巢式PCR（精选五篇）
巢式PCR 篇1
1 样品和试剂
本实验的样品来自河北省疑似患有猪瘟的猪场, 主要试剂包括TRIzol.LS Regent购自Invitrogen公司, p GEM-T Easy购自Promega公司, AMV反转录酶、Rnase-Inhibitor、r Taq DNA聚合酶、d NTPs Mix、AMV Reverse Transcriptase、DNA Marker DL 2 000等均购自宝生物 (大连) 工程有限公司。
2 监测引物的设计
本研究在猪瘟病毒全基因3440~4350位相对保守的核苷酸之间, 设计PCR引物, 扩增的目的片段为546nt。
3 猪瘟病毒巢式RT-PCR监测方法的建立
3.1 猪瘟病毒RNA的提取
参照TRIzol.LS Regent试剂说明书。
3.2 猪瘟病毒反转录体系的建立
猪瘟病毒反转录体系为20μL:RNA模板3μL、引物PR1 1μL、d NTP 4μL、Rnase-Inhibitor 0.5μL、AMV0.5μL、5×AMV Buffer 4μL, 补DEPC水至20μL。42℃反转录1h, 得到相应的c DNA模板。
3.3 猪瘟病毒巢式PCR方法的建立
本实验方法分为2步对猪瘟病毒DNA进行扩增:
猪瘟病毒1扩PCR体系为25μL:反转录产物3μL、10×PCR Buffer 2.5μL、d NTPs 2μL、一扩上下游引物PR1和PF1各0.5μL、r Taq 0.25μL、补水至25μL。反应程序为:94℃变性5min;94℃30s, 55℃30s, 72℃1min, 共32个循环;最后72℃延伸10min。
猪瘟病毒2扩PCR体系为25μL:3μL 1扩PCR产物、10×PCR Buffer 2.5μL、d NTPs 2μL、二扩上下游引物PR2和PF2各0.5μL、r Taq 0.25μL、补水至25μL。反应程序为:94℃变性5min;94℃30s, 55℃30s, 72℃1min, 共32个循环;最后72℃延伸10min。
3.4
通过凝胶电泳, 在凝胶成像设备上观察PCR扩增产物, 阳性结果为获得了546 nt的特异性目的条带。其结果如图所示:
M.Marker DL2000;1~9为CSFV细胞毒PCR扩增结果;10为阳性对照;11为阴性对照。
4猪瘟病毒巢式RT-PCR监测方法的特异性、敏感性、重复性试验
巢式PCR 篇2
关键词：反向PCR；巢式PCR；降落PCR；奥尼罗非鱼；MSTN基因；3′侧翼序列
中图分类号： S917文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）02-0028-03
收稿日期：2013-07-05
基金项目：浙江省自然科学基金 （编号：Y3110432、Y3090561）；浙江省钱江人才计划（编号：2012R10076 ）；浙江省公益性技术应用研究计划（编号：2011C37078）；浙江省重点创新团队项目（编号：2012R10026-05）。
作者简介：李景芬（1977—），女，浙江湖州人，博士，主要从事分子生物学方面的研究。E-mail：lijingfen@hutc.zj.cn。奥尼罗非鱼（Oreochromis niloticus×O.aureus）为奥利亚罗非鱼父本同尼罗罗非鱼母本杂交获得的良种，雄性率高，生长速度快，群体产量高，且抗病力强。因其肉白、富弹性、刺少而被称为“白色三文鱼”，是联合国粮农组织向世界各国推荐养殖的优良水产品之一，也是全球旺销的水产品之一[1]。肌肉生长抑制素（MSTN，简称抑肌素）基因是转录生长因子β（TGF-β）家族的一个成员，最先在小鼠中发现[2]，并且已有研究证明该基因是哺乳动物骨骼肌生长发育的负调控因子。有研究表明，该基因的功能在鱼与哺乳动物上一致，即均可抑制骨骼肌生长，如转基因斑马鱼因MSTN被抑制而使肌纤维数量明显增加[3]；通过RNA干扰沉默MSTN基因的斑马鱼表现出体型巨大化[4]；MSTN基因显性失活形式的过表达导致转基因青鳉的肌纤维数量在成年后加倍[5]；青鳉MSTN基因的缺失，在幼鱼后期到成鱼初期表现为肌纤维数量的增加，随后出现肌纤维的肥大，呈现“双肌”表型[6]。因此，笔者选择反向、巢式、降落3种PCR技术克隆奥尼罗非鱼MSTN基因的3′侧翼序列，以有效获得这一未知序列，完成奥尼罗非鱼MSTN基因全序列的克隆，从而为研究奥尼罗非鱼MSTN基因功能和分子育种奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
