备用。

水,一级纯水,自制。

其它试剂均为分析纯。

TY-CZ1024超声波清洗器(常州天亿电子设备有限公司),超声频率25KHz;AEL-200千分之一电子分析天平(岛津);YL-JJ1-20阳伦超纯水机(上海阳伦精密科技有限公司)。RE-50型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);DIONEX Ultimate3000制备型高效液相色谱仪(DAD、RI检测器,低压四元梯度泵,自动进样器)色谱柱:Agilent pLaquagel-OH MIXED(7.5mm×3000mm,8μm),数据处理:Chroneleon色谱工作站(美国戴安公司)。层析柱为实验室常规物品。

1.2 方法

1.2.1 分析测试方法

1.2.1.1 蛹虫草多糖含量测定［３］

按照NY/T1676-2008 中华人民共和国农业行业标准-食用菌中粗多糖含量的测定规定的方法进行。

1.2.1.2 蛋白质含量测定

考马氏亮蓝法、凯氏定氮法。

1.2.2 虫草粗多糖的制备

称取一定量的蛹虫草粉,用20 倍量的水于100℃热回流提取3次,每次90min,提取虫草多糖,提取液按8000r/min离心20 min,上清液过1μm滤膜,滤液减压浓缩至小体积,按1∶4的体积比加入无水乙醇醇沉,4℃静置过夜,倾去上清,沉淀冷冻干燥,即为粗多糖,备用。

1.2.3 蛋白质的去除

1.2.3.1 Sevage法除蛋白［４］

将氯仿与正丁醇按5∶1的比例混合。吸取制备的虫草粗多糖溶液100 mL于分液漏斗中,加入Sevage试剂,Sevage试剂与虫草多糖溶液的比例为3∶1。充分振摇,离心,如此反复6次。测定上清液的蛋白质含量和多糖含量。

1.2.3.2 改良的Sevage法除蛋白［５］

吸取制备的虫草粗多糖溶液100mL,用改良的Sevage法除蛋白。按照氯仿40%、正丁醇10%、甲醇2%、乙醇40%、氯化钠0.01% 的条件配制Sevage试剂,Sevage试剂与虫草多糖溶液的比例为1∶1,振荡萃取,离心,如此反复6次,收集上清液,测定上清液的蛋白质含量和多糖含量。

1.2.3.3 澄清剂法除蛋白

吸取制备虫草粗多糖溶液100 mL,加热到50~80 ℃,加入12 mL质量分数为1% 的B组分,每30min左右间隔搅拌1次,处理2h。2h后,定容至100mL,加入6mL质量分数为1%的A组分。30~60min后再搅拌1次。静置2~6h,离心10 min(8000r/min),上清液定容到100mL。连续处理3次。测定上清液的蛋白质含量和多糖含量。

1.2.4 蛹虫草多糖脱色

1.2.4.1 双氧水脱色

脱蛋白后的虫草多糖浓缩液100mL中加入6g质量分数为30%的双氧水,调pH值至3~4,于40℃恒温水浴反应6~7h,静置,过滤。加入滤液3 倍体积的无水乙醇,醇沉36h,离心10min(5000r/min),倒掉上层清液,取沉淀。沉淀用无水乙醇、甲醇、丙酮洗涤3~4次,留作测糖含量用。

1.2.4.2 活性炭脱色

脱蛋白后的虫草多糖液浓缩液100mL中加入1g活性炭,75℃ 恒温振荡2.5h,离心,弃沉淀,上清液过滤留作测糖含量用。

1.2.5 DEAE-52分离

按照常规方法处理DEAE-52 纤维素,装柱,柱子规格2.6cm×60cm。去蛋白的粗多糖上样,质量分数5%样液6mL,依次以水、0.05mol/L、0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L、0.5 mol/L、0.7mol/L、1mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱,收集,每管7mL,共收集30管。逐管苯酚硫酸法检测490nm下OD值,以管号为横坐标,以OD值为纵坐标,作图。

1.2.6 Sephdex G-100葡聚糖凝胶柱层析

按照常规方法处理Sephdex G-100,装柱,柱子规格2.0cm×60cm。将DEAE-52分离出的峰上样,质量分数5%样液6 mL,水洗,收集,每管7mL,共收集30管。以下同1.2.5。

1.2.7 蛹虫草多糖纯度检验

1)凝胶色谱法:制备的虫草多糖分别上葡聚糖凝胶G-200,水洗脱,收集,每管7mL,共收集30管。以下同1.2.5。

2)HPLC法:制备的虫草多糖分别上液相色谱,色谱柱为凝胶色谱柱,流动相为水,视差检测器及DAD检测器,观察吸收峰形状。

2 结果与分析

2.1 蛋白质去除

Sevage法除蛋白,蛋白质去除率61.31%,多糖保存率78.16%。改良的Sevage法除蛋白,蛋白去除率73%,多糖保存率76%。澄清剂法除蛋白,蛋白去除率93.4%,多糖保存率90.7%。澄清剂法除蛋白效果好。

2.2 脱色

2.2.1 双氧水脱色

双氧水处理,能达到脱色的目的,但是多糖含量降低了26%,损失比较大。双氧水脱色法适用于色素多含有不饱和双键、羟基、芳香环的物质,其脱色的原理是氧化,因此目的产物需具有稳定性、不易氧化的特点。双氧水脱色,色素氧化后的产物并未脱除,仍然存留,需要进一步去除。而且在脱色的过程中极有可能将多糖的链状结构破坏,影响多糖的抗氧化等活性。另外,双氧水脱色易受用量、温度、时间、pH值等因素影响,反应终点难以判断,双氧水残留不易去除干净。因此,确定不采用该法脱色。

2.2.2 活性炭脱色

活性炭能达到脱色的目的,但是多糖含量降低了43%。活性炭具有原料易得、操作简单、价格低廉等有点,但是多糖损失大,而且在脱色时pH需调至3.5左右,可能导致多糖变性,脱色后溶液中炭残渣难以去除,因此,确定不采用该法脱色。

2.3 DEAE-52分离

DEAE-52分离,经水及系列浓度盐洗脱,只有水洗出一个主峰,命名为蛹虫草多糖(CP),系列浓度的盐均未洗出峰。而且经DEAE-52 分离,颜色都挂在层析柱上,洗脱液无色,达到脱色的目的。水洗脱图见图1。

2.4 Sephdex G-100葡聚糖凝胶柱层析

水洗图见图2。

从图2可以看出,CP经葡聚糖凝胶G-100分离,洗脱出两个峰,分别命名为CP-1、CP-2。葡聚糖凝胶G-100可以将多糖很好的分离。CP-1、CP-2的冷冻干燥品见图3、图4。

3.5 蛹虫草多糖纯度检验

3.5.1 凝胶色谱法

CP-1凝胶色谱图谱见图5,CP-2凝胶色谱图谱见图6。

从5图可以看出,CP-1过葡聚糖凝胶G-200后,只有一个单一对称峰,可以初步判定CP-1为纯品。从图6 可以看出,CP-2 过葡聚糖凝胶G-200后,只有一个单一对称峰,可以初步判定CP-2为纯品。

2.5.2 HPLC法

CP-1 HPLC示差色谱图见图7,紫外色谱图见图8。

从图7、图8可以看出,CP-1在紫外检测器下有一微小峰,在示差检测器下均为对称单一峰,可以认为其为均一性多糖组分,对其图谱进行面积归一法积分,其峰面积所占比例即纯度为98%。

CP-2 HPLC示差色谱图见图9,紫外色谱图见图10。

从图9、图10可以看出,CP-2在紫外检测器下有一微小峰,在示差检测器下均为对称单一峰,可以认为其为均一性多糖组分,对其图谱进行面积归一法积分,其峰面积所占比例即纯度为97%。

3 结论

3.1 ZTC1+1天然澄清剂去除粗多糖中杂蛋白效果好,蛋白去除率93.4%,多糖保存率90.7%。

3.2粗多糖经ZTC1+1天然澄清剂去除杂蛋白后,依次采用DEAE-52、Sephdex G-100葡聚糖凝胶柱层析进一步分离纯化,得到两种均一性虫草多糖,其纯度均在97%以上。

4 讨论

4.1 有机试剂法在粗多糖脱蛋白过程中往往造成多糖的损失,而且有机试剂在使用的过程中对人有害,在制备的多糖纯品中有残留,不宜用作虫草多糖去除蛋白。本试验将ZTC1+1天然澄清剂应用到虫草多糖纯化,去除蛋白效率高,安全无毒,成本低,对重要成分虫草多糖没有影响。

大孔树脂分离纯化苜蓿皂苷工艺研究 篇2

大孔树脂分离纯化苜蓿皂苷工艺研究

研究D101大孔吸附树脂提取苜蓿皂苷的工艺条件及参数.优化工艺条件包括树脂载样量、稀醇洗脱浓度和体积,有效部位洗脱液醇浓度和体积等参数考察.纯化前固形物苜蓿皂苷含量为0.37%,纯化后固形物中苜蓿皂苷含量为5.8%.

作 者：许舒雯 龚祝南 丛晓东 张锋伦 作者单位：南京师范大学生命科学学院新药中心,江苏南京,210097刊 名：安徽农业科学 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF ANHUI AGRICULTURAL SCIENCES年，卷(期)：34(13)分类号：Q946关键词：大孔吸附树脂 提取 苜蓿皂苷

桔梗多糖提取纯化工艺研究进展 篇3

关键词：桔梗；多糖；提取；纯化

中图分类号：R932 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2016）09-0032-02

桔梗为桔梗科植物桔梗（Platycodon grandiflorum A. DC）的干燥根，具有降血脂、降血糖、抗炎、止咳化痰、抗肿瘤、抗氧化等功效。桔梗是药食同源的佳品，全国各地均有栽培。研究表明，桔梗多糖是桔梗中重要的生物活性物质之一，具有较好的抗肿瘤及增强机体免疫活性等作用，广泛应用于医药、保健食品。国内对桔梗多糖的提取纯化进行了大量研究，在查阅收集大量文献的基础上，综述近几年桔梗多糖的提取、分离纯化等研究进展，旨在为进一步进行相关研究提供参考。

1 提取方法

1.1 水浸提法

水浸提桔梗多糖是传统方法之一，成本低、不破坏生物活性、方便实用且安全性高，但耗时、提取率低。张晶等分析不同提取温度对桔梗多糖提取率及抗氧化性的影响，结果表明：50 ℃时桔梗多糖的提取率最高，为35.82%；提取率大小依次为50 ℃﹥40 ℃﹥60 ℃﹥30 ℃﹥20 ℃，与40 ℃的提取率相比差异不显著，与60 ℃的提取率相比差异显著，与20 ℃、30 ℃的提取率相比差异极显著。

韩美艳采用传统的水煮醇沉法提取桔梗多糖，分别考察提取温度、提取时间、料液比、提取次数对桔梗多糖提取率的影响，在单因素试验的基础上采用4因素3水平正交试验优化到的桔梗多糖提取工艺为：提取温度80 ℃，提取时间为2 h，提取次数为2次，料液比为1‥25。通过3次平行验证试验得出该方案下桔梗多糖的提取率为42.51%。

1.2 超声辅助提取法

超声波辅助提取是在水浸提的同时加超声波辅助。此法不仅缩短提取时间，提高提取率，同时避免高温对有效成分的影響。于侃超等采用单因素和正交试验，比较热水浸提法、超声波提取法和微波提取法提取桔梗多糖的最优条件，为其深入开发利用提供依据，结果表明，超声波提取法、微波提取法和水提取法的提取率分别为34.16%，31.30%和25.57%；超声波提取法和微波提取法优于传统的水提取方法，其中超声波提取法提取率最高，为34.16%；微波提取法提取时间最短，为4 min。

