免疫测定（精选九篇）
免疫测定 篇1
关键词：雪卡毒素,免疫测定
近年来, 由食用深海鱼引发的雪卡毒素中毒事件日益增多, 并引起人们的关注[1,2,3,4]。因此雪卡毒素中毒成为了目前世界上报道最多的海洋生物毒素性疾病, 对雪卡毒素的研究也成为了近年来国际上海洋生物毒素研究的一大热点[2,3,4]。雪卡毒素是热带、亚热带海域的珊瑚礁鱼类体内含有的一种海洋毒素, 属神经毒。当人们食用含有雪卡毒素的老虎斑、老鼠斑、苏眉鱼、红斑、虎鳗等热带、亚热带珊瑚礁深海鱼, 就会引发胃肠、神经、心血管等方面的中毒症状[5]。雪卡毒素属于神经毒素, 它无色、耐热, 极易被氧化, 能溶于极性有机溶剂, 但不能溶于苯和水, 也不易被胃酸破坏, 是一类脂溶性的有机化合物。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂
离心机 (上海安亭, TGL-16gR) 、移液器 (Jencons Sealpette) 、超纯水净化仪 (LABCONCO) 、分析天平 (OHAUS) 等。试剂盒:Oceanit Test Systerns, Inc.公司提供。雪卡毒素标准品:振翔公司。
1.2 供试材料
老虎斑、老鼠斑、苏眉鱼、红斑、虎鳗鱼。
1.3 测定方法
1.3.1 清洗检测鱼组织样品, 用镊子移取大米粒大小的鱼肉样品用于检测。样品不能带血, 一定要避免样品与采样人皮肤接触。把采集好的样品放入含有清澈液体的管形瓶中。 注意操作时不要让手上的油污染检测样品。
1.3.2 取出一测试条, 然后把测试条插入 (用纸覆盖端朝下) 含有清澈液体和鱼样的管形瓶中, 放置20min。
1.3.3 取出测试条, 让其在空气中充分干燥, 手指切勿接触试剂条白纸覆盖的末端。
1.3.4 轻轻晃动装有蓝色液体的瓶子使里面的溶液混匀。打开瓶盖把上一步干燥的测试条 (纸覆盖端朝下) 插入装有蓝色液体的瓶子中, 放置10min。
1.3.5 取出测试条在自来水下面轻轻地冲洗。
1.3.6 将测试条末端紧靠试剂盒右侧白色区域, 测试条上面有任何颜色的改变都意味着被检测的鱼含有雪卡毒素而不能食用。
每次实验必须同时进行阴性对照实验, 阴性对照实验不添加鱼肉样本。阴性对照实验的结果是测试条末端没有颜色出现。
1.4 质控试验
一个阳性的质控试验表明试剂条仍然对毒素敏感。从一个红盖的小瓶中拿出质控试剂条。从第五步开始做, 轻轻摇动含蓝色液体的小瓶, 放入质控试剂条, 等10min。用自来水冲洗, 试剂条上的很淡的蓝色表明 (0.8～1.0ppb) , 试剂条仍然敏感。
一个阴性试验进一步验证。从第三步开始做 (但不要放入鱼样品) , 这个试验应该没有任何颜色变化。
如果这两个实验有一个没有达标, 并且试剂盒已在保质期外, 表明试剂盒已经不能使用了。
1.5 添加回收试验
取鱼肉组织, 在鱼肉组织中添加雪卡毒素标准品, 使得组织中雪卡毒素浓度为 0.1～100.0μg/kg, 记录检测结果。
2 结果
2.1 检测限
进行10种不同浓度水平的添加, 分别是0.1 μg/kg、0.2 μg/kg、0.5 μg/kg、0.8 μg/kg、1.0 μg/kg、1.2 μg/kg、1.5 μg/kg、2.0 μg/kg、5.0 μg/kg、10.0 μg/kg, 每种浓度做两个平行实验, 实验结果见表1。根据测试试纸条的显色情况, 最终确定检测低限是1.0μg/kg。
2.2 实验室内验证结果
选取老虎斑、老鼠斑、苏眉鱼、红斑、虎鳗5种珊瑚礁深海鱼, 分别进行阴性样品和阳性样品的验证实验。阳性样品按3种浓度, 1 μg/kg、10 μg/kg、100μg/kg进行添加, 每种浓度做10个平行实验。共进行150次检测, 实验结果见表2, 检测为阴性次数是3次, 阳性次数是147次, 假阴性率为2%。阴性样品验证实验, 共进行50次检测, 实验结果见表3, 检测为阳性次数是1次, 阴性次数是49次, 假阳性率为2%。
注“-”表示阴性, “+”表示阳性
注“-”表示阴性, “+”表示阳性
2.3 实验室间验证结果
在检验检疫系统、质监系统、疾控系统、高校测试中心、企业等5个实验室进行验证试验。每个实验室随机抽取两种鱼, 每种鱼取两个样本, 阴性、阳性样本各一个, 阳性样本均添加10μg/kg雪卡毒素标准品, 结果见表4。实验室间实验验证试验表明, 浓度在10μg/kg时, 假阴性率为0。
注“-”表示阴性, “+”表示阳性
3 小结
本研究采用免疫膜检测试剂盒建立了鱼肉组织中雪卡毒素的测定方法, 方法的检测限为 1.0 μg/kg, 实验室内及实验室间验证结果表明方法的假阳性和假阴性率低, 具有准确、灵敏、便利、快速等优点。
参考文献
[1]吕颂辉, 李英.我国西加鱼毒流行现状研究进展[J].中国公共卫生杂志, 2006, 22 (2) :226-227.