供试的奥尼罗非鱼由浙江省淡水水产研究所提供。限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ、NcoⅠ、BglⅡ、HindⅢ，T4 DNA连接酶，rTaq DNA 聚合酶，dNTP，DL 2000 DNA Marker、琼脂糖、大肠杆菌DH5α及质粒载体pMD19-T vector均购自TaKaRa 公司。AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒、AxyPrep 质粒小量制备试剂盒、AxyPrep PCR Clean-up kit 均购自爱思进生物技术（杭州）有限公司。此外，还有EDTA、苯酚、三氯甲烷、异戊醇等。
1.2试验方法
1.2.1DNA的提取采用经典的苯酚-三氯甲烷法提取鱼血DNA。2.0 μL DNA 样品进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，再结合紫外分光光度计法检测所提取的DNA 的重量和浓度。
1.2.2DNA的酶切参照限制性内切酶说明书进行酶切试验，分别采用BglⅡ、XhoⅠ、NcoⅠ、BamHⅠ、HindⅢ、XbaⅠ 等6 种限制性内切酶对基因组DNA 进行酶切，酶切反应总体积为40 μL，37 ℃水浴酶切18 h。用电泳检测酶切效果，之后用AxyPrep PCR Clean-up kit 进行纯化，用20 μL ddH2O洗脱以去除限制性内切酶。
1.2.3酶切片段的连接与酶切片段的连接环化参照T4 DNA 连接酶说明书进行连接，反应体系为100 mL[包括 82 μL ddH2O、10 μL T4 DNA Ligase Buffer、6 μL 酶切产物（>50 ng/μL）和2 μL T4 DNA 连接酶]，16 ℃连接21 h，再用AxY PrepTM PCR Clean up kit 进行纯化，以10 μL ddH2O 洗脱，获得5个酶切库。
1.2.4引物设计与PCR 扩增已克隆到的奥尼罗非鱼MSTN基因序列设计引物，由上海英骏公司合成。反向、巢式PCR第1轮引物： 1S为5′-CTTCTTCCCTGTTGTCATCTCCCAGCAC-3′，1A为5′ -CTACCCACTCACTGTGGACTTCGAGGAC-3′；第2轮引物：2S为5′-TCGTACTGATCCAGAAGCTGCTGCA-3′，2A为5′-CCCCAACAAAGATGTCGCCAATCAA-3′。引物1S和1A分别以各酶切库为模板进行第1轮反向、巢式、降落PCR，PCR体系 50 mL 包括10 PCR Buffer 5 μL、10 mmol/L dNTP 4 μL、10 pmol/μL 1S 4 μL；10 pmol/μL 1A 4 μL、25 ng/μL 模板 2 μL、5 U/μL rTaq 0.4 μL、ddH2O 30.6 μL。扩增程序：95 ℃ 预变性4 min；95 ℃ 变性30 s，73、71、69、67、65、63、61 ℃退火40 s，72 ℃ 延伸3 min，每个退火温度均如此循环3次；95 ℃变性30 s；55 ℃ 退火40 s，72 ℃延伸3 min，30个循环；72 ℃延伸 10 min。PCR结束后电泳。
对PCR产物进行30倍稀释，以稀释后的PCR产物为第2轮PCR的模版，PCR体系、程序同第1轮，只是引物为2S、2A，模版为4 μL，ddH2O 28.6 μL。PCR结束后电泳。
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1.2.5PCR产物克隆与测序用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收和纯化PCR 扩增的目的片段。将纯化的DNA 片段与pMD-19T Vector连接，构建重组质粒，转化感受态大肠杆菌DH5α，PCR 法筛选重组子，摇匀，用AxyPrep质粒小量制备试剂盒提取质粒，双酶切（BamHⅠ、HindⅢ）鉴定正确后送往上海英骏公司测序。
1.2.6序列分析采用DNAman 软件进行序列分析，与GenBank 数据库的相关序列进行核苷酸序列同源性比较。
2结果与分析
2.1奥尼罗非鱼MSTN基因3′侧翼序列的扩增与克隆