1.4 微波辅助提取法

微波辅助是在水浸提的同时加入微波，此法具有高效、快速、节能的优点。刘畅以桔梗多糖为研究对象，采用单因素分组试验法对桔梗多糖提取工艺（热水法、微波辅助提取法及超声辅助提取法）进行初步研究，比较料液比、温度、提取时间、微波功率、粒度等因素对多糖提取率的影响。结果表明，微波辅助提取时间最短且多糖提取率最高的最佳工艺条件为：微波功率250 W，微波时间4 min，粒度60目，料液比1‥40。

1.5 其它提取方法

除上述提取方法外，很多研究也尝试采用超声波辅助热水浸提法和微波协同酶解提取法、超临界二氧化碳提取法等提取桔梗多糖，均取得了较好的提取率。

刘畅采用单因素及正交实验对微波辅助热水浸提桔梗多糖工艺进行了研究，分析了料液比、温度、提取时间、微波功率、粒度、微波时间等因素对多糖提取率的影响。实验结果表明传统热水提取法的最佳工艺条件：浸提温度80℃，提取时间240 min，粒度80目，料液比1：20；微波辅助热水浸提桔梗多糖的最佳工艺条件：料液比1‥20，微波处理时间2 min，微波功率400 W，热水浸提温度80℃，粒度80目，热水浸提时间240 min。采取短时高频微波前处理利于多糖析出，再通过后续热水浸提，其多糖提取率为32.85%，高于传统热水浸提（16.59%）和微波提取（22.83%）。

迟宗磊等采用微波协同酶解法提取桔梗多糖，实验步骤：选择晒干的桔梗，粉碎后过40-80目筛，得桔梗粉，在桔梗粉中加水并搅拌均匀，桔梗粉与水的重量比例为1‥5-10，在水中浸泡8～16 h，加入纤维素酶酶解，再加入无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶，在微波条件下酶解，酶解后浓缩并脱色，离心，取上清液浓缩醇沉，再离心，采用乙醇清 洗沉淀，冷冻干燥后并粉碎，得桔梗多糖。

2 分离纯化方法

要想得到较纯的多糖，则需要除去粗多糖中非多糖组分。通过有机溶剂沉淀得到的多糖带有一些色素、蛋白质等杂质，所以粗多糖需进行脱色和脱蛋白处理。常用的脱蛋白的方法有Sevag法、盐酸法、三氟三氯乙烷、酶解等；常用的脱色的方法有双氧水脱色、树脂脱色、活性炭脱色、聚酰氨脱色等；纯化多糖的方法有分级沉淀法、季铵盐沉淀法、离子交换层析法、凝胶柱层析法等，但较为常用的是离子交换层析法和凝胶层析法。

华芳等以多糖损失率、蛋白脱除率为指标，比较Sevag法和三氯乙酸法（TCA）的桔梗多糖脱蛋白效果；以脱色率、多糖保留率为指标，比较不同质量分数的活性炭的桔梗多糖脱色效果；采用柱层析分离纯多糖的结果表明：用Sevag法脱蛋白、2%活性炭脱色，依次过DEAE-52纤维素和SephadexG-200，分离纯化得到PG和PG2两个多糖组分。

廖春燕等以蛋白去除率和多糖损失率为指标，比较Sevag法、三氯乙酸-正丁醇法、正丁醇法、AB-8大孔吸附树脂法去除桔梗多糖中蛋白质的效果。以脱色率和多糖保留率为指标，在单因素的基础上，采用正交试验对活性炭脱色工艺进行优化。结果表明：AB-8大孔吸附树脂脱蛋白的效果最好，蛋白去除率为90.1%，多糖损失率为17.4%；活性炭脱色的最佳条件为60 ℃下，调节pH6.0，加体积分数为0.5%的活性炭脱色20 min，脱色率为80.47%，多糖保留率为83.51%。

韩美艳采用Sevag法、盐酸法、三氯乙酸法、酶法、酶法与Sevag结合法等5种方法进行粗多糖脱蛋白，以蛋白清除率和多糖损失率为指标得到的最适方法为三氯乙酸法，蛋白清除率为89.35%，多糖损失率仅8.55%。脱色采用H2O2氧化法，条件为：多糖液‥H2O2=4‥1，用浓氨水或0.1%NaOH调pH值为8.8，37 ℃保温12 h。采用Sephadex G-25柱层析法脱盐及小分子物质。纯化后的桔梗多糖采用DEAE-纤维素52进行分离得到3种多糖。

3 结语

桔梗是药食兼用植物，具有极高的保健功效及生物活性，其中桔梗多糖是桔梗的有效成分之一。开展大枣多糖的提取、分离纯化等方面的研究，对大枣资源的进一步开发利用具有重要意义。

参考文献

[1] 韩美艳.桔梗多糖的提取、分离纯化和结构研究[D].郑州：郑州大学，2010.

[2] 廖春燕，黄惠.桔梗多糖脱蛋白方法的研究[J].食品工业科技，2011（9）：246-248.

[3] 刘畅.热水法？微波辅助法及超声辅助法提取桔梗多糖的比较研究[J] .当代化工，2016（7）：25-35.

[4] 华芳，王举涛，桂双英.桔梗边角料中桔梗多糖的分离纯化研究[J].中成药，2012，34（7）：1 380-1 382.

桑麻合剂提取纯化工艺研究 篇4

关键词：总黄酮,提取工艺,纯化工艺,正交设计,单因素筛选

桑麻合剂是广东省第二医院研制的医院制剂,由桑白皮、紫菀、甘草等12味药组成,具有清热宣肺、化痰止咳的功效,主要用于风热咳嗽症状。临床上以汤剂煎服,疗效确切。黄酮类成分为方中多味药材的主要药效成分之一[1,2],因此,本研究选用总黄酮含量和干浸膏得量作为评价指标,采用正交设计法和单因素优选法,分别优选其提取工艺和纯化工艺,以便更好地发挥该制剂的疗效。

1 仪器与试药

UV22501PC型可见分光光度计(岛津),Bp211D电子分析天平(德国,sartorius)。芦丁对照品(中国药品生物制品检定所,批号:100080-200306)。桑麻合剂所用药材均由广东广弘药业有限公司购得,经毕晓黎副主任中药师鉴定为正品;所用化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 提取工艺优选

2.1.1 正交试验设计

根据预试验结果,选择影响提取因素的料液比、提取时间、提取次数,进行优选,其因素水平设计见表1。

2.1.2 供试品溶液的制备

按处方比例,称取桑白皮、紫菀、甘草等12味药材共9份,每份136.6 g,按正交试验设计表L9(34)安排,分别提取,过滤,滤液分别浓缩并定容至200 mL。测定干浸膏含量和总黄酮含量。

2.1.3 干膏含量的测定

精密吸取各样品浓缩液25 mL,置已恒重的蒸发皿中,水浴蒸干,照干燥失重测定法(《中国药典》2010年版一部附录ⅨG)测定,计算干膏得量。

2.1.4 总黄酮含量测定[4]

2.1.4. 1 芦丁对照品溶液的制备

精密称取6 mg芦丁,精密称定,加95%乙醇定容至50 mL,得0.12 mg/mL的芦丁标准对照液。

2.1.4. 2 测定波长的确定

精密移取芦丁对照溶液10 mL置25 mL容量瓶中,振荡摇匀后,加入5%亚硝酸钠1 mL,摇匀静置6 min,再加入10%硝酸铝溶液1 mL,摇匀静置6 min,再加4.3%氢氧化钠10 mL,摇匀后,加蒸馏水稀释至刻度,摇匀放置15 min,以95%乙醇调零,从400 nm至600 nm进行全波长扫描,测得503 nm处有最大吸收,因此,以503 nm为测定波长。

2.1.4. 3 标准曲线的制备[4]

精密吸取上述对照品溶液2、4、6、8、10 mL至25 mL容量瓶,分别加蒸馏水稀释至10 mL,振荡摇匀后,自“加入5%亚硝酸钠1 mL”起,同测定波长的确定法操作,以试剂作空白,于503 nm下测定吸光值,以吸光度值(A)为纵坐标,芦丁质量浓度(C)为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程为:C=0.078 5A-0.000 3(r=0.998 7)。结果表明芦丁对照品在0.009 6～0.096 0 mg/mL呈线性关系。

2.1.4. 4 供试品溶液的制备与测定

精密吸取提取液2 mL,加蒸馏水定容至50 mL,摇匀,精密吸取稀释液1 mL,置25 mL容量瓶中,加蒸馏水稀释至10 mL,按上述方法操作显色,计算总黄酮含量。

2.1.4. 5 精密度试验

精密吸取芦丁对照品溶液0.6mL,置10 mL的量瓶中,按上述方法操作显色,平行测定6次,结果RSD=0.27%,表明精密度良好。

2.1.4. 6 稳定性试验

精密吸取上述供试品溶液0.6 mL,置10 mL的量瓶中,按上述方法操作显色,分别放置0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 min,测定各时间点的吸光度,结果RSD=1.79%,表明供试品溶液在90 min内稳定。

2.1.4. 7 重复性试验

精密吸取供试品溶液各0.6 mL,置10 mL量瓶中,按上述方法操作显色,测定吸光度,结果RSD=2.31%,表明重复性良好。

2.1.4. 8 加样回收率测定

精密称取已知黄酮含量的供试品5份,分别加入芦丁对照品适量,按上述方法操作显色,测定吸光度,计算回收率为98.9%,RSD=0.91%。说明该方法测定结果准确。

2.1.5 数据处理与工艺优选

用综合加权评分法,以干浸膏得量和总黄酮含量的9次试验的最大值为100分,将各指标成分的总量分别转换为评分值,总固体得量的加权系数为0.4,总黄酮含量的加权系数为0.6,将每次试验的各指标成分的评分值乘以相应的加权系数后求和,得综合评分值,以综合评分值计算正交试验结果,并进行方差分析,结果见表2、3。

注:F0.05(2,2)=19.00;F0.01(2,2)=99.00

结果表明:由直观分析可知因素主次为提取次数(C)>液料比(A)>提取时间(B)。方差分析表明,因素A和因素C对试验结果有显著影响,因素B对试验结果无影响。因此,提取工艺条件定为:处方药材加水提取3次,每次加8倍量水,提取1.0 h,即A2B1C3。

2.1.6 提取工艺验证

按处方比例,称取药材3份,每份136.6 g,按正交试验结果的最佳工艺条件重复试验3次,结果表明:干浸膏得量分别为:34.80、34.51、33.09 g,总黄酮含量为2.254、2.268、2.205 g,平均综合评分值为96.020。与正交试验最大综合评分值接近,提示优选的工艺稳定。

2.2 纯化工艺优选

2.2.1 药液含醇量的确定

取按上述提取条件制备的浸膏(浸膏-药材比为1∶1)3份,每份273.2,分别加乙醇至表4所示药液含醇量,冷藏静置24 h,取滤过,滤液回收乙醇,并定容至200 mL。分别照上述方法测定滤液固形物含量和总黄酮含量,剩余滤液回流煮沸30 min,冷藏放置24 h,观察药液澄明度,结果见表4。

结果表明:纯化药液含醇量为70%,可满足本品制成合剂的要求。

2.2.2 浓缩液相对密度的确定

取按上述提取条件制备的浸膏(浸膏-药材比为1∶1)4份,每份273.2 g,分别浓缩并加水调整至表5所示浓缩比,混匀,用密度计测定60℃时浓缩液的相对密度,浓缩液分别加乙醇至药液含醇量70%,冷藏24 h,滤过,滤液回收乙醇并定容至200 mL,测定各浓缩液中总黄酮含量,结果见表5。

结果表明:浓缩至相对密度为1.05～1.10(60℃)比较合理。

3 讨论

由于部分黄酮类成分具有易溶于乙醇和热水的特点,在含量测定过程中,浓缩液出现沉淀应充分摇匀后迅速取样,否则易造成测定结果的偏差。

中药复方药效成分复杂,作用靶点尚不清晰,因此,本制剂选择用水提取的工艺,更符合原汤剂合煎有效的特点。提取工艺筛选以总黄酮含量和干浸膏得量为评价指标进行综合评分,鉴于总黄酮含量比干浸膏得量能更好地反映药物提取情况,故在设计权重系数时,总黄酮含量权重系数较大,二者的权重系数设计为6∶4,这样相对合理些。经正交试验验证结果表明,优选的提取工艺参数稳定,可行。

本制剂纯化工艺采用了传统的乙醇沉淀工艺,试验分别对药液含醇量和浓缩液的相对密度两个重要的影响因素进行筛选,经稳定性考察,优选出的最佳醇沉工艺稳定,可满足本合剂对澄明度的要求。

参考文献

[1]杨乐,陈泣.桑白皮研究进展[J].江西中医学院学报,2007,19(3):98-100.

