自噬相关基因

自噬相关基因（精选五篇）

自噬相关基因 篇1

关键词：自噬,Beclin-1,口腔癌

1 自噬基因Beclin-1的结构

Beclin-1位于人染色体17q21, 编码一个450个氨基酸序列, 60KD的蛋白质, 能够与bcl-2基因产物相互作用。该基因完整的c DNA序列编码2098bp的转录序列, 5’UTR 1 2 0 b p, 编码区1 3 5 3 b p, 3’UTR625 bp, 与酵母的自噬基因ap96/vps30有高度的同源性[1]。据研究表明, 75%卵巢癌、50%乳腺癌以及40%前列腺癌, 存在beclin-1等位基因的缺失突变[2]。也有研究发现上皮性良性卵巢肿瘤、宫颈鳞癌、肺癌、肝癌、卵巢癌和乳腺癌中同样出现Beclin l蛋白表达下降。Beclin-1是哺乳动物参与自噬活化的特异性基因, 也是自噬的重要的调节因子, 尤其是定位于内质网的Beclin 1, 与自噬活化直接相关, 目前已经被定为新的抑癌候选基因。

2 自噬基因Beclin-1在肿瘤中的双向作用

自噬作为II型程序性细胞死亡, 是一种不同于凋亡的、不依赖于caspase途径的程序性细胞死亡。它以在细胞内形成具有双层或多层胞膜包裹的、含有细胞器及大量细胞质的吞噬泡为特点, 该吞噬泡与自身的溶酶体结合, 发生细胞器的降解和转化[3,4]。自噬基因Beclin-1的调控异常与肿瘤发生存在着一定的关系。一方面, Liang等的研究表明, Beclin-1在正常乳腺上皮组织中均有高水平表达, 但在乳腺癌组织中表达水平降低或无表达, 而许多研究也证明在多种肿瘤组织中, Beclin-1的蛋白表达含量下降, 这在一定的程度上表明Be c l i n-1可以通过多种方式抑制肿瘤的发生。另一方面, 也有相反的报道证明自噬基因Beclin-1可以促进肿瘤的发生, Kang[5]等研究发现Be c l i n-1在原发性肝细胞性肝癌组织中的表达明显高于其在正常肝组织及某些其他的肝脏疾病中的表达, 表明自噬在肝癌的发展中起着相对积极的作用。因此可以看出自噬基因Beclin-1在肿瘤中具有双向作用。但具体的机制究竟是如何, 仍是争议的热点。

4 Beclin1基因和口腔癌的关系

口腔癌的发生发展是一个多步骤、多基因变化从而导致细胞增生失控和凋亡异常的结果, 癌变在不同阶段有不同的基因表达改变。虽然关于Beclin1基因和口腔癌关系的研究还不透彻, 但是有研究发现Beclin1在有淋巴结转移的鳞癌组织中的表达率为9.09% (1/11) , 在无淋巴结转移的鳞癌组织中表达率为50% (18/36) ;说明Beclin1在有淋巴结转移的口腔鳞状细胞癌组织中的表达低于没有淋巴结转移的口腔鳞状细胞癌组织。说明Beclin1随着口腔癌恶性程度的升高, 表达率降低[6], 表明其与口腔癌的发生、发展有关。日本学者No m u r a等[7]通过3 3例口腔鳞癌组织和口腔正常组织的免疫组化研究发现, 在口腔鳞癌细胞的胞质和胞膜上ATG16L1表达升高, ATG16L1上升通常与细胞自噬活性提高有关。由于口腔癌的转移是一个多因素参与的过程, Beclin1和ATG16L1可能与其他自噬调控基因发生作用共同抑制肿瘤的转移。中国台湾学者Lu等[8]发现发现槟榔核提取物 (areca nut extract, ANE) 作用于口腔癌细胞能够诱导细胞自噬, 阻断ANE介导的自噬会增加细胞凋亡的发生, 表明自噬能保护口腔癌细胞逃避ANE介导的凋亡, 从而促进细胞存活。但口腔癌细胞自噬与凋亡的确切关系及分子机制尚不清楚。

4 展望

适度的自噬有利于细胞的存活在维持内环境的稳定也起到一定的作用, 但细胞过度表达Bec li n-1可诱导细胞自噬的发生。Beclin 1作为一种抑癌基因对其在多种肿瘤组织中的表达普遍达到共识, 有的报道指出Beclin-1在对提示某些疾病的预后有着重要的意义, 或者可以采取Beclin-1辅助肿瘤治疗药物的临床治疗方案来进行肿瘤的基因治疗。但有关Beclin 1与口腔癌关系的研究至今报道甚少。口腔癌发生发展过程中自噬在其中的机制是如何及其对口腔微环境是否有影响均有待阐述。

参考文献

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[3]Ed inger AL, Thomp sonCB.Defective autoph agy leads to cancer[J].C ancer C el, l2003, 4 (6) :422-424.

