植物基因组（精选十篇）
植物基因组 篇1
随着以PCR为试验手段的分子标记技术的应用逐渐扩展到更多的植物种,许多研究者发现,植物体内的许多次生代谢物质(如单宁、酚类及色素等)与核酸形成复合物,DNA埋在这种粘稠的胶状物中难以溶解或产生不同程度的褐变。这种质量的DNA既不适于做限制性酶切,也不能用于DNA扩增[4]。本研究以壳斗科多个属的植物为材料,先后采取了改良的CTAB法及SDS法,从壳斗科植物中提取总DNA,并对2种方法对壳斗科植物DNA的提取效果进行比较分析,希望得到能很好的用于PCR扩增的较纯、较完整DNA的提取方法。
1 材料与方法
1.1 实验材料
试验材料选自江西省林科院培育的壳斗科种质资源库内的健康植株,各树种及编号见表1。
1.2 主要试剂
主要试剂来源:λDNA/HindⅢ及100bp标准分子量Marker,Taq DNA聚合酶,primer等主要试剂均购自上海生物工程公司。
1.2.1 CTAB法。
提取液1.4mol/L Na Cl;20mmol/L EDTA,p H8.0;100mmol/L Tris-HCl,p H 8.0,2%CTAB,5%可溶性PVP,2%β-巯基乙醇。TE缓冲液10mmol/L Tris-HCl,p H8.0;1mmol/L EDTA。
1.2.2 SDS法。
提取液2%SDS;100mmol/L Tris-Cl;50mmol/LEDTA;500mmol/L Na Cl;5%PVP-40;5mol/L KAc;10mmol/Lβ-巯基乙醇。TE缓冲液同上。
1.3 DNA提取方法
将采集的各树种的新鲜幼叶洗净,用三蒸水冲洗2~3次,晾干后作好标记待用。采用的CTAB法及SDS法均做了适当改进。
1.3.1 CTAB法。
称取0.5~1g植物新鲜幼叶于液氮中研磨成粉末,放入加有4m L CTAB抽提液(65℃预热)的10m L离心管中,充分混匀,封口膜封口后于65℃水浴中保温30min~60min,其间不时轻轻摇动;将样品置于冰上迅速冷却至室温后,立即加入4m L氯仿-异戊醇(24∶1,V/V)混合液,轻轻混匀后12 000r/min离心10min;取上清液500μL于1.5m L离心管中,加入1/10体积4mol/L浓度的Na Cl溶液,2倍体积冰预冷的无水乙醇后于-20℃沉淀2h以上或过液(期间可再补加Na+,以增加盐的浓度);视DNA量,用8 000r/min离心3min或用枪头挑出DNA沉淀,并用1m L 70%(V/V)乙醇漂洗两次,500μL无水乙醇漂洗后风干;加入500μL于56℃水浴预热的0.1×TE缓冲液充分混匀后,12 000r/min离心5min,上清液加入2倍体积冰预冷的无水乙醇,沉淀物经同样方法漂洗后风干,经灭菌去离子水溶解,离心后上清即为所需的DNA溶液,4℃保存。
1.3.2 SDS法。
取0.5~1g植物叶片放入液氮中研磨成粉末,放入10m L的离心管中,加入3m L的SDS提取液及60μL 2-ME(65℃预热),充分混匀,封口膜封口于65℃水浴保温30min,其间不时摇动;加入1m L的5mol/L KAc,水浴锅中混匀后迅速放置在冰上5min;加入4m L氯仿:异戊醇(V/V∶24∶1),充分混匀后1 000r/min离心10min,上清液加等体积-20℃异丙醇,-20℃冰箱静置,4℃5 000g离心10min;所得沉淀用70%的乙醇洗涤2次,干燥;将沉淀溶于200μL TE液中,4℃冰箱保存。
1.4 DNA纯度的检测
1.4.1 紫外吸收检测。
通过754紫外分光光度仪分别测定2种提取方法所得到的DNA样品A260和A280并计算OD比值(A260/A280)。
1.4.2 限制性内切酶酶切检测。
将DNA调节浓度至300~400ng/μL,采用ECORI单酶切,15μL酶切体系里还有DNA3~5μg,内切酶12U,37℃水浴过夜。1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。
1.4.3 PCR扩增。
以0.8%琼脂糖凝胶电泳结果为参考,将2种方法提取的DNA样品,将浓度稀释至30ng/μL,选用随机引物S36进行RAPD反应。反应体系:10×Buffer2μL;10m M Mg Cl21.6μL;2m M d NTP 2μL;5μ/μL酶0.2μL;10pmol/μL Primer 1μL;无菌水补充至20μL。反应程序:94℃预变性3min,然后进入下列循环:94℃变性30sec,38℃退火30sec,72℃延伸1min30sec,共38个循环,最后72℃再延伸7min。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
2 结果与分析
2.1 两种方法提取DNA的对照
提取过程中,乙醇沉淀DNA上清,改进的CTAB法对9个试验样品有明显的絮状沉淀;而SDS法只有1、3、6号有絮状沉淀,其他各号均成混浊粉状,须离心才能得到沉淀。紫外分光光度计检测结果显示,采用CTAB法提取的DNA OD比值为1.42~1.8,原液浓度在225~925ng/μL;而SDS法检测结果为1.25~1.54,原液浓度在275~1 650ng/μL电泳检测,结果见图1。
(图中M为Marker,Marker左侧为CTAB法提取的DNA,右侧采用SDS法,下同)
实验表明:采用改进CTAB法能有效去除多糖、多酚,用该方法提取的基因组DNA纯度较SDS法高的多,所提取的DNA在水平式0.8%琼脂糖凝胶电泳检测时,更为明显,且重复性好。
2.2 酶切结果比较
酶切结果显示采用两种方法提取的DNA均能被限制性内切酶很好的酶切,而采用SDS方法提取的DNA在稀释同样浓度过程中2、7、8、9号DNA的相对含量较少,故酶切显示结果很不明显,结果见图2。
2.3 PCR检测对比
采用RAPD-PCR检测两种DNA提取方法的效果。在PCR过程中,DNA纯度是影响PCR扩增的关键因素,其作用远远大于浓度对反应的影响。在被稀释成相同浓度后,PCR检测电泳图中显示SDS法提取的4、6、8、9号扩增很不稳定,带型背景深且扩增效率低,可见用此法提取的DNA纯度不高,而相对比采用CTAB法提取的DNA扩增效果好,重复性高,结果见图3。
3 讨论
实验证明,这种改良的CTAB抽提法适用于壳斗科植物叶片DNA抽提,提取的DNA量大,质量也较好,能满足PCR扩增和其它分子生物学分析的要求。为了提高DNA的纯度和得率,建议选用较幼嫩的叶片,因为处于延伸生长期的植物细胞果胶含量较少。在抽提过程中,发现不同种其抽提效果及DNA得率也有较大的差异。同是采用CTAB法提取DNA,硬斗柯DNA得率最高可达900~1 500ng/μL,而云山的得率却只有200~300ng/μL,这可能是由于不同种其叶片中酚类和脂类等杂质含量差别较大,从而影响到DNA抽提过程中DNA的得率。
实验中我们在预热的抽提液中加入2%β-巯基乙醇,有效的抑制了酚化物褐化,此外在提取液中加入5%可溶性PVP,防酚褐化效果明显比在研磨同时加入固体PVP更好;通过延长离心时间,可将蛋白质、多糖、脂类等生物大分子降低到最低程度;增加氯仿/异戊醇的抽提次数,可使蛋白质杂质量降到最低;RNA可通过对提取的DNA原液采用温浴处理加以去除,少量的RNA不影响PCR;此外,尽量简化操作步骤,缩短提取过程,以减少各种有害因素对核酸的破坏。
参考文献
[1]端木.江西省壳斗科资源的综合利用[J].林产化工通讯,1995(1):34-36.
[2]吉成均,沈海花,方精云.基于RAPD标记的我国水青冈属植物的分类研究[J].北京大学学报,2002,38(6):817-822.
[3]Koller B,Leharmann A,Mc Dermott J M.Identification of AppleCultivars Using RAPD Markers[J].Theor Appl Genet,1993,85(7):901-904.
植物基因工程课件 篇2
植物基因工程课件
(1)植物基因转化受体系统的条件
(2)植物基因转化受体系统的类型和特性。
(3)植物基因工程载体的种类和特性
(4)根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能：T-DNA、Vir区操纵子的基因结构与功能。
(5)农杆菌Ti质粒基因转化机理
(6)农杆菌Ti质粒的改造及载体构建
(7)载体构建中常用的选择标记及报告基因
(8)根癌农杆菌的转化程序及操作原理
(9)外源基因在植物中的表达
了解植物基因转化受体系统的类型、特性掌握Ti质粒的结构与功能，植物载体构建原理，植物基因工程常用的载体类型。
重点
根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的原理和方法
难点
植物载体构建原理
关键点
转基因植物的获取和检测
教学目的和要求
教材分析
主要教具和设备材料
投影仪、电脑、常规教学设备板书与多媒体授课相结合
教法 思考题
1. 植物基因工程载体种类?
2. 根癌农杆菌转化程序?