[2]侯海燕,陈立,董俊兴.紫菀化学成分及药理活性研究进展[J].中国药学杂志,2006,41(3):161-163.

[3]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社,2010:附录Ⅵ30.

[4]刘齐林,李雪婷,王沛,等.正交设计优选痛风宁的最佳提取工艺[J].辽宁中医杂志,2011,38(5):959-960.

纯化工艺 篇5

作者：于惠 康磊等

来源：《安徽农业科学》2015年第05期

摘要近几年，随着枸杞的化学成分和药理作用的广泛研究，枸杞总黄酮因具明显的抗氧化、清除自由基、提高免疫力等活性而逐渐成为研究热点，因此人们采用多种方法对枸杞黄酮进行提取分离。在此从枸杞黄酮的提取和分离提纯两方面进行总结，为今后的分离提纯提供参考依据。

关键词 枸杞；黄酮；提取；分离纯化；研究进展

中图分类号 S567；TS225.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）05-062-03 Research Progress of Separation and Extraction Flavones in Lycium barbarum YU Hui1，2，KANG Lei1，2，ZHANG Rui1，2 et al（1.State Key Testing Laboratory of Coal Chemical，Yinchuan，Ningxia 750002； 2.Chemical Laboratory Center of Ningxia Baota，Yinchuan，Ningxia 750002）

Abstract In recent years，the chemical composition and pharmacological function of Lycium barbarum has been extensively studied，the total flavones in Lycium barbarum has been gradually become a hot topic because of significant antioxidation，removal of the free radicals，enhancing immunity and other activities.Thus，many researchers used variety methods to separate and extract the total flavones from Lycium barbarum.The separation and extraction of total flavones from Lycium barbarum were summarized，providing a reference for separation and purification in future.Key words Lycium barbarum； Flavones； Extraction； Separation and purification； Research progress 基金项目 宁夏自然科学基金项目（NZ13255）。

作者简介 于惠（1986-），女，辽宁凌源人，工程师，硕士，从事分离型功能高分子材料研究。

收稿日期 20141226

龙源期刊网 http:// 枸杞（Lycium Barbarum）为茄科枸杞属，多年生落叶小灌木植物，是我国传统的药食两用同源植物之一[1]。枸杞的药用部位较多，明朝李时珍《本草纲目》记载：“春采枸杞叶，名天精草；夏采花，名长生草；秋采子，名枸杞子；冬采根，名地骨皮”。枸杞子为枸杞的成熟干燥果实，其活性成分主要包括色素类、多糖类、黄酮类化合物、多种氨基酸、维生素及微量元素[2]。枸杞子具有滋补肝肾、益精明目之功效，现代临床上广泛用于调节免疫功能[3]、抗氧化[4]、抗辐射[5]、抗肿瘤[6]、清除自由基[7]、促进益生菌细胞生长及抗衰老[8]等。枸杞叶，又名天精草，为茄科植物枸杞或宁夏枸杞的嫩茎叶，功能补肝益肾、生津止渴、虚劳发热。枸杞叶中的活性成分与枸杞子类似，其蛋白质含量极其丰富，另外据报道枸杞叶中含有丰富的有机锗，具有增强免疫力、延缓衰老的功效[9]。枸杞根皮，又称为地骨皮，为茄科、枸杞属植物枸杞的根皮，可入药，具有清热、凉血、降压、清肺降火等功效。我国枸杞有7个种3个变种，其中以宁夏地区生产的宁夏枸杞（Lycium Barbarum L.）最为著名[10]，青海、甘肃等地的枸杞品质也很高。近几年，枸杞的化学成分和药理作用被广泛的研究，作为枸杞中重要的活性物质之一，枸杞总黄酮因具明显的抗氧化、清除自由基、降血脂、降血糖、治疗心脑血管疾病、抗肿瘤、抗衰老、提高免疫力等活性而逐渐成为研究热点[11-12]。

枸杞中黄酮类化合物的提纯，主要包括以下两方面：一方面是提取，基于植物不同部位所含黄酮类化合物的结合状态不同，如在花、果、叶中以甙为主要存在形式，在木质部分以甙元为主要存在形式，需要根据被提取物的类型和理化性质选择合适的提取溶剂和提取方法；另一方面是分离纯化，目的是尽可能充分将黄酮类化合物与其他成分分开，并进一步分离得到黄酮类成分单体。笔者在此对近年来枸杞中黄酮类化合物的提取与分离纯化工艺的研究进展进行了系统总结。1 提取方法 1.1 有机溶剂提取法

有机溶剂提取法是国内外使用最为广泛的一种提取方法，主要以乙醇、甲醇、石油醚等有机溶剂作为提取溶剂，在索氏提取器中进行抽提。通常采用乙醇作为提取溶剂，提取的过程中，乙醇的浓度对黄酮类化合物的提取存在影响。高浓度的醇（90%～95%）适用于提取黄酮甙元类化合物，而低浓度的醇（60%～70%）更适合提取黄酮甙类化合物[13]。该方法操作简单、成本低，易于大规模生产，但工艺繁琐，杂质含量也较高，回收率低。李铭芳等采用70%的乙醇为溶剂回流提取宁夏枸杞中的总黄酮，通过正交试验，研究发现最优提取条件为提取温度70 ℃、提取时间2.0 h、固液比为1∶20[14]。刘兰英等以70%乙醇对枸杞叶进行回流提取，并通过正交试验确定了提取工艺条件为70%乙醇、料液比1∶

8、提取时间3 h、提取3～8 nm碎粒，黄酮得率为3.72%[15]。1.2 超声辅助提取法

超声波的作用机理是在被提取样品和溶剂之间产生声波空化效应[16]，破坏植物细胞并加速溶剂分子之间的运动，使植物细胞中的有效成分较易溶解于溶剂中，加速了植物有效成分的龙源期刊网 http:// 浸出提取。另一方面，超声提取过程中的空化作用还会增大样品与提取溶剂之间的接触面积，从而提高植物中活性成分从固相转移到液相的传质速率[17]。因此，对植物有效成分采用超声提取，可以在很大程度上加快提取速度，缩短了提取时间，进而提高了天然产物中活性成分的提取速率和提取量。该方法节省提取时间、提高提取效率、试验设备简单、操作方便，在工业生产中具有较为广阔的应用前景。王汉卿等通过正交试验优选出超声辅助提取枸杞叶总黄酮的最佳工艺条件为乙醇体积分数 65%、乙醇用量 1∶60、超声提取时间 35 min、超声温度 70 ℃；利用优选出的最佳超声提取工艺测定比较不同采收期枸杞叶中的总黄酮含量，结果为5月中旬含量最高[18]。孙化鹏等通过正交试验法优选出超声辅助提取枸杞叶总黄酮的最佳工艺条件为乙醇浓度75%、乙醇用量1∶40、超声提取时间30 min、超声提取温度50 ℃[19]。1.3 微波辅助萃取法

微波萃取又称微波辅助萃取（Miacrowaveassisted extraction，MAE），是利用微波的热效应对样品及其有机溶剂进行加热，从而将目标组分从样品基体中分离出来的一种新型高效分离技术。微波萃取过程是高频电磁波穿透萃取介质到达物料内部，微波能转化为热能，物料内部的温度迅速上升，使物料内部的压力超过细胞壁膨胀所能承受的压力，导致细胞膨胀破裂，从而促使有效成分自由流出，并溶解于萃取介质中[20]。微波加热不同于传统的加热模式，即热量由外向内传递，而是直接作用于内部和外部的介质分子，使整个物料同时被加热，即“体加热过程”，从而可克服传统的传导式加热方式所存在的升温较慢的缺陷。同时，微波所产生的电磁场可加速被萃取组分的分子由固体内部向固液界面扩散的速率，从而使萃取速率提高数倍，并能降低萃取温度，最大限度地保证萃取物的质量[21]。

与其他的提取方法相比较，微波辅助萃取具有如下优点：①选择性好。由于样品中各组分对微波的吸收能力存在差异，从而导致其温度不同，致使各组分从基体中分离的速度也存在差异。因此，微波萃取能对萃取体系中的不同组分进行选择性加热，可以使目标组分直接从基体中分离。②热效率较高。微波加热是内外同时加热的模式，由微波能量直接转化为热能，没有热传递造成的温度梯度和热量损失，因而加热均匀，热效率较高。③质量稳定。可以在较低的温度下完成萃取，有效地保护了被提取物的有效成分。④操作简单。微波萃取无需干燥等预处理，简化了工艺，减少了投资。

巨敏等以枸杞为原料，用乙醇作为提取剂，采用微波提取法对枸杞中总黄酮进行提取，以二次同归正交试验设计对结果进行优化分析，得出的最佳条件为乙醇浓度68.3%、微波时间100 s、微波温度73 ℃、微波功率300 W、液料比14.7∶1.0（ml/g），在最佳条件下，总黄酮的提取率为19.52 mg/g[22]。孙波等以芦丁为对照品，采用单因素试验和正交试验时影响枸杞总黄酮提取率的因素进行了考察，并优选出最佳提取工艺为乙醇浓度70%、料液比1∶30（g/ml）、微波辐射功率400 W、温度120 ℃、提取时间8 min，在此条件下枸杞总黄酮的含量为18.3 mg/g[23]。1.4 磁场强化萃取法

龙源期刊网 http:// 磁场强化萃取是一种借助外加磁场以强化化工分离过程的新技术，被称为“绿色分离技术”，它可以利用磁场产生的特殊能量来改变抗磁性物质的微观结构，使其理化性质发生变化[24]，同时通过影响反应速率来起到强化萃取的作用。周芸等以新鲜枸杞为原料，采用磁场强化萃取法提取枸杞黄酮，通过正交试验，得出优化磁场处理的最佳条件为：在磁感应强度 640 mT、磁化时间 40 min、磁化温度 65 ℃、浸提回流时间 60 min 的条件下，枸杞黄酮的提取率可达290.81 mg/100g[25]。李冰等发明一种利用磁性吸附树脂及外加磁场分离纯化葛根黄酮的方法，具体的工艺流程如图1所示。首先，将葛根粉碎置于微波萃取罐中，加入95%乙醇，微波萃取除去杂质后得葛根黄酮提取液；其次，将磁性吸附树脂装入树脂柱，置于可调磁场中，将葛根黄酮提取液流过树脂柱，收集解吸液，浓缩干燥后得葛根黄酮产品[26]。1.5 高压均质提取法