[2]Hsieh CH, Hwang KL, Lee MM, et al.Species identification of cigua-toxin-carrying grouper implicated in food poisoning[J].J Food Pro-tection, 2009, 72:2375-2379.
[3]Daransa AH, Norte M, Fernandez JJ.Toxic marine microalage[J].Toxicon, 2001, 39:1101-1132.
[4]Lehame L, Lewis RJ.Cigutera:resent advances but the risk remains[J].Int.J.of Food Microbiol, 2000, 61:91-125.
免疫测定 篇2
免疫亲和色谱-高效液相色谱法测定土壤中氯磺隆残留
采用碳酰二咪唑(CDI)将Sepharose CL-4B活化并与纯化的抗氯磺隆抗体共价偶联,合成免疫亲和吸附剂并制备对氯磺隆具有特异性亲和力的免疫亲合色谱(IAC)柱.对IAC条件进行优化,选择0.02 mol・L-1 pH7.2磷酸盐缓冲液作吸附与平衡介质,80%(体积分数)甲醇水作洗脱剂.结果表明,在实验条件下,IAC柱对氯磺隆的.动态柱容量达2.6 μg・mL-1床体积.当标样溶液中氯磺隆含量为2.0 ng・mL-1时,经IAC柱富集后浓度提高近250倍.土壤中添加氯磺隆0.10 μg・g-1、5.0 ng・g-1,提取液以IAC柱分离富集,洗脱液采用高效液相色谱(HPLC)法测定,5次重复实验的平均回收率分别为92.9%、94.8%,相对标准偏差分别为8.46%、8.41%.成功建立了氯磺隆IAC-HPLC分析技术并用于土壤中痕量残留氯磺隆的测定.
作 者：冯大和 邵秀金 韦林洪 刘曙照 FENG Da-he SHAO Xu-jin WEI Lin-hong LIU Shu-zhao 作者单位：扬州大学环境科学与工程学院,江苏,扬州,225009刊 名：农业环境科学学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF AGRO-ENVIRONMENT SCIENCE年，卷(期)：25(6)分类号：X592关键词：免疫亲合色谱(IAC) 高效液相色谱(HPLC) 土壤 氯磺隆
免疫测定 篇3
关键词：大便潜血 邻联甲苯胺法 免疫胶体金
The Comparison Between the Chemical Method and Immunogold Method in Detecting Sedoccult Blood
Duan Xiangyuan
Abstract:Objective:To explore the comparability between the chemical method and immunogold method in detecting sed occult blood．Methods:To detect the sed occult blood of 300 specimens with both O-tolidine method and immunogold method．then analyse the results．Results:2 kinds of methods in line with the consistency of the results of the measured rate of greater than 90%.Conclusion:Food and drink impact the results of chemical method very much．so chemical method is lesssensitive and specific than immunogold method．But immunogold method also has false positivereaction，therefore we suggest detecting sed occult blood with the both two methods.
Keywords：Sed occult blood O-tolidine method Immunogold method
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1008-1879(2012)03-0026-01
大便潜血 (fecesoccultblood,FOB)实验是临床诊断消化道出血的一项重要项目，也是普查筛选消化道肿瘤的有效手段。常用的化学法主要有联苯胺法、邻联甲苯胺法、无色孔雀绿法、愈创木脂法、匹拉米洞法等,以邻联甲苯胺法较为实用。随着近年来对粪便隐血检测试剂的深入研究,免疫法测定潜血，方便快捷并取得了较满意的结果，已逐渐取代邻联甲苯胺法。但实际工作中，某些特殊标本用胶体金试纸法检测结果与临床不符。为进一步了解粪便隐血免疫法与化学法在检测灵敏度特异性方面的特点，我们用化学法（邻联甲苯胺法）与免疫法（胶体金试纸法）测定粪便隐血结果作如下比较，探讨二者在临床上的应用价值。
1 材料与方法