心得
在自然界的许多双子叶植物中，常常发生一种严重危害植物生长的病害——冠瘿。已知90多科，600多种双子叶植物都能感染这种病。一般认为单子叶植物和裸子植物对此病不敏感。70年代中期，世界上几个实验室发现诱发肿瘤的根癌农杆菌中含有大量的诱瘤质粒Ti(tumor-inducing plasmid),且证实了肿瘤的形成正是由于pTi中的特定片段——T-DNA转移并稳定地整合进植物细胞核基因组中的结果;由于其上载着的冠瘿碱合成基因和激素合成基因表达，因此分泌冠瘿碱并形成肿瘤。人们就把这种冠瘿的形成过程称作天然的植物细胞转化系统。
农杆菌将自身的DNA插入植物细胞诱发肿瘤只对其本身是有益的，重要原因之一是因为农杆菌诱发植物细胞合成冠瘿碱为自己提供食物。植物自身不能利用这种物质，只能为它的合成付出代价，别的细菌也不能利用它，在自然条件下，只有农杆菌能分泌分解冠瘿碱的酶，将这些特异产物作为唯一的碳源和氮源来利用。
肿瘤的产生是由于T-DNA上的激素合成基因所致，刺激细胞生长而产生肿瘤，这是T-DNA转入的一个副产品。
Ti质粒给自己设计出一套为其自身存活的非常优秀的进化格局：它感染植物细胞，使之出现愈伤组织增生，后者便产生出供带有Ti质粒的细菌用作能源、碳源和氮源的冠瘿碱;而冠瘿碱的产生又可激发Ti质粒转移到原先没有存在这种质粒的土壤农杆菌中去，如此周而复始得到不断发展。
Ti质粒是一类理想的植物基因工程载体，通过它们可以将外源DNA转移到植物细胞，并再生出能够表达外源基因的转基因植物。 Ti质粒还具有若干其他载体所不具备的优点：
(1)T-DNA能够进行高频的转移，而且这种转移的DNA通常是以未发生变化的完整形式整合到植物的核基因组上。
(2)Ti质粒不存在包装限制问题，大到50kb的外源DNA也能顺利地包装与转移。
一、植物基因工程载体种类
据载体的功能和构建过程，可把有关载体分为四大类型(九种载体)。 克隆载体、中间载体、卸甲载体、转化载体
据载体的功能和构建过程，可把有关载体分为四大类型，九种载体。
1、克隆载体(目的基因的克隆载体)
通常由多拷贝的E.coli小质粒为载体 功能：保存和克隆目的基因。
2、中间载体又分为中间克隆载体和中间表达载体。
中间克隆载体：由大肠杆菌质粒插入T-DN段及目的基因、标记基因等构建而成。
功能：构建中间表达载体的基础。
分为：中间粘粒载体、质粒粘粒愈合载体、基因标记载体。 中间表达载体：含有植物特异启动子的中间载体
功能：作为构建转化载体的质粒。
3、卸甲载体
解除武装的Ti质粒或Ri质粒。(onc+ -------- onc-) 功能：作为转化载体的受体质粒
4、转化载体
最后用于目的基因导入植物细胞的载体，亦称工程载体。 它是由中间表达载体和卸甲载体构建而成。
分为一元载体系统(顺式载体)和双元转化载体系统(反式载体)。 一元载体系统包括共整合载体和拼接末端载体(SEV)。
二、根癌农杆菌Ti质粒
1、Ti质粒的类型、结构与功能
(1)类型
Ti质粒是根癌农杆菌染色体以外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，分子量为95~156 x 106D，约150 ~ 200 Kb长。根据其诱导的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可分为三类： 章鱼碱型(octopine)：pTiAch5, pTiA6NC, pTiB653, pTiAg162 胭脂碱型(nopaline)：pTiT37, pTiT38, pTiC58
农杆碱型(agropine)和农杆碱素型(agrocinopine)或琥珀碱型(succinamopine)
(2)结构和功能
各种Ti质粒都可分为四个区：
①T-DNA区(transferred-DNA regions)：是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA。该DN段上的基因与肿瘤的形成有关。
②Vir区(Virulence region)：该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。T-DNA区与vir区在质粒上彼此相邻，合起来约占Ti质粒DNA的1/3。
③Con区(region of replication)：质粒结合转移位点编码区，该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因(tra)，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此，称之为接合转移编码区。
④Ori区(origin of replication)：该区段基因调控Ti质粒的自我复制，称之为复制起始区。
3种成分与Ti质粒肿瘤诱导有关:
T-DNA：它可转移至宿主细胞，是一种可移动因子。
毒性区：vir基因可产生转移活动蛋白，对增强植物细胞的转化是必须的。 土壤农癌杆菌染色体基因:间接参与转化，负责将细菌细胞接合于植物上。
2、T-DNA的基因结构和功能
(1)T-DNA的结构特点 长约23Kb
在T-DNA的5’和3’端都有真核表达信号，如TATAbox，AATAAbox及polyA等。
T-DNA的两端左右边界各为25bp的重复序列，即边界序列，分别称之为左边界(BL或TL)和右边界(BR或TR)。该25bp边界序列属保守序列(TGACACGATATAT TGGCGGGTAAAC)。通常右边界序列更为保守，左边界在某些情况下有所变化。左边界的缺失突变仍能致瘤，但右边界缺失则不致瘤，这时几乎完全没有T-DNA的转移，这说明右边界在T-DNA的转移中的重要性。
胭脂碱型肿瘤，为一连续的一段序列，长约23.4Kb，有肿瘤系，仅一个拷贝，有的T-DNA是多拷贝的。
章鱼碱型肿瘤：T-DNA分左右两部分(TL-DNA和TR-DNA)，各自带有左右边界序列。左区的顺序变化不大，长度约13Kb，通常一个拷贝，但也有几个拷贝首尾相连排列。含章鱼碱合成酶基因和致瘤基因。TR-DNA较短，长约6-7Kb，拷贝数达数个 或数十个，有的肿瘤系中没有TR-DNA。TR-DNA编码5个基因，如甘露碱和冠瘿碱合成酶基因。
(2)T-DNA上的编码基因及功能
章鱼碱型和胭脂碱型T-DNA的转录有下述共同特点： T-DNA的两条链都是有意义链;
T-DNA上每个基因都有各自的启动子; 基因的转录由植物细胞RNA聚合酶II完成;
T-DNA具典型的真核生物RNA合成起始和终止的调节信号，在其5’端转录起始处有TATA和CAAT盒。另外，至少在5个T-DNA基因中发现有一个8bp的相同顺序(TTTCAA GA)，同时AATAAA加尾信号也在同一条链上发现。
植物或农杆菌中可能有甲基化或去甲基化的调节基因活性。 3、Vir区操纵子的基因结构与功能
毒性区的大多数基因产物都控制T-DNA的转移，这个区域的突变往往导致农杆菌感染植物能力的下降。
(1)Vir区操纵子的基因结构
章鱼碱型Ti质粒：Vir区大小为40kb，含有VirA、B、C、D、E、F、G、H(PinF)等8个操纵子，共24个基因。大多数操纵子含有多个基因VirA(1)、VirB(11)、VirC(2)、VirD(4)VirE(2)、VirF(1)、VirH(2)。
胭脂碱型Ti：有7个操纵子，少一个VirF，它们的第一个操纵子也不同，章鱼碱型Ti是VirH，而胭脂碱型Ti是Tzs，其功能也不同。 Vir区基因的表达有两种方式：
组成型表达;在无植物诱导分子存在下依然保持一定的表达水平，virA，virG、virH 诱导型表达：这些基因的表达必须在土壤农杆菌感染植物时，在植物受伤组织分泌的信号分子作用下才能启动表达，如virB、C、D、E
virG虽属于组成型表达，但有植物信号分子存在下表达量提高10倍，也具诱导表达特性。
(2)Vir区操纵子的基因的功能
①Vir A 单个基因，2.4kb，仅编码一条多肽。Vir A编码一种结合在膜上的化学受体蛋白(92KD)，可直接对植物产生的酚类化合物感应，是一种感应蛋白。
Vir A的活化：当AS与Vir A的受体部分结合后，会使整个Vir A蛋白构象发生变化，其C端活化。Vir A蛋白的胞质区有自激酶的功能，可在保守的组氨酸残基上磷酸化，从而Vir A蛋白被激活。激活后的Vir A具有转移其磷酸基至Vir G蛋白的一个宿存的天冬氨酸残基的能力，使Vir G蛋白激活。
②Vir G Vir G ，只有1Kb，单基因，编码DNA结合蛋白,其C端有DNA结合活性，N端具有磷酸化的酸性结构。
从总体效应讲，Vir G基因是属于组成型表达的，这对于细菌迅速地将外部环境信号传递到细胞内十分有利。
当磷酸化的A蛋白将其磷酸基转到Vir G保守的天冬氨酸残基上时，使Vir G蛋白活化，活化Vir G蛋白可以二体或多体形式结合到Vir启动子的特定区，从而成为其它Vir 基因转录的激活因 子，打开Vir B、C、D、E、H等几个基因。Vir A或G突变后会减弱或完全失去对其他Vir 位点活化的诱导，VirA及 Vir G 的这种调控作用被称为双因子调控体系。 ?Vir H、Vir F及Tzs
这些基因对质粒是特异的，在章鱼碱型中有Vir F、Vir H，在胭脂碱型中有Tzs。
Vir H：对植物产生的某些杀菌或抑菌化合物起解毒作用，从而使自身生不受抑制，可增强致瘤能力。
Vir F：编码一个23KD蛋白，通过Vir 系统传递到植物细胞中，对T-DNA起运输作用。
Tzs：大部分胭脂碱型菌株的Ti质粒上均有Tzs基因，转运玉米素合成酶基因，在细菌中表达后将玉米素分泌到细胞外。该细胞分裂素被植物吸收后，能促进农杆菌感染部位的植物组织脱分化和细胞分裂，提高植物对农杆菌转化的感受性。
三、农杆菌Ti质粒基因转化机理
1. T-DNA的加工及转移
首先在下链25bp重复序列的右边界左起第3和第4碱基间剪切，从缺口的3’端开始合成新的DNA链，并一直延伸到左边界第22bp处。置换出原来的下链，形成ssDNA，即T链。
VirD蛋白的功能：VirD1及 VirD2分别编码16KD和47KD蛋白，与T-DNA的加工有关，决定在边界重复序列的特定位点上形成切口，产生T链断裂。 VirD2蛋白的功能：①特异剪切，并与T链的5’端共价结合。②导向功能;
2.T链蛋白复合体的形成及VirE的功能
T链必须横向跨越细菌细胞膜、细菌细胞壁、植物细胞壁、植物细胞膜及核膜才能整合进植物基因组。
T链以一种DNA-蛋白复合体(T复合体)的形式存在。
目前已知至少两种Vir特异蛋白即VirE2和VirD2与T链蛋白复合体的形成有关。
VirE2的功能：编码ssDNA结合蛋白，该蛋白可非特异地一与任何ssDNA结合，通过与T链非共价结合，VirE2可包被T链形成细长的核-蛋白丝，使ssDNA抗3’和5’外切核酸酶和内切核酸酶。
3、T链复合体通过细菌细胞膜的转运及VirB的功能
(1)VirB的功能
VirB启动子有11个基因，大多数编码跨膜蛋白或膜结合蛋白，能在膜上形成一种类似细菌接合转移时从供体菌转至受体菌所必须的结构——接合孔或性毛。T-DNA通过这种孔由细菌进入植物细胞。同时，VirB也可能起运输和提供能量的作用。 按功能，可将VirB蛋白分成五类：
R：在内膜上或内膜内的某些蛋白，可能作为T复合体的受体;
A：此类蛋白可能作为能源，作为一种ATP酶促进T复合体被泵出细菌细胞，VirB11可能是这种A类蛋白。
C：形成通道的作用，如：VirB4是一种富集蛋白，无疏水区，无信号肽，可能在T链转运中起一种结构作用，形成至少一部分特殊的通道结构。
