pcr技术在林业的应用

pcr技术在林业的应用（共9篇）

篇1：pcr技术在林业的应用

PCR技术在临床检验中的应用

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医学检验大致可分为形态学、生物化学、血清免疫学和分子生物学几大类，其分别代表几代实验诊断技术。60年代DNA双螺旋结构及半保留复制模式的出现，70年代基因重组及体外基因克隆技术、分子杂交技术的应用使分子生物学在疾病诊断中得到了长足的发展。特别是1985年Mullis发明了聚合酶链式反应（PCR）技术，使医学界真正兴起了基因诊断技术热，成为现代医学发展的又一里程碑。用于临床检验的PCR技术与经典的PCR反应在操作上稍有区别，有其自己的特色。一般在样品处理上，多采用非离子去污剂一次加热处理，这种方法对DNA纯化有限，但适应临床微量、快速的特点。另外PCR反应体系中各组成成份往往都预分装到反应管中，既减少操作者的工作强度而且也减少了污染的机会，具有极高的使用价值。本公司率先研制并推出单管单人份的PCR诊断试剂，具有开创性意义。这些改进都不影响PCR效果，同样表现出高特异性、高敏感性、简便快捷等PCR最优秀的特征，在常见传染病、性病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、优生优育、法医学等广泛领域中有相当高的实际应用价值。

常见的传染性疾病有细菌、病毒、衣原体、支原体等，可引起消化、呼吸、循环、泌尿生殖等不同系统相应的病变。消化系统感染性疾病在我国具有代表性意义的有肝炎、胃炎及肠道感染性疾病。引起肝炎的病原体主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它还有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。这几种肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均为RNA病毒。我国是乙肝高发区，乙肝病人为世界乙肝病人总数的50％。乙肝病毒经血液传播，病毒主要在肝细胞中增殖，也可以长期存留在骨髓细胞或外周血白细胞中。通常用PCR法检测血清中的乙肝病毒。有报道用PCR法可以在泪液、乳汁、精液及血白细胞中检出乙肝病毒，这些发现提示其它传染途经存在的可能。PCR法检测乙肝的优势表现在：①早期诊断，因为PCR扩增极其敏感，理论上可检出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潜伏期即可被PCR法检出。②对低持续感染乙肝病人的诊断，有些乙肝病人体内的病毒长期低复制感染，血清病毒浓度极低，一般酶标试剂无法检出，可以用PCR法检出。③疗效跟踪及病程判断，因为PCR能半定量检测乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其数量多少的最直接指标。在治疗过程中通过监测血清或白细胞中病毒基因存在与否及其动态变化即能准确地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的浓度很低，丙肝病毒的分离尚未成功。目前用于丙肝病毒检验的方法主要是ELISA法测定血清中的HCV抗体。由于HCV尚无法分离纯化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，这些人工抗原与天然病毒抗原有一定的区别，理论上是存在假阳性或假阴性。同时血清中抗体的出现及动态变化与病人病情无线性相关关系。RT－PCR技术使这些困难得到解决。HCV是RNA病毒，需先将病毒RNA逆转录为cDNA（RT）后再进行PCR扩增，这种技术称之为逆转录－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以检测出血清中低浓度的病毒，了解病毒在体内复制的动态状况。RNA纯化要求严格，是RT－PCR的技术关键，本公司目前使用的高效基因释放剂，联合特异性固相基因吸附乳胶颗粒，对样本中的RNA进行分离纯化，使这一问题得到解决。通常用于RNA→cDNA逆转录的酶大致可以分为二大类，即低温逆转录酶，如AMV/MLV逆转录酶，高温逆转录酶，如Tth酶。Tth酶在锰离子作用下，具有逆转录酶活性，Tth酶活性温度高，可以使核酸充分线性化，提高逆转录效率及特异性。Tth酶在镁离子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，从而真正实现单管单酶单人份的扩增要求，这样就在不降低扩增敏感性的条件下，一步完成扩增，不仅简化操作，而且又减少污染，提高检测的准确性。国内本公司已采用这种技术推出单管单酶单人份的RT－PCR诊断试剂。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，与乙型肝炎病毒协同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人粪便样本中，戊型肝炎病毒也长期存在于血清中。在PCR检测时，需注意取材的合理性。在消化道传染性疾病中，另一类最重要的感染性疾病是幽门螺旋杆菌（HP）所引起的胃炎、胃溃疡等。HP可以经口－口途经传播并定位于胃粘膜上皮细胞，早期表现为浅表性胃炎，可发展成为胃溃疡。我国胃炎发病率之高估计比乙型肝炎更严重，对HP的检测应受到广大医务工作者的重视。对HP的检测可以用生化法测试尿素酶或用免疫法测试血清中对HP特异性抗体，也可对胃液、胃粘膜样本进行细菌培养及菌种鉴定。PCR法检测HP非常敏感且特异性高，有研究发现可以从病人的唾液或口腔含漱液中检出HP。PCR法避免了取胃液及胃粘膜，减少病人痛苦，是目前最理想的方法。

呼吸系统感染性疾病主要的有肺结核、非典型性肺炎等。结核杆菌感染曾给人类健康带来很大威胁，一度是较严重的致死性疾病之一。解放以后由于对结核病的预防的重视，特别是特效抗痨药物的出现，使结核病流行基本被控制。近来结核病有抬头的趋势，基原因可能有两方面，其一是耐药株的不断出现，其二是对结核预防重视不足。结核菌痰涂片镜检阳性率太低，酶标法又因抗原交叉反应易出现假阳性，结核检测的金标准是结核菌培养法。但培养法费时昂贵并且受到用药的影响，在实际应用中受到限制。PCR在结核菌检测方面有简便、敏感、特异的优点。一般认为样本中内要有100个左右的结核菌即可被检出。目前用于结核菌PCR诊断的试剂，其引物主要来源于以下基因片段36KD/65KD抗原蛋白基因；染色体重复插入序列IS986、IS960、IS6110、染色体质粒DNA PH7311、PMTB4、P36基因等。其中最常用的是染色体重复插入序列IS986或IS6110，1990年Hermans首先介绍并使用了IS986基因设计的引物扩增产物为245BP，研究表明这一基因对人型结核菌有特异性。而后Thierry又介绍了插入序列IS6110基因，并认为这一基因对人型结核菌具有比IS986更高的特异性及敏感性，最适合M.TB的检测。结核菌痰标本的PCR检测应注意以下几种常见的问题。其一，多条带。即扩增产物电泳后有三条或三条以上的萤光除最前面的引物以外有两条产物带，这与插入序列本身各片段长度有差异、结核菌在治疗过程中染色体畸变、断裂、缺欠及不等位交换有关。这种扩增结果的判断应特别注意，凡在阳性对照相应位置有明显条带的判阳性，否则应为阴性，或建议病人过一些时间后再复检一次；其二，结核痰样本PCR检测时，要使样本充分液化，否则痰液中的粘液成份将影响扩增效果，甚至会导致严重非特异性扩增，电泳结果呈雾状；基三，结核痰样本PCR检测结果可能表现为阳性、阴性交替出现，这与结核病灶的不规律排菌有关。

