网织血小板检测方法改良的临床意义

2022-09-11

笔者从事多年的网织血小板检测方法的改良工作, 并研究外周血RP数值的变化在各型血小板减少性疾病中的诊断价值, 现将结果报道如下。

1 一般资料

我院2005年4月至2008年6月间住院血液病病人48例, 其中ITP-21例, AA15例, AL12例, 诊断均符合《血液病诊断及疗效标准》。正常对照组为正常健康人30例, 为我院门诊体检者, 血小板计数 (100~300) ×109/L。采病人静脉血2m L, 500r/min离心5min, 取上清, 加入TES, 2000r/min离心10min, 弃上清, 制成PRP。取FCM专用试管两支, 每支试管中加入15μL PRP, 50μLPBS和10μLCD41-PE单抗, 标记血小板, 漩涡混匀后室温避光孵育20min后, 分别在对照管中加入1m L PBS, 测定管中加入TO试剂 (20μg/L) 1m L, 再次室温孵育30min。

2 改良的检测方法

由于使用的TO试剂的浓度和孵育时间及设定的Mark (阴阳性的界线) 的不同, 对检测的结果有很大的影响, 故对TO试剂进行了一系列不同浓度的稀释, 并进行了检测标本的比较, 以确定TO试剂的测定的最佳浓度。将TO溶于甲醇, 使其终浓度为1g/L, -20℃保存作为储存液备用, PBS配成浓度为20μg/L应用液, 可保存1周, 结果稳定。参照MATIC等描述的设门策略识别网织血小板, FSLOG为X轴, 对数CD41-PE为Y轴, 设CD41阳性细胞为A门, 另开一窗以SSLOG为X轴, 对数 (TO-Retic) 为Y轴, 对A门中的血小板进行分析, 以自身血小板为阴性对照, 沿血小板实际点图上缘设立界值, 使其RP百分数在1%以下, 检测标本与自身对照试验条件完全一致。流式细胞仪检测20000个血小板, RP结果以百分数表示, RP绝对值为血小板数乘以RP百分数。所得数据均以 (±s) 表示, 组间比较采用完全随机设计资料的方差分析。

3 结果

正常对照组、ITP组、AA组、AL组RP绝对值分别为 (18.16±6.60) ×109/L、 (8.98±3.09) ×109/L、 (1.84±0.75) ×109/L、 (1.54±0.48) ×109/L, R P百分数分别为 (7.3 8±3.5 1) %、 (7.3 8±3.5 1) %、 (4.7 1±1.3 2) %、 (6.5 1±1.4 7) %。ITP病人RP百分数明显高于正常对照组 (F=65.29, q=10.26, P<0.01) , 而RP绝对值明显低于正常对照组 (F=85.07, q=19.59, P<0.01) ;AA病人RP百分数及绝对值均低于正常对照组 (q=3.47、16.41, P<0.05、0.01) ;AL组病人RP百分数与正常对照组比较无明显差异 (q=0.51, P>0.05) , 但其RP绝对值明显低于正常对照组。

4 讨论

网织血小板是从骨髓中释放入血的新生血小板, 与成熟血小板相比, 体积大, 蛋白质合成能力强, RNA含量多。织血小板的得名1969年国外学者Ingram和Coopersmith应用新亚甲蓝染料, 对Beagle犬外周血进行染色, 发现血小板内有一种网状结构物, 故将这一部分血小板命名为网织血小板[1]。Ingram等发现正常Beagle犬RP为0.8%~3.0%。若对犬进行放血实验, 放血后5~10d RP可增加至6%以上。因此认为这种RP与网织红细胞类似, 能反映骨髓血小板的生成状态。1986年外国学者Lee等研制了能与活细胞RNA结合的荧光色素-噻唑橙 (TO) 。检测外周血的RP的临床意义鉴别血小板减少症。在血小板破坏增多或生成不足所致的疾病中, RP的比例和绝对值均有相应的显著变化。在临床上可作为特发性血小板减少性紫癜 (ITP) 诊断的重要指标, 并可与其他血小板生成不足性疾病如脾亢等相鉴别。ITP患者血小板破坏增加, 骨髓生成血小板加快, 外周血中新生血小板增多, 使RP比例升高。但由于血小板寿命缩短, 使RP绝对值减少。脾亢虽有血小板减少, 但RP比例接近正常, RP绝对值亦低于正常水平。了解骨髓被抑制后恢复血小板生成功能具有一定的意义。再障、白血病及肿瘤等患者由于骨髓受抑制, 故血小板总数减少, 而RP比率基本正常。化疗后, 血小板总数上升前4~5d, RP比率即开始明显增高。因此RP可较血小板更敏感地反映血小板再生情况。原发性血小板增多症 (ET) 时, 检测RP对预测血栓形成有一定临床意义。ET无并发血栓形成时, RP比例与健康者对照基本相同, 而ET并发血栓形成时, RP比例与健康者对照有显著差异。可能是与RP对凝血酶原受体激动肽剌激有较强的反应性有关。由此可见, 测定外周血RP有助于区分外周血小板减少是由于血小板生成减少或破坏过多所致。综上所述, 通过对传统的RP检测方法的改良, 建立一简便、稳定、适用于临床的检测手段, 可为临床各类血小板减少性疾病的诊断提供可靠方法。

摘要：通过对传统的网织血小板检测方法的改良, 建立一简便、稳定、适用于临床的检测手段, 可为临床各类血小板减少性疾病的诊断提供可靠方法。

关键词：网织血小板,检测方法