1.1 标本。测定本院300份无重复门诊及住院患者新鲜大便，均为成年人，女89例，非月经期，男211例(均排除痔肛裂出血)。患者随机分为A、B二组：A组（65例）严格按照医嘱进行饮食和药物控制3日。B组（235例）未按照医嘱进行饮食和药物控制。
1．2 试剂。艾康生物技术公司提供的便潜血胶体金检测试纸条（批号20070124）；邻联甲苯胺由上海远航试剂厂生产，冰乙酸及无水乙醇由开封化工厂生产，均为AR级。10g/L邻联甲苯胺冰乙酸试剂、3%过氧化氢自配。
1．3 方法。邻联甲苯胺法按文献操作［1］，便隐血胶体金试纸法严格按说明书操作。对收集的每份标本分别做邻联甲苯胺法和便隐血胶体金试纸检测，记录同一份二种不同方法的测定结果。邻联甲苯胺法阳性而胶体金试纸检测阴性的标本，按一定比例稀释后以胶体金法再测。
2 结果
2.1 化学法（邻联甲苯胺法）和免疫法（胶体金法）对二组检测结果的比较。见表1。
2.2 A组排除饮食及药物的影响，邻联甲苯胺法和胶体金法对A组检测结果基本一致。
2.3 B组受饮食及药物等干扰因素的影响，邻联甲苯胺法阳性率明显高于胶体金法。B组中80例化学法阳性者，胶体金法均为阴性，经咨询病史和饮食情况，除5例服用铁剂外，其他人近日曾食用动物血、肉、肝脏、及富含叶绿素食物等。其中胶体金法为阴性的2例柏油样便标本经1∶50～1∶100稀释后以胶体金法重测皆为阳性。
3 讨论
粪便隐血实验是消化道疾病辅助诊断试验。邻联甲苯胺法利用血红蛋白中的亚铁血红素具过氧化物酶活性，催化过氧化氢放出新生态氧，把受体邻联甲苯胺氧化成联甲偶氮苯而显蓝绿色。显色的深浅反映了Hb的多少，即出血量的大小。该法可检出1～5mg/L的Hb，消化道5～10ml出血即为阳性。但缺乏特异性和准确性，易出现假阳性反应，任何有类似氧化物酶活性的物质都可影响此实验，外源性动物食品如含有Hb、肌红蛋白，其含铁血红素的作用可使试验阳性；大量生食富含葉绿素蔬菜，其中含有活性的植物过氧化物酶也可催化H2O2分解出现阳性反应。邻联甲苯胺法灵敏性低于胶体金法［2］，故极少量的出血会造成邻联甲苯胺法(阴性)胶体金法(阳性)的结果。此时粪便外观通常无明显异常，但如果血红蛋白在消化道停留时间过长，或受细菌分解等因素而降解，其与胶体金试纸上包被的抗体的相应抗原受到破坏时就会出现假阴性，若此时出血量在邻联甲苯胺法检测限上就会出现邻联甲苯胺法阳性而胶体金法阴性的结果。另外当出血量大于胶体金法检测范围，随着血红蛋白含量增加，抗原抗体复合物反而减少，产生后带现象，免疫胶体金法出现假阴性，上述两种情况大便外观通常会有明显改变，只需将粪便溶液调配成一定浓度后检测，免疫胶体金法可获阳性结果。由于胶体金单克隆抗体免疫法是利用金标Hb-抗体与Hb结合后，向上扩散分别与测试区的抗-Hb抗体及对照区的Hb结合，此时胶体金的颗粒聚集呈颜色反应，它只特异地针对人-Hb抗原表位，基本排除了饮食及药物因素的干扰；且具有很好的灵敏度，一般Hb为0.2mg/L就可得到阳性结果［3-4］。被世界卫生组织（WHO）和世界胃肠镜检查协会推荐作为粪便隐血实验的一种较为确认的方法［5］，且对操作者无损害，但其成本较化学法高。
鉴于两种方法各有优缺点，有条件的实验室应同时开展两种方法：二者皆为阳性判断为真阳性；化学法阳性而免疫胶体金法阴性者，若外观无改变者建议禁肉食、富含叶绿素食物、停用某些已知有影响的药物2 d～3 d后复查，若外观有所改变者稀释重测免疫胶体金法；若化学法阴性而免疫胶体金法阳性者建议连续复查2次及做进一步检查。
参考文献
［1］ 叶应妩，王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程［M］.第3版.南京:东南大学出版社,2006.310-311
［2］ 王建洲，陆希明．三种便潜血试验测定方法的比较［J］．哈尔滨医药,2005,25(2)：1314
［3］ 朱立华.实验诊断学［M］.北京：北京医科大学出版社，2002，264-265
［4］ 高茂馗，束国防.免疫法与化学法测定隐血的比较［J］.临床检验杂志，2004，22（1）：69
增强免疫比浊法试剂测定血清铁蛋白 篇4
1.1 原理
样品中铁蛋白与试剂中相应的抗体在溶液中相遇, 立即形成抗原—抗体复合物, 并形成一定浊度, 在一定量抗体存在时浊度的高低与抗原的含量成正比。通过与同样处理的校准液比较, 计算未知样品中的铁蛋白含量。
1.2 试剂
铁蛋白检测试剂、标准品、质控品由浙江伊利康生物技术有限公司提供。
1.3 仪器
采用FH400全自动生化分析仪。
1.4 方法
将80μg/L校准品按倍比稀释为40, 20, 10, 5及0μg/L作6点定标。基本测定参数:主波长600nm, 副波长800 nm, 试剂1 (R1) 240μL, 试剂2 (R2) 60μL。加入R1试剂5min后加入R2试剂, 反应时间5min。
2 实验结果
2.1 精密度评价[1]
按NCCLS评价方案, 取低、中、高3个不同浓度的血清样本, 铁蛋白浓度分别为55μg/L 、174μg/L、435μg/L , 连续测定20次, 再每天测1次, 共测20d, 结果见表1。
2.2 线性范围评价[2]