循环系统以肠道小RNA病毒感染最具代表意义，如柯萨奇病毒等。这些病毒经肠道粘膜、淋巴结进入血液，最终可定位于心肌细胞中导致心肌炎。目前对这些病毒的血液样本检测往往比较困难。PCR用于柯萨奇病毒检测时因其是RNA病毒所以应注意样本的保存。外在环境中存在大量RNA酶，病毒脱壳后RNA将被迅速降解。一般用于RNA检测的血清常温下不应超过24小时，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。

PCR检测在性传播性疾病(STD)的诊断中有较广泛的应用。经典的性传播疾病有梅毒、淋病、腹股沟淋巴肉芽肿、软锐湿疠、硬下疳等。而在现代STD中、解尿支原体及沙眼衣原体引起的非淋菌性尿道炎（NGU）可能更具有代表性意义。梅毒是由梅毒螺旋体感染布致，首先在局部形成硬软下疳，布后经血行播散到全身，最严重的是波及中枢神经系统。感染早期，梅毒螺旋体大量存在于硬下疳中，可以用生理盐水湿棉签擦去皮疹表面污物再用钝刀片轻轻刮去上皮及结痂，用洁净棉签取渗出液样本作PCR检测，其敏感性及特异性极高。二期梅毒皮疹中也存在梅毒螺体其取样方法同埂下疳，三期梅毒皮疹中一般无螺旋体存在，因此III病人及部分无皮疹的I、II期梅毒病人可以取EDTA抗凝全血检测。淋病是目前发病率最高的性传播性疾病之一，由淋病双球菌引起。淋病双球菌一般为胞内寄生，常见的感染部位为外生殖器、尿道粘膜最常见。在尿道及外生殖器分泌物中有许多非致病的双菌存在，对分泌物拭子进行涂片镜检时，常导致误诊。另外目前非淋球菌性尿道炎的发病率不断增加，鉴别诊断特要，培养法准确但费时且费用高，受用药的影响。PCR法简便、快捷、准确非常理想。常用的引物多采用外膜蛋白抗原基因、隐性质粒DNA或16s RNA基因。16s RNA基因设计的引物特异性高但其敏感性低；隐性质粒设计的引物敏感性高但偶尔出现多条带的扩增产物，判断结果时应以阳性对照为标准，凡在阳性对照相应部位有明显条带的为阳性，其余均为阴性。以往对沙眼衣原体及解脲支原体的检测主要靠培养法，费时且昂贵，简便快速的PCR检测对其有极高的使用价值。沙眼衣原体、解脲支原体样本来源主要是尿道及宫颈分泌物拭子，由于分泌物中有许多污物含有PCR扩增的抑制剂，因此每次采样时尽量避免采集过多脓性分泌物，如果宫颈分泌物太多可以先用湿棉签将表面的分泌物擦去，再用洁净的湿棉签轻压旋转采集宫颈脱落细胞送检，其准确性更高。PCR也可以用检测单纯疱疹病毒、EB病毒、乳头瘤病毒等。引物尖锐湿疣的病毒是人类乳头瘤（HPV）,可致生殖系统感染的乳头瘤病毒主要是6、11、16、18、33型。新近研究结果表明，在乳头瘤病毒引起的良、恶性生殖器病变中，与血清型的关系并不密切，经常有交叉或多型民时感染。为简化操作，对其基因对比分析寻找共同序列设计的简并引物可以同时检出这几种型别的病毒既简化操作又减少费用是一种极理想的方法。

我国恶性肿瘤为人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的发病率最高，占恶性肿瘤死亡总数的60％以上。引起肿瘤的原因非常复杂包括外界环境因素及遗传背景。外界因此可分为三大类即化学、物理及生物因素。肿瘤与遗传有关的证据越来越多，除已知的单基因遗传肿瘤如视网膜细胞瘤、肾母细胞瘤等以外，还在几乎所有的肿瘤细胞中观察到原癌基因的重排，这些基因的变化常导致细胞增殖调控失调终形成肿瘤。癌基因是指在自然或实验条件下具有潜在诱导细胞恶性转化的基因，它们是在研究逆转录病毒时发现的。目前已知的肿瘤基因有60多种，1969年Hubner根据Rous(1911)的实验，在小鸡肉瘤滤液中发现一种能诱导宿主细胞转化的RNA病毒性癌基因（Viral Oncogene）。后来又在其它哺乳动物基因中发现与病毒癌基因同源序列，这种正常的细胞基因表达产物与细胞生长、增殖、分化有关。但若被某种因素激活就会转化为有活力的癌基因，通常称之为原癌基因（Proto Oncogene）。为了与病毒癌基因区分，分别用V-Onc及C-Onc基因来代表。目前了解较多的癌基因（C-one）有scr基因族、ras基因族、mgc及myb基因族。原癌基因存在于正常细胞中，并表达生物功能，只有在原癌基因被激活后才能诱导细胞转化，可能的原癌基因活化机理有：①点突变，受到射线、化学因素、生物因素的诱导，这样微小的变化，就会活化癌基因，活化的基因产物仅有极微的结构差异，但在功能在却有很大的区别。②获得启动子，原癌基因从病毒基因中获得启动子而活化。③基因易位，内外界因素能导致染色体的某些基因易位、重排使原来无活性的原癌基因移至某些强的启动因子或增强子附近而被活化。④原癌基因的过量扩增，原癌基因产物一般与生长因子、生长因子受体、跨膜信息蛋白有关或功能相近，过度表达时，会因调控失常而引起细胞癌变。另一类与肿瘤相关的基因是抑癌基因如P53。抑癌基因较复杂，作用机理不太清楚。癌基因检测中常用的分子生物学技术有：杂交、DNA分子克隆、PCR扩增及序列分析。PCR扩增简便、快捷有较强的实用性，甚至可从病人体液样本中检测活化的癌基因而不需取活组织，对癌症的早期诊断有极重要的意义。Ras基因是1964年首次从大鼠肉瘤的急性逆转录病毒（Harver Murine Sarcoma and Kister Murine Sarcoma Virus）中分离出来取大鼠肉瘤（Rat Sarcoma）的字首命名。1982年首次在人膀胱细胞细胞癌中检出有转化能力的ras基因与Harver大鼠肉瘤病毒癌基因有同源性称C-H-ras基因，后从肺细胞癌中发现了与Kister大鼠肉瘤癌基因同源的C-K-ras基因，从神经母细胞中又发现了N-ras基因。Ras基因激活的最常见方式是点突变。人类原发肿瘤时点突变主要发生在密码子12、13、59、61位。激活后的ras基因不牟自行灭活，根据其点突变的情况可以基因诊断、疗效观察。用PCR扩增样本ras原癌基因，再使用杂交法、限制性内切酶消化或产物测序法检测基因的突变情况即可用诊断。P53是抑制癌基因的代表，位于17号染色体短臂上，其产物为53KD分子量的蛋白从此而得名，可分为突变型和野生型，前者为癌基因，后者为抗癌基因。1979年Cane发现了P53蛋白Eliyahu发现了p53基因有抑癌作用。P53突变后其产物突变蛋白稳定性增加，半衰期较野生型基因产物长，在细胞内堆积，可以用免疫组化法测出。PCR-RELP、PCR-SSCP则因方法简单、快速、特异性高，更具有实用价值。在SSCP分析中，单链DNA因碱基序列的变异，导致构型改变，在进行凝胶电泳时，其泳动速率发生改变，从布将变异的DNA与正常DNA区分开，统计表明100-300bp分子大小的ssDNA突变检出率可达97％，300-450bp标出率可达69％，因此大于400bp的片段多态性应采用其它方法检测。