基因组DNA分别采用BglⅡ、XhoⅠ、NcoⅠ、BamHⅠ、HindⅢ和XbaⅠ进行酶切，结果见图1。由图1可知，X泳道的基因组没切开，应舍弃；其余酶切较好，从上到下可看见弥散的条带，分别纯化后连接作为PCR的模板库。第1轮反向、巢式、降落PCR 扩增结果见图2，未获得特异性的PCR条带。第2轮反向、巢式、降落PCR 扩增结果见图3，从BglⅡ库中扩增到约1 450 bp的特异性条带，从NcoⅠ库中扩增出约 960 bp 的特异性目的条带，而从BamHⅠ、XhoⅠ和XbaⅠ库中均未扩增出特异性目的条带。将所获得的2条特异性目的条带进行克隆测序，将测序所获得的序列与已有的奥尼罗非鱼MSTN基因序列进行核苷酸序列比对，获得3′端1 376 bp 新序列。
2.2奥尼罗非鱼MSTN基因新获得序列分析
将所获得的新序列在网上进行在线Blast分析，该新序列与莫桑比克罗非鱼的MSTN基因序列相似度为99%，与点带石斑鱼和加州鲈的MSTN基因序列相似度为85%，与尼罗尖吻鲈的MSTN基因序列相似度为81%。目前已经得到了奥尼罗非鱼MSTN基因的全部序列，并已提交给GenBank，序列号为KC583258。
3结论与讨论
反向PCR技术是由Ochman等研究开发的[7-8]，主要用
于扩增与已知DNA序列相临的未知DNA序列。对含有已知序列及其相邻未知序列的基因组DNA样品用一种在已知序列中无酶切位点的限制性内切酶进行酶切，再用T4 DNA连接酶使酶切片段连接环化，之后以环化的DNA库为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物向夹在中间的未知序列部分进行扩增。该方法在很多研究中都有应用[7-12]，本研究利用该方法也成功得到了奥尼罗非鱼MSTN基因3′端 1 376 bp 的未知序列。
巢式PCR在医学检测和分子生物学方面研究应用较多[13-16]。该方法的原理是设计2对引物，第1次PCR采用能扩增较大片段的引物，扩增结束后，采用能扩增较小片段的引物，以第1次扩增的产物为模板进行第2次扩增，以增强扩增的特异性。本研究设计了2对引物，先用扩增较大片段的引物进行扩增，结果如图2所示，未扩增到单一的目的条带；再用扩增较小片段的引物以第1次扩增产物为模板进行第2次扩增，结果如图3所示，得到了非常单一、特异性的目的条带，达到了试验的目的。由此可见，巢式PCR能有效获得特异性目的片段。
降落PCR是一种多循环PCR，其原理是：随循环数增加，退火温度逐渐降低，当退火温度低于解链温度（Tm≈10 ℃）时，则固定于该退火温度进行扩增，从而达到最佳扩增效果[17-18]。起始退火温度可高于Tm（约为5 ℃），然后每个循环降低1～2 ℃或每几个循环降低1～2 ℃，直到退火温度低于Tm（约为10 ℃）。尽管退火温度最终降低到非特异性杂交的Tm，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩余循环中超过任何非特异性产物的扩增量。虽然降落 PCR 程序复杂，但能非常有效地降低或避免假阳性[19]，尤其对那些不了解的引物和目的模版匹配程度，比如在用简并引物进行扩增时，笔者就曾经利用降落PCR、简并引物顺利克隆了草鱼的PKR基因[20]。对于Tm 相近的PCR反应可在同一循环条件下进行，可大大提高工作效率[21]。对不确定退火温度基因的扩增而言，这是首选[22]。由此可见，降落PCR在基因克隆上有较强的优势，可用于普通PCR难以扩增的基因片段。反向PCR结合巢式PCR在低拷贝甚至是单拷贝基因的侧翼序列克隆时，可显示其较好的特异性和灵敏度[23]。本试验联合使用这3种PCR，有效获得了奥尼罗非鱼MSTN基因的3′侧翼这一未知序列，完成了奥尼罗非鱼MSTN基因全序列的克隆。
从本试验顺利成功的实施可以看出，反向、巢式、降落PCR相结合是扩增已知基因侧翼序列行之有效的方法。如只采用反向PCR（图2）不能获得目的条带，但结合巢式PCR就得到了特异性目的条带。但反向、巢式PCR相结合，用普通的PCR程序进行扩增，本研究没有扩增到到任何条带，而在此基础上采用降落PCR后扩增到了目的条带，说明3种PCR技术相结合可有效获得目的条带，提高效率。另外，该方法比较经济，避免了使用RACE法的高昂费用。笔者计算过该方法涉及到的试剂费用约需2 500元，而完成该试验每种试剂只用了一点点；而RACE法只1个10次的3′RACE试剂盒就2 000元左右。再者，该方法操作严格度低，虽然步骤繁琐，但都是在DNA上进行的，操作严格度相对宽松；而RACE法的对象是RNA，操作与DNA相比相对比较严格。由此可见，反向、巢式和降落PCR技术相结合是克隆已知基因旁侧序列经济、有效并可广泛使用的好方法，为科研工作者提供了克隆已知基因旁侧序列的新途径。
参考文献：
[1]梁素娟，李登明，杨琼，等. 奥尼罗非鱼池塘生态养殖试验[J]. 大众科技，2012，14（12）：112-113.