按NCCLS的评价方案, 用铁蛋白浓度为600μg/L和40μg/L的高低值样本2份, 等量混合产生中间值320μg/L, 中间值再与高、低值等量混合, 产生460μg/L和180μg/L的5个梯度值铁蛋白样本, 在仪器上以低值到高值和高值到低值分别测定, 求得两次平均值, 以X作为理论值, Y作为测定值进行回归分析, 其方程Y=0.9857X+1.1714, R2=0.9996。表明铁蛋白浓度在180μg/L～600μg/L范围内, 线性良好。
2.3 比对实验
取铁蛋白浓度从30μg/L～500μg/L的新鲜血清标本50份, 分别用本试剂与进口试剂同时测定铁蛋白浓度, 所得数据均按NCCLS文件统计, 经t检验得P>0.05, R2 =0.9996, 表明本试剂与进口试剂高度相关。
2.4 回收实验
取低值和高值新鲜血清各1份 (60 μg/L、530 μg/L) , 以不同比例混合, 结果显示本法测定血清铁蛋白的平均回收率为99% 。见表2。
2.5 干扰试验
取4份高值铁蛋白混合血清, 分别加入干扰物类风湿因子、胆红素、甘油三酯、Hb, 使其终浓度如表3。由表3可见RF≤ 1200IU/L、BIL≤ 420μmol/L、TG≤10.0mmol/L、Hb≤4.0 g/L时, 对本法无干扰。
3 讨论
铁蛋白是体内铁储备蛋白, 肝脏是铁的主要贮存器官, 在合成铁蛋白、释放铁蛋白、维持血液中铁蛋白浓度方面起着重要作用。因此, 肝脏损害可直接影响铁蛋白的贮存和代谢, 导致血清铁蛋白含量的改变[3,4]。国外学者Yinon等对证实为不同性质的良恶性疾病引起的胸、腹水患者进行了铁蛋白测定, 并发现良性漏出液中铁蛋白无1例异常改变, 而恶性渗出液铁蛋白超出正常值高达94.4%, 从而表明肿瘤细胞可能是铁蛋白的一个来源, 因此测定铁蛋白也有利于良恶性积液的诊断和鉴别诊断。本文对浙江伊利康生物技术有限公司的胶乳增强免疫比浊法试剂测定血清铁蛋白的方法进行性能评价, 其结果显示精密度CV<4%、回收率为99%、线性范围达600μg/L、类风湿因子≤1200IU/L、三酰甘油≤10mmol/L、Hb≤4g/L、胆红素≤420μmol/L时对结果无显著性干扰 (P>0.05) , 该方法使用方便、反应快速、结果准确, 抗干扰能力强, 适用于全自动生化分析, 能满足临床检测要求。
摘要：使用增强免疫比浊法测定血清铁蛋白, 设置比对、回收、干扰试验对该方法进行性能评价, 结果显示其使用方便、反应快速, 抗干扰能力强, 适用于全自动生化分析, 满足临床检测要求。
关键词：增强免疫比浊法,含量测定,血清铁蛋白
参考文献
[1]杨昌国.精密度评价和方法比较中NCCLS评价方案的应用[J].临床检验杂志, 1999, 17 (1) :47.
[2]杨昌国.线性评价和干扰实验中NCCLS评价方案的应用[J].临床检验杂志, 1999, 17 (3) :184.
[3]潘泊荣.铁蛋白与肝脏疾病[J].临床肝胆病杂志, 1985, 1 (4) :210.
紫外分光光度法测定免疫球蛋白A 篇5
1 实验方法
在10mL比色管中分别加入0.4mLpH值为6.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液0.30mL经过适当比例稀释的羊抗人IgA溶液, 0.60mL的PEG4000, 一定量的IgA溶液用二次纯水定容至3mL, 摇匀, 静置30分钟。用紫外可见分光光度计扫描得到体系的吸收光谱, 测定283nm波长处的吸光强度A;不加IgA作空白, 测其吸光强度Ib;计算ΔA=A-Ab。
2 结果与讨论
根据免疫反应原理, IgA抗原与IgA抗体发生特异性结合形成抗原-抗体复合物微粒。PEG为一种无电荷的线性分子的多糖, 能够解除抗原抗体周围的电子云和水化层, 促进两者靠近并结合成大复合物, 加快反应速度。IgA在一定浓度范围内随其浓度的增加, 在283nm处的吸收强度呈线性增强, 据此可建立IgA的免疫吸收光谱分析法。
2.1 吸收光谱
IgA和羊抗人IgA血清在283nm处都有1个吸收峰, 随着IgA浓度增大该吸收峰强度呈线性大大增强。本实验未采用试剂厂家推荐波长340nm, 因为在340nm处吸光度值变化幅度小, 为了增加灵敏度, 本实验采用283nm为测定波长。
2.2 p H值、缓冲溶液用量的选择
分别测定了pH值为5.8~8.0范围内体系在Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液中ΔA283nm的波动变化。结果表明, 当pH值为6.2时, ΔA283nm达到最大值, 增加灵敏度的效果达到最好, 所以本文选择了p H值为6.2的Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液;又考察了缓冲溶液的用量从0~0.8mL对ΔA28 3n m的影响。结果表明, 当缓冲溶液的用量在0.40~0.8mL时ΔA变化不大, 免疫复合物结合较稳定, 故选用0.40mL缓冲液。
2.3 聚乙二醇的选择
聚乙二醇简称PEG, 因分子量不同, 对体系的影响不同。分别考察了PEG-4000、PEG-6000、PEG-10000用量0~1mL对体系ΔA283nm的影响。随着PEG用量的增加, ΔA显著增加, 但Ab也有明显增加, 当PEG用量为0.8mL时, 空白值已上升的相当大, 严重影响了灵敏度。要提高灵敏度就必须得降低空白值, 所以本实验选取用0.6mL的PEG4000, 浓度为60mg·mL-1。