遗传病是由于遗传基础异常而引起的疾病，人类遗传病约有3000多种，患者占总人口数的10％。遗传病大概可分为单基因、多基因及染色体遗传病。常用诊断方法有家系谱分析、染色体检查（特别是显带法）、生物化分析等。随分子生物学发展，基因诊断愈来愈表现出其优越性，PCR技术是基因诊断的主要技术之一，为快速、准确地检测人类遗传病开辟了一个新的途径，预计与遗传相关的疾病的检测有80％将在3-5年内被PCR法所取代。PCR在遗传病诊断应用中，可以利用引物直接扩增变化的基因产物，也可以结合应用限制内切酶，分子杂交及电泳图谱分析进行诊断。应用较为广泛的有PCR法检测中海贫血、苯丙酮尿症、血友病、脆性X综合症及性别鉴定等。地中海贫血（Thalassmia）是世界上最常见的单基因遗传病，不有同类型，以a地中海贫血及在中海贫血最常见。a珠蛋白基因位于11号染色体短臂上，a珠蛋白基因突变致血红蛋白的全成减少或缺失，表现溶血性贫血，肝脾肿大，在我国发病率为0.66％，贵州、四川等地高发可达2.2％。应用PCR技术可以直接检测突变的基因诊断此病。苯丙酮尿症（Phenylketouria,PKU）是一种常染色体隐性遗传病。病人肝脏苯丙氨酸羟化酶严重缺乏使苯丙氨酸不能转化为酷氨酸血症，出现脑组织损伤，智力障碍。此病患者出生时正常，出生后一经确诊立即停止母乳喂养，采用低苯丙氨酸饮食治疗8-10年不致影响患者智力，但低苯丙氨酸饮食代价之昂贵是一般家庭所不能承受的，关键在于避免患儿出生。因此本病的早期诊断有极其重要的意义。PCR结合斑点杂交能有效诊断PKU。遗传性疾病的基因变化很复杂，单基因固定位点变异布致病的情况很少，因此基因诊断过程中往往需要PCR技术与限制性内切酶、斑点杂交、聚丙烯酰胺胶电泳图谱分析及扩增产物序列分析结合，作综合判断。

优生学包括基础优生学、社会优生学、临床优生学及环境优生学。孕期检查及产前诊断是临床优生学的最重要内容之一。孕期检查除一般项目外还能及时了解孕妇是患有某些对胎儿发育有严重影响的疾病如风疹病毒感染、沙眼衣原体、解脲支原体、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、弓体感染等，及时发现及时治疗并采取有效措施预防发展成为宫内感染。PCR技术对这些病原体的检测简便而确实，另外利用PCR技术可以对地中海贫血、血友病、苯丙酮尿症、脆性X综合症等遗传性疾病进行宫内诊断。可见PCR在优生优育方面有很高的应用价值。

PCR技术的出现对法医学的发展也有不可低估的作用。在法医物证如血斑、毛发、组织碎片等的确证，DAN多态性分析远比血清学或等方法确实可靠。早期DNA多态性分析主要使用Southern印迹杂交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌红基因第一个内含子中的串联重复序列作探针，从人的基因库中筛选出小卫量DNA，使用阿交法产生杂交图谱即DNA指纹。这一技术成功地应用于个人识别及亲子鉴定。这种方法仍受到样本量的限制，当样本DNA数量不足时或DAN严重降解则不能正常检出。且杂交技术常使用同位素杯记探针要求较镐的防护措施。PCR技术的出现，可以对极少量物证如一根毛发、一滴血液、极小精斑都可以进行分析。在人类基因组中有许多由10-15bp核心顺序构成的串联重复DNA序列，具有单位点特征的称为VNTR结构，多位点串联成为卫星DNA。由于VNTR在等位基因中的多态性便构成了遗传标记。使用PCR技术对其进行扩增结合对扩增产物凝胶电泳图谱分析即可进行个人识别及亲子鉴定。由2-6核苷组成的重复串联序列称为微卫星。在人类基因组中，微卫星更加丰富。微卫星的重复序列比VNTR短，扩增分型简便，易于自动化，在VNTR或微卫星不仅重复片段的数量不同而且重复片段的核苷酸也具有多态性。在VNTR或微卫星多态性分析时，如再结合碱基配对分析可以藜得更大量的信息，这一种更有希望的标志即MVR（Microsatllite Variant Repeats）。理论上其对嫌疑人的排除率为99.999％。PCR技术可以完成替代早期的Southern印迹法进行多态性分析而且操作简便，敏感性及准确性都有大幅度的提高。当然PCR技术在法医中的应用仍在起步阶段有许多技术问题等待解决，如样本中的抑制剂、检村中DNA的损报告伤、PCR扩增污染等。想念随着PCR技术的不断完善它将在法医学领域中有更加广泛的应用。

篇2：pcr技术在林业的应用

多重PCR技术在病原检测中的应用

多重PCR能够同时扩增不同片段,具有普通PCR方法不可比拟的优势.简要论述了多重PCR在细菌病原体的检测、病毒病原体的检测、支原体和衣原体及寄生虫的检测、微生物耐药性检测等方面的应用,分析了多重PCR的.影响因素及条件优化,并进一步综述了多重PCR的应用前景.

作 者：赵红庆 苑锡铜 黄留玉 ZHAO Hong-qing YUAN Xi-tong HUANG Liu-yu 作者单位：军事医学科学院,疾病预防控制所传染病控制中心,北京,100071刊 名：生物技术通讯 ISTIC英文刊名：LETTERS IN BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：18(5)分类号：Q503 R372关键词：多重PCR 病原 检测 影响因素

篇3：pcr技术在林业的应用

聚合酶链式反应 (简称PCR) , 是依据DNA模板的特性, 模仿体内的复制过程, 利用DNA聚合酶有选择性地在体外快速扩增DNA片段的方法。由于PCR技术可快速特异地扩增任何期望的DNA片段或目的基因, 所以PCR技术自1985年问世以来, 至今短短的数年内得到了迅速发展, 并日趋完善, 该技术在分子生物学、生物工程、法医学、考古学和生物分类学等领域中都有重要的实际应用价值。

1. 以PCR为基础的分子生物学技术

在PCR的基础上, Williams等 (1990) 采用随机核苷酸序列为引物扩增基因组DNA的随机片段, 获得了一种新的分子标记, 即随机扩增多态性DNA (Random amplifiedpolymorphic DNA) , 简称RAPD。基本原理和特点是用一个 (有时用两个) 随机引物 (一般8-10个碱基) 非定点的扩增DNA片段, 然后用凝胶电泳分开扩增片断。

与RAPD类似的随机扩增多态性的方法, 还有AP-PCR。AP-PCR是任意引物PCR (Arbitrary Primed PCR) 的简称。它在PCR反应中使用的引物长度与一般PCR反应中的引物相当, 但在反应开始阶段退火温度较低, 允许大量错配, 因此可引动具有随机性质的扩增。