高压均质提取法是指利用柱塞泵将被分离物保持在一定的压力条件下，液料高速流过一个狭窄的缝隙时而受到强大的剪切力，同时还有液料与金属环接触产生的碰撞力以及由于静压骤降和骤升而产生的孔爆发力等综合力的作用，使原料中不透明、粒径较大的悬浊液转化成稳定细小的悬浊液的过程[13]。高压均质提取法可以将样品中的组成结构破粹到纳米级，利于目标成分的溶出，大大提高了样品的提取率。同时，操作时温度较低，因此对样品的破坏力较小，可以保持样品原有的性质。因此，该方法将在天然活性成分的提取方面展现越来越重要的作用[27]。

刘增根等考察了高压均质提取柴达木枸杞叶有效成分的最佳工艺及对有效成分进行了纯化，发现高压均质提取柴达木枸杞叶总黄酮的最佳工艺条件为乙醇体积分数 80%、料液比 1∶

10、均质压力 60 MPa、提取时间 30 min，在该条件下，提取物中芦丁质量分数为 10.53%，总黄酮质量分数为32.61%[28]。2 分离纯化方法

2.1 大孔吸附树脂吸附分离法

大孔吸附树脂（Macroporous Adsorption Resin，MAR）是由功能单体、交联剂等可聚合成分与致孔剂、分散剂等添加剂经悬浮或反相悬浮聚合制备而成的一类球状的多孔高分子吸附分离材料，其内部存在大大小小、形状各异、相互贯通的孔穴，即使在干燥状态下，其内部均具有较高的孔隙率，且存在大孔结构（一般在100～1 000 nm）。MAR不同于离子交换树脂，其本身不含可交换性功能基，它的吸附性主要依靠范德华力（包含色散力、定向力和诱导力等）和氢键的作用，同时，网状结构和很高的比表面积又赋予其良好的吸附性能和筛分性能，因此，MAR是一类不同于离子交换树脂的、集吸附和筛分性能为一体的分离型功能高分子材料。目前，国内外MAR的生产厂家主要有美国RohmHass、日本三菱化成公司、天津南开大学化工厂、华北制药厂树脂分厂、西安蓝晓科技有限公司、西安蓝深特种树脂有限公司、沧州宝恩化工有限公司、天津海光化工有限公司等，部分厂家产品的性能如表1～3所示[29-30]。

龙源期刊网 http:// 目前，MAR主用于皂苷类、黄酮及其苷类、蒽醌及其苷类、酚酸类、色素类及生物碱类等的分离纯化。利用MAR分离纯化中草药中的有效成分，有以下几点优势：首先，由于MAR独特的吸附性和筛分性，利用MAR分离纯化了多种单味中草药的有效成分，这为其他中草药的提取研究奠定了基础；其次，不断有新的MAR问世，这为中草药有效成分的分离富集提供了可供选择的保障。

胡晓莲等通过优选MAR，并考察其工艺参数，筛选合适的吸附树脂DA201，最佳的工艺条件为上样量10柱床体积（BV）、上样液浓度15 mg/ml、上样液流速1 BV/h，上样液pH=3，解吸洗脱剂乙醇浓度为40%、乙醇用量8 BV，富集纯化总黄酮得率75.85%，总黄酮纯度35.70%[31]。何彦峰等通过比较11种MAR的静态吸附解吸性能，筛选出适合纯化柴达木枸杞总黄酮的树脂类型HPD400；并进行动态吸附解吸试验，利用单因素和响应面法优化MAR纯化柴达木枸杞总黄酮，得到的的最佳工艺条为：以16.0 ml pH为4.0的柴达木枸杞总黄酮粗提液上柱，流速1.0 ml/min，充分吸附后用3 BV去离子水洗柱，然后用23.0 ml 80%乙醇溶液以流速1.0 ml/min进行解吸，枸杞黄酮的平均回收率为89.92%，含量为27.62%，约为纯化前总黄酮含量的5倍左右[32]。2.2 高效液相色谱法（HPLC）

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）又称“高压液相色谱”，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。HPLC具有高压、高效、高速、高灵敏度及应用范围广的特点。

董静洲等对宁夏枸杞果实黄酮提取液进行色谱柱分离，检测波长为259 nm，流动相 A为1.0%乙酸，流动相 B为甲醇，流速为1.0 ml/min；并对我国宁夏枸杞六大产区的枸杞果实总黄酮提取液进行了 HPLC 分离和 HPLC 指纹图谱比较[33]。张自萍等以10个宁夏不同产地的宁夏枸杞主栽品种“宁杞I号”样品建立枸杞黄酮类化合物指纹图谱共有模式，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件进行数据处理，对15个不同来源的枸杞样品进行了分析[34]。

安徽农业科学 2015年 3 展望

近几年，随着人们对枸杞黄酮的化学成分和药理作用不断深入研究，使枸杞黄酮愈来愈受到人们的重视。因此，通过不断地探索枸杞黄酮提取和分离纯化工艺研究的新方法，仍将是提纯枸杞黄酮的热点研究方向。

参考文献 [1]

龙源期刊网 http:// 国家药典委员会.中国药典第一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：225-226.[2] 王业勤，李勤生.天然类胡萝卜素[M].北京：中国医药科技出版社，1997：68-78.[3] LIN F Y，LAI Y K，YU H C，et al.Effects of Lycium barbarum extract on production and immunomodulatory activity of the extracellular polysaccharopeptides from submerged fermentation culture of Coriolus versicolor [J].Food Chemistry，2008，110（2）：446-453.[4] MA M，LIU G H，YU Z H，et al.Effect of the Lycium barbarum polysaccharides administration on blood lipid metabolism and oxidative stress of mice fed high-fat diet in vivo[J].Food Chemistry，2009，113：872-877.[5] QIAN J Y，LIU D，HUANG A G.The efficiency of flavonoids in polar extracts of Lycium chinense Mill fruits as free radical scavenger[J].Food Chemistry，2004，87（2）：283-288.[6] CHAO J C J，CHIANG S W，WANG C C，et al.Hot waterextracted Lycium barbarum and Rehmannia glutinosa inhibit proliferation and induce apoptosis of hepatocellular carcinoma cells[J].World J Gastroenterol，2006，12（28）：4478-4484.[7] HSU H Y，YANG J J，HO Y H，et al.Difference in the effects of radio protection between aerial and root parts of Lycium chinense[J].Journal of Ethnopharmacology，1999，64（2）：101-108.[8] YU M S，LEUNG S K Y，LAI S W，et al.Neuroprotective effects of anti-aging oriental medicine Lycium barbarum against β-amyloid peptide neurotoxicity[J].Experimental Gerontology，2005，40（8/9）：716-727.[9] ROMAGNOLO D F，SELMIN O I.Flavonoids and cancer prevention：a review of the evidence[J].Journal of Nutrition in Gerontology and Geriatrics，2012，31（3）：206-238.[10] 张云霞，王萍，刘敦华.枸杞活性成分的研究进展[J].农业科学研究，2008，29（2）：79-83.[11] 杨文君，肖明，吕新，等.不同采摘期对柴达木枸杞外观性状及活性成分影响[J].农产品加工，2014（15）：50-52.[12] 刘安军，刘慧慧，郭丹霄，等.大孔吸附树脂分离纯化枸杞叶总黄酮的研究[J].现代食品科技，2012，28（3）：292-296.[13] 马婷婷.宁夏枸杞叶黄酮类化合物的提取、纯化及抗氧化活性作用研究[D].银川：宁夏大学，2012.龙源期刊网 http:// [14] 李铭芳，李淑芳，汪小强，等.枸杞中总黄酮的分析方法及提取工艺研究[J].天津农业科学，2011，17（1）：46-50.[15] 刘兰英，曹有龙，赵友谊.枸杞黄酮提取工艺研究[J].安徽农业科学，2011，39（30）：18490-18491.[16] 李伟，刘亚青.超声波的空化作用在聚合物化工中的应用[J].科技情报开发与经济，2007，17（1）：132-134 [17] 许忠华，张洪波.超声清洗的空化作用机理[J].哈尔滨铁道科技，2009，4（2）：3-5.[18] 王汉卿，王文苹，闫津金，等.超声提取枸杞叶中总黄酮提取工艺及其不同采收期含量变化研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（8）：44-47.[19] 孙化鹏，钟晓红，张珉，等.超声提取枸杞叶总黄酮的工艺研究[J].现代生物医学进展，2009，9（14）：2645-2648.[20] 贾淑云.微波萃取技术在中药有效成分提取中的应用[J].中国处方药，2014，12（3）：34-35.[21] 马玉哲，张俊杰，李红霞.中药有效成分提取分离技术最新进展[J].河北理工大学学报：自然科学版，2009，31（1）：99-101.[22] 巨敏，杨鹏，朱沛沛，等.二次回归正交优化枸杞中总黄酮提取工艺的研究[J].中国酿造，2011（10）：94-96.[23] 孙波，王琨，郝鹏程，等.枸杞总黄酮微波辅助提取工艺的优化[J].安徽农业科学，2012，40（12）：7377-7379.[24] 杜娟，冯瑞玉，赵静，等.磁场改变物质理化性质及其分离效果的研究进展[J].河北化工，2006，29（11）：21-24.[25] 周芸，张珍，张盛贵，等.正交试验优化磁场法提取枸杞黄酮工艺[J].食品科学，2012，33（18）：98-101.[26] 李冰，赵巍，李琳，等.利用磁性吸附树脂及外加磁场分离纯化葛根黄酮的方法：中国，200710026481[P].2007-08-01 [27] 许亮，师俊玲，陈志娜，等.大孔树脂分离纯化宁夏枸杞总黄酮的研究[J].离子交换与吸附，2011，27（3）：202-211.龙源期刊网 http:// [28] 刘增根，党军，江磊，等.柴达木枸杞叶有效成分高压均质提取及纯化[J].精细化工，2011，28（4）：350-354.[29] 郭丽冰，王蕾.常用大孔吸附树脂的主要参数和应用情况[J].中国现代中药，2006，8（4）：26-32.[30] 郭立玮.中药分离原理与技术[M].北京：人民卫生出版社，2009：501-510.[31] 胡晓莲，张华.大孔吸附树脂富集枸杞子中总黄酮的工艺研究[J].食品与药品，2013，15（2）：94-97.[32] 何彦峰，杨仁明，胡娜，等.大孔吸附树脂纯化枸杞总黄酮的研究[J].食品工业科技，2012，33（18）：274-278.[33] 董静洲，王瑛.宁夏枸杞主要产区枸杞子总黄酮的测定与分析研究[J].食品研究与开发，2009，30（1）：36-40.[34] 张自萍，廖国玲，李弘武.宁夏枸杞黄酮类化合物HPLC指纹图谱研究[J].中草药，2008，39（1）：103-105.责任编辑 黄小燕 责任校对 况玲玲

龙源期刊网 http://

纯化工艺 篇6

关键词：大枣多糖；提取纯化；生物活性

中图分类号：R932 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2016）10-0062-02

大枣为鼠李科植物枣（Zizyphus Jujuba Mill.）的干燥成熟果实，其性甘、温，归脾、胃经，为药食同源植物，具有补中益气、养血安神和缓和药性的功效。研究表明，大枣多糖是大枣中含量最多、生物活性物质较明显的成分，具有免疫调节、抗衰老、抗癌等多种生理活性，广泛应用于医药、保健食品。国内对大枣多糖的提取純化、生物活性等进行了大量的研究，本课题在收集、查阅大量相关文献的基础上，综述近几年大枣多糖提取纯化及其生物活性等方面的研究情况，旨在为相关研究提供参考。