2.4 羊抗人IgA用量的选择
分别试验了羊抗人IgA用量为0-0.8mL时对ΔA283nm的影响变化情况。当羊抗人IgA用量为0.30mL时, 体系的ΔA达到最大值。随着羊抗人IgA用量的继续增加, ΔA呈降低趋势, 故本文选取羊抗人IgA血清的最佳用量为0.30mL。
2.5 温度及反应时间的影响
考察了不同温度下对体系的影响。结果表明, 室温下ΔA较大, 条件容易简单, 容易控制, 且灵敏度也较高。同时考察了反应时间的影响, 室温条件下30分钟后, 反应已完全且实验结果比较稳定, 在30分钟内基本无变化。故本文选择在室温条件下进行, 反应时间为30分钟。
2.6 线性关系
在选定的实验条件下, 分别测定不同浓度CIgA (μg·mL-1) 的吸光强度ΔA283nm, 并绘制工作曲线, 发现浓度在0.2-4.00μg·mL-1范围内与ΔA283nm之间存在良好的线性关系;回归方程为:ΔA283nm=0.1869CIgA+0.0204, 相关系数为0.998。
2.7 样品的测定
取正常人血清5份, 用移样器准确移取100μL用水稀释至5mL;再移取100μL按实验方法测定, 实验结果如表1, 测定结果与人体正常血清中IgA的含量基本一致[3]。 (如表1)
样品由商丘市第一人民医院提供。
摘要：本文建立了用紫外分光光度计测定免疫球蛋白A的方法, 分别考察了五个条件下在283nm处对测定IgA的影响。在选定的实验条件下, IgA浓度在0.20-4.00μg.mL-1范围内均与283nm处的吸光度呈线性关系, 该法已用于人血清中IgA的测定, 结果满意。
关键词：免疫球蛋白A (IgA) ,羊抗人免疫球蛋白A,吸收光谱
参考文献
[1]姚春艳, 俯伟灵.人免疫球蛋白功能及临床诊断方法[J].中国新医药, 2004, 3 (3) :55.中国煤炭工业医学杂志, 2004, 7 (12) :1209-1210.
[2]王娜.免疫球蛋白A等的免疫共振散射光谱分析[D].广西师范大学, 2007:29-39.
免疫测定 篇6
1 资料与方法
1.1 一般资料:
选取2011年5月至2014年5月在我院采用酶联免疫吸附测定患者200例, 其中男117例, 女83例, 年龄16~76岁, 平均年龄 (55.37±2.37) 岁。将200例患者随机分为两组, 手工组100例患者, 其中男58例, 女42例, 年龄16~76岁, 平均年龄 (55.50±2.00) 岁, 自动组患者100例, 其中男59例, 女41例, 年龄18~75岁, 平均年龄 (55.00±2.50) 岁, 对比两组患者的性别比例和平均年龄, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。患者酶联免疫吸附测定方法为患者自愿选取。
1.2 检测方法:
手工组100例患者, 首先对患者的情况进行准确的掌握, 对患者的病史进行详细的询问, 后进行静脉血采集, 将血液标本置于专用试管内, 后依据酶联免疫吸附测定方法和试剂盒说明, 进行手工酶联免疫吸附测定, 同时对检测结果进行分析[2]。
自动组患者100例, 患者成功采集标本后, 进行处理, 后将标本置于自动分析仪上进行全自动酶联免疫吸附测定, 对使用过后的血液标本丢弃子专用的垃圾筒内。
1.3 统计方法:
统计学分析选用SPSS11.0软件, 计数资料采用χ2检验表示, 采用t检验, 差异有统计学意义为P<0.05。
2 结果
2.1 对比两组患者的检测情况:
全自动组患者准确诊断比例、操作时间、重复性、污染比例对比手工组患者, 无显著性差异, 无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。
2.2 酶联免疫吸附测定常见问题:
常见的问题为凝血、交叉污染、检测结果误差、环境问题, 对其实施针对性的应对策略。主要措施为, 定期进行科内人员的技术培训, 提高检验人员操作的熟练程度, 对流程熟练掌握, 并且能够准确的进行;提高标本的管理, 降低操作过程中污染的发生, 对检验机器和环境严格消毒和定期进行清理, 减少其他标本的残留和污染, 并且实施有效的管理措施, 降低误差。对检验处存在传染性疾病的标本进行针对的处理和销毁, 防治交叉污染发生, 导致检验结果发生误差[3]。
3 讨论
ELISA是一种利用免疫学原理检测抗原或抗体的技术, 可用于定量测定, 测定的对象可以是抗体或抗原。ELISA是将酶与抗原或者抗体相结合形成酶标志物, 或者将酶与酶抗体相结合形成免疫复合物, 这种酶标志物或免疫复合物检测与一般上午临床化学或临床血液学检验不同, 它具有高度的特异性和敏感性, 且操作简单, 避免了因标本和试剂分配时间或分配量的不一致造成的检测误差。随着医院免疫检测仪器的不断更新和发展, 目前医院的许多检验科免疫室都有半自动酶标仪和全自动酶联免疫仪[4], 由于检测系统的不同, 两种仪器被同时使用, 用于衡量检验科免疫室的检测质量。因此每年都应进行仪器之间的比对。本研究通过比对[5], 同时对两种操作方法的常见问题进行分析。
本文对TECAN FREEDOMEVOLYZER-2200全自动酶联免疫仪的性能进行评价, 结果表明该仪器可满足临床工作需要, 但手工操作方法与全自动酶联免疫分析系统操作方法存在一定的预期偏差, 处于值附近临床意义可疑的称之为灰区的检测结果不易判定时, 需要考虑两种操作方法间的预期, 偏差使同一份标本在不同操作系统的检测, 结果保持一致保证检测结果的准确稳定[6,7]。