S：载体蛋白，起运载T 复合体穿过通道的作用，这类蛋白可能与所有膜成分(内膜、外膜及周膜)有关。
P：位于外膜上，可能作为结合植物细胞膜的一种受体。
(2)T复合体向植物细胞核的转运
VirD2可能以一种极性方向，将T复合体定向至核孔，而VirE2则作为一种促进因子，保证很长的T复合体在进入核孔时不受干扰。 在T-DNA转移过程中，VirD2具有火车头的作用，牵制T复合体以5’端到3’端的方向向核迁移，而VirE2则只助推器的角色，帮助未折叠的长形T复合物不被打断，并方便其向核运动。 已知VirE2-ssDNA可以抗拒内切酶的作用，如核酸外切酶VII对VirE2-ssDNA降解能力将相当于对ssDNA的6%，对S1核酸酶的效果也相似。
4、细菌染色体上与T-DNA转移有关的基因
目前已知农杆菌染色体上有10个基因与T-DNA转移有关，它们主要涉及细菌与植物细胞的接触和细菌向植物伤口的趋化性。
chvE——编码一个葡萄糖和半乳糖结合蛋白，主要结合组成植物细胞壁的单糖;可能由于识别植物受伤产生的糖单体，导致细菌向植物伤口的趋化性;在低pH值、磷酸饥饿条件下启动VirG表达。
chvD——编码一种细菌ATP结合蛋白，在低pH值、磷酸饥饿条件下诱导VirG蛋白含量升高，然后VirA接受AS信号，刺激VirG转化成活性形式，启动其他VirG 基因表达。
chvA 、chvB、chvC——与环状?-1，2-葡聚糖的合成和运输有关; chvB产物催化合成葡聚糖， chvA产物将多糖从胞质运到胞外，影响农杆菌对植物细胞的附着能力。
pscA和Exoc——与多糖的合成有关，并影响农杆菌对植物细胞的附着能力。
四、农杆菌Ti质粒的改造及载体构建
1、野生型Ti质粒直接作为基因工程载体的障碍：
(1)分子量大，160~240Kb;
(2)有各种限制性内切酶的多个切点;
(3)T-DNA区中含有许多编码基因与基因转移无关，如致瘤基因，其存在还会导致植物体丧失形态发生能力;
(4)Ti质粒不能在大肠杆菌中复制。
2、Ti质粒构建的几个重要因素
(1)右边界序列;
(2)完整的Vir基因群;
(3)有独特的酶切点;
(4)有在植物中可表达的选择性基因;
(5)有在细菌中可表达的选择性基因;
(6)章鱼碱型农杆菌品系需要独特的增强子。
3、载体构建
先将T-DN段克隆到大肠杆菌质粒中，并插入外源基因，最后通过三亲交配或接合转
移把外源基因引入农杆菌Ti质粒上。
Ti质粒的载体系统分两类：一元载体和双元载体
例：双元载体的构建
双元载体系统由两个分别含T-DNA和Vir区的相容质粒构成。
(1)构建原理
Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T-DNA的转移，T-DNA和Vir区处于不同的Ti质粒上同样能起到转移T-DNA的作用。
双元载体含有广泛寄主范围质粒的复制起点(oriv)，从而代替了在共整合载体中用以重组的同源区，它们能在任何农杆菌寄主里自发复制。所以寄主仅需一套完整的vir质粒就可。主要的转移区载在小重组Ti质粒上。
(2)微型Ti质粒(mini-Ti plasmid)
含有T-DNA边界，缺失Vir基因的质粒;含广谱质粒的复制位点OriV及选择标记基因。
(3)辅助Ti质粒
含Vir区段的Ti质粒，helper Ti,是T-DNA缺失的突变型Ti(卸甲Ti)，提供Vir基因功能，反式激活T-DNA的转移。
LBA4404中含有pAL4404(pTiAch5的衍生质粒)，野生型Ti也可做Helper Ti,有更强的毒性。
五、根癌农杆菌侵染植物细胞的机理
1、根癌农杆菌的生物学特性
分类
农杆菌属，也称土壤杆菌属和根瘤菌属，是同属于根瘤科的革兰氏阴性菌。
土壤杆菌属有4 个种：根癌农杆菌、放射形农杆菌、毛根农杆菌和悬钩子农杆菌。
根癌农杆菌，根据其诱导植物细胞产生的冠瘿碱种类不同可分为三种类型即章鱼碱型、胭脂碱型和农杆碱型。
生活习性
土壤杆菌属都是土壤习居菌，主要生活在曾被多种植物生活过的土壤中，好氧，但也能在低氧压的植物组织中生长，最适温25~30℃，pH4.0~12.0,最适pH6.0~9.0。 形态结构
农杆菌细胞呈杆形，0.8x1.5~3.0μm,以1~4根周生鞭毛运动，不形成芽孢，菌落无色，随菌龄增加，光滑的菌落逐渐变成有条纹，但也有许多菌株生成的菌落呈粗糙型。 寄主范围
根癌农杆菌广泛存在于双子叶植物中，根据不完全统计，约有93属643种双子叶植物对根癌农杆菌敏感。裸子植物对该菌同样具敏感性，能诱发肿瘤，对绝大多数单子叶植物无侵染能力。
2、根癌农杆菌侵染的诱导信号及作用机理
(1)酚类化合物
酚类物质——农杆菌浸染植物细胞所必需的诱导物，同时将其作为趋化物来识别。 实验证明，一些植物中常见的酚类化合物的混合物都可激活Vir区基因。如：儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、β-羟基苯甲酸、原儿茶酸、香草醛。
Stachel等在烟草叶片的伤口诱出液中确认了两种主要的Vir区基因诱导物：乙酰丁香酮AS和羟基乙酰丁香酮OH-AS。AS效果最好，0.5~1.0μmol/L即可诱导Vir活化。
(2)中性糖和酸性糖
中性糖在Vir基因诱导和致病毒力中也起重要作用。Shimoda等人，在限定AS诱导条件下，
发现许多中性糖(L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-艾杜糖、D-半乳糖、D-塔罗糖、2-脱氧-D-葡萄糖)都可增强一些Vir区基因的诱导。这些中性糖是通过chvE和VirA起作用，chvE编码葡萄糖和半乳糖结合蛋白，识别伤口产生的糖单体，导致农杆菌的趋化作用。
酸性多糖是组成植物细胞壁中果胶质的主要成分。最近的实验证明，酸性糖(胡萝卜根提取物中蒸馏出来)可改变农杆菌基因的表达。蛋白质标记实验表明，至少有10种蛋白质合成被其诱导，一种被阻遏。
(3)pH值
5.0~5.5的低pH值。诱导物对pH的要求是<.6.0, 在农杆菌培养在含有酚类化合物(AS)的培养基中时，pH5.0 ~5.8Vir的诱导达到一个最高水平
3、根癌农杆菌的侵染能力及其特异性
(1)常用的根癌农杆菌
胭脂碱型(Nop)菌株：染色体背景为C58，生长快，不结球，转化中容易操作，常用的菌株有C58、pGV3850、A208SE等。
章鱼碱型(Oct)菌株：染色体背景为Ach5，生长慢，结球，转化中难操作，培养后不易洗掉，常用的菌株有LBA4404,LBA1010,GV2260,GV3111SE,K61等。
农杆碱型(Agr)菌株，也称琥珀碱型(Suc)：染色体背景为A281或A136，具有胭脂碱型菌株的特点，以A136为染色体背景的常用菌株是EHA101，生长快，不结球，侵染能力强，常用的菌株有A281、EHA101、EHA105等。
(2)、根癌农杆菌的侵染能力差异
根据侵染能力大小将农杆菌分为：
广宿主菌株：大多数双子叶、若干裸子植物、少量单子叶植物;如：pTiB0542、pTiA6; 窄宿主菌株：有限的几种植物上诱发肿瘤，如pTiAg162,仅能在葡萄的几个品种上诱发肿瘤。 不同植物对农杆菌侵染的敏感性不同，在转化中，二者的选配十分重要，要选农杆菌与植物之间有高侵染力的配合。如：杨树茎，用C58优于LBA4404;苹果，6种基因型比较，叶：EHA101(pEHA101)优于LBA4404，C58;茎：A281优于C58，ACH5，A348。
农杆菌的染色体背景对宿主范围同样有着重要作用。因为除Vir区功能外，农杆菌对植物表面识别与结合有关的功能还取决于农杆菌染色体上基因位点。农杆菌所展示出不同的生长速率、多糖产生和对植物细胞的毒力都会影响转化率和宿主范围。
六、根癌农杆菌转化程序及操作原理
1、根癌农杆菌Ti质粒转化的基本程序
(1) 选择适宜的培养基，使创伤部位能产生尽可能多的再生植株。
(2) 确定供体植物最适的培养条件。
(3) 确定最佳外植体类型、大小、部位等：再生途径，愈伤组织起源(细胞类型、层次)，
保证转化愈伤组织和芽原基由创伤部位的浅层细胞发育而来。
(4) 确定适宜的抗生素水平：抑菌抗生素Cef ，Cb ，能抑制细菌生长，还能保证愈伤组
织正常生长和分化。
(5) 确定选择压力的最低水平。
(6) 优化农杆菌接种和共培养条件改进筛选条件，促进抗性细胞恢复再生能力：采用无毒的生化物质。
2、根癌农杆菌的培养、纯化、保存及工程菌液的制备
(1)农杆菌的培养
常用的农杆菌培养基有 LB、YEM、YEB、TY、523、PA及 MinA等培养基。
这些培养基中，LB、YEB、YEM及523属富集培养基，其营养成分丰富，包括有各种有机成分。在这些培养基中农杆菌生长快，分裂旺盛，它们是常用 制备工程菌液的培养基。 ? PA和 TY培养基是属营养较好的培养基，氨基酸及碳源、氮源都很丰富。农杆菌在这些培养基上生长也很快，是常用的农杆菌选择培养时的培养基。
MinA培养基与前几种培养基有明显差异：只提供必要的无机盐，并用葡萄糖和(NH4)2SO4 提供碳源和氮源。
Minimal只用相应的冠瘿碱如 NOpaline、Octopine等取代蔗糖、氨基酸和无机氮作为农杆菌的碳源和氮源。
农杆菌在MinA和Minimal培养基上生长较慢。在进行三亲杂交时通常用这两种培养基，并加相应的抗生素选择转化的农杆菌。含重组质粒的大肠杆菌及含辅助质粒 pRK20 13的HB101因不能利用冠瘿碱作为碳源和氮源而不能生长，同时还存在抗生素的选择，因此有利于选择转化的农杆菌的`生长。
农杆菌的生长周期
农杆菌培养方式：分为固体平板培养和液体振荡培养，
固体培养一般需2～3d，液体培养生长更快，一般需1～2d。
农杆菌接种在培养液后，并不立即开始增殖。一般在25～30℃时，需1～2 h细菌才开始分裂。
当生长开始后，细菌数目以一恒定的指数速率倍增，直至培养基成分改变和供氧缺乏时才停止增殖。当细菌增长速率达到对数指数时称之为对数生长状态。
当细菌密度达到 177/ml时，空气中的氧气便难以很快地扩散到细胞内。在振荡或通气条件下培养，细菌浓度也很少超过 2～3 X 109/ml。
测定农杆菌浓度的方法：最简单的方法是光密度测定法。将菌液装入比色杯汽在分光光度计上选用600nm波长测定其OD值。光密度与浓度换算公式是1OD约等于 8 X 108/ml。
(2)工程菌的纯化
纯化菌种的方法主要采用常规的微生物纯化方法，即划线法。用接种针划线，然后用石蜡膜封口，将平皿倒置放恒温箱内，在25～28℃条件下培养过夜，次日或即日看到分离的单菌落。挑取单菌落接种在液体培养基内进行液体振荡培养。
(3)工程菌侵染悬浮液的制备
液体振荡培养的工程菌，通常培养 12～24 h后即可达到对数生长期。用离心管取一定数量的菌液进行4000r/min离心，倒掉上清液，再加入植物外值体诱导愈伤组织或分芽的液体培养基，使其光密度OD值达到0.5，即可用作接种外植体的工程菌液。
注意：因为农杆菌培养基中通常含有抗生素，它对外植体的生长、脱分化或分化有不良影响，放需通过离心除去细菌培养基，加入植物培养基。也有的做法是，将农杆菌加入植物培养基后再振荡培养 12 h，当细菌生长达到对数生长期后再离心，倒掉上清液，用新的植物液体培养基稀释至一定OD值，再作为工程菌液使用。
(4)工程菌的保存
菌种的保存的目的是创造一个适合细菌休眠的环境(低温、干燥、缺氧)，使其得以长期保存。其功能在于尽量减少菌株的传代次数;使菌种经保存后不死亡、不污染杂菌，并保持其原有性状，降低菌种的变异率;最终目的是的基因不能丢失。