CAPS标记又可称为PCR-RFLP。所用的PCR引物是针对特定的位点而设计的其基本步骤是:先进行PCR扩增, 然后将PCR扩增产物用限制性内切酶酶切, 再用琼脂凝胶电泳将DNA片段分开, 用EB染色, 观察。与RFLP技术一样, CAPS标记检测的多态性其实是酶切片段大小的差异。

另外, RFLP-PCR标记是将RFLP探针测序, 再根据其DNA序列, 设计和合成适当的PCR引物, 进行PCR扩增, 即将RFLP标记转化为PCR标记。

反转-PCR (RT-PCR) 又叫RNA-PCR, 是将m RNA反转录与PCR技术相偶联的一种基因分离技术。通过m RNA反转录, 得到与m RNA相对应的c DNA, 然后利用特定的PCR引物直接以反转录c DNA为模板进行PCR扩增, 得到所需要的基因或者基因片段。

AFLP是在RFLP和RAPD的基础上发展起来的。它是RFLP和RAPD的有机结合, 克服了二者各自的缺点, 集中了二者的长处。它既有RFLP的可靠性, 又具有RAPD的方便性。与RFLP类似, AFLP也是通过限制性内切酶片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA分子标记技术。但AFLP是通过PCR反应先把酶切片段扩增, 然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳, 多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。

2. PCR技术在微生物学研究中的应用

2.1 微生物检测。

王泽霖等应用应用PCR扩增和核酸探针杂交2种方法同时对3株不同IBV (传染性支气管炎病毒) 在鸡胚中繁殖动态进行了检测。结果表明, PCR检测较核酸杂交检测灵敏度高。同时指出, PCR和核酸探针杂交检测IBV, 其诊断的速度之快是常规的病毒分离, 中和试验无法相比的, 其诊断的灵敏性、特异性远远超过琼扩试验、HI试验和ELISA试验。刘滨东等利用逆转录-PCR (RT-PCR) 特异性扩增IBV基因组中M基因和N基因之间一段核酸片段, 以pUC19质粒载体将此片段克隆, 用EcoRI和HindⅢ酶切此重组质粒, 回收克隆片段后, 制成生物素标记的核酸探针, 建立了RT-PCR结合分子杂交检测IBV的特异性检测方法。结果表明, PCR法能将IBV特定核酸片段体外扩增繁殖, 以达到探针杂交能够检出的程度, 使IBV检出率大大提高。周志江等根据产vero毒素大肠杆菌 (VTEC) 产生的vero毒素1 (VT1) 和vero毒素2 (VT2) 的基因序列, 合成了2对寡核苷酸引物, 建立了PCR扩增方法检测产vero毒素大肠杆菌的方法, 且灵敏度较高 (用VT1引物可检测出低达32pg的全细菌DNA) 。J.Cubero等发展了一种简易PCR法来检测在植物上形成肿瘤的细菌。结果表明, PCR法是探测植物肿瘤病原细菌最有效的方法。

2.2 分类鉴定。

在酿造工业中, 对于保持发酵持久度的一致性和全体产品质量的一致性来说, 从非酿酒酵母菌株中纯化酿酒酵母菌株是必要的, 来自于像Hansenula, Picchia, Candida, Brettanomyces和Saccharomyces属的其他种会引起啤酒腐败, 导致啤酒变浑浊和变味。传统的基于形态、生理生化的检测和分类鉴定方法常常比较耗时且结论也不确定和完全, 特别是难于从表现型上区分Saccharomyces属的S.cerevisiae, S.bayanus和S.diastaticus, 因为这些酿酒酵母它们属于同一个属。H.Yamagishi等应用标定FLO1的开放阅读框架的PCR法来区分酿酒酵母和非酿酒酵母, PCR分子水平的显示结果表明了二者的不同。PCR和RAPD-PCR对于Lactobacillus delbrueckii subsp.和L.delbrueckii subsp.Lactis的鉴别来说是两种快速而可靠的方法。鲍朗等指出对钩体病患者血清标本进行低严格度单引物聚合酶链式反应 (LSSP-PCR) 检测, 可快速地对所感染钩体作出初步遗传学分类鉴定。

2.3 遗传多样性研究。

与REP-PCR、RAPD和RFLP等指纹技术相比, AFLP指纹图谱清晰, 结果的重现性好, 能提供更高信息量的DNA长度多态性。目前已用于大肠杆菌Escherichia coli农杆菌agrobacterium tumefaciens (Lin et.al.1996) 、炭疽杆菌 (Keim et.al.1997) 和真菌 (Majer et.al.1996) 的遗传多样性研究, 证明AFLP指纹分析是目前研究生物群体遗传多样性的最有效的方法。在根瘤菌研究中, 张小平等 (1999) 采用AFLP技术, 对分离自中国、津巴布韦和以色列的133株花生根瘤菌Bradyrhizobium sp. (Arachis) 的DNA扩增长度多态性进行了分析, 结果表明供试菌株的AFLP指纹图型具有菌株特异性, 经UPGMA相似性聚类分析发现, 所有供试菌株的相似性水平仅有10%, 说明花生根瘤菌群体中, 存在许多个遗传型, 具有很高的遗传多样性。根据致病性的差异我国大麦黄花叶病毒 (BaYMV) 存在若干不同株系, 血清学和核酸杂交等技术不能区分这些株系。V.M.de Oliveira等通过用PCR扩增从全细胞或土壤中提取的DNA方法, 分析了Rhizobium tropici和Rhizobiumleguminosarum16S-23S间隔r DNA的多态性, 从而评价了Rhizobium tropici和Rhizobium leguminosarum的遗传多样性。E.A.Momol等用23rRNA基因5′末端指纹分析和RAPD标记的方法, 研究了来自与美国和欧洲不同地区形成葡萄根瘿的Agrobacterium vitis中的69个菌株, 描述了它们的特征, 指出RAPD可更好的鉴定其多样性。

3. 展望

篇4：pcr技术在林业的应用

关键词：PCR技术 食品检测 微生物 多重PCR技术

中图分类号：TS207 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）04-0014-02

1 概述

PCR多聚酶链式反应（polymerase Chain Reaction），是1985年诞生的一项DNA体外扩增技术。自从其问世就快速的应用于食品科学的许多领域中。

2 PCR技术

2.1 PCR技术的原理和基本步骤

2.1.1 PCR技术的原理

PCR技术的基本原理是在体外对已知的，待扩增的双链DNA片段，人工合成与该DNA两条链末端互补的两条寡核苷酸引物，在体外将待检的DNA序列在酶促作用下进行高效扩增。

2.1.2 PCR技术的主要检测步骤

PCR技术的主要检测步骤包括：运用化学手段对目标DNA提取，设计并合成引物，进行PCR扩增，克隆并筛选鉴定PCR产物，DNA序列分析。

2.2 PCR技术的优点

（1）快速，PCR技术用于食品检测，仅一天就能完成检测。（2）灵敏，PCR技术能够比较准确的检测出食品中的微生物，可以避免传统检测分离所有微生物的困难。（3）操作方便，PCR技术检测食品的操作简单方便，仅一人就能完成检测。