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[5]Kang KF, Wang XW, Chen XW, et al1Expression ofBeclin1 in p rimary hepatocel2 lularcarcinoma[J]1Nan Fang Yi Ke Da Xue XueBao, 2009, 29 (1) :15121531

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[7]Nomura H, Uzawa K, Yamano Y, et al.Overexpression and altered subcellular localizationof autophagy-related 16-like 1 in human oralsquamous-cell carcinoma:correlation withlymphovascular invasion and lymph-nodemetastasis[J].Hum Pathol, 2009, 40 (1) :83-91

基因工程相关研究参考论文 篇2

首先获得需要生产的蛋白质药物的目的基因，然后选择合适的运载体(多以病毒)并与运载体结合形成重组DNA分子，再将重组DNA分子转入受体生物(动物或植物)内，从而得到生物反应器。

(3)实例：动物乳腺生物反应器。

操作大致过程为：获取目的基因→ 构建基因表达载体→显微注射导入哺乳动物受精卵中→形成胚胎→将胚胎送入母体动物→发育成转基因动物(只有在产下的雌性个体中，转入的基因才能表达)。

因为动物所有的体细胞都是由受精卵发育成的，故其乳腺细胞中含有重组基因并进行选择性表达，产生出抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素等重要的医药产品。

4.蛋白质工程(prtein engineering)

(1)概念：利用基因工程的技术，对天然蛋白质进行改造，以便获得具有理想生物学功能的蛋白质。

蛋白质工程可以创造新的、自然界不存在的蛋白质分子。

目前，蛋白质工程主要是改造现有的蛋白质，通过修改蛋白质中的氨基酸序列来改进蛋白质的结构和构象，提高蛋白质的活性、稳定性和产率。

也可以利用基因工程改造蛋白质。如下方法：

预期蛋白质功能→设计预期的.蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列(基因)。

(2)与基因工程的关系

蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，是第二代基因工程。

基因工程的实质：将一种生物的基因转移到另一种生物体内，产生本不能产生的蛋白质，从而产生新性状。原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。

蛋白质工程的目的：生产符合人们生活需要的并非自然界已存在的蛋白质。

二、基因工程的未来

基因工程是一种新鲜的事物，也是一把“双刃剑”，人们对此会有不同的看法。只要科学地、合理地加以利用，相信基因工程一定会使我们的生活更美好。

纲举目张理清结构

基因工程的研究在动植物育种、人类疾病防治及生态保护方面取得了一定的成就，但科学家永不放弃研究，又致力于新的尝试，努力使基因工程为人类提供更大的帮助。

突破难点化解疑点

1.分析说明基因工程应用研究的实质。

探究发现：将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以生产它本不能生产的蛋白质，进而表现出新的性状。

基因工程可以发生在不同植物之间、不同动物之间以及微生物与动植物之间。目的基因位于微生物体内，可以转基因至植物或动物体内，如植物的抗性基因大多于细菌或病毒;目的基因位于动物体内，如动物的生长激素基因、胰岛素基因等可转移至细菌中大量生产;当然在植物与植物之间、动物与动物之间更容易发生。

不同的生物甚至亲缘关系比较远的生物之所以能发生基因重组，是由于各种生物基因的结构基本相同，在遗传上共用一套遗传密码。

我的发现

2.蛋白质工程与基因工程有何关系?

探究发现：简单地讲，蛋白质工程就是根据蛋白质的精细结构和生物活力的作用机制之间的关系，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至于创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。蛋白质工程在诞生之日起就与基因工程密不可分。基因工程是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内，并在其中进行表达，它的产品还是该基因编码的天然存在的蛋白质。蛋白质工程则更进一步根据分子设计的方案，通过对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对其所编码的蛋白质的改造，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的，具有了人类所需要的优点的蛋白质。天然蛋白质都是通过漫长的进化过程自然选择而来的，而蛋白质工程对天然蛋白质的改造，好比是在实验室里加快了的进化过程，期望能更快、更有效地为人类的需要服务。