菌种保存的方法根据其保存时间长短可分为三种方法：
短期保存〔数月)：采用斜面或平板保存法。斜面菌种置于4℃可保存数月，平板用石蜡膜密封后也可在低温0～4℃下放置数月。
中长期保存(数年)：中长期保存采用穿刺法，这是一种菌种接入柱状培养基的方法。经常应用的是半固体柱状培养基，用接种针沾取少量问后直接插入柱状培养基中。需注意的是，要从培养基中间插入，直插到接近管底，但不要穿透培养基，再慢慢按原途径拔出接种针，切勿搅动，以免使接种线不整齐而影响观察，甚至会因用力搅动造成空隙太大进入空气，而影响保存效果。穿刺培养的菌种用蜡封口，在室温下可保存数年。
长期保存菌种：主要采用甘油保存法。在7%二甲基亚(DMSO)或 15%甘油中，菌种可于- 70℃冰箱或液氮中长期保存。当甘油含量增加40～ 50%时，细菌可在- 20℃或- 70℃条件下，保存若干年而不失活。将冰冻菌种从冰柜中取出时，应当放在冰浴上慢慢融化，不可直接将其放室温下，否则会导致菌体失活，更不能直接接种至液体培养基内28℃振荡培养。
3、Vir基因活化诱导物的使用
(1)诱导物：
常用诱导物是乙酰丁香酮(AS)和羟基乙酰丁香酮(OH-AS)，其中效果优是AS。但最近又有新的发现，有两种特殊化合物比AS的诱导活性高10～100倍。
(2)诱导物的使用方法
在农杆菌液体培养时加 AS，加入时间-般在制备工程菌浸染液使用前4～6 h加入。使农杆菌既处于对数生长期，又处于vir基因高度活化状态，从而提高侵染能力。也有的在农杆菌悬浮液离心后用植物外植体培养基稀释成侵染液时加入。
AS加在农杆菌和外植体共培养的培养基中。共培养的过程是Ti质粒实现 T-DNA转化时期。一般农杆菌附着 16 h后才能进行转化，这时需要vir基因的高度活化。因此，许多科学家赞成这种使用方法。
在农杆菌液体培养基中及共培养基中都加入AS。这种方法似乎最牢靠，只不过是使用的AS诱导剂太多了。
(3)诱导物使用的pH值
pH值对vir区的活化有着明显的影响，从理论上讲含AS的培养基pH值为5.0～5.6时， Vir区基因的诱导达到最高水平。
pH值改变 0.3，即对多种植物的转化率有明显影响。
章鱼碱型和农杆碱型菌系比胭脂碱型和琥珀碱型需要更低的pH值。
通常农杆菌培养时pH值为7.2。这种生长旺盛的菌株的vir基因均处于不活化状态。而组织培养基中的pH值常为5.8，有利于vir基因的活化。在vir基因活化诱导中应调整培养基的pH值。
4、外植体的选择
Mayer等指出，转化只发生在细胞分裂的一个较短的时期内，可能只有处于细胞分裂周期的S期才具有外源基因的转化能力，因为核基因组DNA正在复制时才能使外源DNA整合。因此细胞具有分裂能力是转化的基本条件。
(1)外植体的种类
叶片、叶柄、子叶、子叶柄、下胚轴、茎、花茎、匍匐茎、块;茎尖分生组织、芽、根、合子胚或体细胞胚，以至成熟的种子等都可作为外植体转化。但各种外植体材料的转化率有明显差异。
最佳共培养的时间：
农杆菌转化时，并不“侵入”到植物细胞中去，而是把T-DNA转移到植物细胞。农杆菌附着后不能立即转化，只有在创伤部位生存16h之后的菌株才能诱发肿瘤，这一段时间称为“细胞调节期”。因此，共培养时间必须长于 16h。共培养时间太长，由于农杆菌的过度生长，植物细胞因受到毒害而死亡。共培养时间对转化率有着很大影响，而且不同物种、外植体种类、农杆菌菌株的最佳共培养时间不同。
确定最佳共培养时间的方法主要采用gus基因瞬时表达测定法，即共培养后定时测定外植体的gus基因颜色反应，统计瞬时表达率及表达面积，以表达率高，表达面积大为优。同时还要考虑外植体的受损害程度，以保证外植体的旺盛生长为直。最后还要以获得的转化愈伤组织频率或转化不定芽频率为最终依据。
农杆菌的增殖适度
在共培养时农杆菌增殖生长不良，外植体切口边缘只有很少的农杆菌生长，则转化的机率很小。反之，农杆菌在外值体四周过度增殖，可引起对外植体的毒害，致使其褐化死亡。 控制农杆菌增殖适度的原则是既要使菌株在外植体边缘特别是切口面旺盛增殖生长，又不应过度，一般以覆盖切口面为适度。 控制农杆菌增殖的方法有以下几种：
1)调整工程菌液的浓度，生长太快则应降低菌液浓度。
2)控制共培养时间，农杆菌的增殖生长适度也是确定共培养最佳时间的指标，共培养时间太长可造成农杆菌过度生长。
3)使用抗生素调控农杆菌的增殖生长。一种方法是在共培养基中加入适量的抗生素如羧苄青霉素或头孢霉素。另一种方法是共培养2～3d后的外植体需用含抗生素的液体共培养基充分洗涤，以除去过量的农杆菌，然后转到新鲜的共培养基上继续共培养。共培养结束时若仍存在农杆菌过度增殖，则可再用上述洗涤培养基充分洗涤后进行愈伤组织诱导或不定芽分化培养 。 共培养中激素的影响
共培养时培养基中是否加激素，文献报道不一，有的不加激素，有的则认为加激素后促进外植体细胞分裂，保持细胞活力，也有利于转化后细胞的生长，从而提高转化率。
如 Mansur等(1993)用 A281菌株与花生叶片外植体共培养时，加激素比不加激素的肿瘤诱导率提高约 30%。
目前大多数研究者采用加激素的方法，而且共培养基与愈伤组织诱导或不定芽诱导培养基相同。
(4)外植体脱菌及选择培养 外植体的脱菌培养 脱菌培养，即把共培养外植体转移到含有抗生素的培养基上。常用的脱菌抗生素有羧苄青霉素(Carb)、头孢霉素(Cef) 等。这些抗生素不仅对农杆菌有杀伤或抑菌作用，而且对植物细胞同样有一定的生物效但对不同植物的不同外植体产生的影响不同。
Holford 等(1 992 )指出，Carb 的分解物为生长素及苯乙酸，因此 Carb 可刺激愈伤组织的增殖。Howe 等( 1994 )观察到对杨树的愈伤组织诱导有抑制作用。在甘蓝研究中发现，Carb 抑制根分化，Cef 抑制芽分化，因此芽分化阶段需用Carb， 生根阶段则用Cef。 抗生素的使用浓度一般为500mg/L 左右。其使用原则是在达到抑制农杆菌生长的目的后，尽量降低其浓度。
脱菌培养的时间：脱菌培养的时间，一般需5～6次继代培养，但仍然不能把残留的农杆菌杀死，特别是共生在维管束和细胞间隙中的农杆菌。如果停止使用抗生素后的外植体又有农杆菌可再使用抗生素脱菌。也有的植物一直使用抗生素，直到试管苗形成。
(5)转化体的选择培养
?选择压： 选择抗生素如 Km，加入选择培养基后，对细胞的生长产生一种选择作用，
称之为选择压。加入的抗生素浓度愈大，选择压也愈大。选择培养基中抗生素的浓度，即选择压的强度，也要根据植物的特性而定，较敏感的植物要用较低的 Km浓度。一般浓度范围是 Km 50～ 100mg/L， hpt 10~20mg/L， ppt 5～20mg/L。
?选择的方法：前期选择、延迟选择和后期选择。
前期选择：就是外植体共培养后，在转入愈伤组织或不定芽诱导的一开始就加入选择压，相当于前面讲到的先选择后再生。
延迟选择：当愈伤组织和不定芽诱导培养时开始不加选择压，过一周或一定时间后再加入选择压，这样既有利于转化细胞生长又不会产生更多的嵌合体 后期选择：即相当于前面说的先再生后选择，有利于提高转化率。
选择培养过程中转化和再生细胞的一致性
在选择培养条件下再生细胞和转化细胞是否一致，关系到能否得到真正的转化，只有同时具有再生和转化潜力的细胞才有可能分化成转基因植株。因此再生部位和可被转化的细胞部位应该发源一致，反之得到的可能是假转化体。假转化体在继代选择培养基上生长不良而死亡，或呈白化。
七、根癌农杆菌Ti质粒转化的方法
1、整体植株接种共感染法
该途径是模仿农杆菌天然的感染过程，人为地在整体植株成创伤部位，然后把农杆菌接种在创伤面上，或用针头把农杆菌注射到植株体内，杆菌在植株体内进行侵染实现转化，获得转化的植物细胞，因此也称之为体内转化。为了获得更高的转化频率，一般采用无菌的种子实生苗或试管苗。它是最简便的转化法。
优点：
实验周期短;
充分利用了这些无菌实生苗的生长潜力;避免在转化中其他细菌的污染;菌株接种的伤口与培养基分离，以免农杆菌在培养基上过度生长，允许在无抗生素的培养基上进行;
具有较高的转化成功率。
缺点：
转化组织中常混有较多未转化的正常细胞，即形成严重的嵌合体; 需要大量的无菌苗材料; 转化细胞的筛选比较困难。
2、叶盘转化法
(1)叶盘法转化的操作
打孔器从消毒叶片上取得叶圆片
叶盘在过夜培养的对数生长期的农杆菌的菌液中浸数秒种后，置于培养基上共培养 待菌株在叶盘周围生长至肉眼可见菌落时再转移到含有抑菌剂的培养基中除去农杆菌。
同时在该培养基中加入抗生素进行转化体选择，3~4周培养可获得转化的再生植株。
优点：操作简单、重复性高、适用性广 (2)转化苗的保持与繁殖
主要采用两条途径实现转化苗的保持与繁殖。
营养繁殖途径，它包括试管苗的无性快速繁殖及嫁接、扦插等田间的无性繁殖方式。 该途径保持繁殖转化苗时应注意如下：
①正确使用激素浓度，低水平的激素能有利于保持外植体活力，并刺激休眠侧生分生组织的发育及侧枝形成。适当提高分裂素浓度有利于芽的分化，形成原始转化苗的无性系克隆。因此可根据实验目的选择细胞分裂的浓度。
②为消除残留的农杆菌在繁殖培养基中加入抑菌抗生素是明智的种子繁殖：
这对于转基因植株的正常表达、遗传特性及向生产化过渡具有重要作用。该途径的主要操作是将转化试管苗在小花盆中移栽成活，然后转入田间，开花时套袋隔离防止杂交授粉及向环境中释放转化的花粉。结种后注意收割种子，保存。
3、原生质体共培养转化方法
(1)操作步骤：
①从叶片分离原生质体，在26t下暗培养24 h，然后转移到lX下继续培养48h;
②在细胞即将分裂，新的细胞壁物质已经形成时，加入活化的农杆菌悬浮液。农杆部原生质体的比例以1：1000左右为宜。共培养约2～3 d;
③再加入选择标记的抗生素对转化体进行选择培养约3～4周后可产生肉眼可见的小块转化愈伤组织;
④将小块愈伤组织转移到固体培养基上再生愈伤组织，此时继续保持选择压力，以便保证只有转化愈伤组织才能不断生长;
⑤将转化愈伤组织转入固体分化培养基，获得转化再生植株。其他步骤与叶盘法相同。
(2)原生质体共培养法的优点及一些技术问题原生质体的密度一般以105～106个/ml为宜。
在农杆菌和原生质体共培养期民农杆菌附着在原生质体上，超过32小时之后方可除菌洗涤，也就是要有一定的附着时间。
原生质体出现新形成的细胞壁物质是农杆菌转化的基本条件，这是因为细胞壁物质与农杆菌的附着有关。未形成新细胞壁物质的原生质体没有农杆菌的附着，也没有转化进行。 在共培养过程中，某些二价阳离子(Mg2+)为农杆菌的附着和转化所必需。二价离子的整合物EDTA可以抑制农杆菌对植物细胞壁的吸附及转化作用，因为上述 Mg2+(不是 Ca2+)与农杆菌附着到植物细胞壁有关。 共培养转化似乎是在单细胞或二细胞阶段发生，因此获得的转化愈伤组织大部分是来自一个细胞。
八、癌农杆菌转化系统的评述
优点：
成功率高，效果好。该转化系统是模仿或称之为利用天然的转化载体系统，不管是用菌株接种整体植物的伤口，还是直接侵染离体培养细胞，通常都可以获得满意的转化频率。
在所有的转化系统中，Ti质粒转化系统是机理研究得最清楚的，方法最成熟，应用也最广泛。
Ti质粒的T-DNA区可以容纳相当大的DN段插入，目前已把长达50kb的异源DNA序列通过T-DNA完整地转移到植物细胞中。
T-DNA上含有引导DNA转移和整合的序列，以及能够被高等植物细胞转录系统识别的功能启动子和转录信号，使插入到T-DNA区的外源基因能够随同T-DNA一道在植物细胞中表达。
可根据人们的需要连接不同的启动子，使外源基因能够在再生植株的各种测器官中特异性表达，例如在果实中表达，在叶中表达，甚至仅在根中表达，即可进行人为地控制。