[2]McPherron A C，Lawler A M，Lee S J. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-β superfamily member[J]. Nature，1997，387（6628）： 83-90.
nlc202309040722
[3]Xu C，Wu G，Zohar Y，et al. Analysis of myostatin gene structure，expression and function in zebrafish[J]. The Journal of Experimental Biology，2003，206（22）：4067-4079.
[4]Acosta J，Carpio Y，Borroto I，et al. Myostatin gene silenced by RNAi show a zebrafish giant phenotype[J]. Journal of Biotechnology，2005，119（4）： 324-331.
[5]Sawatari E，Seki R，Adachi T，et al. Overexpression of the dominant-negative form of myostatin results in doubling of muscle-fiber number in transgenic medaka （Oryzias latipes）[J]. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol，2010，155（2）： 183-189.
[6]Chisada S，Okamoto H，Taniguchi Y，et al. Myostatin-deficient medaka exhibit a double-muscling phenotype with hyperplasia and hypertrophy，which occur sequentially during post-hatch development[J]. Developmental Biology，2011，359（1）： 82-94.
[7]Ochman H，Gerber A S，Hartl D L. Genetic applications of an inverse polymerase chainreaction[J]. Genetics，1988，120（3）： 621-623.
[8]Triglia T，Peterson M G，Kemp D J. A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences[J]. Nucleic Acids Research，1988，16（16）： 8186.
[9]Akiyama K，Watanabe H，Tsukada S，et al. A novel method for constructing gene-targeting vectors[J]. Nucleic Acids Research，2000，28（16）：E77.
[10]凌飞，李加琪，梅盈洁，等. 反向PCR技术克隆猪H-FABP基因5′侧翼序列[J]. 广东农业科学，2007（6）：75-76.
[11]Zimmerman A，Lüthy J，Pauli U.Event specific transgene detection in Bt11 corn by quantitative PCR at the integration site[J]. Lebensmittel-Wissenschaft & Technologie，2000，33（3）：210-216.
[12]Kumar S，Fladung M. Gene stability in transgenic aspen （Populus）.Ⅱ.Molecular characterization of variable expression of transgene in wild and hybrid aspen[J]. Planta，2001，213： 731-740.
[13]Ledwidge S A，Mallard B A，Gibson J P，et al. Multi-primer target PCR for rapid identification of bovine DRB3 alleles[J]. Animal Genetics，2001，32（4）： 219-221.
[14]Navaneetham D，Penn A S，Howard J F Jr，et al. TCR-V beta usage in the thymus and blood of myasthenia gravis patients[J]. Journal of Autoimmunity，1998，11（6）： 621-633.
[15]Atzori C，Agostoni F，Angeli E，et al. Combined use of blood and oropharyngeal samples for noninvasive diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia using the polymerase chain reaction[J]. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases，1998，17（4）： 241-246.
[16]杨洁，戴琳，郭亚兵，等. 应用多重PCR法对广东地区HBV进行基因型（A-F）分型[J]. 第一军医大学学报，2002，22（8）：707-709.
[17]迪芬巴赫 C W，德维克斯勒 G S. PCR 技术实验指南[M]. 黄培堂，俞炜源，陈添弥，译.北京： 科学出版社，1998：33.
[18]Helweg-Larsen J，Jensen J S，Benfield T，et al. Diagnostic use of PCR for detection of Pneumocystis carinii in oral wash samples[J]. Journal of Clinical Microbiology，1998，36（7）： 2068-2072.
[19]Piraee M，Vining L C. Use of degenerate primers and touchdown PCR to amplify a halogenase gene fragment from Streptomyces venezuelae ISP5230[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2002，29（1）： 1-5.
[20]李景芬，刘莉，曹访. PolyI ∶C体外诱导草鱼PKR基因的克隆与表达[J]. 安徽农业科学，2011，39（33）： 1943-1945，1961.
[21]Komura J，Ikehata H，Hosoi Y，et al. Mapping psoralen cross-links at the nucleotide level in mammalian cells： suppression of cross-linking at transcription factor- or nucleosome-binding sites[J]. Biochemistry，2001，40（13）： 4096-4105.