1 提取方法

大枣多糖的提取方法主要有热水浸提法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法和酶解辅助提取法等。

1） 热水浸提大枣多糖是目前最为常用的传统方法之一，此法成本低、不破坏生物活性、方便实用且安全性高，但耗时、提取率低。魏然通过研究优化得到热水法提取圆铃大枣多糖条件为：液料比20∶1、提取温度90 ℃、时间5.3 h，得率为5.27%±0.03%；各因素对多糖得率的影响顺序为：提取温度、提取时间、液料比、提取温度。

2） 超声波辅助提取是在水浸提的同时加超声波辅助，此法可以缩短提取时间、提高提取率，同时避免高温对有效成分的影响。魏然优化得到超声波法提取圆铃大枣多糖条件为：液料比12∶1、超声功率360 W、提取温度55 ℃、超声时间40 min，多糖得率为4.93%±0.03%；各因素对多糖得率的影响顺序为：超声功率、超声时间、提取温度、液料比。

3） 微波辅助提取是在水浸提的同时加入微波，此法具有高效、快速、节能的优点。韩秋菊等人采用微波浸提法提取大枣多糖，得到最佳工艺条件为：料液比（g/mL）1∶50、微波功率420 W、微波处理时间8 min，大枣多糖提取率为7.99%。

4） 酶解辅助提取目前使用的酶有纤维素酶、淀粉酶、中性蛋白复合酶法、木瓜蛋白酶、果胶酶、复合酶和酸性蛋白酶，均有较好的效果。陈晋芳等人采用果胶酶提取大枣多糖，最佳工艺条件为：pH 4.5、温度40 ℃、时间3 h、加酶量0.2%，多糖得率为3.84%。

2 纯化方法

要得到较纯的多糖，需对粗多糖进行脱色和脱蛋白处理，然后再进行纯化。目前，大枣多糖脱蛋白的方法有Sevag法、盐酸法、三氟三氯乙烷、酶解和壳聚糖絮凝等；脱色方法有双氧水脱色、树脂脱色、活性炭脱色、聚酰氨脱色、“填料型”冷电弧脱色，其中大孔树脂和聚酰氨层析较为常用；纯化方法有分级沉淀法、季铵盐沉淀法、离子交换层析法、凝胶柱层析法等，其中离子交换层析法和凝胶层析法较为常用。姚文华比较了Sevag法、三氯乙酸法、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和国产中性蛋白酶对大枣多糖的脱蛋白试验，量终确定木瓜蛋白酶的脱蛋白效果最佳，其工艺条件为温度60 ℃、pH 5.0、浓度10 g/L木瓜蛋白酶酶液与多糖液的体积比为0.4∶1.0、酶解时间90 min，蛋白除去率为91.8%。鲁小静、刘海霞、冯艳波等人采用大孔树脂对大枣多糖提取液脱色，均取得了较好的效果，提取液中色素的吸附率分别为91.74%，91.20%，86.59%。阿力木江·穆提拉将聚酰胺与其他脱色剂比较，结果表明，聚酰胺脱色效果比较好，骏枣粗多糖的回收率比较高。魏然等人将圆铃大枣粗多糖经DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-200柱分離纯化后得到4种多糖。

3 生物活性

3.1 抗氧化活性

罗莉研究发现，在抗氧化活性方面，超声辅助提取较热水提取的多糖高；同时，在一定的温度储存下，大枣多糖的抗氧化活性随着时间的延长呈现降低趋势；羧甲基化和硫酸化修饰对羟基自由基和ABTS自由基的清除能力有增强作用；羧甲基化使大枣多糖对DPPH自由基清除能力有减弱作用，但硫酸化大枣多糖对DPPH自由基清除能力却有增强作用；羧甲基化和硫酸化修饰对大枣多糖的还原力有减弱作用。

3.2 机体免疫调节活性

魏然的研究结果表明，制得的大枣多糖具有促进小鼠淋巴细胞增殖的作用，其中4种多糖均对小鼠的脾淋巴细胞有促进增殖的作用，并呈现量效关系，但各多糖之间的促增殖活性各不相同；ConA与YP1a，YP2两者之间具有协同作用；YP1a，YP2促淋巴细胞增殖作用强于YP3，YP4a。黄海英等人研究大枣多糖对气血双虚模型小鼠免疫功能的影响，结果表明，与空白对照组相比，大枣多糖能够显著提高腹腔巨噬细胞的吞噬能力，促进淋巴细胞的转换，以及增加血细胞、血小板等的数量，同时增加红细胞ATP酶活性。

3.3 抗肿瘤活性

刘晓连等人研究发现，试验得到的6种长枣多糖中的LJU-3的浓度为400 mg/L时，对人肝癌细胞株Bel7402、人胃癌细胞株BGC823、人鼻咽癌细胞株KB有一定的增殖抑制率，其IC50值分别为198，178，167 mg/L。张仙土等人研究发现，大枣多糖对S-180瘤细胞具有一定的杀伤作用，浓度越高，抑瘤率越高，肿瘤细胞生长周期时间越短，裸鼠生存时间越长，病理组织观察可见明显改变，为多糖治疗骨髓瘤提供了理论依据。

3.4 抗凝血活性

王娜等人研究发现：大枣粗多糖能够显著延长人体血浆的活化部分凝血活酶时间，而对凝血酶原时间和凝血酶时间无明显影响；不同品种大枣的抗凝血活性存在显著差异，其中灵宝大枣的抗凝血活性相对较好；不同提取方法和大枣干制方式下大枣粗多糖体外抗凝血活性也有很大差异，其中热风、真空冷冻干制大枣及碱提粗多糖能较好地保持粗多糖的抗凝血活性。

3.5 其他生物活性

大枣多糖还具有肝损伤保护、神经保护、影响动物生长性能和免疫功能、烟草保润等活性。

4 结语

大枣是药食兼用植物，具有极高的药用功效及保健功能，而大枣多糖是大枣中的有效成分，所以开展大枣多糖的提取纯化及其生物活性等方面的研究，对于大枣资源的进一步开发利用具有重要的意义。

参考文献

[1] 巴特.大枣多糖提取纯化工艺研究进展[J].农业科技与装备，2015（11）：52-54.

[2] 魏然.圆铃大枣多糖提取、纯化及生物活性研究[D].济南：山东农业大学，2014.

[3] 黄海英，于定荣，郭艳丽.大枣多糖对小鼠免疫功能的影响研究[J].人人健康，2016（2）：35.

[4] 王娜，马琳，谢新华.红枣多糖初步纯化及其对体外抗凝活性的影响[J].中国食品学报，2015，15（10）：141-146.

[5] 陈剑平，李中桂，张尚斌.大枣神经保护作用的活性组分筛选及其作用机制研究[J].中国药房，2016，27（25）：3 495-3 498.

二级反渗透法制备纯化水工艺说明 篇7

反渗透膜能去除无机盐、较大有机物、细菌、热源、病毒、较大悬浊物等, 因反渗透膜性能良好, 应用广泛, 所以运用二级反渗透法制备纯化水, 目前是一种应用最广的工作原理, 并对二级反渗透法制备纯化水各工艺点进行了详细说明, 为利用二级反渗透法制备纯化水提供了参考。

1二级反渗透法制备纯水的工艺流程

原水箱 (自来水) →原水增压泵→石英砂介质过滤器→活性炭吸附器→精细过滤器→一级加药系统→一级高压泵→一级反渗透设备→二级加药系统→一级淡水箱→二级高压泵→二级反渗透设备→紫外线照射或臭氧杀菌设备→纯化水箱→各纯化水用水处。

2二级反渗透设备工作原理

黄瓜放入盐水溶液中, 黄瓜中的水分子进入盐水溶液, 黄瓜会失水缩小, 盐水溶液会增加, 这就是自然界常见的渗透现象, 如果给盐水溶液加足够大的压力, 理想状态下, 盐水溶液中的水分子就会进入黄瓜, 使黄瓜变得更加粗壮, 盐水溶液因为失水, 盐水溶液的浓度就会增大, 这就是反渗透。这里的黄瓜表皮相当于半透膜, 只允许水分子通过, 而不允许盐离子通过。反渗透膜是一种用特殊材料加工方法制成的、具有半透性能的薄膜。它能在外加压力作用下使水溶液一些组分选择性透过, 从而达到淡化、净化或浓缩的目的。反渗透膜可以将重金属、农药、细菌、病毒、杂质等彻底分离, 整个工作原理均采用物理法, 不添加任何杀菌剂和化学物质, 所以不会发生化学变相。一、二级反渗透法就是两个反渗透膜组合在一起, 提高渗透效果的方法[1]。

3二级反渗透设备主要工艺流程说明

3.1原水箱

自来水、普通蒸馏水或普通去离子水称作原水, 原水箱用来储存原水, 沉淀水中的大泥沙颗粒等可沉淀物质, 同时缓冲原水管中水压过低或过高会对水系统造成的冲击。

3.2原水增压泵

原水增压泵为普通水泵, 用于给原水增压增速, 恒定供水压力, 稳定供水量。

3.3石英砂介质过滤器

采用砂芯滤板和纤维柱滤等多次过滤层的过滤器, 主要是去除原水中含有的泥沙、铁锈、胶体物质、较大的悬浮物等颗粒等机械性质的杂质, 采用电气动阀门或手动阀门控制或者全自动控制器进行反冲洗、正冲洗等一系列操作, 保证设备的过滤效果。

3.4活性炭吸附器

水中普遍存在氯气等能损害反渗透膜的气体, 制纯化水要求必须除尽氯气, 活性炭是广谱吸附剂, 所以系统采用果壳活性炭吸附器。果壳活性炭吸附器不但可吸附电解质离子, 还可进行离子交换吸附;另外由于吸附作用使表面被吸附复制的浓度增加, 因而还起到可吸附细菌和某些过渡金属、催化作用、去除水中的色素、异味、大量生化有机物、降低水的余氯值及农药污染物等其它的污染物。

3.5精密过滤器

精密过滤器采用孔径极细的滤芯为5μm熔喷滤芯, 对水中残留的悬浮物、非曲直粒物及胶体等物质去除, 防止大于5μm的杂质进入反渗透装置损坏膜的表面而降低反渗透膜的脱盐性能。

3.6一、二级加药系统

一级加药系统主要是加入阻垢剂, 阻止碳酸盐、二氧化硅等晶体析出。反渗透装置工作一段时间后, 反渗透膜特别是浓水端会出现碳酸盐、二氧化硅等盐浓度积大于其平衡溶解度常数而结晶析出, 损坏反渗透膜, 所以应在预处理后的水中加入阻垢剂。二级加药系统主要是加入氢氧化钠溶液, 氢氧化钠可以与活性炭吸附器中残余的氯离子生成盐, 也可以起到调节水的电导率的作用。

3.7一、二级高压泵

一、二级高压泵为高压水泵, 扬程可达150~200 m, 预处理的水通过精密的一、二级反渗透膜的阻力和所需的压力是非常大的, 所以一、二级高压泵用于给预处理后的水增压增速, 达到一定的水压和速度, 预处理的水才能通过一、二级反渗透膜。

3.8一、二级反渗透设备

通过反渗透膜过滤可滤除95%以上的电解质和大分子化合物, 包括胶体微粒和病毒等。由于绝大多数离子的去除, 使离子交换柱的使用寿命大大延长。反渗透设备是用足够的压力使溶液中的水通过反渗透膜而分离出来。反渗透设备的脱盐率提高、回收率高、运行稳定、占地面积小、操作简便, 反渗透设备在除盐的同时, 也将大部分细菌、胶体及大分子量的有机物去除。一级反渗透设备为预处理后的水第一次通过反渗透膜, 二级反渗透为预处理的水第二次通过反渗透膜, 一二级反渗透膜为串联关系。

3.9紫外线照射或臭氧杀菌设备

紫外线照射主要是用短波分解水中不易被活性炭吸附的甲醇、乙醇等小有机化合物使其转变成CO2和水而除去。臭氧杀菌设备杀灭由二次污染产生的细菌保证成品水的质量[2]。

3.10纯化水箱

用来储存成品纯化水, 以便及时输入到车间各用水处, 或以纯化水为原料制备注射用水。

4结语

二级反渗透设备的系统除盐率一般为98%~99%。基本可以满足各类生产对纯化水的要求, 对除盐率要求比较高的行业, 可以采用更多级的反渗透设备或者配合EDI装置来制得更高要求的纯化水。二级反渗透法制备纯化水脱盐率高、回收率高、运行稳定、占地面积小、操作简便, 能适应各类含盐量的原水, 是目前纯化水制备普遍采用的方法之一。

摘要：从二级反渗透法制备纯化水工艺流程入手, 介绍了二级反渗透设备工作原理, 并对二级反渗透法制备纯化水各工艺点进行了详细说明, 为利用二级反渗透法制备纯化水提供了参考。

关键词：二级反渗透法,工作原理,工艺流程,说明

参考文献

[1]余鹏, 吴磊明, 刘丹, 等.二级反渗透法制备纯化水的质量考察[J].中国医药科学, 2013 (4) :147-148.