农杆菌Ti质粒转化系统转化的外源基因以单拷贝为多数，遗传稳定性好，并且多数符合孟德尔遗传规律，因此转基因植株能较好地为育种提供了中间选育材料。
潜心解构植物基因 篇3
从某种意义上说，吴忠义的经历是我们听惯了的故事：来自并不富足的农民家庭，考入大学后不断深造获得博士学位，如今沿着所学的专业脉络在工作岗位上追求着自己的人生目标……然而，当他坐在你对面，投入又略带兴奋地讲述着他的研究工作时，你仍然会被他快乐的语气所感染。
留学3年获益多
1998年9月，吴忠义来到正在筹备创建中的北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心报到，在中国农业大学获得的博士学位让他踌躇满志。可是，在单位工作了不到一年的时间，吴忠义深深感到：自己在上学期间所学的细胞生物学水平还停留在上世纪70年代，离世界先进国家的水平相差甚远，他萌生了出国深造的想法。此时，一个机会促成了他以公派自费的形式来到美国马里兰大学生命科学学院，在该学院细胞生物学与分子遗传系进行学习与研究工作。
尽管马里兰大学在生物技术方面的整体研究水平在美国算不上顶尖，但在那里吸收的知识养分和积极向上的学术气氛，让吴忠义陶醉其中。谈到那里的科学家，他们做人、做学问的品德更是让吴忠义受益颇丰。吴忠义给记者讲了这样一件事，他刚去不久，有一天他想去一个实验室做实验，于是他就给实验室的主人打电话，话筒里传来一位和蔼的老太太的声音，耐心地询问吴忠义是否会使用那里的设备，当听到吴忠义还不会使用时，老太太马上和他约定了时间，亲自来到实验室，手把手交他如何操作，使用完后怎样收好。事情过去很长时间，吴忠义才从自己导师那里得知，原来那位老太太竟是马里兰大学里最著名的Elisabeth Gantt教授、年收入超过学校校长的美国科学院院士。
现在，吴忠义把恩师们的言传身教都带给了他的学生，他觉得这样才尽到了他的一份职责。
有感而发的新星项目
通过3年的努力，吴忠义顺利完成了马里兰大学的博士后学业，怀着一腔热情回到北京。但是，当他踏出舱门时，却被一阵夹杂着黄沙的大风吹迷了眼。后来，他听接机的朋友说，那些天北京正闹沙尘暴。相比3年的美国生活，吴忠义戏称：“在美国，一双鞋穿一个星期都可以不擦，因为那里的风无土可带。”鲜明的对比，让他很快做出了决定，回国后的第一个课题就定位在抗干旱的高羊茅草上。据吴忠义介绍，这种草是一种重要的草坪草，原产西欧、北非，具有抗干旱、耐瘠薄、抗病、适应性广等特点，在城市绿化和运动场地的建设中有广泛的应用，非常适合像北京这种严重缺水的大城市。令他高兴的是，他的想法很快就得到了市科委新星计划的资助，让他的研究能够迅速进入轨道。
目前，在以吴忠义为首的课题组的数百次试验后，经过基因改良后的高羊茅草具备以下特点：一是改良后的草种具有安全性，不会成为难以清除的杂草威胁现有的植物生态系统，防止了转基因技术带来的不精确、不可预测和不可逆转问题，避免了给环境造成潜在威胁。二是经过转基因技术培育出来的草种将具有出色的目标性状，抗旱、耐盐能力得到显著提高。尽管项目才取得了阶段性成果，但已经得到了美国、阿根廷和非洲等国家学者和研究机构的密切关注。
除了草，吴忠义现在对花的研究也是如火如荼，尤其是北京的市花——菊花。吴忠义表示：“现代菊花是经过多重组合，反复杂交，不断演变形成的杂合体。每个品种都蕴含着若干潜在的形质(基因)，并不时出现重组、性状分离、基因突变，可塑性极强。目前，我们已经开发了上千个品种，而且花期大大提前，七八月就可以绽放，正好可以为明年的北京奥运服务。而菊花尚无蓝色，这正是我们准备攻克的目标。从去年开始，我每天都与行色各异的‘花中君子’打交道，并发挥着我的专业特长，对我来说这样的工作真是太美了。”
植物基因组 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料金丝楸(J)、灰楸(H)、梓树(Z)、美国梓树(M)、豫楸1号(Y)来自河南省林业科学研究院试验场。随机引物由大连宝生物生物工程公司合成,Taq酶,dNTP,10×PCR Buffer,Mg2+均购自上海生物工程公司。PCR扩增采用美国伯乐公司MyCycler PCR扩增仪器,凝胶成像采用伯乐Gel Doc XRTM凝胶成像分析系统。
1.2 方法
1.2.1 梓树属基因组DNA提取
采用2×CTAB法提取梓树属基因组DNA:(1)取幼嫩叶片加液氮研磨成粉末状,转入1.5 ml离心管中;(2)加入600 ul 65℃预热的2×CTAB溶液混匀并置于65℃水浴中保温30～60 min;(3)取出冷却后,上下摇匀,加入600 ul的氯仿异戊醇(24∶1),12 000 r/min离心10 min,(4)取上清液于另1个1.5ml的离心管中;加600 ul异丙醇,12 000 r/min离心10 min,倒掉上清液,用75%的酒精清洗,沉淀晾干后加100 ul无菌水溶解;(5)加10 ul(10 mg/ml)的RNA酶,37℃水浴酶解1 h,补水至500 ul;(6)加500 ul的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1),混合均匀,12 000 r离心10 min,抽提纯化2次;(7)取上清液,加入等体积的氯仿,混合均匀,12 000 r离心10 min;(8)取上清液,加入1/10体积3 mol/L的乙酸钠和2.5倍体积的预冷无水乙醇,-20℃放置30 min以上;(9)12 000 r离心10 min后,沉淀即为提取得到的基因组DNA,用70%酒精清洗3次,晾干后加100 ul TE或无菌水溶解。
1.2.2 基因组DNA浓度及质量检测
将原液稀释50倍后,用紫外分光光度计测定DNA样品在260 nm和280 nm的吸光度,计算OD260 nm/OD 280 nm的值,按1 OD260=50 ng/μl计算基因组DNA原液的浓度,即50×OD260×稀释倍数。
琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA片段的大小,将DNA样品用无菌水稀释50倍,取5 ul用0.8琼脂糖进行凝胶电泳分析,检测所提取DNA片段量。
RAPD分子标记技术的缺点就是重复性差,试验过程中容易受到反应体系中其他因素的影响,比如退火温度、模板DNA质量、扩增参数的设置等。该研究对影响扩增的主要因素Mg2+的浓度、Taq聚合酶的用量、dNTP的用量进行了优化,建立适宜梓树属反应的优化体系。
采用25 ul反应体系,包括dd H2O、d NTP、10×Buffer、引物、模板、Taq酶,设置镁离子浓度梯度为50 umol/L、100 umol/L、150 umol/L、200umol/L、250 umol/L;dNTP浓度梯度为50 umol/L、100 umol/L、150 umol/L、200 umol/L、250umol/L;Taq酶浓度梯度0.5 U、1.0 U、1.5 U、2.0U、2.5 U,通过对比试验找出最佳反应体系,并利用42种不同引物进行优化条件的检验。
1.3 DNA扩增反应程序
根据树种的不同和引物合成的退火温度,程序设置如下:首先进行预变性95℃5 min,预变性之后进入循环体系:变性:94℃30 s;退火:36℃30 s;延伸:72℃45 s,共45个循环,最后72℃再延伸10 min,反应结束后4℃保存。
1.4 电泳检测
实验结束后,取15 ul扩增产物用0.5倍TBE电泳缓冲液,在1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳,电压为100 V。电泳结束,EB染色20 min后,在伯乐凝胶成像仪下观察、拍照。
2 结果分析
2.1 梓树属基因组DNA提取质量及电泳分析
通过分光光度计分析得知提取得到的DNA浓度较高,样品色泽白色透明,OD260nm/OD280nm为1.73,接近1.8,表明DNA浓度符合RAPD分析要求。
通过0.8%琼脂糖凝胶电泳分离检测,溴化乙锭染色,观察DNA分子的完整性,结果见图1。基因组DNA在凝胶上表现为一条规则的带,基本无降解现象,有少量的RNA,但不影响RAPD分析。
2.2 RAPD扩增条件优化结果及参数确定
2.2.1 镁离子和dNTP浓度优化及结果
该实验设计了镁离子为50 um/L、100 um/L、150 um/L、200 um/L、250 um/L的浓度梯度,从实验结果分析,镁离子浓度对扩增产物的影响很明显:浓度太低时,没有扩增产物出现(图2中第1、2泳道),浓度太高时,条带模糊且多态性低(图2中的5泳道)。在浓度为150 um/L或200 um/L时条带多且较为清晰。
在扩增反应体系中,dNTP是PCR反应的原料,在实验过程中会螯合部分镁离子,减少溶液中镁离子的数量,导致扩增谱带的改变直至产物消失。因此,镁离子和dNTP的浓度要综合考虑,结合实验结果(见图2),采用镁离子最终浓度是200 umol/L,dNTP的最佳浓度是50 umol/L。
2.2.2 Taq酶浓度优化及结果
该实验设计Taq酶5个浓度梯度,分别是25 ul体系中0.5 U、1 U、1.5 U、2 U、2.5 U。由图3的电泳图可见,Taq酶以1 U为最好,条带多而且清晰,浓度减少条带清晰度下降,而浓度增加条带变粗,背景较模糊。
2.3 RAPD扩增条件优化参数确定
经过对镁离子、dNTP、Taq酶的优化,建立如下RAPD优化体系:10×buffer:2.5 ul;Mgcl2:2.0 ul;dNTP:0.5 ul;Taq酶:0.2 ul;引物:1.0 ul;模板:1.0 ul,加双蒸水至25 ul。
PCR循环参数设定:95℃预变性5 min,94℃变性30 s、36℃退火30 s、72℃延伸45 s,进行45个循环,然后72℃延伸10 min,最后4℃保存。
2.4 梓树属基因组RAPD测定结果
用优化参数和选定的扩增条件对梓树属5种植物基因组DNA进行扩增,扩增产物用1.5%琼脂糖电泳分离,溴化乙锭染色,凝胶成像系统照相,结果见图4。由图4可见,DNA扩增图谱清晰,豫楸1号和金丝楸谱带相同,这和豫楸1号是从金丝楸中选育出来的实践结果一致。不同品种之间DNA存在明显的多态性,其中1 500 bp为5个品种所共有,在不同样本中没有变异,这表明它们是比较保守的DNA片断,其他条带在不同品种和个体中或有或无,这反映了梓树属品种的遗传多样性,同时也说明了我们建立的RAPD优化体系适合梓树属植物遗传多样性分析。
3 结论与讨论
通过对反应体系的优化,建立了梓树属植物的RAPD-PCR最佳反应体系,为下一步进行梓树属植物种质资源的RAPD分析及其亲缘关系鉴定、遗传多样性研究提供了可靠的试验依据。
在优化RAPD扩增条件过程中,应尽可能找出各种对RAPD扩增产生不良影响的高低变数[4]。多次实验证明,采用梯度设置法是优化RAPD扩增条件的简便快速、经济实用方法,它使RAPD扩增条件优化过程实现了程序化和数量化,采用该方法、程序与策略,可以在短时间内获得RAPD扩增全部优化参数,节约大量的试剂、DNA样本和实验时间,应用该方法进行RAPD扩增可以获得图谱清晰、稳定可靠的实验效果。
参考文献
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植物基因组 篇5
植物同源异型基因及同源异型盒基因的研究进展
植物同源异型基因及同源异型盒基因是涉及植物个体发育调节的两类重要转录因子编码基因.近来的研究表明,这两类基因及其产物的结构与功能具有明显的`差异.深入研究这两类基因的结构与功能对揭示植物的发育机制具有重要意义.