[22]王天云，张贵星，薛乐勋. 一种简便高效的改良降落PCR[J]. 中国生物工程杂志，2003，23（11）：80-82.
[23]李竹红，刘德培，梁植权. 改进的反向PCR技术克隆转移基因的旁侧序列[J]. 生物化学与生物物理进展，1999，26（6）：600-602.
巢式PCR 篇3
1 材料和方法
1.1 病料
来自山东某规模化猪场送检的3头疑似CSF的发病仔猪, 采集其扁桃体、脾、肾等组织作为病料。
1.2 试剂
TRIzol试剂购自Invitrogen公司;AMV reverse transcriptase (10 U/μL) 、RNA酶抑制剂、d NTP (40 U/μL) 购自Promega公司;Taq DNA polymerase (5U/m L) 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;DEPC水购自上海生工生物技术公司;异丙醇、氯仿、氯化钠为天津市化学试剂三厂产品。
1.3 主要仪器
高速微量离心机 (Sigma, USA) ;PCR仪Gene Amp System 2400 (PE公司) ;紫外凝胶成像系统 (UVP公司) ;稳压稳流电泳仪DYY-31A型为北京六一厂产品。
1.4 引物的设计与合成
参照Alfort株、Brescia株和C-株 (SK-6) 核苷酸序列, 利用primer5.0软件设计4条引物, 其中正负链各1条, 由宝生物工程 (大连) 有限公司合成, 其引物代号、位置见表1。
1.5 组织中总RNA的提取
参照Invitrogen公司的TRIZOL!LSReagent的Total RNAisolation system进行, 方法如下:
剪取50~100 mg的组织, 用生理盐水冲洗后加1 000μLTRIZOL!LS Reagent在匀浆器中匀浆 (样品量不应超过用于匀浆的TRIZOL!LS Reagent的10%) , 将液相转移到1.5m LEppendorf管内。在15~30℃ (一般室温) 孵育5 min, 使核酸蛋白完全降解, 加入0.2 m L氯仿, 颠倒混匀 (轻轻) , 置于15~30℃孵育2~15 min。在2~8℃ (4℃) 以11 500 r/min离心15min, 取上层水相于一新Eppendorf管中。每1 m LTRIZOL!LS Reagent处理样品加0.2 m L异丙醇沉淀RNA。先在15~30℃孵育2~15 min, 在2~8℃ (4℃) 以11 500 r/min离心10 min。弃上清, 用750 m L/L乙醇 (1g/L DEPC水配制) 洗涤沉淀, 每1 m LTRIZOL!LS Reagent处理样品加至少1 m L750m L/L乙醇, 在2~8℃ (4℃) 以7 400 r/min离心5 min, 混匀样品。弃上清, 室温干燥沉淀5~10 min。用无RNase酶水 (30μL) 溶解沉淀, 加1μL (40 U/μL) RNA酶抑制剂 (Ribonu-clease inhibitor, 冰上操作) , 置-20℃备用。
1.6 目的片段的RT-PCR和RT-n PCR扩增
反转录合成c DNA:在一新Eppendorf管中加入:总RNA提取液8μL, CSFV-E2-p1a B (20 pmol/μL) 1μL, 5×AMV buffer 4μL, d NTP (25 mmol/μL) 6μL, RNasin (20 U/μL) 0.5μL, AMV (10 U/μL) 0.5μL。42℃水浴1.5~2 h, 置-20℃备用。
目的片段扩增 (一扩) :在一新Eppendorf n PCR管中加入:灭菌双蒸水13.25μL, 反转录c DNA液5μL, 10×PCR缓冲液2.5μL, d NTP (25 mmol/μl) 2μL, CSFV-E2-p1a (20pmol/μl) 1μL, CSFV-E2-p1a B (20pmol/μL) 1μL, Taq DNA polymerase (5 U/m L) 0.25μL。反应条件为:95℃变性4 min;然后94℃30 s, 56℃30 s, 72℃45 s, 35个循环;最后在72℃下延伸10 min。
扩增 (二扩) :将上步 (一扩) 的PCR产物作为模板, 用CSFV-E2-p2a和CSFV-E2-p2B做为配对引物完成的PCR (二扩) 。灭菌双蒸水16.25μL, 一扩PCR产物2μL, 10×PCR缓冲液2.5μL, d NTP (25 mmol/μL) 2μL, CSFV-E2-p2a (20 pmol/μL) 1μL, CSFV-E2-p2B (20 pmol/μL) 1μL, Taq DNA polymerase (5 U/m L) 0.25μL。反应条件为:95℃变性4 min;然后94℃30 s, 56℃30 s, 72℃45 s, 35个循环;最后在72℃下延伸10 min。