大孔树脂纯化马兰总黄酮工艺研究 篇8

大孔吸附树脂是一类广泛运用于天然产物纯化的有机高聚物吸附剂,具有较好的选择性、高效的吸附效率、温和的解吸附条件以及价格低廉和再生处理简便等优点［4 － 5］,但目前不同型号的大孔树脂对不同植物中的化学成分具有不同的吸附性能,并且纯化工艺参数也不尽相同,所以本文对大孔树脂纯化中马兰总黄酮的工艺条件参数进行研究。

1 材料与方法

1. 1 材料与仪器

紫外分光光度计( UV759CRT) ,上海佑科仪器仪表有限公司; 十万分之一电子天平,赛多利斯仪器系统有限公司; 大孔吸附树脂( NKA - 9、HPD - 100、HPD - 300、HPD - 500、HPD - 750、HPD - 826、D - 101、AB - 8) ,沧州宝恩吸附材料科技有限公司。

马兰购自亳州药材市场,经安徽中医药大学中药标本中心黄和平副教授鉴定为菊科植物马兰Kalimeris indica ( L. ) Sch -Bip的干燥全草; 芦丁对照品来自中国药品生物制品检定研究院; 实验中所用的化学试剂均为分析纯。

1. 2 方法

1. 2. 1 样品制备

称取一定量干燥马兰药材,加16 倍量的40% 乙醇,提取3 次,每次2 h,合并提取液,过滤,浓缩,干燥至恒重,备用。

1. 2. 2 标准曲线

准确称取干燥后的芦丁对照品8. 6 mg,将75% 的乙醇置于25 m L容量瓶中定容至刻度,充分溶解后摇匀,得对照品溶液( 0. 344 mg/m L) 。分别量取0. 25、0. 5、0. 75、1. 00、1. 25 m L置于5 个5 m L容量瓶中,再分别加入5% 的Na NO2溶液0. 2 m L,摇匀,静置5 min后,加入10% 的Al ( NO3)3溶液0. 2 m L,摇匀,静置6 min后,加入4% 的Na OH溶液2 m L,然后,以75% 的乙醇定容,摇匀后静置15 min,以样品空白溶剂为参比液,在波长506 nm处测得其吸光度［6 － 7］。以所测得的吸光度值为纵坐标、稀释后对照品溶液的浓度为横坐标,绘制标准曲线,得以芦丁稀释后浓度为自变量,所测吸光度为因变量的线性回归方程: y = 0. 1125x + 0. 0081,R = 0. 9995。线性范围: 8. 72 ~ 52. 32 μg/m L。

1. 2. 3 树脂静态吸附- 解吸附

分别量取预处理后的NKA - 9、HPD - 100、HPD - 300、HPD- 500、HPD - 750、HPD - 826、D - 101、AB - 8 八种型号的大孔树脂各20 m L置于100 m L锥形瓶中,吸取表面水至树脂在锥形瓶内不能流动为准,然后分别加入20 m L 0. 0285 g干膏/m L的马兰黄酮提取液( 相当于0. 1 g生药/ m L) ,加入样液后前2 h每30 min震摇一次,每次震摇1 min,并于0、2、4、6、8、12、24 h分别吸取上清液1 m L稀释后测得吸光度并计算各时间段不同型号树脂的总黄酮吸附量。

总黄酮吸附量= ( 上样液浓度 × 上样液体积- 所取上清液浓度 × 所取时液体体积) /树脂体积

24 h后,将大孔树脂从锥形瓶中滤出,置于200 m L锥形瓶中,并加入70% 的乙醇100 m L,每30 min震摇一次,每次1 min,持续8 h,8 h后分别取上清液2 m L稀释后测吸光度并计算洗脱量和解吸率。

洗脱量= 洗脱液中总黄酮质量/树脂体积; 解吸率= 洗脱中总黄酮质量/饱和吸附量 × 100%

1. 2. 4 马兰总黄酮纯化条件优化

1. 2. 4. 1 上样浓度及洗脱速率的确定

取筛选出型号的大孔树脂若干,装入直径2 cm的色谱柱,装柱高度10 cm,然后分别将0. 1、0. 25、0. 5 g生药/m L的上样液以2 m L/min的流速上样完全后,梯度浓度的样液体积依次为20、40、80 m L,每个浓度平行上样两根色谱柱,待上样完全后,先以4 倍柱体积的蒸馏水对色谱柱冲洗,然后用4 倍柱体积的70% 乙醇分别对每个上样浓度的色谱柱以2 m L/min和4 m L/min的流速进行洗脱,收集乙醇洗脱液,并测吸光度,计算总黄酮转移率。

总黄酮转移率= 洗脱液中总黄酮质量/上样液中总黄酮质量 ×100%

1. 2. 4. 2 上样量的确定

同2. 4. 1 项下装一根色谱柱,配制筛选出的最佳浓度的上样液100 m L,以2 m L/min的流速上样,每5 m L收集一份流出液,收集20 份,待上样结束后每份流出液取1 m L,稀释后测吸光度,并计算流出液浓度。

1. 2. 4. 3 洗脱乙醇浓度的确定

以筛选出的树脂装柱四根,并以筛选出的上样浓度平行上样,2 倍柱体积的水冲洗后,分别以4 倍柱体积30% 、50% 、70% 及90% 浓度的乙醇进行洗脱,收集洗脱液,测吸光度后计算流出液黄酮质量和回收率。

1. 2. 4. 4 洗脱乙醇体积的确定

以筛选出的树脂装柱,并以筛选出的上样浓度上样,以2 倍柱体积的蒸馏水冲洗,然后用200 m L筛选出的浓度乙醇进行洗脱,洗脱液每10 m L收集一份,测吸光度并计算每份流出液的浓度。

2 结果与讨论

2. 1 静态吸附- 解吸附结果

以八种型号的静态吸附结果做静态吸附曲线,见图1,并计算各型号树脂的饱和吸附量、解吸量和解析率,见表1。结果显示各型号的树脂在静态吸附2 h后几乎接近饱和,其中以HPD - 300 型树脂的饱和吸附量最高,达到5. 64 mg / m L,并且解析率也最高,达到82. 54% ; D101 型树脂的饱和吸附量最低,为5. 29 mg/m L,HPD - 500 型树脂的洗脱率最低,仅为33. 64% 。所以选择HPD - 300 型树脂对马兰总黄酮进行纯化。

2. 2HPD - 300 树脂纯化马兰总黄酮的工艺条件优化结果

2. 2. 1 上样浓度及洗脱速率

对HPD - 300 树脂纯化马兰总黄酮的工艺条件进行筛选,得到不同上样液浓度及不同洗脱速率的结果,见表2。结果显示,当上样液浓度为0. 1 g生药/m L,洗脱液速率为2 m L/min时,醇洗脱总黄酮量为83. 30 mg,总黄酮转移率为78. 13% ,均为最高值,所以对上样浓度和洗脱速率的筛选结果分别为0. 1 g生药/ m L和2 m L / min。

2. 2. 2 最大上样量

对HPD - 300 树脂纯化马兰总黄酮时的上样量的选择结果见图2,由图2 可见,在第15 份流出液后,也就是75 m L时,流出液浓度保持不变,说明此时树脂已经吸附饱和,上样量达到最大。

2. 2. 3 最佳洗脱乙醇浓度

以同体积不同浓度的乙醇对上样树脂柱进行洗脱,得到不同的总黄酮回收率,见表3。表3 显示90% 乙醇洗脱时,流出液黄酮质量和回收率最高,故选择洗脱乙醇浓度为90% 。

2. 2. 4 最低洗脱乙醇量

以90% 乙醇对上样树脂柱进行洗脱,测定不同体积的流出液浓度,乙醇体积与流出液浓度关系见图3。由图3 可知,第7份( 每份10 m L) 流出液后的流出液浓度已经很低,并保持稳定,所以洗脱乙醇体积为70 m L( 约2 倍柱体积) 。

3 结论

本研究通过对八种不同型号的大孔树脂进行了静态吸附-解吸附的筛选,发现HPD - 300 型树脂对马兰中总黄酮的吸附和解吸附效果最好,于是选定HPD - 300 型树脂对马兰中总黄酮进行纯化,并进一步对纯化工艺条件进行优化,最后确定的纯化工艺条件为: 0. 1 g/m L的上样浓度,2 m L/min的洗脱速率,0. 239 g生药/m L的最大上样量以及90% 的最少洗脱乙醇浓度和2 BV的大孔树脂用量; 以上述实验所得工艺条件纯化马兰中总黄酮时,含量可达到56. 34% ,纯化效果显著。

参考文献

[1]刘跃钧,姜根平,兰冬香,等.野生马兰研究开发现状概述[J].中药材,2011,34(6):992.

[2]王镠园.马兰的综合研究分析[J].现代医药卫生,2013,29(1):86.

[3]涂朝勇,田徽,王建,等.路边菊水煎液抗实验性胃溃疡的研究[J].时珍国医国药,2009,20(10):2595.

[4]刘安军,刘慧慧,郭丹霄,等.大孔吸附树脂分离纯化枸杞叶总黄酮的研究[J].现代食品科技,2012,28(3):292-296.

[5]矫晓丽,董琦,迟晓峰,等.大孔树脂分离纯化藏药白花龙胆花总黄酮的研究[J].离子交换与吸附,2012,28(3):231-239.

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010版一部[M].北京,中国医药科技出版社,2010:30.