作 者：魏文辉 宋运淳 覃瑞 WEI Wen-Hui SONG Yun-Chun QIN Rui 作者单位：武汉大学发育生物学研究中心,武汉,430072 刊 名：生物化学与生物物理进展 ISTIC SCI PKU英文刊名：PROGRESS IN BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS 年，卷(期)： 27(2) 分类号：Q37 关键词：同源异型基因 同源异型盒基因 发育调节植物基因组 篇6
1 材料和方法
1.1 材 料
本方法提供了一个通用、简单易行，成本低，且安全地去除植物DNA 提取过程中多糖等杂质的方法，所提取 DNA无降解并且纯度较高，采用该方法所提DNA的纯度和浓度可以满足PCR扩增和限制性内切酶消化的要求，这为后续以分子标记和序列分析为基础的植物群体遗传学和保护遗传学的研究奠定了重要的基础。
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植物基因组 篇7
1 EST-SSR的原理和方法
1.1 EST-SSR技术的原理
EST是指通过对cDNA文库随机挑取的克隆进行大规模测序所获得的cDNA 的5′或3′端序列, 它代表生物体某种组织某一时期的表达基因。而SSR分布于整个植物基因组, 除分布于基因间隔区外, 在基因编码区也有广泛分布。EST-SSR基本原理是:筛选包含SSR的EST并根据微卫星序列两端保守的侧翼序列设计引物, 通过PCR 反应扩增基因组编码区的微卫星序列, 将扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳, 再经银染后分析微卫星中核心序列重复单位数目的多态性。EST-SSR的原理与技术与基因组SSR相似, 两者区别在于EST-SSR来源于基因组的编码区, 因此其更能反映出植物基因组功能的信息[7]。
1.2 EST-SSR引物的开发
从GeneBank、EMBL等公共数据库中下载EST, 应用Clustal X、Treeview、Genedoc等软件经过拼接和聚类去掉冗余。由于并非全部EST都包含简单重复序列, 通常需要筛选得到可利用的EST, 可以使用在线SSR识别软件SSRIT来完成。一般选择识别标准为:二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸和五核苷酸重复序列的重复次数分别大于或等于10、7、5和4。应用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物。引物设计的原则为:EST序列长度大于100bp; SSR序列的开始和结束位置分别距5′和3′端不少于20bp, 引物设计一般长度为18~24bp。
1.3 实验操作
EST-SSR是基于PCR技术的分子标记, 其实验操作与基因组SSR方法相同。实验流程通常包括基因组DNA提取、PCR扩增、聚丙烯酰胺变性凝胶电泳、银染显色、统计分析等步骤。
2 EST-SSR的物种间的可转移性及其在植物基因组研究中的应用
2.1 EST-SSR的物种间可转移性
SSR标记在不同物种之间的可转移性取决于其侧翼序列的保守程度与SSR进化的稳定性。基因组SSR由于大多来源于非编码序列, 而且侧翼序列往往具有明显的物种特异性, 因此其在不同物种间通用性极差。而EST作为基因的一部分, 由于不同物种间基因的共线性和保守性, EST-SSR侧翼序列往往在物种之间高度保守, 从一种植物中开发的EST-SSR 可通用于其它近缘物种研究, 加快了物种之间的基因组信息转换, 为植物基因组研究提供了新的思路和途径。EST-SSR在不同作物中的通用性已有大量报道, 而且 EST-SSR与基因组SSR相比具有更高的物种间的可转移性[8]。Vendramin E等[9]利用21对桃 (Prunus persica) 的EST-SSR引物研究了在蔷薇科李属近缘种植物杏 (P.dulcis和P. armeniaca) 、李 (P. domestica和P. salicina) 、甜樱桃 (P.avium) 可转移性, 发现18个引物能有效扩增出条带, 其中杏和日本李多态性条带比率均为38.1%, 甜樱桃多态性条带比率为14.3%, 表明EST-SSR在李属近缘种植物之间具有高效的通用性。宿俊吉等[10]选用普通小麦534对基因组SSR引物和351对EST-SSR引物分别对普通小麦品种Fukuho和同族物种四倍体冰草Z559的基因组DNA进行扩增, 结果显示226对SSR和258对EST-SSR引物对冰草能有效扩增, 通用性比率分别为42.3%和73.5%, 表明SSR和EST-SSR在同族植物种小麦和冰草之间的可转移性, 小麦EST-SSR对冰草的通用性明显高于SSR。EST-SSR在物种间的可转移性显著增加了标记数目, 提高其利用价值, 表现为物种间通用性好高, 为不同物种的标记开发提供了新的方法。
有研究表明物种间SSR转移的成功率与物种之间的亲缘有关, 除了在近缘植物种间有较高的转移率以外, 也有许多EST-SSR在植物不同属间可转移的研究报道[11,12]。忻雅等[13]利用15对白菜的EST-SSR引物研究了该标记在白菜、油菜、玉米、高粱、水稻和茶树等不同物种间的通用性, 结果表明, 所设计的引物对不同白菜品种、近缘种油菜以及玉米、高粱、水稻、茶树的扩增成功率分别为100%、93.3%、80%、93.3%、93.3%和86.7%, 并且各物种基因组的扩增产物中均检测出不同程度的多态性片段。Saha M C等[14]利用145对高羊茅 (Festuca arundinacea) EST-SSR引物研究在一些草地植物间的通用性发现, 在黑麦草、草甸羊茅、小麦、水稻中成功转移率分别为86%、83%、71%、59%, 表明转移成功率与这些物种与高羊茅的亲缘关系远近有关, 而且扩增片段呈现出了较高的多态性。以上研究表明, EST-SSR在近缘或远缘物种之间均有较好的通用性, 并且在植物基因组研究如比较遗传作图和种质亲缘关系鉴定和利用等方面已经体现出明显优势和巨大的应用潜力。
2.2 EST-SSR在植物基因组学研究中的应用
作为一种新的SSR分子标记来源, 利用其在物种之间的高通用性, 大量不同物种的EST-SSR标记得以开发出来, 为进行遗传连锁图构建、比较遗传作图、种质资源遗传多样性评价、亲缘关系鉴定与系统分析等植物基因组研究领域提供了技术平台, 目前该技术已经在许多重要作物和野生植物资源等基因组研究中成功应用。
2.2.1 遗传连锁图谱构建
遗传图谱的构建是遗传学研究中的一个重要领域, 是对基因组进行系统性研究的基础, 也是遗传育种的依据。传统的基因组SSR标记由于受到引物开发的限制, 很难获得高密度的遗传连锁图, 而EST-SSR弥补了基因组SSR的不足, 为构建高密度遗传图谱提供了有力的技术手段。近年来, 与其它分子标记的整合遗传图谱构建开始被关注, 尤其在作物遗传图谱构建方面得到了广泛应用。Yi G等[15]利用辣椒 (TF68×Habanero) F2群体, 利用EST-SSR技术获得139个分子标记, 远大于SSR、AFLP遗传图谱标记数, 并将获得EST-SSR位点定位于14个连锁群, 整合构建了总图距为2 201.5cM的遗传连锁图谱。Gonzalo M J等[16]应用EST-SSR、SSR、RPLP等分子标记以韩国甜瓜品种PI161375和自交系PS的杂交后代以及加倍单倍体为研究对象进行图谱整合, 获得图距为1 021cM由12个连锁群组成包括16个EST-SSR标记在内的整合遗传图谱。遗传图谱的构建为进一步进行抗病基因和重要农艺性状基因的克隆、定位与鉴定提供了理论依据。
由于EST-SSR来源于基因组编码区, 与基因的功能可能密切相关。随着植物基因组学研究的不断深入, 构建功能基因图谱成为植物基因组学研究热点。Guo W Z等[17]以陆地棉TM-1和海岛棉Hai7124以及杂交后代与TM-1回交BC1为作图群体, 通过以雷蒙德氏棉EST-SSR检测到两个亲本之间存在很高的多态性位点, 并以此构建了遗传图谱, 将1 122个EST-SSR位点定位于26个染色体上, 其中使得原有棉花遗传图谱增加至1 790个位点, 获得了包括26个连锁群在内图距为3 425.8cM的遗传图谱, 大大增加了其连锁密度。通过与数据库蛋白质序列比对, 表明475个位点与生物代谢过程、细胞组分、分子催化、结合功能等基因的功能有关, 并得到与棉花纤维发育的一些重要基因, 对进一步研究棉花基因组功能和改良农艺性状都具有重要意义。
2.2.2 比较作图
基因组比较作图是利用共同的遗传标记对相关物种进行物理或遗传作图, 比较这些标记在不同物种基因组中的分布, 揭示染色体或染色体片段上的基因及其排列方式的相同或相似性, 有助于在不同物种间互相利用遗传信息, 从而研究不同物种的基因组结构、功能。EST-SSR由于在物种间有很好的通用性, 因此, 在比较作图方面展现出独特的优势。Hori K等[18]利用栽培一粒小麦 (Triticum monococcum) 和野生一粒小麦 (Triticum boeoticum) 杂交F10群体, 将大麦242个EST-SSR标记定位于小麦遗传图谱上, 获得了图距为1 038.1cM的遗传连锁图谱。阐明了小麦遗传图谱与原先构建的大麦遗传图谱呈明显的共线性, 小麦和大麦染色体之间存在同源联系。Chen C X等[19]应用在甜橙 (Citrus sinensis) 和枳橙 (Poncirus trifoliata) 间通用性很高的甜橙EST-SSR标记, 利用141个在杂交F1代分离的多态性标记分别构建了图距分别为775.8cM和425.7cM甜橙和枳橙的遗传图谱。两个遗传图谱的比较研究表明, 两个物种图谱中相应的连锁群之间存在明显的共线性, 为进一步研究甜橙相关属物种之间比较遗传作图分析奠定了基础。EST-SSR通用性为研究基因组功能区域的相似程度, 指导基因组功能的预测提供了有效的技术方法。Varshney R K等[20]利用大麦遗传图谱中的含有SSR的EST与黑麦、小麦、水稻的EST数据比对时发现在大麦中的这些EST在上述物种中都有同源性。把其中9个大麦的EST-SSR标记用于黑麦图谱的绘制, 发现所有的这些标记的位置都在预期的功能区, 与大麦图谱相比处于相似位置。由此可以看出, EST标记在物种之间遗传图谱中进行比较以揭示基因组功能及进化有着重要意义。
2.2.3 种群遗传多样性评价
遗传多样性是种群遗传结构特性的重要组成部分, 是生态系统多样性和物种多样性的核心与基础, 也是物种的适应性的体现, 对于种质资源遗传多样性的研究有助了解物种对环境的适应性、生存力以及进化潜力, 对制定有效管理措施有着极其重要的意义。然而对于许多自然生态环境的野生物种, 其遗传背景不是十分清楚, 共显性标记基因组SSR因引物设计困难应用受到很大限制, 对于其种群遗传多样性研究多限于RAPD、ISSR、AFLP等显性分子标记的使用, 对杂合体不能有效加以区分, 影响了对种群遗传多样性准确评价。EST-SSR由于其很高的物种间的通用性, 数量剧增的公共数据库公布的EST序列为开发SSR提供了大量可利用资源。近年来利用遗传信息丰富的植物EST开发近缘种EST-SSR的策略开始受到关注, 并已在植物种群遗传结构研究中开始应用。Pashley C H等[21]应用22个向日葵栽培种 (Helianthus annuus) EST-SSR引物比较分析了两个栽培种和近缘稀有野生向日葵 (Helianthus verticillatus) 3个种群的遗传多样性和遗传结构, 发现22个栽培种EST-SSR引物在野生种种群内和种群间产生更为丰富的多态性位点, 表明该稀有植物种种群具有极高的遗传多样性和一定程度的种群遗传分化, 初步揭示了遗传分化可能源于适应性位点的遗传变异, 为进一步制定保育管理措施提供了理论依据。
2.2.4 种质资源的鉴定
种质资源鉴定是进行品种改良、资源利用的前提和基础, 植物种质资源的鉴定在提供多样化亲本、扩大品种遗传基础及合理利用种质资源等方面都具有十分重要意义。近年来, EST-SSR技术的发展和应用, 为种质资源鉴定深入开展提供了一个全新的途径。金基强等[22]采用16对EST-SSR引物对42个茶树品种资源进行了分析, 结果显示10对引物具有多态性, 占76.9%, 共检测到84种等位基因型和74个等位变异, 每对引物可检测到基因型和等位基因数分别为4~12和3~10种, 并将42茶树品种划分为 3个亚类, 表明EST-SSR标记是鉴定茶树资源有效的方法。Caruso M等[23]用EST-SSR对36个竹笋品种进行了鉴定, 研究材料包括35个栽培种和1个新的变种, 应用8对EST-SSR引物对36个品种进行了区分, 聚类分析表明品种间遗传联系与其地理起源有明显的相关性。张鹏等[24]对192份国内外芝麻的进行了EST-SSR 分析, 25对SSR 引物扩增的136个等位基因中56.28%呈多态性, 平均每对检测引物产生3.04个。经聚类分析发现, 192份芝麻材料可被分为3个类群6个组, 中国南部地区芝麻遗传多样性高于中部和北部地区, 为保护利用芝麻种质资源及育种工作打好了基础。
2.2.5 分子系统发育与进化
分子系统发育与进化的基本关系就是在DNA水平上探索生物进化的原因和机制, 以生物大分子信息推断生物进化的历史, 重建系统谱系关系。EST-SSR由于物种间通用性高, 打破了传统基因组SSR的局限, 在分子系统发育与进化研究中被广泛应用。Wang M L等[25]采用苜蓿、大豆的28个EST-SSR标记研究野百合属4个种26个品种的系统亲缘关系, 把26个划分为4个类群, C.juncea与C.retusa和C.spectabilis有较近的亲缘关系, 而与C.pallida的亲缘关系较远, 并对26个品种的系统分类进行了重新确定。Mian M A等[26]用145对高羊茅EST-SSR标记对来自禾本科2个亚科8个属的12个代表性草本种进行系统分类分析, 发现均可以扩增出条带并呈很高的多态性。根据EST-SSR的多态性和含有这些SSR的DNA序列比对分别构建了系统树, 两种分析发现冷季型禾本科牧草模式种Lolium temulentum和他们研究的羊茅属 (Lolium) 和黑麦草属 (Festuca) 的大部分种有比较近的亲缘关系, 两种分析方法的结果表现出一致性并且与传统系统分类相吻合, 表明EST-SSR在该属物种具有很好的通用性, 利用基因组信息丰富的模式植物或作物EST-SSR标记为分子系统发育与进化分析提供了便捷。