1.7 琼脂糖凝胶电泳PCR产物鉴定
取上述PCR (一扩产物, 预计305 bp;二扩产物, 预计172 bp) 产物5μL在10g/L TAE琼脂糖凝胶中电泳, 凝胶中含0.5μg/m L溴化乙锭, 电泳缓冲液为1×TAE, 90~100V, 25 min电泳完毕后, 于紫外凝胶成像系统观察。
2 结果与讨论
Marker左侧2、3、4为一扩引物扩增结果, 如图1。Marker右侧2、3、4为二扩引物扩增结果, 如图2。表明用引物p1a/p1a B进行扩增产物电泳后, 在预计的305 bp处有阳性条带;再用p2a/p2B做为配对引物完成的PCR二扩电泳, 在预计的172 bp处有更加明显的阳性条带。说明被检病猪存在CSFV感染。
巢式PCR的原理就是使用2对PCR引物扩增完整的片段, 第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似, 第二对引物称为巢式引物结合在第一次PCR产物内部, 使得第二次PCR扩增片断短于第一次扩增, 巢式PCR的好处在于, 如果第一次扩增产生了错误片断, 则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低, 因此, 巢式PCR的扩增非常特异[9]。Liu等[11]提取CSFV感染组织中总RNA进行RT-PCR反应, 扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测表明, 其灵敏性可检测到104TCID50的病毒。Sand-Vik等[12]和Goldrick等[13]分别利用巢式PCR对CSFV进行检测, 结果证实扩增灵敏性较普通RT-PCR可提高1 000倍。
巢式PCR 篇4
1 材料与方法
1. 1 样品采集
于2013 年10 月份—2014 年10 月份期间,采集洛阳地区6 个奶牛养殖小区28 头新鲜流产胎牛组织及对应母体的新鲜抗凝血液和新鲜乳样。取胎牛脑、心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏,- 20 ℃ 保存,备用; 血样和乳样迅速送至实验室进行前处理和DNA提取。28 例流产病例中有25 例为妊娠5 ~ 7 个月流产,其余3 例妊娠时间分别是128,135,140 d; 流产母牛均为二胎以上,且均未见到其他明显的临床症状。
1. 2 样品基因组DNA提取
应用组织/血液/细胞DNA提取试剂盒( 北京庄盟国际生物基因科技有限公司产品) 提取样品基因组DNA。不同类型样品在提取基因组DNA前采用不同方法处理。对于胎牛脑、心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏等胎牛组织,先用玻璃研磨器分别研磨; 对于新鲜血液,先用红细胞裂解液充分裂解红细胞; 对于新鲜乳样,取10 m L置15 m L离心管中,4 000 r/min离心10 min,收集沉淀。最后再按照组织/血液/细胞DNA提取试剂盒的操作说明书提取对应样品基因组DNA。
1. 3 巢式PCR检测
参照参考文献[2]中的方法,由生工生物工程( 上海) 股份有限公司合成引物,外引物的序列为Np6 5' - CTCGCAGTCAACCTACGTCTTCT - 3',Np215' - CCCAGTGCGTCCAATCCTGTAAC - 3'; 内引物的序列为Np9 5' - GTTGCTCTGCTGACGTGTCGTTG -3',Np10 5' - CTCAACACAGAACACTGAACTCTC G - 3'。
PCR扩增体系( 总体积为25 μL) : 2 × Easy Taq PCR Super Mix 12. 5 μL,上、下游引物( 20 pmol / μL)各0. 5 μL,模板2 μL,加水补足25 μL。内引物扩增时,以0. 5 μL外引物扩增产物为模板。
巢式PCR扩增新孢子虫Nc5 基因的内、外引物扩增条件相同,具体如下: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s,63 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30 个循环; 72 ℃ 再延伸10 min。扩增时以新孢子虫标准株Nc - 1 的基因组DNA和双蒸去离子水分别作为阳性对照和阴性对照。
用1% 琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物,随机选取部分阳性产物送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序结果在NCBI上用BLAST工具进行相似性搜索,以确定巢式PCR的扩增结果。