大孔树脂纯化野葛总黄酮的工艺研究 篇9

1 仪器与试药

1.1 试药

野葛购于张仲景大药房,用粉碎机粉碎后过40目筛备用。葛根素标准品(购于中国药品生物制品检定所,批号:110752-200912)。HPD-750、HPD-600、AB-8、ZKA-Ⅱ、ADS-17等型号大孔树脂由河北沧州宝恩化工有限公司提供。95%乙醇、盐酸、氢氧化钠等试剂均购自天津市化学试剂三厂,且均为分析纯。

1.2 仪器

JA3003型电子天平(上海天平仪器厂),3200B型超声波清洗器(50 HZ,220 V,150 W,昆山市超声仪器有限公司),UV-2000型紫外可见分光光度计(尤尼柯仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 试验方法

2.1.1 样品总黄酮含量的测定

以葛根素为标准品,在250 nm波长处测定吸光度,以质量浓度为纵坐标(C),以吸光度为横坐标(A),得线性回归方程为:C=-0.000 4+0.011 4A,r=0.998 4。

2.1.2 野葛粗提液的制备

将处理过的野葛粉,按固液比1∶8加入95%乙醇浸润1 h。回流提取,抽滤并浓缩成上样液。取样测定总黄酮质量浓度。

2.1.3 大孔树脂预处理

新树脂先用乙醇覆盖,浸泡至充分溶胀,然后用乙醇洗涤至洗涤液无浑浊。再用蒸馏水洗净乙醇,转入酸碱处理。加入3%～5%盐酸溶液浸泡2 h后,用同样浓度5～7倍体积量盐酸溶液淋洗,再用纯水充分淋洗,直至出口洗涤液pH值呈中性,然后以5%氢氧化钠溶液按以上方法浸泡2 h,并用同样方法淋洗至通完5～7倍体积量氢氧化钠溶液,再用水充分淋洗直至出水pH值呈中性,即可再次投入使用[6,7]。

2.1.4 树脂筛选试验

准确称取处理好的HPD-750、HPD-600、AB-8、NKA-Ⅱ、ADS-17型号树脂各1.00 g置于烧杯中,分别加入20 mL野葛粗提液(总黄酮质量浓度44.80 mg/mL)。每5 min振动1次,持续2 h,静置24 h,使树脂达到饱和吸附,抽滤得澄清溶液,测定吸光度并计算各种树脂对野葛总黄酮的吸附量。将5种饱和吸附树脂置入烧杯中,分别加入20 mL 70%乙醇进行超声解吸,每10 min超声2 min,持续2 h,静置24 h,使树脂充分解吸。抽滤得解吸液,测定吸光度并计算各种树脂对野葛总黄酮的解吸率[8,9,10]。

Q=(C0-Cr)×V/W

A=(C0-Cr)/C0×100%

R=Cd×Vd/(Q×W)×100%

式中:Q为吸附量,单位mg/g;C0为初始浓度,单位mg/mL;Cr为剩余浓度,单位mg/mL;V为溶液体积,单位mL;W为树脂质量,单位g;A为吸附率,单位%;R为解吸率,单位%;Cd为解吸液浓度,单位mg/mL;Vd为解析液体积,单位mL。

2.1.5 动态吸附试验

取静态吸附试验筛选出的理想树脂20 g,湿法装柱(2 cm×30 cm),对于吸附泄露曲线、上样液的浓度及pH值等因素进行动态吸附试验,以获得该树脂的动态试验最佳工艺条件[11,12]。

2.2 结果分析

2.2.1 大孔树脂的静态吸附与解吸能力比较

分别测定了5种树脂的饱和吸附量及解吸率,通过比较优选出综合性能较好的1种树脂,用于后续的动态试验研究。不同种类树脂的静态吸附和解吸结果,见表1。

从表1中可以看出,AB-8、NAK-Ⅱ以及ADS-17型大孔树脂的饱和吸附率较大,均大于130 mg/g,其中AB-8及NAK-Ⅱ型树脂的解析率均大于75%。此外,由于AB-8型树脂廉价易得,综合考虑选择AB-8型大孔树脂进行后续动态试验。

2.2.2 上样液浓度的影响

取提取液(总黄酮浓度29.46 mg/mL)10 mL,分别稀释0、2、3、5、7倍,以2BV/h的流速进行动态吸附,之后用5BV水以2BV/h的流速洗脱,再以70%乙醇以2BV/h的流速洗脱,收集洗脱液,测定吸光度。见图1。

从图1中可看出,上样液浓度对于野葛总黄酮的吸附影响较大。若上样液浓度低,传质未进行彻底就可能泄漏,且吸附处理时间延长,效率降低,不利于实际工业生产;若上样液浓度太大,则黏度大,传质速度变慢,黄酮未吸附就已泄露,吸附率依然低下。因此,当上样液浓度约为9.82 mg/mL时,树脂吸附率最大,可达91%以上。

2.2.3 动态吸附泄露曲线

取野葛粗提液(总黄酮浓度9.82 mg/mL)加于柱顶,以2BV/h的流速进行动态吸附,收集流出液,于250 nm处测定吸光度,绘制泄露曲线。见图2。

从图2可看出,树脂在吸附1BV时就有轻微泄漏,上样量超过2BV后,洗脱液浓度变化不大,在4BV时基本达到饱和,可知树脂的动态平衡吸附浓度为9.41 mg/mL,从经济角度考虑,上样量选择2BV。

2.2.4 动态解吸曲线

将上述经动态吸附的树脂,先用5BV水以2BV/h的流速洗脱,再以70%乙醇以2BV/h的流速洗脱,收集洗脱液,测定吸光度,绘制该树脂的解吸曲线。见图3。

由图3可知,采用70%乙醇洗脱基本没有拖尾,洗脱液用量为4BV时,基本可将吸附的总黄酮洗净。

2.2.5 乙醇体积分数的影响

取一定量提取液(总黄酮浓度为9.82 mg/mL),以2BV/h的流速进行动态吸附,之后用5BV水以2BV/h的流速洗脱,再分别用体积分数为10%、30%、50%、70%、90%的乙醇以2BV/h的流速进行洗脱,收集洗脱液,测定吸光度。见图4。

从图4中可看出,对于AB-8这种弱极性树脂来说,当乙醇体积分数过小,极性较大,柱上吸附的总黄酮不易解吸。因此,当乙醇体积分数为70%,洗脱效果较好,解析率可达92%以上。

2.2.6 洗脱pH的影响

取一定量提取液(总黄酮浓度9.82mg/mL),用1 mol/L的HCl或1 mol/L的NaOH调节pH值为1～2、3～4、5～6、7～8、9～10,之后用5BV水以2BV/h的流速洗脱,再以70%乙醇2BV/h的流速洗脱,收集洗脱液,测定吸光度。见图5。

由图5可知,当pH在5～6范围内,动态洗脱效果较好,解析率可达93%以上。

3 讨论

通过考察5种不同型号的大孔树脂对于野葛总黄酮提取液的吸附率及解析率,优选出AB-8型树脂。选用AB-8型树脂装柱,进一步通过动态试验获得AB-8型树脂最优工艺条件为:上样液浓度9.82 mg/mL,上样液体积2 BV,洗脱剂乙醇体积分数70%,洗脱pH 5～6,可达较好的吸附及解吸效果。其吸附率吸附率可达91.21%,解吸率可达93.61%。试验中发现再生树脂的吸附率有明显下降,需要进一步试验可行的树脂再生方法,以提高其工业化应用价值。

摘要：目的 对野葛提取液中总黄酮的纯化分离进行了研究,旨在促进野葛药用价值的进一步发展。方法 通过对5种不同型号的大孔树脂:HPD-750、HPD-600、AB-8、NKA-Ⅱ、ADS-17进行静态吸附解吸试验,筛选出AB-8型树脂进行动态试验,确定最佳纯化工艺条件。结果 所得最佳条件为:上样液浓度9.82 mg/mL,上样液体积2BV,洗脱剂乙醇体积分数70%,洗脱pH 5～6,在此条件下吸附率可达91.21%,解吸率可达93.61%。结论 AB-8型树脂有较好的综合性能,可用于野葛提取液总黄酮的纯化。

牛蒡菊糖的提取工艺及其纯化的研究 篇10

菊糖是由果糖分子通过β (2→l) 键连接, 末端常含有一个葡萄糖基, 是自然界中天然存在的可溶性纤维之一, 是一种在人体内可延长碳水化合物的供能时间, 而又不显著提高血糖水平, 代谢不需要胰岛素的碳水化合物。菊糖具有多种生物活性, 如:清除自由基、止咳、促进肠道内双歧杆菌和乳酸菌的生长和增殖, 抑制病原菌、长效释放能量和替代脂肪等, 在食品工业中有着良好的应用前景。据资料报道, 菊糖作为植物的储备多糖广泛存在于3 600种植物内, 例如菊芋、牛蒡、洋蓟、天冬、洋葱、韭菜、大蒜、大丽花和小麦等。

菊糖的提取方法常用的有:热水浸提法、酸浸提法、碱浸提法、微波辅助萃取法、超声波提取法以及酶法等。其中利用酶法提取牛蒡菊糖的研究, 目前报道较少。本试验采用酶法提取牛蒡菊糖, 对牛蒡中的菊糖进行了提取和脱色纯化的研究, 旨在为开发利用这一植物资源提供科学依据。

1 试验材料与方法

1.1 原料与预处理

牛蒡购自徐州市百惠佳美时超市。鲜牛蒡根用自来水洗净、去皮并切成薄片, 干燥至质量恒定, 粉碎, 过40目筛, 置于磨口瓶中备用。

1.2 试剂与设备

纤维素酶 (1万U/g) 、酸性蛋白酶 (10万U/g) 、中性蛋白酶 (13万U/g) 、碱性蛋白酶 (10万U/g) 、木瓜蛋白酶 (65万U/g) 、胰蛋白酶 (3 500U/g) 和果胶酶 (10万U/g) , 天津市诺奥科技发展有限公司;D202大孔强碱性苯乙烯系阴离子树脂、966大孔树脂, 江苏色可赛思树脂有限公司;D215大孔强碱阴离子交换树脂、D309脱色专用树脂、XDA-1大孔树脂和D208脱色专用树脂, 西安电力树脂厂。其他试剂均为分析纯;水为蒸馏水。

7230G型可见分光光度计、FA2104N电子天平, 上海精密科学仪器有限公司;PC-1000数显式电热恒温水浴锅、GZX-DH-600电热恒温干燥箱, 上海跃进医疗器械厂;DZF-6020型真空干燥箱, 上海精宏试验设备有限公司;DL-5低速大容量离心机, 上海安亭科学仪器厂。

1.3 牛蒡菊糖的提取

1.3.1 单酶的确定

单酶:纤维素酶、胰蛋白酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。

设定在50℃下, 固液比为1∶15, 根据各种酶的活力不同加入一定量的单酶, pH值根据加入酶类选取最佳条件, 分别酶解4h, 90℃灭酶10min, 取出冷却, 于离心机 (4 000r/min) 离心10min, 取上清液量体积, 分别稀释到一定的倍数, 于分光光度计上测定吸光度, 分别测定总糖和还原糖的含量, 从而计算出菊糖提取率, 确定最佳单酶。

1.3.2 单因素试验

1.3.2. 1 提取温度对菊糖提取率的影响

准确称取4g牛蒡粉, 加入60mL蒸馏水配制成固液比1∶15, 在pH酸度计上将pH值调至7, 加入0.4g (10% (m/m) ) 木瓜蛋白酶, 分别在40、45、50、55和60℃下于振荡器中水浴4h, 取出冷却, 于离心机中4 000r/min离心10min, 取上清液, 分别稀释相应的倍数, 测定总糖和还原糖的含量, 计算出菊糖提取率, 确定最佳提取温度。

1.3.2. 2 pH值对菊糖提取率的影响

准确称取4g牛蒡粉, 加入60mL蒸馏水配制成固液比1∶15, 在pH酸度计上将pH值分别调至5、6、7、8和9, 加入0.4g (10%) 木瓜蛋白酶, 在50℃下于振荡器中水浴4h, 取出冷却, 于离心机中4 000r/min离心10min, 取上清液, 分别稀释相应的倍数, 测定总糖和还原糖的含量, 计算出菊糖提取率, 确定最佳pH值。