3 存在问题及采取措施
EST-SSR作为一种新型的分子标记, 尽管在遗传连锁图谱构建、比较遗传作图、种质资源遗传多样性评价与保护、亲缘关系鉴定与系统分析等基因组研究中具有很大优势, 但同时也存在一定的缺陷, 主要表现在以下几个方面:
(1) 由于EST-SSR来源于序列相对保守的基因组编码区, 与传统SSR标记相比较, EST-SSR标记的多态性较低。
(2) EST-SSR多态性是主要基于微卫星重复序列数目的变化而产生的长度多态性, 对于长度相同而由不同碱基重复序列组成的SSR不能有效加以区分。
(3) 由于EST仅仅是一个基因的部分序列, 所以它所揭示的基因组信息不够全面, 如有些调控序列等在基因表达调控中起重要作用的信息不能体现出来。
针对以上EST-SSR存在的不足, 利用数量迅速增加的EST开发新的EST-SSR, 增加EST-SSR标记数量, 并结合其它分子标记如RFLP、AFLP、SSR、CAPS、SNP等进行比较研究, 以提高实验的可靠性和准确性。
4 前景与展望
高通用性EST-SSR已经在遗传图谱构建、遗传多样性评价、比较遗传作图、种质资源鉴定、系统发生与进化等植物基因组研究中被广泛应用。随着功能基因组学研究的不断深入, 大量表达序列标签成为开发SSR可利用的资源, 特别是水稻、拟南芥等模式植物全基因组序列的测定, 源于植物基因组编码区高通用性的EST-SSR开始在分析基因组功能如基因定位与克隆、转录图谱的构建、发掘和利用功能基因、揭示基因对于环境的适应性进化等方面发挥重要作用。随着分子生物学技术和生物信息学的飞速发展, 高通用性分子标记EST-SSR必将有着更为广阔的应用前景。
摘要：数量迅速增加的表达序列标签已经成为开发分子标记的重要资源。EST-SSR是基于表达序列标签开发微卫星的一种新型分子标记, 与基因组SSR相比, EST-SSR具有在植物物种之间可转移性的优点。目前, EST-SSR被广泛应用于植物基因组学研究如遗传图谱构建、比较作图、遗传多样性评价、种质鉴定、系统发育与进化研究等方面。该文介绍了EST-SSR原理、引物开发、实验方法, 并对其物种间通用性以及其在植物基因组研究中的应用进行了评述。
植物基因组 篇8
关键词：基因工程,基因芯片,植物胁迫应答
基因芯片是伴随人类基因组计划而发展起来的一种高新生物技术, 具有快速、高效、大规模、高容量、高度并行性等特点, 已成为目前国际上生命科学研究的热点之一。随着植物基因序列数据库迅速增长, 基因芯片已成为植物基因组学的主要手段之一。近几年, 采用基因芯片技术进行转基因植物表达谱分析的研究越来越广泛, 通过对差异基因生物信息学分析, 筛选与植物胁迫应答相关基因, 从而深入研究其在植物胁迫应答过程中调控机理。
1基因芯片的概念及分类
基因芯片是利用核酸杂交测序 (sequencing by hybridization, SBH) 原理, 在载体表面建立可寻址的高密度DNA分子微阵列, 通过与标记过的样品核酸序列互补匹配, 进行测序与大规模平行检测生物未知基因分子的有关信息。通过基因芯片技术可大规模、高通量地对成千上万条基因同时进行研究, 从而大大加快了基因研究的效率。基因芯片的种类较多, 根据DNA微阵列上的核酸序列长度, 基因芯片可分为两类:一类是cDNA 微阵列;另一类是寡聚核苷酸微阵列。根据基因芯片所用的载体材料不同, 可分为玻璃芯片、硅芯片、膜芯片、陶瓷芯片等;根据基因芯片制备方式不同, 可分为原位合成芯片、直接点样芯片、电定位芯片和三维芯片等。
2基因芯片实验设计
实验设计是基因芯片实验研究中重要的部分, 是芯片数据可靠的前提。由于基因芯片实验成本昂贵, 在进行实验时需严格设计和认真操作。实验设计中探针筛选、芯片选择、生物学重复次数对试验数据质量都有影响。基因芯片中荧光实验是利用标记了红色荧光Cy5和绿色荧光Cy3的两个样品同时与基因芯片进行杂交, 基因芯片上每一个点包括了这两种样品中相应mRNA的荧光信息, 通过比较两者的荧光信号强度计算相对表达量。因此, 其实验设计和常规比较试验思路是一致的。要得到可靠的生物学结论, 基因芯片实验在实际操作中至少应有三个重复。不必对同一个样品进行重复杂交分析, 但是必须要进行试验重复。
3基因芯片数据分析
基因芯片分析产生大量的数据, 需要专业统计学软件对整体表达情况进行分析。由于芯片实验中涉及许多不确定因素, 因此原始数据首先需经过归一化, 以消除由于系统变异引起的误差, 使得基因表达数据能够真实地反映测量样品的生物学差异。聚类分析是通过建立各种不同的数学模型, 把基于相似数据特征的变量或样本组合在一起。根据芯片中反映的转录因子基因的变化, 与其调节的下游响应基因进行联系分析, 对推测的关联性进行验证将有助于研究这些调控体系。
4基因芯片在植物胁迫应答基因功能研究中的应用
采用基因芯片技术分析干旱胁迫条件下, 小麦根中差异表达的基因。研究发现大部分脱水应答相关基因表达, 这与在其它物种和渗透胁迫研究中得到的结果相一致。通过芯片数据分析, 得到一个新的干旱胁迫诱导的AP2/ERF转录因子, 并且鉴定出一个干旱胁迫诱导的小分子蛋白LitP脂质转移酶。这些干旱胁迫相关基因的深入研究, 对提高小麦品种的抗旱性具有重要的意义[1]。Chujo等 (2007) 对超表达OsWRKY53水稻细胞进行基因组学分析, 发现明显上调防卫反应相关基因表达, 如PBZ1, PR14, Chitinase1, PR5, Chitinase2和Peroxidase。通过实时荧光定量RT-PCR验证这些基因表达量, 与基因芯片结果一致[2]。为了进一步阐明OsWRKY53在防卫反应中作用, 采用真菌病原M.grisea race 007分别侵染野生型和超表达OsWRKY53水稻, 转基因植株明显减轻病害症状, 提高了其对真菌的抗病性。拟南芥中DREB2C基因过表达, 提高了转基因植株耐热性, 进一步采用基因芯片和RT-PCR分析, DERB2C调控了热胁迫相关基因的表达, 且基因启动子区含有DRE/CRT元件[3]。组成型表达ZmEREB2A提高拟南芥植物抗旱性, 对超表达ZmEREB2A植株进行基因组学分析, 表明ZmEREB2A上调了LEA proteins和热胁迫相关基因的表达, 并且超表达ZmEREB2A提高转基因植物耐热性。因此, 可能ZmEREB2A在干旱胁迫和热胁迫过程中起到双重调节作用[4]。小麦HvCBF4基因在水稻植株中过表达, 提高其抗旱性、抗盐性和低温胁迫抗性。采用基因芯片分析转基因植株, 表明HvCBF4调控非生物胁迫相关基因, 如Lip5, Dip1, BBT1 和Jac2[5]。
5结论
基因芯片作为生物技术平台之一, 已成为植物基因功能研究中重要手段。然而, 基因芯片在植物基因功能分析中存在几个重要的问题。 (1) 基因芯片杂交的均一性, 完善同一方法操作的标准化。 (2) 增强基因芯片杂交的灵敏度。 (3) 基因芯片数据的生物信息学分析, 保证快速处理和分析杂交数据。在植物功能组学研究中, 通过基因芯片技术可以深入研究植物胁迫应答调节机理及代谢作用机理等。相信随着研究不断深入和技术的完善, 基因芯片在生命科学研究领域将发挥更加重要作用。
参考文献
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[2]Chujo T, Takai R, Chiharu A, et al., Involvement of the elicitor-in-duced gene OsWRKY53 in the expression of defense-related genes in rice.Biochimica et Biophysica Acta.2007 (1769) :497-505.
[3]Lim CJ, Hwang JE, Chen H, et al., Overexpression of the Arabidopsis DRE/CRT-binding transcription factor DREB2C enhances thermotolerance.Biochem.Bioph.Res.Co.2007 (362) :431-436.
[4]Qin F, Kakimoto M, Sakuma Y, et al., Regulation and functional analysis of ZmDREB2A in response to drought and heat stresses in Zea mays L.Plant J.2007 (50) :54-69.
植物基因克隆技术的研究进展 篇9
关键词：植物,基因克隆技术,研究
植物基因克隆技术在生命科学技术中扮演着越来越重要的角色, 而植物基因克隆技术从传统意义上来讲可分为两种不同的方式。正向以及反向的遗传学方式, 正向遗传学途径是一种很早的经典的克隆方法, 通过研究突变表型性状进行克隆, 包括了功能以及表型克隆等较为基本的克隆的方式;反向遗传学途径和正向遗传学途径截然不同, 它是通过一些特殊的方法, 获得遗传基因片段, 然后经过一系列的定位, 将之后所研究的基因逆向研究。如定位克隆, 同源序列克隆等。除了这两种克隆技术外, 随着社会发展, 也有一些新的克隆技术产生。
1 基因芯片技术
基因芯片技术是电子克隆技术的典型代表, 基因芯片又称DNA芯片、DNA微阵列, 是以预先设计的方式将大量的基因探针固定在玻片、硅片等固相载体上组成的密集分子阵列。基因芯片技术类似于计算机的电子芯片技术, 其具有高通量、微型化、连续化、自动化、快速和准确等特点。是一种随着人类基因组计划的进行而发展出的产物, 这一发展使得人类对越来越多的微生物和动植物基因组取得了更长远的认识, 对其的研究, 是全人类对于基因组认识做出的不断地努力的成果, 其中不乏许多典型的实例, 用c DNA芯片技术对草莓、矮牵牛其基因是如何进行表达的进行研究, 进而实现对转基因植物进行形状的观察及控制, 可以更好的获悉分子对于基因表达是如何作用以及影响的也有利于获得更为优异更为良好的作物[1]。
基因芯片技术是一种新型的克隆技术, 是科技创新和生命科学的很好的结合, 代表着人类在基因的克隆方面进展和成就, 解决了很多传统克隆不能解决的问题, 也讲基因克隆技术引向一种新的思维模式。
2 功能克隆
功能克隆是人类采用最早的基因克隆策略, 功能克隆技术从已知蛋白质的功能着手进行研究, 其方法原理是先测知基因的编码蛋白质, 利用它的信使RNA进行反转录成c RNA, 再利用c DNA做探针, 从基因组中获取基因本身, 进而完成克隆。
功能克隆用于很多基因的克隆和分离, 具有广泛的应用。生命科学工作者通过收集以及建立了天麻c DNA的染色体基因片段集合库, 利用以探针为载体的抗体将具有抗真菌能力的基因蛋白摘取出来, 从而更好的利用抗真菌基因, 使其对农业的生产起到不可或缺的作用。功能克隆是先进一个很常用的克隆方法, 也是最基本的克隆方法, 为人类在克隆领域的研究和发展做出了不可多得的贡献, 也是人类对于基因海洋不断探索的最初体现, 功能克隆的方法简便而实用, 但是其具有致命的弊端, 就是必须是已知的编码序列才可以进行有效的克隆, 然后如今人类仍有很多位置的基因编码序列, 所要克隆的基因也有大部分是位置的, 所以功能克隆具有很大的限制性, 这就有了之后的更多更为先进的克隆方法。
3 定位克隆
定位克隆是一种完全不同于功能克隆的克隆方法, 很成功的克服了功能克隆对未知其基因片段无法克隆的局限性, 其原理是根据待测基因在染色体上的表达位置不同而进行定位, 从而克隆的方式, 当某基因精确定位在染色体特定的位置之后, 利用各种方法进行定位, 从而达到克隆的目的。
定位克隆在植物基因克隆中起着重要的作用, 近年来随着对其不断的研究, 如今已经可以从番茄、甜菜、水稻、番茄、拟南芥、马铃薯等植物中分离了几十个重要的基因, 对其大部分抗病基因基因进行克隆, 使原本不抗病的基因片段具有抗病性, 比如:拟南芥的RPS2、RPM1基因、抗霜霉病RPP5基因等, 番茄的Mi基因[2], 小麦的抗线虫基因Cre, 甜菜抗线虫基因Hsl[3], 水稻的Pi-b基因[4], 马铃薯的Gpa2基因等。定位克隆技术为基因克隆的发展做出了显著的贡献。解决了功能克隆在基因产物不明确的前提下进行克隆的问题, 是基因克隆策略的又一进步的体现。
4 同源序列克隆
同源序列克隆方法是一种不同于传统克隆的方法, 在一定意义上具有很大的优越性, 克服了费时费力的问题, 顾名思义, 同原序列法是根据被克隆的基因其序列的同源性进行克隆的方法, 比传统的克隆方法更具优势, 此种克隆方法是基于已有的基因文库之上, 又满足同源性的基础条件, 从而可以利用基因库中已经掌握的基因探针进行克隆。如今随着不断探索和发展, 已经有了诸多的应用, 如:马铃薯、大豆、番茄、莴苣、水稻、小麦。
同源序列克隆的方法虽然更为简便, 更容易操作, 然后通过其结果基因序列片段和已知的抗病基因进行比较, 仍发现一些问题, 其相关性出现了三种不同的表现形式, 也就是说, 通过此种方法不一定会获得与抗病基因相关的基因, 这就需要在克隆中在引物的设计PCR的检测, 对于获得的RGA进行转基因的检验, 从而判断其是否真的具有抗病性等方法进行筛选, 从而使同源基因克隆的整个流程更为完善。
5 结束语
多年来, 生命科学工作者们历经坎坷, 经过不懈的努力创造和研究出上述的多种植物基因克隆的方法, 这些方法各具特点, 也都存在不同的优缺点, 对生命科学的发展起到了巨大的作用, 植物基因克隆技术的研究以及进展可以很大程度上促进人类基因组计划的进行, 也为将来人类克服一切疑难的疾病, 解决现今无法解决的问题起着非常重要的作用, 生命科学关乎人类的兴衰, 是民生之本, 生物的基因就像一片海洋, 人类已经迈出了坚实的步伐, 但这些还是远远不够的, 我们要做的仍然是持之以恒的努力, 为整个人类做出更大的贡献。
参考文献
[1]舒群芳.植物基因克隆的方法和策略[J].植物学通报, 1999, 16 (1) :80-85.[1]舒群芳.植物基因克隆的方法和策略[J].植物学通报, 1999, 16 (1) :80-85.