3 PCR 技术在食品检测中的应用

3.1 食品中成分种类及有效成分的检测

进行食物中动物成分种类的鉴定，是为了防范某种特定的动物病，例如：上个世纪的疯牛病，食品、药品、饲料中的牛源性成分开始受到严格限制，2004年，李林等应用PCR方法鉴别肉骨粉中的动物成分种类。进行食品有效成分的检测是因为食品中各种营养成分有了数字指标。特别是对于那些加工后的食品，如果通过传统的方法，不能判断出食材的优劣以及相关成分，而PCR技术则不受限，对于加工后的产品有效成分的鉴定有重要的作用。

3.2 PCR技术在食品微生物检测中的应用

3.2.1 PCR技术检测食品微生物的优势

PCR技术的优势是监测时限短，操作简单，灵敏度高。例如在单核细胞增生李斯特氏菌检测中，在金黄色葡萄球菌的检测中，在顽固性梭状芽孢杆菌的检测中都显现出较之传统技术其具有极高的特异性和敏感性的特点。

3.2.2 传统PCR技术及其在食品微生物检测中的应用

PCR技术在食品检验中最早是用来监测食品中的病原体，但是传统PCR检测技术需要依赖不同类型的后处理过程来解决假阳性污染和定量准确度的难题。而且处理过程繁琐，可能产生有害物质，影响操作者的健康，所以近年来，PCR改进技术迅速发展起来，通常采用传统常规型与改进型相结合的方法进行研究。

4 PCR 改进技术在食品检测中的应用

4.1 实时定量PCR技术及其在食品检测中的应用

实时定量PCR技术是在反应体系中加入荧光染料或者荧光探针，通过信号的积累来监测整个进程，然后再通过标准曲线对未知的模板进行定量分析的方法。有很多优点：快速灵敏，操作方便，全封闭反应，减小环境污染，不使用有毒试剂，操作安全，定量准确，监测结果直观等优点。

4.2 多重PCR 在食品检测中应用

4.2.1 多重PCR技术在食品病原微生物检测中的应用

食品污染的病原菌包括多种，例如：沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肠出血性大肠杆菌等。在检测时，易受其他微生物和本身的变异株的干扰。使实验结果呈现出假阳性和准确率低的现象。目前研究多采用多重PCR检测。如：肠出血性大肠杆菌利用多重PCR检测与传统的血清学方法检测相比，更高效灵敏。沙门氏菌利用多重PCR检测，可以提高食品沙门氏菌的检测率，还可以鉴定沙门氏菌的血清型和突变情况。金黄色葡萄球菌利用多重PCR检测，虽然检测结果与免疫学检测结果基本一致，但是多重PCR还可以检测一些免疫学方法不能检测的肠毒素基因。多重PCR在复杂的食品样品检测中有很好的重复性和高度的敏感性表明其是检测食品致病菌的可行性方法。

4.2.2 多重PCR技术在食品非致病菌检测中的应用

乳酸菌（LAB）是真空环境下存在的主要微生物，对致病菌的生长有着较强的抑制作用，但是乳酸菌的存在也是食品腐败的信号。乳酸菌在真空的包装中含量一般都很低，Yost等（2000）用16S rRNA、16S-23S rRNA ISR建立多重PCR检测与真空包装牛肉产品腐败相关的乳酸菌，Kye等（2006）用种特异性基因代替16S rRNA设计引物同时检测韩国泡菜发酵过程中的10种重要的LAB，随发酵的时间和菌群的变化多重PCR的检出率不断提高，试验建立的多重PCR技术重复性好，同时又解决了16S rRNA不能有效检测韩国泡菜乳酸菌的问题。

5 PCR技术在应用过程中可能存在的问题及解决方法

5.1 应用过程可能存在的问题

样品的预处理、样品DNA的提取等具体的操作过程可能会遇到不同的问题，PCR的反应过程中具体的操作，比如确定退火的温度、适温延伸时间的长短和循环数的确定等问题都是复杂的。

5.2 解决方法

在不同的反应体系中，为避免假阴性、假阳性的现象的出现，应该确定好与之相适应的反应条件。试验操作要规范化。在检测前，要进行预实验来进一步完善检测方法。

6 结语

PCR检测技术作为现代生物学技术的手段应用于食品检测，克服了传统检测方法的缺点和不足，尤其方便快捷，灵敏度高的特点，如果可以克服其缺点，前景一定会很广阔。

参考文献

[1]刘红芳，宋慧. PCR及其改进技术在食品微生物检测中的应用[J].现代化农业，2012，26（5）：34-36.

篇5：pcr技术在林业的应用

摘要：本文围绕分子生物学技术中的PCR-DGGE技术,介绍了PCR-DGGE的技术优缺点,并结合当前的废水处理新技术,尤其是在新型脱氮工艺方面的`应用进行综述,并对未来废水生物处理中PCR-DGGE的应用进行了展望.作 者：熊毅 赵�Z 赵鑫 XIONG Yi ZHAO Jing ZHAO Xin 作者单位：熊毅,XIONG Yi(重庆市设计院,重庆,400015)

赵�Z,ZHAO Jing(中国石油天然气管道工程有限公司天津分公司,天津,300280)

赵鑫,ZHAO Xin(大港油田滩海开发公司,天津,300280)

篇6：3S技术在林业的应用与前景

随着3S技术在林业中的`应用,我国林业信息技术的发展与应用也实现了质的飞跃,“数字林业”建设取得了长远发展,林业信息化建设步伐加快.如何利用3S技术保护森林资源,掌握森林资源现状,监测其动态变化,分析森林资源的数量、质量、分布规律等,预估其发展趋势,为林业产业提供宏观决策支持,这些已成为当前“数字林业”建设的重要研究课题.

作 者：郭少波 王丰 雷和平 作者单位： 刊 名：陕西林业 英文刊名：FORESTRY OF SHAANXI 年，卷(期)： “”(2) 分类号：S7 关键词： 

篇7：pcr技术在林业的应用

在当前林业育苗工作中除草技术是一项十分重要的环节，同时也是对苗木生长进行保障的一项重要基础。随着当前我国化学技术在林业育苗过程中的广泛应用，传统的人工除草方式已经很难满足当前林业发展的实际需求了。同时在大量的实践中也表明，化学除草技术也是一项十分高效的除草方式，不仅能对大量的人力和资金进行节省，同时也能在很大程度上对苗木的质量进行提升，通过这种方式也将对林业的发展起到十分有效的帮助和影响[1]。针对这种情况，本文就将对林业育苗中化学除草技术的应用展开研究，希望对于林业的整体发展起到更大的帮助作用。

1在化学除草技术进行应用需要注意的问题

1.1合理选择化学除草工作的时间

在实际工作的过程中要想将化学技术发挥出最大的功效，进一步对除草工作的效率进行提升，首先一项重要的因素就是合理选择除草时间，通常情况下利用化学技术展开除草工作最好在早期进行，也就是在杂草为四个叶片前进行除草工作。在苗木最初的发芽过程中，最有效的一种除草方式就是毒土法，通过这种方式对苗木的发芽率进行全面提升。当苗木的生长正处于旺盛阶段时，则需要对化学药剂的用量进行控制，这是因为植物在实际生长的过程中对于除草剂等物质有着较为敏感的反映，因此一旦这个过程中的除草剂出现使用过量的情况，就很容易出现苗木中毒的情况。所以在这种前提下，对化学除草时间进行选择就是一项十分重要的工作[2]。