本文中对在我院进行酶联免疫吸附测定患者200例分别进行全自动分析和手工分析结果显示, 全自动检查分析患者准确诊断比例、操作时间、重复性、污染比例对比手工检测患者, 无显著性差异, 无统计学意义 (P>0.05) 。常见的问题为凝血、较差污染、检测结果误差、环境问题, 对其实施针对性的应对策略[8]。
综上所述, 对于酶联免疫吸附测定应用全自动生化仪进行酶联免疫吸附测定和手工酶联免疫吸附测定, 准确诊断率和重复性、较差污染的比例无明显的差异性, 其中酶联免疫吸附测定主要存在的常见问题为凝血、较差污染、检测结果误差、环境问题, 针对上述问题进行针对性的处理措施, 可有效的增加临床准确诊断率和酶联免疫吸附测定准确率[9]。
摘要：目的 对酶联免疫吸附测定常见问题分析及对策进行分析。方法 选取2011年5月至2014年5月在我院采用酶联免疫吸附测定患者200例, 随机进行分组, 手工组100例患者, 进行手工酶联免疫吸附测定, 自动组患者100例, 进行全自动酶联免疫吸附测定, 对两组患者在检测中存在的问题进行总结和分析。结果 全自动组患者准确诊断比例、操作时间、重复性、污染比例对比手工组患者, 无显著性差异, 无统计学意义 (P>0.05) 。两组监测方法常见的问题均为凝血、较差污染、检测结果误差、环境问题, 对其实施针对性的应对策略。结论 对于酶联免疫吸附测定, 应用全自动生化仪进行酶联免疫吸附测定和手工酶联免疫吸附测定, 准确诊断率和重复性、较差污染的比例无明显的差异性, 其中酶联免疫吸附测定主要存在的常见的问题均为凝血、较差污染、检测结果误差、环境问题, 无明显的差异, 针对上述问题进行针对性的处理措施, 可有效的增加临床准确诊断率和酶联免疫吸附测定准确率。
关键词：酶联免疫吸附测定,常见问题分析,对策,全自动生化分析,手工分析
参考文献
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免疫测定 篇7
目前, 国内外关于万古霉素检测的研究主要集中于医学方面, 检测方法包括微生物法[3]、高效液相色谱法[4,5]和液相色谱-串联质谱法[6,7];关于动物源性食品中万古霉素的残留检测国外未见报道, 国内也较少, 且是与其他多肽类抗生素采用高效液相色谱-串联质谱法 (HPLC-MS/MS) 同时检测[8,9]。试验的目的是建立一种快速、灵敏地检测牛奶中万古霉素残留的胶体金免疫层析法, 为我国抗生素残留的现场监控提供理论依据, 现报道如下。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
万古霉素 (纯度≥99%) 、各种交叉反应药物 (纯度≥99%) 、牛血清白蛋白、卵清蛋白, 购自Sigma公司;氯金酸、柠檬酸三钠, 购自国药集团化学试剂有限公司;分泌万古霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 北京勤邦生物技术有限公司制备、保存。
复溶缓冲液, 由含牛血清白蛋白0.1%～0.3%、吐温-20 0.05%～0.2%及pH值为7.2的0.02 mol/L 磷酸盐缓冲液混合而成。
1.2 仪器与设备
PVC背板, 购自上海金标生物科技有限公司;硝酸纤维素膜、吸收垫、样品垫, 购自普利来基因技术公司;2000SBL电子天平, 购自美国Setra公司;90-2磁力搅拌器, 购自上海振荣科学仪器有限公司;LGJ-50C冻干机, 购自北京四环科学仪器厂有限公司;CT300数控切条机, 购自上海金标生物科技有限公司;Isoflow点膜仪, 购自Biodot公司;752S分光光度计, 购自上海棱光技术有限公司。
1.3 万古霉素半抗原的合成
0.50 g万古霉素、0.40 g琥珀酸酐和2 mL吡啶在10 mL二甲基亚砜中混合, 在80 ℃搅拌反应10 h, 蒸除溶剂, 柱层析后在乙醇-水体系中重结晶得到万古霉素单琥珀酸酰胺, 即为万古霉素半抗原。
1.4 万古霉素半抗原-卵清蛋白耦联物的制备
取15 mg半抗原, 溶解于1 mL N, N-二甲基甲酰胺中, 取碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺各30 mg, 用0.2 mL水充分溶解后加入半抗原溶液中, 室温下搅拌24 h, 即可得到反应液A;称取卵清蛋白50 mg, 使之充分溶解在3.8 mL、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液中, 将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中, 并于室温搅拌24 h;用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液4 ℃透析3 d, 每天换3次透析液, 以除去未反应的小分子物质;分装, 于-20 ℃保存, 备用。
1.5 胶体金的制备