基因工程是遵循中心法则，从DNA→RNA→蛋白质→折叠产生功能，基本上是生产出自然界已有的蛋白质。

子宫肌瘤相关基因研究 篇3

【关键词】子宫肌瘤；基因；研究

文章编号：1004-7484（2013）-11-6377-01

子宫肌瘤是妇女常见的生殖道良性肿瘤，虽然它属于良性的，不会对妇女的生命安全构成威胁，但是这种疾病经常会引起妇女月经量增多、盆腔疼痛，甚至可能导致不孕和流产等情况，对妇女的生活质量造成极大的影响，其也是引发子宫切除的重要原因之一。据相关学者研究表明[1]，子宫肌瘤在育龄妇女中的发生率高达70%左右，发病的妇女人群主要是30岁到50岁的妇女。因此，子宫肌瘤是严重影响妊娠期妇女生活质量的病症。因此，研究子宫肌瘤相关的分子生物学，其是一种必要性措施。1HMGI（Y）与HMGI-C

1.1相关概述就子宫肌瘤的分子生物学基础而言，有些学者认为它引起子宫肌瘤的主要原因，其是由于子宫肌细胞在多种环境因素下由燃烧体重排引起某个或某些等位基因突变，当基因突变到一定程度的时候就会引起子宫肌瘤。根据目前的研究来看，在血管平滑肌、脂肪瘤中发现高泳动组分基因家族成员HMGI-C、HMGI（Y）基因异常表达，其和肿瘤发生有着很大的关系，这也是近年来研究子宫肌瘤遗传学的重要内容，HMGI-C/HMGI（Y）基因结构改变，酸性尾丢失，AT-钩作用增强，促进子宫肌瘤细胞增殖。与HMGI-C/HMGI（Y）相对应的若干融合配对基因具有有限的协同作用。原癌基因c-fos可能抑制子宫肌瘤向恶性转化。雌激素受体（ER）β基因的作用值得进一步关注和研究。

1.2基本结构在细胞核中，HMG蛋白属于非组蛋白里面富含电荷的一组不均一而又丰富的蛋白[1]。一般说来，其相对分子量是3 104。由于它在聚丙烯酰胺的电泳里面具备非常高的迁移率，因而被称之为HMGI蛋白。HMGI（Y）和HMGI-C都隶属于HMG，它们二者都有三个结构域。

1.3HMGI在组织细胞生长分化中的作用一般而言，HMGI（Y）和HMGI-C在人胚胎期表达，并在胚胎第12.5至14天位于峰值，在间质组织中存在。成人分化组织中，普遍存在水平极低的HMGI（Y），而HMGI-C消失。在甲状腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、宫颈癌中HMGI-C和HMGI（Y）呈现出高水平的表达，但在小鼠畸胎瘤的分化中HMGI（Y）的表达水平则降低。在进行动物实验时，HMGI-C失活有可能造成基质组织延迟生长，相比于同窝仔要小百分之六十。

1.4子宫肌瘤与HMGI-C、HMGI（Y）的基因融合在子宫肌瘤里面最为常见的染色体畸变便是12号染色体的q13-15易位突变，同时它还常见于子宫内息肉、乳腺纤维瘤、肺错构瘤、脂肪瘤中。上述肿瘤共同的特点便是基质源性，并且都属于良性。相关研究表明，12号染色体的q13-15易位突变会造成HMGI-C的基因编码被破坏。由于HMGI（Y）处于6号染色体的q21上，因而可以在变异剪接机制的作用下对HMGI和HMGY这两种蛋白进行编码。子宫肌瘤同别的良性肿瘤产生基因重排的重要区域之一便是6q21。HMGI（Y）与HMGI-C基因重排的染色体断裂点有可能出现在3-UTR区和编码区。

现如今，在子宫肌瘤HMGI的作用机制争论如下：由于外源性融合的序列作用；由于羧基端的酸性尾丧失造成的；DNA与AT-钩区的结合能力上调。

HMGI（Y）与HMGI-C基因的作用机制不完全相同。在子宫肌瘤中，如果HMGI-C的蛋白水平升高，那么其mRNA的水平也会升高。但mRNA的水平和HMGI（Y）蛋白之间并没有相关性，这就表明在转录之后，在HMGI（Y）调节中机制起到了一定的作用。此外，没有任何一例子宫肌瘤中同时表达HMGI（Y）和HMGI-C，某些肌瘤中两者的表达都属于阴性。由此推测可能是存在和HMGI（Y）与HMGI-C功能相近的基因。HMGI（Y）与HMGI-C在同一肿瘤中不会同时存在，这也就是表明两者在子宫肌瘤中存在相反或者类似的作用，当然这还需要进一步确认。2在基因重组里HMGI-C的配对基因

2.1RAD51B基因与thREC与RAD51B为同一基因，在人体中hREC起着监测参与基因，进行减数分裂重组及修复的目的，它在确保基因组完整性方面意义重大。hREC的同源异构体总共有四种，它们分别是R51h2、Hrec2T、HREC2U、HRAD51B。