1.3.2. 3 固液比对菊糖提取率的影响

准确称取4g牛蒡粉, 分别加入36、48、60、72和84mL蒸馏水配制成固液比1∶9、1∶12、1∶15、1∶18和1∶21, 在pH酸度计上将pH值调至7, 加入10%木瓜蛋白酶, 在50℃下于振荡器中水浴4h, 取出冷却, 于离心机中4 000r/min离心10min, 取上清液, 分别稀释相应的倍数, 测定总糖和还原糖的含量, 计算出菊糖提取率, 确定最佳固液比。

1.3.2. 4 酶解时间对菊糖提取率的影响

准确称取4g牛蒡粉, 加入60mL蒸馏水配制成固液比1∶15, 在pH酸度计上将pH值调至7, 加入0.4g (10%) 木瓜蛋白酶, 分别在50℃下于振荡器中分别水浴2、3、4、5和6h, 取出冷却, 于离心机中4 000r/min离心10min, 取上清液, 分别稀释相应的倍数, 测定总糖和还原糖的含量, 计算出菊糖提取率, 确定最佳时间。

1.3.2. 5 加酶量对菊糖提取率的影响

准确称取4g牛蒡粉, 加入60mL蒸馏水配制成固液比1∶15, 在pH酸度计上将pH值调至7, 分别加入6%、8%、10%、12%和14%的酶, 在50℃下于振荡器中水浴4h, 取出冷却, 于离心机中4 000r/min离心10min, 取上清液, 分别稀释相应的倍数, 测定总糖和还原糖的含量, 计算出菊糖提取率, 确定最佳加酶量。

1.3.3 正交试验

选取3个主要影响因素, 选用三因素三水平L9 (33) 正交表进行试验。

1.4 牛蒡菊糖的脱色

采用静态吸附法, 即在20mL菊糖提取液中加入4g树脂于150mL锥形瓶中, 恒温振荡2h (120r/min) 。振荡结束后, 过滤后取过滤液, 将pH值调至6.5, 测定溶液在420、520和620nm的吸光度, 比较不同树脂的脱色率、菊糖保留率。

脱色率= (OD脱色前-OD脱色后) /OD脱色前100%

其中, OD=OD420+OD520+OD620

1.5 分析方法

1.5.1 菊糖含量的测定

总糖的测定:采用苯酚-硫酸法, 以葡萄糖为标准, 以吸光度 (A) 为纵坐标, 糖浓度 (C) 为横坐标, 绘制标准曲线, 得线性回归方程:y=0.0586x-0.0318, R2=0.9997。计算出总糖的含量。

还原糖的测定:采用3, 5-二硝基水杨酸法法, 以葡萄糖为标准, 以吸光度 (A) 为纵坐标, 糖浓度 (C) 为横坐标, 绘制标准曲线, 得线性回归方程:y=0.0197x-0.0435, R2=0.9992。计算出还原糖的含量。

总糖含量减去还原糖含量既为菊糖的含量。

1.5.2 菊糖提取率的测定

菊糖提取率=样品中菊糖含量/原料中菊糖含量×100%

2 结果与分析

2.1 牛蒡菊糖的提取

2.1.1 最佳单酶的确定

于7支具塞试管中加入相同质量的牛蒡粉, pH值取各个酶的最佳值, 在50℃、固液比为1∶15和酶解时间4h条件下, 根据各种单酶的酶活的不同, 分别加入相同酶活的单酶, 对牛蒡菊糖的提取率见表1。

由表1可知:在胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶这7种单酶中, 牛蒡菊糖提取率最高的是木瓜蛋白酶, 为50.81%, 所以在以下试验中采用木瓜蛋白酶进行单因素的研究。

2.1.2 提取温度对菊糖提取率的影响

准确称取4g牛蒡粉, 在pH值7、固液比1∶15、加酶量0.4g (10% (m/m) ) 、时间为4h的条件下, 分别在40、45、50、55和60℃, 来研究提取温度对牛蒡菊糖提取率的影响, 结果如图1所示。

由图1可知:在温度50℃时, 木瓜蛋白酶菊糖提取率最高, 为56.06%。

2.1.3 pH值对菊糖提取率的影响

准确称取4g牛蒡粉, 在固液比1∶15、加酶量10%、温度50℃、时间4h的条件下, 取pH值5、6、7、8和9, 对酶法提取菊糖的pH值进行研究, 结果如图2所示。

由图2可知:菊糖提取率随pH值增大而增大, 当pH值为7时, 菊糖提取率最大, 随着pH值的继续增大, 提取率变化不大。所以, 木瓜蛋白酶提取菊糖的最佳pH值为7, 此时菊糖提取率为50.81%。

2.1.4 固液比对菊糖提取率的影响

准确称取4g牛蒡粉, 在pH值为7、加酶量10%、温度为50℃、时间为4h的条件下, 采用不同的固液比1∶9、1∶12、1∶15、1∶18和1∶21来研究固液比对菊糖提取率的影响, 结果如图3所示。

由图3可知:木瓜蛋白酶在固液比1∶15时对牛蒡的菊糖提取率最高, 为50.58%。因此最佳固液比为1∶15。因为固液比过高会导致牛蒡液浓度过低, 所提取的菊糖量就会降低, 而固液比过低时, 牛蒡液浓度又过高, 甚至出现糊状, 样液不能被充分酶解, 菊糖提取率也会显著降低。

2.1.5 时间对菊糖提取率的影响

准确称取4g牛蒡粉, 在pH值为7、加酶量10%、温度为50℃、固液比1∶15, 选取酶解时间分别为2、3、4、5和6h, 对酶解时间进行研究, 结果如图4所示。

由图4可知:在2~4h范围内, 菊糖提取率随时间的延长而增大, 但4h以后呈现下降趋势, 因此选择4h最佳, 此时菊糖提取率为49.76%。

2.1.6 加酶量对菊糖提取率的影响

准确称取4g牛蒡粉, 在固液比1∶15、时间4h、温度50℃、pH值7的条件下, 选不同的加酶量6%、8%、10%、12%和14%来确定最佳的加酶量, 结果如图5所示。

由图5可知:在6%~10%的加酶量范围内, 菊糖提取率随加酶量的增加而增大, 但10%以后菊糖提取率明显下降, 因此选择10%的加酶量最佳, 提取率为57.29%。

2.1.7 最佳条件的确定

为了优化提取条件, 在以上单因素试验的基础上, 进行了三水平三因素正交试验, 正交试验结果见表2。

由表2可知:各个因素对菊糖含量的影响顺序为A>C>B, 固液比A是主要影响因素, 其次是加酶量C, 最后是pH值B。试验最佳组合为A2B3C1, 在固液比1∶15 (m/V) 、提取时间为4h、提取温度50℃、pH值8和加酶量为8%, 菊糖提取率为63.11%。

验证试验:由于理论最佳组合A2B3C2与正交试验结果不同, 因此对比理论最佳和试验最佳, 做验证试验, 结果见表3。

由表3可知:理论最佳的菊糖提取率是64.45%, 高于试验最佳63.11%的提取率。因此, 木瓜蛋白酶提取牛蒡中菊糖的最优工艺组合为A2B3C2, 即牛蒡在固液比为1∶15、pH值为8、加酶量为10%和温度为50℃的条件下提取4h, 此时菊糖提取率达到64.45%。

2.2 牛蒡菊糖的脱色研究

粗菊糖分别用D202大孔强碱性苯乙烯系阴离子树脂、966大孔树脂、D215大孔强碱阴离子交换树脂、D309脱色专用树脂、XDA-1大孔树脂和D208脱色专用树脂的方法进行脱色研究, 结果见表4。

由表4可知:就脱色率而言, D215大孔强碱阴离子交换树脂脱色率最高, 为95.56%;966大孔树脂排在第二, 为93.65%;就菊糖保留率而言, D208脱色专用树脂菊糖保留率最高, 为66.03%;其次是966大孔树脂, 为57.72%。综合起来考虑, 选择966大孔树脂进行脱色。采用上述条件所提取的牛蒡菊糖, 菊糖含量为72.42%。

3 结论

(1) 用酶法提取牛蒡菊糖的最佳单酶为木瓜蛋白酶, 在七种单酶中的菊糖提取率最高, 为50.81%。

(2) 用木瓜蛋白酶提取牛蒡菊糖的主要影响因素:固液比、pH值和加酶量。通过单因素和正交试验确定了牛蒡菊糖的最佳提取条件:利用木瓜蛋白酶, 在固液比1∶15 (m/V) 、提取时间为4h、提取温度50℃、pH值8、加酶量为10%;提取液经乙醇沉淀、真空浓缩, 得到粗菊糖, 菊糖提取率为64.45%。

(3) 采用静态吸附法对菊糖提取也进行脱色, 比较D202大孔强碱性苯乙烯系阴离子树脂、966大孔树脂、D208脱色专用树脂、D215大孔强碱性阴离子交换树脂、D309脱色专用树脂和XDA-1大孔树脂的脱色率、菊糖保留率, 选择966大孔树脂进行脱色效果最佳, 脱色率为93.65%, 菊糖保留率为57.72%。

(4) 菊糖提取液经脱色、浓缩、乙醇沉淀后得到浅灰色的粗菊糖, 产品中菊糖含量为72.42%。

摘要：本文以新鲜的牛蒡作为原料提取菊糖, 采用酶法提取牛蒡菊糖, 研究了纤维素酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、果胶酶和木瓜蛋白酶对菊糖提取率的影响, 再通过单因素和正交试验方法研究了加酶量、pH值、固液比、酶作用时间以及提取温度对牛蒡菊糖提取率的影响。结果表明:采用木瓜蛋白酶在加酶量10%、固液比1:15 (m/V) 、提取时间4h、提取温度为50℃和pH值8的条件下菊糖提取率最高, 为64.45%。然后采用D202、966、D208、D205、D309和XDA-1阴离子交换树脂对牛蒡菊糖的脱色效果进行了探讨。结果表明:966大孔吸附树脂脱色效果最佳, 脱色率为93.65%, 菊糖保留率为57.72%。

关键词：牛蒡,菊糖,酶解,提取,纯化

参考文献

[1]曹泽虹, 卢海燕, 董玉玮, 等.牛蒡菊糖酶法提取[J].食品科学, 2010 (24) :37-45.

[2]郝林华, 陈靠山, 李光友.牛蒡菊糖及其制备方法的研究[J].中国海洋大学学报, 2004, 34 (3) :423-428.

[3]李丹丹, 刘-, 金征宇.牛蒡菊糖及其分离纯化[J].食品与生物技术学报, 2007, 26 (5) :1-5.

[4]徐鑫, 陈小辉, 刘国艳, 等.微波辅助法提取牛蒡根中菊糖的研究[J].食品科学, 2007, 28 (10) :207-210.

[5]董梅, 姚惠源.牛蒡根中菊糖的提取与制备[J].食品工业, 2005 (2) :43-45.

[6]张惟杰.糖复合物生化研究技术[M].杭州:浙江大学出版社, 1999:10-12.

[7]熊善柏.菊糖的提取与精制[J].冷饮与速冻食品工业, 2001 (12) :1-3.

[8]李丹丹, 金政宇.牛蒡菊糖脱色工艺的研究[J].农业工业学报, 2007 (8) :241-244.

[9]吕莹, 程玉来.牛蒡中提取菊糖的初步研究[J].食品工业科技, 2007 (4) :153-155.