2 结果与分析
2. 1 巢式PCR检测
巢式PCR内引物扩增的基因片段大小均为225 bp,与预期结果相符,结果见图1 ~ 3。
M.DL-2 000 Marker;1~8.脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及阳性对照和阴性对照。
M.DL-2 000 Marker;1~8.6份血样及阳性对照、阴性对照。
M.DL-2 000 Marker;1~8.6份乳样及阳性对照、阴性对照。
随机选取3 个阳性产物测序,BLAST比对结果显示,测得的3 株新孢子虫Nc5 基因序列之间有4 个碱基存在差异,相似性为99 % 。与Gen Bank中北京株新孢子虫( 登录号为JN106449、JN106453、JN106452) 和国外报道的新孢子虫序列( 登录号为EU073600、AY911515、AY665722 ) 的相似性为98 % ~ 99 % 。说明试验所扩增的阳性片段为新孢子虫Nc5 基因片段。
2. 2 所有样品的检测结果
在28 例流产胎牛组织中,通过巢式PCR检测出新孢子虫Nc5 基因片段阳性的16 例,阳性率为57. 14 % ; 对应的母牛血液样品中检出4 例,阳性率为14. 29 % ; 乳样中检出2 例,阳性率为7. 14 % 。流产胎牛组织中检测阴性者未见到对应母牛血样和乳样为阳性。经统计学分析,流产胎牛组织阳性率显著高于对应母牛血液和乳样的检出率( P < 0. 05) ,而后两者差异不显著( P > 0. 05) 。在流产胎牛组织中,脑与心脏检出率均明显高于肾脏、肺脏、脾脏和肝脏( P < 0. 05) ,结果见表1。
注: + 表示为阳性; - 表示为阴性; 22 ~ 24 号母牛的流产时间分别为妊娠128,135,140 d,其余为5 — 7 个月。
3 讨论
本次试验通过对洛阳地区不同奶牛养殖小区流产胎牛及其母牛血样、乳样进行新孢子虫巢式PCR检测,结果阳性率为57. 14 % ,这与L. Yao等[2]2009年在北京、天津等地区的检出结果接近,但明显高于彭武丽等[3]2013 年报道的新疆某地阳性率。不同地区阳性率的差异可能与区域内感染程度和管理水平有关。2011 年,石冬梅等[4]报道了河南省奶牛新孢子虫病血清流行病学的调查结果,豫西地区奶牛新孢子虫血清抗体阳性率达26. 56 % ,明显高于豫东( 12. 00 % ) 、豫北( 17. 33 % ) 、豫南( 8 % ) 及郑州地区( 15. 56 % ) ,结合本次检测结果,说明洛阳地区奶牛新孢子虫感染相当严重。
本次所检测的样品均来自洛阳地区的奶牛养殖小区,每个小区内有多家养殖户,这些养殖户除共用一个通道进出共用的挤奶房外,引种、饲养管理、疫病监测及防控等均各自独立。与现代化的大型奶牛养殖场相比,采用这种养殖模式会出现严重的疫病防控漏洞,如无法监管带虫牛的随意引入、胎盘及流产胎牛等病料的随意处理和防疫措施不统一等问题。本次所检测的奶牛小区均有4 ~ 8 条犬,且大多数没有圈养,可自由进入牛舍、活动场和饲草存放区,其粪便中的卵囊会污染饲草。而在实际生产过程中,大多数畜主会将胎盘和流产的胎牛直接喂犬,从而使新孢子虫由犬向奶牛水平传播,进而造成病原由母牛经胎盘向胎牛的垂直传播[1]。
根据J. P. Dubey等[5]提出的奶牛感染新孢子虫的风险因素,如牛场内犬的存在、饲草饮水污染和缺乏管理等,可以推断新孢子虫是造成洛阳地区奶牛流产的重要病原。鉴于此,洛阳地区奶牛养殖小区应加强此病的预防控制工作,采用包括血清学和PCR等在内的不同监测技术[2,6]检出并淘汰阳性牛,禁止阳性牛入场; 小区内禁止养犬或禁止将流产胎牛、胎盘喂犬; 杜绝犬进入饲养区; 奶牛场应避免使用犬粪便污染的饲料和饮水。
参考文献
[1]刘群.新孢子虫病[M].北京:中国农业大学出版社,2013.
[2]YAO L,YANG N,LIU Q,et al.Detection of Neospora caninum in aborted bovine fetusesand dam blood samples by nested PCR and ELISA and seroprevalence in Beijing and Tianjin,China[J].Parasitology,2009,136(11):1251-1256.
[3]彭武丽,邓明俊,季新成,等.牛新孢子虫病和弓形虫病双重PCR检测方法的建立与应用[J].动物医学进展,2013,34(6):58-62.
[4]石冬梅,陈益,皇甫和平,等.河南省奶牛犬新孢子虫病流行病学调查[J].中国兽医杂志,2011,47(4):48-50.