2.2ALDH2在12q24上会产生各种类型的基因重排，而ALDH2便位于12q24.1上面。然而在子宫肌瘤的发病过程中ALDH2只能起到有限的作用。在融合基因里面，由于ALDH2的某些序列产生新非编码区有可能会对融合基因稳定性产生影响。然而由于其所提供密码子仅为十个，因而其在子宫肌瘤中所起作用还没有HMGI-C自身结构起到的作用大。

2.3COX6C作为细胞色素C中氧化酶亚单位，COX6C是通过线粒体和细胞核基因进行编码，在氧化磷酸化中它的电子传递功能起到了非常关键性的作用。在COX6C的融合产物里面，由于COX6C比較短，因而他的编码序列只能对子宫肌瘤产生有限作用。3子宫肌瘤与ER基因

在子宫肌瘤的生长中雌激素所起到的作用是巨大的。尽管促进和始发子宫肌瘤的各因素不清楚，但研究表明雌激素起着重要作用；在青春期以前，子宫肌瘤不会发病，在妊娠期其体积会增大，而在绝经期则会自然消退。使人体血清的雌激素浓度改变，例如进行药物治疗、用激素治疗、服用避孕药等都会对子宫肌瘤生长产生影响。雌激素的受体有两种，也就是ERβ和ERα。这两者与雌激素有着相同的结合方式，并且其基因结构非常相似，然而由于其基因的大小不一样，因而对抗雌激素有着不同的反映，同时其在体内的分布也不相同。研究表明ERβ在14好染色体上面，而ERα在6号染色体上。子宫肌瘤频繁产生基因重组的区域为前者。由于在14q23-24上基因重排的断裂点至ERβ位点的距离很近，可推测出ERβ也许会受外源性序列影响或调控，进而造成染色体结构改变。但ERβ在子宫肌瘤里面确切的作用还有待研究。4原癌基因作用

在多种肿瘤里面原癌基因都出现异常表达的情况，它对细胞的分化和增殖起着非常重大的作用。通过动物实验可知，在小鼠的子宫肌中，原癌基因的表达会受胆固醇调控，特别是c-fos的位点处在14q24上，即基因重排常发位置，推测上述因子和子宫肌瘤产生存在一定关系。通过实验可知，c-fos在肿瘤产生中并非必需的，然而其在肿瘤恶化中所起到的作用是重大的。低水平c-fos在子宫肌瘤里面可能对子宫肌瘤变为恶性产生阻碍作用。c-fos是导致子宫肌瘤进一步发展的结果或者原因，又或者为偶然出现，现在还无确定证据，需展开深入探究。参考文献

自噬相关基因 篇4

1 材料与方法

1.1 组织标本来源

喉鳞癌标本由山西省肿瘤医院提供, 共收集2005年1月-2007年12月行手术切除和病理确诊的77例喉鳞癌患者组织。其中男71例, 女6例。年龄41~79岁, 平均59.3岁。40例声门上型患者, 30例声门型, 6例声门下型, 1例临床分型不确定。病理分类:5例高分化鳞癌, 64例中分化鳞癌, 8例低分化鳞癌。4例T1期患者, 26例T2期患者, 31例T3期患者, 11例T4期患者, 5例T分期不确定。15例有淋巴结转移, 62例患者无淋巴结转移, 纳入患者确诊时均无远处转移。所有患者手术前未经化疗和放疗, 经病理检查均确认为鳞状细胞癌。手术切除的标本用10%甲醛固定, 石蜡包埋, 组织切片厚度4μm 3张, 对各1张组织切片进行HE、免疫组织化学染色、1张备用。另外选取22例正常喉组织, 其中男20例, 女2例, 年龄44~75岁, 平均58.5岁。两种组织标本一般资料比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 主要试剂

Beclin1和p-PKB为多克隆兔抗人抗体, 购自Santa Cruz公司, 多克隆兔抗人p110α及hvps34抗体购自Abgent公司。过氧化物酶标记的链霉卵白素试剂盒和DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 检测方法

免疫组化采用S-P法, 依据说明书进行操作。Beclin1稀释倍数为1∶20。结果的判断所有切片采用盲法由两位病理科医生独立阅片, 细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。结果采用两种方法: (1) 染色结果判定:每例标本以400倍光镜下随意选取10个视野, 计数每个视野中100个肿瘤细胞中的阳性细胞数, 取其平均数求其阳性百分率作为结果。平均阳性细胞所占比例<5%为阴性, >5%判定为阳性。 (2) 在×100下观察全片, 选择5个阳性物质丰富的视野, 然后采用Image-Pro Plus 4.5分析软件在×400下测定阳性物质的积分光密度值 (integrated optical density, IOD) , 计算平均IOD值。