用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01% (质量分数) , 置磁力加热搅拌器上搅拌煮沸, 每100 mL 0.01%氯金酸加入2.5 mL 1%柠檬酸三钠, 继续搅拌加热反应至液体呈红色时停止加热, 冷却至室温后补足失水, 4 ℃保存, 备用。制备好的胶体金通过肉眼观察其外观、颜色, 并采用电镜检测胶体金颗粒大小。
1.6 单克隆抗体-胶体金标记物的制备
在磁力搅拌下, 用0.2 mol/L碳酸钾调胶体金溶液的pH值至7.0, 按1 mL胶体金溶液中加入10 μg的标准向其中加入万古霉素单克隆抗体, 搅拌混匀, 室温静置10 min;加入10%牛血清白蛋白使其在胶体金溶液中的体积分数为1%, 静置10 min;12 000 r/min、4 ℃离心20 min;弃上清液, 沉淀用复溶缓冲液洗涤2次, 用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬, 置4 ℃保存, 备用。
1.7 微孔试剂的制备
向微孔条中加入50 μL万古霉素单克隆抗体-胶体金标记物, 放入冷冻干燥机中, 在-50 ℃条件下预冻3 h, 再真空干燥15 h, 即可取出, 得到冻干有万古霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂, 密封, 保存。
1.8 硝酸纤维素膜的制备
利用磷酸缓冲液将万古霉素半抗原-卵清蛋白耦联物与羊抗、鼠抗抗体分别进行不同倍数稀释, 并制备成试纸条检测, 根据测试结果确定硝酸纤维素膜上检测线 (T) 和质控线 (C) 的使用浓度及喷量。用点膜仪将所选浓度的万古霉素半抗原-卵清蛋白耦联物与羊抗鼠抗抗体喷在硝酸纤维素膜上, 在37 ℃烘箱中干燥2 h, 备用。
1.9 样品吸收垫的制备
将样品吸收垫置于含0.5%牛血清白蛋白 (体积分数) 、pH值为7.2的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡5～10 min, 37 ℃烘干2 h, 备用。
1.10 试纸条的组装
将样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜依次按顺序粘贴在底板上;样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连, 反应膜的末端与吸水垫的始端相连, 样品吸收垫的始端与底板的始端对齐, 吸水垫的末端与底板的末端对齐;在组装好的试纸上粘贴保护膜, 保护膜上印有MAX标记线的一端粘贴在样品吸收垫上。试纸条组装好后切成4 mm宽, 与冻干有万古霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂配合使用。
1.11 检测方法
用微量移液器吸取200 μL待检牛奶样品溶液于微孔中, 缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀, 室温 (20～25 ℃) 孵育5 min后, 将标记好的试纸条插入微孔中 (印有MAX线端朝下) , 使之充分浸入溶液中。再次室温 (20～25 ℃) 孵育5 min后, 液体会沿着试纸条垂直向上依次通过检测线 (T) 和质控线 (C) , 此时如果检测线和质控线上均出现红色条带, 说明样品呈阴性 (-) ;如果质控线上出现红色条带, 检测线上没出现红色条带, 说明样品呈阳性 (+) 。
1.12 评价试验
1) 样本检测限。
在空白牛奶样本中分别添加万古霉素标准品至质量浓度为0, 20, 50, 100 μg/L, 按照1.11所述方法用3批试纸条进行检测, 每个浓度重复5次, 根据试验结果确定样本检测限。
2) 特异性。
分别向空白牛奶样本中添加其他药物 (纳他霉素、三甲氧苄氨嘧啶、恩诺沙星、磺胺甲唑等) 至质量浓度为0, 10, 50, 100, 500, 1 000 μg/L。用试纸条进行检测, 不同药物每个浓度重复3次, 根据试验结果判定试纸条的特异性。
3) 准确性。
根据农医发[2005]17号文件, 胶体金免疫层析法是一种定性方法, 准确性以假阳性率和假阴性率表示。取空白牛奶样品和添加50 μg/L万古霉素的阳性牛奶样品各50份, 用试纸条进行检测, 计算假阳性率和假阴性率。
4) 重复性。
分别从3个批次中随机抽取试纸条, 对空白牛奶和添加50 μg/L万古霉素的阳性牛奶样品进行多次重复测定, 根据试验结果判定试纸条的重复性。
5) 稳定性。
将足量的试纸条保存于2～8 ℃环境中, 每隔1个月取出适量, 分别检测空白牛奶样品、添加50 μg/L万古霉素的阳性牛奶样品各10份, 重复测定2次, 根据试验结果判定试纸条的稳定性。
2 结果与分析
2.1 试纸条条件的确定
通过对抗体标记pH值、万古霉素半抗原-卵清蛋白耦联物浓度及羊抗、鼠抗抗体浓度等条件进行反复试验及调整, 最终确定最佳条件:抗体标记pH值为7.0、万古霉素半抗原-卵清蛋白耦联物的使用浓度为1 mg/mL (喷量为1.0 μL/cm) 、羊抗鼠抗抗体的使用浓度为200 μg/mL (喷量为1.0 μL/cm) 。
2.2 胶体金质量分析
用肉眼观察制备的胶体金, 颜色为酒红色, 均匀度较好, 无杂质, 透明度较高, 说明胶体金质量较好;对其进行电镜扫描, 结果显示, 所制备的胶体金粒径均匀, 随机测量100个颗粒, 胶体金粒径约为20 nm, 见193页彩图1。