[5]DUBEY J P,SCHARES G,ORTEGA-MORA L M.Epidemiology and Control of Neosporosis and Neospora caninum[J].Clin Microbiol Rev,2007,20(2):323-367.
巢式PCR 篇5
1 材料和方法
1. 1 对象
HIV感染者为2008-12 ~ 2010-12 间到昆明市第三人民医院感染一科就诊的245 例患者; 年龄大于18岁, 男女不限。HIV血清阳性均经云南省或地州市疾病控制中心确诊; 对照人群为例行体检的30 例HIV阴性健康者。高效抗逆转录病毒治疗 ( HAART) 使用者 ( n =100) 界定为使用时间大于3 个月。
1. 2唾液CMV、HHV-6、HHV-7 和HHV-8 DNA的PCR检测
收集受试者上午的非刺激性唾液3 毫升, 并使用AXYGEN公司的体液DNA提取试剂盒提取DNA。CMV、HHV-6、HHV-7 和HHV-8 DNA巢氏PCR的内外侧引物设计及反应条件均按参考文献[2]的方法进行。PCR扩增产物在2% 琼脂糖凝胶中进行电泳, 判断PCR扩增产物片段的大小和扩增特异性。
1. 3 统计分析
使用SPSS 18. 0 进行统计, 主要用到卡方检验等统计方法。
2 结果
HIV感染者中唾液标本CMV、HHV-6、HHV-7 和HHV-8 PCR检测结果显示本组病例92. 3% 检出了至少一种病毒DNA ( 227/245) , 健康对照组唾液中疱疹病毒DNA的检出率为80. 0% ( 18/30) 。HIV感染者的唾液中最常检出的疱疹病毒是HHV-6 ( 204, 83. 3% ) , 其次为HHV-7 ( 172, 70. 2% ) 、CMV ( 85, 34. 7% ) 和HHV-8 ( 14. 3% ) 。在健康对照组唾液中, 最常检出的是HHV-7 ( 70. 0%) , 其次为HHV-6 ( 56. 7%) 、CMV ( 10. 0%) 和HHV-8 ( 0%) 。HIV感染者组和健康人群对照组相比, 总体病毒DNA检出率有差异 ( χ3= 20. 328, P < 0. 01) 。
使用HAART的患者 ( n = 100) 唾液中的CMV、HHV-6、HHV-7 和HHV-8 溢出率并未减少, HAART组患者与非HAART组患者 ( n =145) 唾液4 种病毒的总体检出率无统计学差异 ( χ2= 0. 16, P = 0. 984 0 ) 。将使用HAART和未使用HAART的患者组与健康对照4 种病毒的整体检出率进行组间比较, P均小于0. 05, 表明HAART组、非HAART组与健康人群整体4种观察病毒的检出率差异有统计学意义。
3 讨论
本研究对云南地区HIV感染者唾液CMV、HHV-6、HHV-7 和HHV-8 DNA存在情况的检测结果表明, HIV患者更容易感染疱疹病毒, 并且HHV-8 在健康人群中并未检出, HAART与非HAART组HHVs检出率没有显著差异, 与国外一些文献报道基本一致［3 －4］。至今国内关于HIV感染者口腔HHV流行情况的研究仅一篇关于HHV-8 的文献［5］。因此, 本研究丰富了内地在该领域的研究内容。
本研究的不足之处在于并未具体指明那几种病毒组合更容易发生混合感染, 也没有对HAART使用过程中口腔CMV、HHV6、HHV7 和HHV8 的动态变化进行观察。因此, 今后将采用前瞻性的研究设计, 对HAART治疗过程中口腔各型疱疹病毒溢出率及病毒DNA载量与相关疾病的关系进行动态观察。收集患者的全身情况数据, 分析全身因素对口腔疱疹病毒溢出的影响。
参考文献
[1]赵利芬, 祁燕伟, 段开文.HIV相关口腔疱疹病毒感染的研究情况[J].临床口腔医学杂志, 2009, 25 (4) :249-250.
[2]陈雷.云南地区HIV感染者唾液CMV、HHV-6、HHV-7和HHV-8检测[D].昆明:昆明医学院, 2011.
[3]Carvalho KS, Silvestre Ede A, Maciel Sda S, et al.PCR detection of multiple human herpesvirus DNA in saliva from HIV-infected individuals in Teresina, State of Piauí, Brazil[J].Rev Soc Bras Med Trop, 2010, 43 (6) :620-623.
[4]Grande SR, Imbronito AV, Okuda OS, et al.Herpes viruses in periodontal compromised sites:Comparison between HIV-positive and-negative patients[J].J Clin Periodontol, 2008, 35 (10) :838-845.