1.2对化学除草剂的用量进行正确掌握

对化学除草剂进行科学的使用对于苗木生长有着十分重要的帮助和影响，但是作为一种化学药物，对于化学除草剂的使用也并不是越多越好的。一旦出现用药量过多的情况，就会对苗木的种子造成伤害，但是如果用药量太少也不能发挥出理想的除草效果，所以在这种前提下就需要掌握用量的合理性。同时，当使用的化学除草剂为多种的时候，相关林业人员要正确的选择剂量，并对用药的各项环节进行合理配置，要求掌握苗木的特性和时间、杂草类型等，从而更好的实现具体问题的具体分析，确保苗木的正常生长。

2化学除草剂在林业育苗中发挥作用的相关影响因素

2.1植物的生长阶段

除草剂发挥作用的主要因素不仅应该考虑到苗木的基本特征，同时还应该适当的和杂草进行适应，通过这种方式也将取得十分有效的除草效果。杂草在进行生长的初级阶段是相对比较脆弱的时期，所以在这个阶段利用除草剂对杂草进行处理也是效果最为显著的一个阶段。相反的，当杂草的生长到了中后期的时候，除草的效果就变得不再明显[3]。一般情况下，杂草生长到两个叶片的时候所取得的除草效果是最为明显的。一旦叶片生长到三个叶片的时候，杂草就将对除草剂出现一定的抑制作用，所以当生长到四个叶片的时候，除草剂基本上很难发挥出积极的作用。

2.2自然环境因素

在化学除草剂的使用过程中，土壤也是需要进行考虑的一项重要自然因素。同时，光照也是对其效用进行发挥的一项重要原因。比如有一种除草剂中含有二苯醚，所以在光照下才能对其作用进行发挥，但是如果在黑夜中或是黑暗的环境下，那么这种类型的除草剂将无法发挥作用。这也就是说，除草剂在发挥效用的过程中和光照的强度也是有着十分紧密的联系，随着光照强度的不断提升，除草剂所发挥的作用也将更加明显[4]。此外，风和雨等自然天气也将对除草剂的发挥作用造成严重影响。除草剂的使用一般需要在晴天下进行使用，同时通常还要尽可能选择无风天气，因为如果有风，除草剂很容易被大风吹走，有雨也会造成除草剂的稀释，所以在这种背景下，也需要选择合理的天气条件下进行除草。在植物进行光合作用的过程中需要光照，也就是要在温度适宜的条件下进行，只有温度在一定标准下，才能对除草剂的吸收效果达到最佳阶段，因此在对除草剂进行喷涂的过程中需要将温度控制在20到30摄氏度中。

3在林业育苗过程中化学除草剂所取得的良好效果

在林业育苗的过程中对化学除草剂进行应用，也给林业育苗的发展带来了很大的帮助，同时也将取得十分显著的结果。在本文的研究过程中，主要将云杉育苗为例，并且观察其除草效果。云山在育苗的.过程中通常为每年的四月份，当云杉的木种刚放入土中的过程中，相关的林业工作人员也要对周围的杂草进行研究，防止出现杂草对云杉的生长起到不利的影响和阻碍[5]。如果在这个过程中出现了杂草，那么就可以相应的采用西玛津一类的化学除草方式，按照一定比例和清水进行混合，并进行适当喷洒，就能在很大程度上控制杂草的出现和诞生。

通过本文的研究，化学除草剂作为一项重要的科学技术产物，在实际林业育苗的过程中发挥着十分重要的作用，所以在当前的林业发展过程中，得到了十分明显的应用。在当前林业育苗工作中除草技术是一项十分重要的环节，同时也是对苗木生长进行保障的一项重要基础。所以在今后的实际工作过程中更应该适当的对除草技术进行利用，进一步对育苗的整体质量进行提升，从而全面促进我国今后林业育苗工作的进步和发展。

参考文献

[1]陈强.化学除草技术在林业育苗中的应用[J].北京农业,,36(18):154-154,155.

[2]张凤权,王海英,侯毅等.简析化学除草技术在林业育苗中的应用[J].农民致富之友,,62(12):106-106.

[3]王跃文.化学除草技术在林业育苗中的应用实践[J].北京农业,2014,57(33):89-89.

[4]陈作良,徐晓东.关于化学除草技术在林业育苗中的应用探讨[J].农民致富之友,2015,39(20):159-159.

篇8：pcr技术在林业的应用

1 材料和方法

1.1 病料

来自山东某规模化猪场送检的3头疑似CSF的发病仔猪, 采集其扁桃体、脾、肾等组织作为病料。

1.2 试剂

TRIzol试剂购自Invitrogen公司;AMV reverse transcriptase (10 U/μL) 、RNA酶抑制剂、d NTP (40 U/μL) 购自Promega公司;Taq DNA polymerase (5U/m L) 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;DEPC水购自上海生工生物技术公司;异丙醇、氯仿、氯化钠为天津市化学试剂三厂产品。

1.3 主要仪器

高速微量离心机 (Sigma, USA) ;PCR仪Gene Amp System 2400 (PE公司) ;紫外凝胶成像系统 (UVP公司) ;稳压稳流电泳仪DYY-31A型为北京六一厂产品。

1.4 引物的设计与合成

参照Alfort株、Brescia株和C-株 (SK-6) 核苷酸序列, 利用primer5.0软件设计4条引物, 其中正负链各1条, 由宝生物工程 (大连) 有限公司合成, 其引物代号、位置见表1。

1.5 组织中总RNA的提取

参照Invitrogen公司的TRIZOL!LSReagent的Total RNAisolation system进行, 方法如下:

剪取50~100 mg的组织, 用生理盐水冲洗后加1 000μLTRIZOL!LS Reagent在匀浆器中匀浆 (样品量不应超过用于匀浆的TRIZOL!LS Reagent的10%) , 将液相转移到1.5m LEppendorf管内。在15~30℃ (一般室温) 孵育5 min, 使核酸蛋白完全降解, 加入0.2 m L氯仿, 颠倒混匀 (轻轻) , 置于15~30℃孵育2~15 min。在2~8℃ (4℃) 以11 500 r/min离心15min, 取上层水相于一新Eppendorf管中。每1 m LTRIZOL!LS Reagent处理样品加0.2 m L异丙醇沉淀RNA。先在15~30℃孵育2~15 min, 在2~8℃ (4℃) 以11 500 r/min离心10 min。弃上清, 用750 m L/L乙醇 (1g/L DEPC水配制) 洗涤沉淀, 每1 m LTRIZOL!LS Reagent处理样品加至少1 m L750m L/L乙醇, 在2~8℃ (4℃) 以7 400 r/min离心5 min, 混匀样品。弃上清, 室温干燥沉淀5~10 min。用无RNase酶水 (30μL) 溶解沉淀, 加1μL (40 U/μL) RNA酶抑制剂 (Ribonu-clease inhibitor, 冰上操作) , 置-20℃备用。