[2]Milligan S B, John B, Yaghoobi J, et al.The root nematodere-sistance gene Mi from tomato is a member of the leucinezipper, nucleotide binding, leucine-rich repeat family ofplant genes[J].Plant Cell, 1998, 10:1307-1319.[2]Milligan S B, John B, Yaghoobi J, et al.The root nematodere-sistance gene Mi from tomato is a member of the leucinezipper, nucleotide binding, leucine-rich repeat family ofplant genes[J].Plant Cell, 1998, 10:1307-1319.
[3]Cai d, Kleine m, Kifle S, et al.Positional cloning of agene forne-matode resistance in sugar beet[J].Science, 1991, 275:832-834.[3]Cai d, Kleine m, Kifle S, et al.Positional cloning of agene forne-matode resistance in sugar beet[J].Science, 1991, 275:832-834.
植物叶绿体基因工程发展探析 篇10
关键词：植物叶绿体,基因工程,发展,应用,存在问题,展望
叶绿体作为植物中与光合作用直接相连的重要细胞器, 其基因组的功能也因此扮演着十分重要的角色。1882年Straburger观察到藻类叶绿体能分裂并进入子代细胞;1909年Baur和Correns通过在3种枝条颜色不同的紫茉莉间杂交得出, 质体是母本遗传的。人们便开始对叶绿体遗传方面产生了浓厚的兴趣[1]。1988年Boynton等首次用野生型叶绿体DNA转化了单细胞生物衣藻突变体 (at PB基因突变体) , 使其完全恢复光合作用能力, 标志着叶绿体基因工程的诞生[2]。叶绿体基因工程作为一种很具有发展前景的植物转基因技术, 在植物新陈代谢、抗虫性、抗病性、抗旱性、遗传育种等方面都将有着越来越重要的意义。
1 叶绿体基因工程概述
1.1 叶绿体简介
叶绿体是植物进行光合作用的重要器官, 是一种半自主型的细胞器, 能够进行自我复制, 含有双链环状DNA。叶绿体DNA分子一般长120~160kb。叶绿体DNA有IRA和IRB2个反向重复序列 (分别位于A链和B链) , 两者基因大小完全相同, 只是方向相反, 它们之间有1个大的单拷贝区 (大小约80kb) 和1个小的单拷贝区 (大小约20kb) 。
1.2 叶绿体基因组转化优点
叶绿体基因具有分子量小、结构简单、便于遗传的特点, 故相对于传统的细胞核遗传更能高效表达目的基因, 这是因为叶绿体基因本身拥有巨大的拷贝数[3]。叶绿体基因可实现外源基因的定点整合, 避免位置效应和基因沉默;遗传表达具有原核性;安全性好, 叶绿体属于母系遗传, 后代材料稳定;目的基因产物对植物的影响小。利用叶绿体基因转化的这些优点, 可以加快育种速度和效率, 节约育种时间。
1.3 叶绿体转化的主要过程
叶绿体转化过程通常分4步:一是转化载体携带外源目的基因通过基因枪法或其他转化体系导入叶绿体;二是将外源表达框架整合到叶绿体的基因组里;三是筛选具有转化的叶绿体细胞;四是继代繁殖得到稳定的叶绿体转化植物[4]。
1.4 叶绿体转化的主要方法
依据叶绿体转化的主要过程, 生物学家相应地研究若干种叶绿体基因转化的方法, 其中常用的叶绿体转化方法:一是微弹轰击法。将钨粉包裹构建完整的质粒载体, 用基因枪轰击植物的各种组织、器官, 然后对重组叶绿体进行连续筛选, 不断提高同质化水平, 最后获得所需的转基因植株[5]。二是农杆菌T-DNA介导的遗传转化法。将外源目的基因、选择标记基因等构建到农杆菌的Ti质粒上, 然后通过与植物组织或器官共培养, 最后把所需外源基因转化到叶绿体并获得表达。三是PEG处理法。只需将构建好的质粒 (含外源基因、标记基因、同源片断、启动子、终止子等) 在一定的PEG浓度下与植物原生质体共培养。
2 叶绿体基因工程的应用
2.1 提高植物光合效率
植物的光合效率非常有限, 太阳能的很小一部分可以转化为植物所需要的能量, 从而转变为人类需要的产品。植物光合效率取决于Rubisco酶的丰富度。Rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白, 另一方面也可以限制CO2合成。人们可以通过2种直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循环过程;二是提高酶的特性, 减少光呼吸浪费的能量[6]。很多科学家正试图通过提高Rubisco酶来提高植物的光合效率, 而其中拟南芥和水稻的定点整合试验取得了重大突破, 证明叶绿体基因工程是生产高光合效率作物植物的最有价值的方法。
2.2 合成有机物质
由于叶绿体型转基因植物具有环境安全性好、底物丰富、产物区域化等优点, 已被越来越多的人关注, 并成为工业化生产特定有机物质的可靠场所。例如, 有科学家已发明了用叶绿体基因工程表达聚3-羟基丁酸酯合成相关基因的方法。聚3-羟基丁酸酯及其他类型的聚3-羟基链烷酸酯同属于聚酯类物质, 是自然界中多种细菌的碳源及能源储备物。具有生物可降解性, 如取代化学合成塑料将能从源头解决塑料废弃物引起的“白色污染”。其通过构建了含phb B、ph M、phb C和aad A基因表达盒的叶绿体整合及表达载体, 通过基因枪轰击法转化烟草。Northem点杂交、RT-PCR分析结果表明, 叶绿体型转基因植株中目的基因在转录水平的表达明显高于核转化植株中相应基因。
2.3 生产疫苗
人类治疗用蛋白质可以在叶绿体中实现表达, 表达效率取决于外源基因的整合位点, 增强转录和翻译的调控元件以及外源蛋白的稳定性等。人类已经在用叶绿体基因生产疫苗方面开展了卓有成效的工作。例如, 范国昌等将甲型肝炎病毒VP3P1区和丙型肝炎病毒C区融合, 并导入到衣藻叶绿体基因组中, 融合蛋白得到高效表达, 且具有双抗原活性。而霍乱病毒蛋白B (CTB) 抗原CTB已经在叶绿体中转化成功, 预示着转基因植物疫苗的可商业化前景。Tregoning等将Tet C基因在烟草叶绿体基因组进行表达, 为了增加m RNA的稳定性及在烟草叶片内表达的可行性, 他们将基因进行了密码子优化, 分别表达了未经改造的富含AT (72.3%AT) 和人工合成的富含GC (52.5%AT) 的基因, Tet C-AT和Tet C-GC的表达量分别为总可溶蛋白的25%和10%。
2.4 在植物抗性方面的研究
在抗虫性方面, Kota和Cosa分别于1999年、2001年将BTCry ZAa Z基因转入烟草叶绿体, 前者可100%杀死4 000多倍抗性的抗性虫, 后者报道BT表达量达46.1%。在抗逆性方面, 人们通过编码SOD、APx等酶的基因已经转入到烟草、苜蓿、马铃薯、棉花的叶绿体中, 提高了植物的耐氧化能力, 从而提高了植物对环境胁迫的耐受能力。
2.5 叶绿体基因组在系统发育学上的应用
叶绿体在系统发育学上的优点:一是叶绿体基因组是仅次于核基因组的第二大基因组, 为比较研究提供了一个较大的数据基础;二是叶绿体DNA的核酸置换率适中, 在应用上很有价值。然而, 用叶绿体DNA研究系统发育也存在着明显的不足:一是叶绿体基因组是母性遗传的, 因此并不能单靠叶绿体基因组来解释居群间的杂交现象;二是虽然有越来越多的叶绿体DNA被用作分子标记来研究类群间的系统发育关系, 但只有将这些分子片段提供的信息与其他的分子片段信息、传统的形态及生理特征结合起来获得更多的信息, 才能更接近系统发育的本来面目。
2.6 叶绿体基因在消除环境忧虑问题上的前景
当今最为普遍的问题就是外源基因从转基因作物到杂草的逃逸, 这一逃逸主要是通过花粉的扩散, 产生超级杂草或产生和其他作物之间的基因污染, 对环境极为不利。叶绿体基因工程产生的基因逃逸现象的风险远远低于核转化作物, 因为大多数作物中的质体DNA都是母系遗传, 这样就可以避免作物和作物、作物和杂草之间的杂交, 消除人们对基因污染的忧虑。
3 叶绿体基因工程存在的问题
3.1 叶绿体基因转化在杂合体上的稳定性问题
由于高等植物的每个细胞中有10~100个叶绿体, 每个叶绿体内有10~100个叶绿体基因组拷贝, 因此转化的叶绿体和未转化的野生型叶绿体同时存在于转基因植株中, 造成这种杂合体在遗传上是不稳定的。在转化外源基因之前, 目前可采用降低叶绿体拷贝数、高压筛选和选用致死突变体作为外源基因的受体等方法使转基因植株易于同质化。
3.2 植物的种类有待扩展
可能是由于大多数植物的叶绿体基因组序列不清楚, 因此无法确定用于载体构建的同源重组片段和外源基因的插入位点。目前, 已成功转化的植物种类很少, 只有番茄和烟草通过有性生殖使外源基因获得稳定遗传, 而番茄却是唯一能有高的外源蛋白积累的可食用果实的植物。
4 展望
虽然在叶绿体基因工程领域人们已经取得了一定的进展, 但对于改变叶绿体基因工程中所存在的缺点, 科学界仍然要有大量的工作需要进行。为此, 寻找更多更加合适的方法来改进叶绿体基因工程, 使其优点更加明显, 必将在未来生物技术领域带来又一场革命, 为人类造福。
参考文献
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