1.4 统计学处理

采用SPSS 16.0软件对所得数据进行统计分析, 计量资料用 (±s) 表示, 比较采用t检验, 计数资料采用x2检验, 理论频数小于5时采用Fisher确切概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Beclin1在喉癌组织中的表达

Beclin1表达主要位于细胞浆, 染色阳性物质呈棕黄色, Beclin1在正常喉组织中的表达较高, 在喉癌中的表达减少, 见图1~4。

2.2喉癌和正常喉组织Beclin1蛋白表达比较

与正常喉组织组比较, 喉癌组中Beclin1表达的阳性率及量均明显降低, 比较差异均有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。

*与正常喉组织比较, P<0.05

2.3喉癌中Beclin1表达与临床病理参数的关系

在临床分型中, 喉癌声门上型、声门型、声门下型三组中Beclin1蛋白表达差异无统计学意义 (P>0.05) ;在组织学分化分组中, 与低分化的喉癌比较, Beclin1在高、中分化的喉癌组织中的量及阳性率均明显增高表达 (P<0.05) ;在T期分组中, T1+T2中Beclin1蛋白表达量及阳性率均显著高于T3+T4组 (P<0.05) ;在有无淋巴结转移分组中, 发生淋巴结转移的喉癌组织中Beclin1的表达量及阳性率均明显低于无淋巴结转移者 (P<0.05) , 见表2。

3 讨论

自噬 (autophagy) 是将细胞内受损、变性或衰老的蛋白质以及细胞器运输到溶酶体进行消化降解, 以胞质内出现自噬体为特征的细胞自我消化过程, 生命体借此维持蛋白代谢平衡及细胞内环境的稳定。同时自噬还参与多种疾病的病理过程。最近的研究表明细胞自噬是肿瘤细胞逃避凋亡的一种重要机制, 自噬活性的异常与肿瘤的发生有着直接的关系[3]。喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤, 近年发病有上升趋势, 并且位置特殊、解剖复杂、功能重要、治疗复杂[4]。因此, 研究自噬与喉癌的关系对喉癌进一步诊治有重要意义, 笔者的研究就是在临床上进一步观察自噬基因Beclin1的表达与喉癌的关系。

Beclin1是哺乳动物参与自噬的双等位抑癌基因, 位于染色体17q21[5]。Aita等[4]发现22株乳腺癌细胞株中有9株存在Beclin1的等位基因缺陷, 进而认为Beclin1为一肿瘤抑制基因。Liang等[6]发现在11种人乳腺癌细胞株中有8种细胞株Beclin1蛋白表达缺失, 通过蛋白印迹对17例乳腺癌标本的Beclin1蛋白表达进行分析, 发现15例Beclin1蛋白表达降低, 而用免疫组化检测32例乳腺癌样本有18例Beclin1蛋白明显下调, 证实了乳腺癌中存在Beclin1蛋白表达的特异性缺失, 因此Beclin1蛋白表达下调在人乳腺癌中是常见的现象。自噬基因Beclin-1为杂合子的小鼠发生恶性肿瘤的风险增高;乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌患者Beclin-1等位基因缺失的比例高于健康人。笔者的研究采用免疫组化SP法对77例喉癌、22例正常喉组织中Beclin1的表达进行检测发现:该基因主要表达在正常喉组织细胞以及癌细胞中, 间质中表达少见, 在喉癌中的表达明显低于正常喉组织中的表达, 提示自噬基因Beclin1在喉癌中表达下调[7,8]。

自噬不仅在调控肿瘤的生成有重要的作用, 并且与肿瘤的生长和转移有关。在临床上, 肿瘤的临床分期、组织学分级以及淋巴结转移等因素是喉癌恶性程度以及预后的重要指标[9,10]。患者临床分期越晚, 组织学分化越差, 其侵袭与转移能力也越强, 预后越差[11]。本研究发现Beclin1的蛋白表达与喉癌的临床分型无相关性, 但是T1+T2中Beclin1蛋白表达高于T3+T4组, 表明Beclin1的蛋白表达与喉癌的T分期有显著相关性, 表明Beclin1的表达与喉癌的临床进展有关。在不同分化喉癌组的比较中, 高、中分化组与低分化组的比较时, Beclin1表达明显增高, 表明肿瘤细胞分化程度越低, 恶性程度越高, 自噬能力也减弱地更加明显, 提示Beclin1表达降低和喉癌的预后相关。喉癌患者淋巴结转移是其重要转移途径, 本研究发现淋巴结转移组和非转移组相比, Beclin1表达降低, 提示Beclin1表达降低与淋巴结转移相关。有研究表明, 自噬可能是抑制肿瘤血管形成和分布的一种方式[12]。