1.6 目的片段的RT-PCR和RT-n PCR扩增

反转录合成c DNA:在一新Eppendorf管中加入:总RNA提取液8μL, CSFV-E2-p1a B (20 pmol/μL) 1μL, 5×AMV buffer 4μL, d NTP (25 mmol/μL) 6μL, RNasin (20 U/μL) 0.5μL, AMV (10 U/μL) 0.5μL。42℃水浴1.5~2 h, 置-20℃备用。

目的片段扩增 (一扩) :在一新Eppendorf n PCR管中加入:灭菌双蒸水13.25μL, 反转录c DNA液5μL, 10×PCR缓冲液2.5μL, d NTP (25 mmol/μl) 2μL, CSFV-E2-p1a (20pmol/μl) 1μL, CSFV-E2-p1a B (20pmol/μL) 1μL, Taq DNA polymerase (5 U/m L) 0.25μL。反应条件为:95℃变性4 min;然后94℃30 s, 56℃30 s, 72℃45 s, 35个循环;最后在72℃下延伸10 min。

扩增 (二扩) :将上步 (一扩) 的PCR产物作为模板, 用CSFV-E2-p2a和CSFV-E2-p2B做为配对引物完成的PCR (二扩) 。灭菌双蒸水16.25μL, 一扩PCR产物2μL, 10×PCR缓冲液2.5μL, d NTP (25 mmol/μL) 2μL, CSFV-E2-p2a (20 pmol/μL) 1μL, CSFV-E2-p2B (20 pmol/μL) 1μL, Taq DNA polymerase (5 U/m L) 0.25μL。反应条件为:95℃变性4 min;然后94℃30 s, 56℃30 s, 72℃45 s, 35个循环;最后在72℃下延伸10 min。

1.7 琼脂糖凝胶电泳PCR产物鉴定

取上述PCR (一扩产物, 预计305 bp;二扩产物, 预计172 bp) 产物5μL在10g/L TAE琼脂糖凝胶中电泳, 凝胶中含0.5μg/m L溴化乙锭, 电泳缓冲液为1×TAE, 90~100V, 25 min电泳完毕后, 于紫外凝胶成像系统观察。

2 结果与讨论

Marker左侧2、3、4为一扩引物扩增结果, 如图1。Marker右侧2、3、4为二扩引物扩增结果, 如图2。表明用引物p1a/p1a B进行扩增产物电泳后, 在预计的305 bp处有阳性条带;再用p2a/p2B做为配对引物完成的PCR二扩电泳, 在预计的172 bp处有更加明显的阳性条带。说明被检病猪存在CSFV感染。

巢式PCR的原理就是使用2对PCR引物扩增完整的片段, 第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似, 第二对引物称为巢式引物结合在第一次PCR产物内部, 使得第二次PCR扩增片断短于第一次扩增, 巢式PCR的好处在于, 如果第一次扩增产生了错误片断, 则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低, 因此, 巢式PCR的扩增非常特异[9]。Liu等[11]提取CSFV感染组织中总RNA进行RT-PCR反应, 扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测表明, 其灵敏性可检测到104TCID50的病毒。Sand-Vik等[12]和Goldrick等[13]分别利用巢式PCR对CSFV进行检测, 结果证实扩增灵敏性较普通RT-PCR可提高1 000倍。

篇9：PCR技术在动物检疫中的新应用

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术自1985年建立以来，经过了20余年的发展，应用日益广泛，体现了其强大的生命力。对病原体核酸的扩增被广泛应用于动物病原体的检测中。并在动物检疫中发挥着越来越大的作用。

PCR作为现代分子生物学的核心技术，在科学研究和临床诊断中都发挥了巨大的作用。这项技术经过不断的开发和改进，已经应用到动物检疫领域的各个环节。给我们的工作带来极大的便利。在PCR技术基础上衍生出很多新技术，在动物检疫中逐渐被采用的PCR技术主要有多重PCR和荧光PCR技术。

1多重PCR技术

多重PCR最先被用于疾病的诊断是1988年Chamber-lain将其应用于人的杜氏肌营养不良(DMD)基因外显子的检测。随后，在人医上被广泛应用于各种疾病的诊断。1993年，WirzB将其用于猪瘟病毒和其他瘟病毒属的鉴别诊断，从而拉开了在兽医诊断领域应用多重PCR的序幕。随后该技术不断的被报道用于动物细菌性、病毒性、寄生虫性疾病等的诊断，被公认为是一种方便、快速、敏感、特异的诊断方法。

1.1方法的特点

多重PCR是在常规PCR的基础上发展而来的。因此，其基本原理和常规PCR没有差别，所不同的是多重PCR技术是在同一个体系中加入多对引物，同时检测多个目标序列的存在。理论上讲，引物条数可以不加限制，但是实际操作中，由于随着引物条数的增加，引物之间的相互作用变得更为复杂，二聚体和错配的几率大大增加，优化各种条件变得更为困难，从而影响引物的扩增效果。虽然目前已有同时用9对引物扩增出相应目标片段的报道，但是实际工作中通常以使用引物不超过5对为好。在把单重PCR合并成多重PCR之前要进行不同扩增子之间引物的分析，条件进一步优化。

1.2方法的应用

多重PCR在动物中使用相当普遍，主要用于病原体强弱毒株的区分、鉴别诊断和分型鉴定等。

1.2.1毒力强弱分析新城疫是家禽的一种烈性传染病。但有时却表现出慢性疾病的特点，无典型的临床症状。因而需要一种不仅能够诊断该病而且能快速区别病原是强毒株还是弱毒株的方法。早期的研究多集中在RT-PCR扩增结合序列分析的方法上，虽然也不失为鉴别诊断新城疫的准确可靠的方法，但测序比较烦琐，成本也较高，难以进行大批量操作。20世纪80年代末到90年代初。新城疫基因组结构的阐明为建立这种鉴别诊断方法提供了可能。通过对大量不同毒力新城疫基因核苷酸序列的分析，根据强弱毒株FO裂解位点的序列差异设计合成了3对引物，建立了快速诊断新城疫并能鉴别其强弱毒株的反转录一聚合酶链式反应，该方法具有快速特异和操作简便的特点，不仅适用于对鸡胚毒的检测，而且适用于对病鸡组织匀浆液的检测，是新城疫鉴别诊断和流行病学调查的颇具潜力的分子诊断方法。

1.2.2鉴别诊断鸡传染性支气管炎(IB)、禽流感(AI)、鸡传染性喉气管炎(ILT)、鸡新城疫(ND)是严重危害鸡群的4种主要呼吸道传染病。这些传染病感染不同年龄鸡群，具有较高的发病率和死亡率，曾给养鸡业造成沉痛的打击和巨大的经济损失。由于这些病原引起鸡表现相似的临床症状和病理剖解变化，用传统的临床诊断方法难以区别，并且这些方法常受临床病料新鲜度、污染程度或病程的限制，操作也十分繁琐费时。根据4种传染病的各自保守序列设计4重PCR，由扩增后得到的特异性片段的大小来诊断是哪种疾病引起。

猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)、典型猪瘟病毒(CS，FV)、圆环病毒(PCV)、细小病毒(PPV)、流行性乙型脑炎病毒(JEV)和猪伪狂犬病毒(PRV)是引起猪繁殖障碍的常见病原，在临床上常呈混合感染。多重PCR技术用于PRRSV、CSFV、PCV、PPV和JEV感染的诊断能同时检测5种病毒的感染。

1.2.3动物病原体的分型鉴定 猪链球菌分为35个荚膜血清型，1、2、1/2、7、9和14型从发病猪和死猪体内最常分离到的血清型。其中以2型致病性和毒力最强，其他血清型有的毒力偏弱、危害较少。有的甚至在临床上并不导致疾病。因此，在实践中。需要将2型猪链球菌与其他型分开。2型和1/2型猪链球菌的毒力基因cps基因中有几段是其他血清型猪链球菌没有的(cps2F、cps2H、cps2I和cps2J)。建立同时检测这些独有基因和共有基因的多重PCR就可以将2型、1/2型猪链球菌与其他型分开。

流感病毒的基因组极易发生变异，其中以编码血凝素(HA)的基因的突变率最高，其次为神经氨酸酶(NA)基因。迄今已知有16种HA和10种NA，不同的HA和NA之间可能发生不同形式的随机组合，从而构成许许多多不同亚型。据报道，现已发现的流感病毒亚型至少有80多种，其中绝大多数属非致病性或低致病性，高致病性亚型主要是含H5和H7的毒株，特别是H5亚型禽流感病毒可以导致人的死亡，具有重要的公共安全意义。鉴别诊断H5与其他亚型的多重PCR技术已经在动物检疫中广泛使用。

2荧光PCR技术

实时荧光PCR技术于1996年由美国Applied Biosys-terns公司推出，可以分为探针法和SYBR Green I荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为准确。荧光PCR把PCR的灵敏度和特异性大大提高，灵敏度接近检测方法的极限，荧光探针增加了检测的特异性。

2.1 荧光PCR技术特点

第一是实现了实时检测。能在反应结束后得到PCR扩增动力学曲线。从而很直观地反映整个PCR过程的动态变化。检测点以Ct值为标准，当荧光信号达到Ct值时，PCR反应体系内各种成分均处于最佳饱和状态。受各种干扰因素的影响最少，最能反应体系中模板的起始含量。第二是具有良好的稳定性和重复性，Gerard报道用荧光定量PCR方法，重复40次反应。其Ct值的变异系数为1，6％。如使用电泳后凝胶扫描定量。其变异系数高达31％，两者相差19倍多。第三是用荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，能获得较高的检测精度，因为荧光检测的灵敏度显著高于肉眼观察电泳条带的灵敏度。第四是在荧光定量PCR过程中，除加样一次开盖外，其余过程在闭管情况下进行，反应结束后在电脑上显示，不需要后期的凝胶电泳，有效杜绝了产物污染造成的假阳性问题，同时避免了溴化乙锭或同位素对人体及环境的危害。第五是操作简单、快速，工作效率高。整个过程由电脑控制，从加样到结果出来只需要2h左右，内置9600型PCR扩增仪，可同步完成96个样品的扩增及定量，适宜于大批样品的

检测处理，有利于操作规程的标准化。

荧光PCR也可以设计多重，即多重荧光PCR，通过不同的探针标记不同的发光集团实行荧光分类从而实行多重检测的目的。目前，市面上流行的荧光PCR仪中，ABI公司的7500最多可以检测5个通道的荧光，也就是说最多可以进行5重荧光PCR检测。

2.2荧光PCR的应用

荧光PCR由于具备更多的优势，因此在动物检疫中受到更多的青睐。除了需要对PCR产物进行下游处理的试验外，几乎所有PCR进行的工作都可以由荧光PCR来完成。进出口检验中对方法的灵敏度要求很高，要求有微量的病原体就能够检出，荧光PCR正好可以发挥它的优势。

2.2.1 动物病毒检测 荧光定量PCR技术在动物病毒性疾病的诊断及定量检测中已经被广大临床诊断实验室所接受，现在国内外已经有很多实验室都建立了快速检测病毒的方法，病毒分离结果一致。英国科学家Schweiger报道应用荧光PCR对咽喉拭子等呼吸道标本中禽流感病毒进行型别、亚型鉴定，结果表明敏感性高于常规的病毒分离、培养方法。深圳四基生物工程公司与北京出入境检验检疫局研制出了AIV荧光RT-PCR检测试剂盒。基于该技术的检测试剂在全国各个出入境检测实验室得到了广泛使用，为有效控制禽流感疫情在国际间的传播起到显著的作用。

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由FMDV感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性、接触性传染病。患病动物的口、舌、唇、蹄和乳房等部位出现水泡，破溃并形成烂斑。该病一经检出，相应的家畜及畜产品就禁止运输和出口，造成巨大的经济和政治影响。FMD的暴发和流行除了对畜牧业生产造成巨大的损失外，对人民生活所需要的奶品、肉品供应也造成很大的影响，故各国对FMD的检验检疫非常严格。FMD检测可以通过病毒分离、补体结合实验(CFF)、病毒中和实验(VNT)和动物接种实验等方法。然而，这些方法费时费力。特异性和灵敏度也无法满足需要。急需一种快速、准确的检测技术。在我们国家，检验检疫系统中首先建立了口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测技术，之后形成检验检疫行业标准，成为进出口动物及动物产品的重要检疫规范。

此外，荧光PCR新城疫病毒和猪蓝耳病病毒的检测方法已经建立。部分口岸实验室也在应用。

2.2.2动物细菌病检测 2005年6月，四川省资阳、内江相继暴发猪链球菌病，截止到8月20日，累计报告人感染猪链球菌病病例204例。死亡38例。这些事件不但造成了人员伤亡，而且引发了全国性的食品安全恐慌，造成巨大的经济损失。全国多个动物检疫实验室建立了荧光PCR检测2型猪链球菌的检测技术，其中珠海出入境检验检疫局建立的多重荧光PCR检测技术同时检测2型猪链球菌的荚膜多糖基因cps2I和溶菌素释放蛋白基因MRP，对于控制疫情、减少扩散起到积极作用。

炭疽是由炭疽芽孢杆菌引起的一种人兽共患病，炭疽芽孢杆菌可通过消化道、呼吸道及皮肤接触感染人和动物，具有高度致病性，特定条件下炭疽芽孢杆菌可以形成芽孢，抵抗力强，在外界环境中可存活数十年。2002年美国出现的炭疽生物恐怖事件更是给人们敲响了警钟，快速准确的检测技术对于炭疽的监测和控制具有重大意义。张玲建立了SYBR GREEN I染料法荧光PCR技术，实现了炭疽杆菌的快速检测。2005年陈苏红等针对炭疽杆菌的pX01和pX02质粒建立了Taqman探针荧光PCR检测技术，使检测的特异性和灵敏度大大提高。根据实验数据，他们的研究都取得了不错的效果，有望在实践中，特别是进出口检验中发挥越来越大的作用。

另外，大肠杆菌0157、霍乱沙门氏菌也都建立了相应的荧光PCR检测技术，对保障进出口动物健康和食品安全具有重要作用。

3小结