综上所述, 自噬基因Beclin1在喉癌中的表达明显低于正常喉组织, Beclin1的缺失与喉癌的发生有关。自噬基因Beclin1阳性表达率与喉癌的T分期、分化程度及淋巴结转移相关, 当Beclin1表达下调时肿瘤的恶性程度更高, 更容易发生进展和转移。进一步研究自噬基因Beclin1对喉癌细胞生物学行为的影响, 对进一步探索喉癌的治疗有积极意义。

摘要：目的:探讨自噬基因Beclin1在喉鳞癌组织中的表达及其临床意义。方法:应用免疫组织化学SP法检测77例喉鳞癌组织和22例正常组织中Beclin1的表达, 分析Beclin1的表达与喉鳞癌生物学行为的关系。结果:Beclin1表达主要位于细胞浆, 与正常组织比较, 喉鳞癌组织中Beclin1的蛋白表达阳性率明显降低 (P<0.05) ;Beclin1表达与喉癌的临床分型无关 (P>0.05) , 与喉癌的T分期、分化程度及淋巴结转移相关 (P<0.05) 。结论:Beclin1表达缺失可能是喉鳞癌形成过程中的重要机制之一, 可能成为探讨肿瘤发生和抑制肿瘤浸润转移研究的新靶点。

自噬相关基因 篇5

关键词：阿托伐他汀,血管内皮细胞,自体吞噬

他汀类药是广泛应用于临床的一种调脂药, 除调脂作用外, 还有很多有益的心血管保护作用, 被称为他汀类药的多效性[1]。其中最突出的作用是改善血管内皮功能。自噬是广泛存在于真核细胞中的生命现象, 在调节及更新细胞内成分的生理及病理过程中, 对细胞的稳态、防御及正常的生长控制具有重要意义[2]。那么阿托伐他汀有可能通过抑制血管内皮细胞自噬以保护内皮细胞, 现今这方面的研究尚不多。故本实验对不同干预条件下细胞自噬特异标志物的表达进行分析, 以探讨阿托伐他汀保护血管内皮细胞的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年大鼠, 体重120 g～150 g, 由山西医科大学动物实验中心提供。

1.2 试剂及仪器

细胞总RNA抽提试剂盒Trizol (上海生工生物工程技术有限公司) , PCR引物 (Invitrogen公司) , RT-PCR试剂盒 (美国Fermentas公司) , DNA Marker (大连宝生物有限公司) , 泳仪、电泳槽、GelDoxXR凝胶成像系统及PCR仪 (美国BIORAD公司) , TS100倒置显微镜 (日本Nikon公司) , IX51荧光倒置显微镜 (日本Olympus公司) , 阿托伐他汀钙原料药 (浙江衢州埃菲姆化工有限公司惠赠) 。

1.3 方法

1.3.1 大鼠主动脉内皮细胞的原代培养及鉴定

将SD大鼠颈椎脱臼处死, 取胸腹主动脉段贴块法原代培养, 待细胞融合成单层铺满瓶底时, 胰蛋白酶消化法传代, 免疫细胞化学法 (SP法) 鉴定。

1.3.2 阿托伐他汀溶液的配置

将阿托伐他汀原料药6.0 mg, 溶于2 mL 55 ℃甲醇中, 静置10 min, 加PBS 至总体积10 mL, 过滤后-70 ℃冻存, 贮存浓度为0.5 mmol/L。

1.3.3 自噬模型的建立及实验分组

血管内皮细胞传至第3代时取对数生长期细胞, 换用低血清DMEM 液培养12 h使细胞同步化, 并调节细胞密度2×109/L。细胞换用正常培养液常规培养细胞24 h, 用PBS液洗3遍后, 加入与原培养基相同体积的Hanks’液30 min后收获细胞。实验中分别选用正常培养基或Hanks’液逐级稀释上述已配好的高浓度阿托伐他汀溶液, 最终配置成阿托伐他汀浓度为1 μmol/L的培养基溶液和Hanks’液。根据溶液是否含有阿托伐他汀, 细胞随机分为空白对照组 ( A组) 、仅在诱导前应用阿托伐他汀组 (B组) 、仅在诱导中应用阿托伐他汀组 (C组) 和诱导前和诱导中都应用阿托伐他汀组 (D组) 。

1.3.4 引物的设计及合成

从“GeneBank”中查得的大鼠基因Beclin-1及Map1lc3的cDNA 序列, 应用引物设计软件“Oligo DNA/ RNA Primer Analysis Software”分别设计一对目的基因PCR 引物 (见表1) 上海英骏公司合成。

1.3.5 反转录-聚合酶链反应

细胞总RNA提取采用异硫氰胍- 酚- 氯仿一步抽提法。紫外分光光度计测定RNA浓度, -70 ℃保存备用。各组提取的RNA 2 μL (2 μg) , 随机引物 (Random Primers 9) 1 μL, 加入0.1%DEPC水至12 μL。离心混匀, 70 ℃水浴5 min后, 置于冰上, 加入5×cDNA合成缓冲液4 μL、RNase inhibitor 1 μL、dNTP (10 mmol/L) 2 μL。离心混匀, 25 ℃水浴5 min后, 再加入AMV反转录酶1 μL。放入PCR仪中25 ℃ 10 min, 42 ℃ 60 min, 95 ℃ 5 min, 4 ℃ 5 min, 终止反应。 cDNA保存于-20 ℃冰箱备用。PCR反应体系如下:cDNA10 μL, 10×PCR缓冲液5 μL, dNTP (10 mmol/L) 0.5 μL, 25 μmol/L引物两条各0.5 μL, Taq酶 (5 U/μL) 2 μL, 25 mmol/L MgCl2 4 μL, 加入0.1%DEPC水至50 μL。PCR反应条件:94 ℃变性20 s, Beclin-1和Map1lc3及内参GAPDH基因退火温度均为56 ℃ 30 s, 72 ℃延伸30 s, 循环35次。PCR产物点样于2.0%琼脂糖凝胶上, EB染色, 应用BIORAD凝胶成像系统下拍照, 应用Adobe Photoshop8.0软件分析条带的吸光度值, 与内参GAPDH条带的吸光度值相比来校正。

1.4 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示, 多组间比较采用单因素方差分析 (one-way ANOVA) , 两两比较采用LSD检验, 以α=0.05为检验水准。

2 结 果

2.1 细胞培养及鉴定结果

贴块培养3 d后即有内皮细胞从组织块周围移出, 呈扁平多角形, 边界清楚, 胞质丰富, 核圆形或椭圆形, 居中, 偶见双核。约10 d细胞开始融合成片, 呈“铺路石样”。传代培养的细胞和原代形态相似, 生长较快, 3 d～4 d可融合成单层。荧光显微镜下可见细胞呈多边形, 细胞核圆形或椭圆形, 胞质发绿色荧光。

2.2 各组细胞的Beclin-1、Map1lc3及内参GAPDH基因mRNA表达

A组和B组Beclin-1基因mRNA的表达较C组和D组明显增加 (P<0.01) , 而A组和B组之间及C组和D组之间差别无统计学意义 (P>0.05) 。由各组Map1lc3基因mRNA表达结果得到的分析结果与上述由Beclin-1基因得到的分析结果相同。详见表2。

3 讨 论

血脂异常是导致多种心血管疾病的主要危险因素。目前, 他汀类药物是调脂治疗的一线药物。长期使用他汀类药物可预防冠状动脉疾病的发生, 减少致死性和非致死性心血管病事件的发生率, 具有对心脏的保护作用。有许多临床研究结果提示[3,4], 他汀类药物不但有明显的调脂作用, 而且可在较短的时间内改善动脉的内皮功能, 从而减少患者急性临床事件的发生。他汀类药物可能通过调脂作用间接改善患者的血管内皮功能, 但新近Wassmann 等[5]观察到, 稳定型心绞痛患者在血脂和C反应蛋白 (CRP) 没有明显变化的情况下, 单次口服普伐他汀 (40 mg) 24 h后, 冠状动脉的内皮依赖性舒张功能即出现明显改善。提示其对内皮的作用也许是独立于调脂作用之外的, 对此有待于进一步进行这方面研究。其中阿托伐他汀降低血脂的作用明显优于其同类调脂药, 并可影响机体炎症反应、血管内皮功能及血栓形成等病理生理过程。其中最突出的非降脂作用正是改善血管内皮功能, 但其改善内皮功能保护内皮的机制尚未完全阐明。

自体吞噬是发生在细胞中由初级溶酶体处理内源性底物的重要过程, 生命体借此维持蛋白代谢平衡及细胞内环境的稳定, 这一过程在细胞清除废物、结构重建以及生长发育中起重要作用。然而自噬活性过高或过低亦可导致多种疾病, 其中自体吞噬功能失调与许多不同疾病的发生和发展有关, 包括心肌疾病、骨骼肌疾病、感染性疾病和神经退行性疾病[3], 慢性心肌缺血也可诱导自体吞噬的发生。近年来, 随着对自噬研究的深入, 对恶性肿瘤、神经变性疾病和病原体感染等方面有了新的认识, 并逐渐成为近期的研究热点, 而从自体吞噬角度来探索对他汀类药物对内皮细胞的保护作用的研究尚且不多。有研究发现血管内皮细胞在损伤后有自体吞噬的发生。而在对自体吞噬调控过程中, 胰岛素可以激活丝氨酸/苏氨酸激酶 (Akt/PKB) 以抑制自噬[6]。与此同时有研究指出阿托伐他汀促进热休克蛋白90 (Hsp90) 与蛋白激酶Akt 及eNOS 两者的相互作用, 促进NO生成[7]。提示阿托伐他汀是否有通过抑制血管内皮细胞自体吞噬以保护血管内皮细胞的作用。

本研究中用Hanks’液替代培养基进行氨基酸饥饿以诱导血管内皮细胞发生自噬的方法。分别在诱导自噬前和诱导过程中, 使细胞分别与含或不含阿托伐他汀的正常培养基或Hanks’液共孵育。实验结果显示:仅在诱导前加用阿托伐他汀组的Beclin-1和Map1lc3两基因mRNA表达低于空白对照组的Beclin-1和Map1lc3两基因mRNA表达, 但无统计学意义, 提示了诱导自噬发生前应用阿托伐他汀不能很好的抑制自噬的发生, 可能阿托伐他汀在自噬发生前应用降低自噬保护细胞的作用较弱;仅在诱导中加用阿托伐他汀组的Beclin-1和Map1lc3两基因mRNA表达明显低于空白对照组。说明在自噬发生和发展的过程中应用阿托伐他汀, 能有效抑制自噬的发生和发展, 即在自噬发生阶段及时使用阿托伐他汀可能会减少过度自噬对细胞造成的损害, 以保护内皮细胞功能;诱导前和诱导中都加用阿托伐他汀组的Beclin-1和Map1lc3两基因mRNA表达均低于仅在诱导中加用阿托伐他汀组, 但差别无统计学意义。提示在诱导自噬发生前预防性使用阿托伐他汀较仅在自噬过程中使用的抑制自噬减少损害的效果可能不会很明显。本研究中发现Map1lc3的mRNA表达要强于Beclin-1, 可能的原因:①Map1lc3是哺乳动物细胞中酵母ATG8 (Aut7/Apg8) 基因的同源物, 定位于前自噬泡和自噬泡膜表面, 是细胞自噬泡膜的通用标记物。而哺乳动物Beclin-1 是酵母Apg6/Vps30基因的同源物, 是自噬重要的正调节因子[8]。因此可能数量上前者多于后者。②细胞饥饿的方法诱导自噬中, 随着时间的延长, 自噬的发生在增加, 并在去氨基酸饥饿细胞2 h时, 自噬达到高峰[9]。如果诱导自噬的时间延长, 会使上述两基因的表达程度发生改变。这些都有待于进一步研究。上述结果说明阿托伐他汀可以在自噬的发生和发展中起到抑制自噬的作用, 那么在心血管疾病发生时阿托伐他汀也许正是通过抑制血管内皮细胞的自噬过程, 减少自噬发生的程度, 进而减小血管内皮细胞在病理情况下受到的损伤, 保护内皮细胞。

本实验推测阿托伐他汀改善血管内皮功能的机制可能与其减少血管内皮细胞的自噬有关。而实验中也发现在自噬发生前应用阿托伐他汀却不能有效的抑制自噬的发生, 这就为进一步对阿托伐他汀具体抑制自噬的信号通路的研究提供了线索, 即他汀类药物抑制自噬可能是通过对自噬信号通路的作用来发挥抑制其的作用, Akt/PKB可能就是其中的关键分子。而随着上述信号通路的明晰, 并结合几年来对他汀类药物药理作用信号通路的研究, 有望在分子学水平发现他汀类药物抑制自噬的信号分子是否与其降脂作用的信号传导通路存在交叉, 这也为探讨他汀类药物对内皮的作用是否独立于调脂作用之外提供了线索。相信随着这方面研究的深入会为进一步探索阿托伐他汀的药物作用机制带来突破。

参考文献

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[4]赵水平, 张湘瑜, 高梅, 等.小剂量辛伐他汀对急性心肌梗死患者血管内皮功能的影响[J].中华心血管病杂志, 2001, 9 (3) :421-424.

[5]Wassmann S, Faul A, Hennen B.Rapid effect of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme, a reductase inhibition, on coronary en-dothelial function[J].Circ Res, 2003, 93 (9) :98-103.

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