2.3 样本检测限
在空白牛奶样本中分别添加不同质量浓度的万古霉素标准品, 按照1.11所述方法用试纸条进行检测, 观察结果, 确定检测限。以只出现C线时的最低标准品质量浓度作为试纸条的检测限, 结果见表1和193页彩图2。
注:+表示阳性, -表示阴性。
肉眼观察, 万古霉素质量浓度为0时, 检测线出现很深的红色条带, 随着质量浓度的增加, 检测线条带逐渐减弱, 当增加至50 μg/L时检测线完全消失。由此判断, 该试纸条对牛奶样本中万古霉素的检测限为50 μg/L。
2.4 特异性
对选取的其他4种药物进行检测, 结果表明, 该试纸条特异性强, 在0～1 000 μg/L范围内与其他药物无交叉反应, 结果见表2。
2.5 准确性
50份空白牛奶样品中有1份为阳性, 其余均为阴性, 试纸条假阳性率低于5%; 添加50 μg/L 万古霉素的50份阳性牛奶样品的检测结果均为阳性, 试纸条假阴性率为0。说明试纸条准确性较好, 适用于牛奶样本中万古霉素的检测。
注:+表示阳性, -表示阴性。
2.6 重复性
多次重复测定结果一致, 表明试纸条批内、批间测定差异小, 重复性良好。
2.7 稳定性
试纸条从生产之日起至第12个月, 空白牛奶样品的检测结果均为C线和T线显色, 为阴性;阳性牛奶样品的检测结果均为C线显色, T线不显色, 为阳性;随后试纸条检测出现了假阳性和失效现象。由此可见, 试纸条稳定性较好, 在2～8 ℃至少可以保存12个月。
3 结论与小结
试验应用胶体金免疫层析技术, 成功研制出了万古霉素快速检测试纸条, 适用于牛奶样本的检测, 检测限为50 μg/L。方法操作简单, 牛奶样品无需前处理, 可直接用于检测, 整个过程10 min内就能判定结果, 而且具有稳定性好、灵敏度高、结果准确、易于判定、经济实用等优点, 适合于大批量样品的现场快速检测。
试验所建立的胶体金免疫层析方法, 是将胶体金标记的单克隆抗体直接冻干在微孔试剂中, 这样在检测过程中, 能够使金标抗体与待检样品液充分接触, 充分反应, 从而减少误差, 增加整个体系的反应灵敏度, 易于对样品中的药物残留情况进行分析。但由于胶体金免疫层析法主要通过目测颜色来判断结果, 比较主观, 可能出现假阳性;因此对阳性样本还需用仪器方法进行确证。
1～4.万古霉素的质量浓度依次为0, 20, 50, 100μg/L。
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免疫测定 篇8
目前检测食品中氯霉素残留的方法主要包括:薄层层析法、高效液相色谱法[5]、气相色谱法[6,7,8]、和液相色谱-质谱法[9,10]、气相色谱-质谱法等[11]、免疫学检测方法等[12,13,14]。无论何种检测方法, 对样品纯度的要求较高, 检测前必须对样品进行净化处理。由于生物样本成分复杂, 残留的氯霉素浓度低, 且大多数取样量少, 常规的样品前处理方法繁琐、耗时长、成本高。免疫亲和色谱 (IAC) 是以抗原抗体的特异性、可逆性免疫结合反应为原理的色谱技术, 最显著优点在于对待测物的高效、高选择性保留能力, 特别适用于复杂样品痕量组分的净化与富集[15,16,17]。使用免疫亲和色谱纯化富集样品中的氯霉素, 可以很大程度的简化和加快检测流程, 提高分析结果的准确性、可靠性和分析的极限。
本文中研制的微型氯霉素免疫亲和色谱柱具有浓缩待测样品中氯霉素浓度、降低检测下限、排除杂质干扰、提高检测结果的准确性和可靠性、减少样品过柱时间的作用, 为氯霉素的分析检测提供了快速高效的前处理手段。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
氯霉素多克隆抗体 (南宁市蓝光生物技术有限公司) ;过碘酸氧化的琼脂糖凝胶 (sigma, A9951) ;硼氢化钠 (分析纯) ;碳酸钠 (分析纯) ;氯霉素标准品 (Sigma, C0378) ;氯霉素氘代内标 (氯霉素-D5) ;0.01mol/L磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲液 (PBS) , p H7.4;洗涤液为含0.05%Tween-20的PBS溶液 (PBST) ;洗脱液 (3%乙酸-80%甲醇水溶液) ;饱和tris溶液;色谱纯甲醇;色谱纯乙腈;色谱纯正己烷;色谱纯正丙醇。
分析天平 (上海天平仪器厂) ;可调试移液器 (美国雷勃公司) ;旋转蒸发仪 (上海荆和分析仪器有限公司) ;离心机 (上海安亭科学仪器厂) ;涡旋混合器 (德国IKA集团) ;液相色谱-质谱/质谱 (美国AB SCIEX公司) 。
1.2 试验方法
1.2.1 免疫亲和柱的制备
用50m L浓度为0.1mol/L碳酸钠溶液溶解1g氯霉素多克隆抗体, 与40m L的过碘酸氧化的琼脂糖凝胶在室温下反应30min后, 于4℃冰箱静置30min, 然后加入50mg硼氢化钠还原稳定, 清洗后, 得到富集氯霉素的免疫亲和色谱填料。取25μL填料装入容量为0.25m L的亲和层析塑料柱中, 填料两头分别加上1个孔径为50μm的筛板, 筛板刚好与填料接触后得到微型富集氯霉素的免疫亲和色谱柱。往柱里加入100μL甘油, 3-8℃下保存, 待用。
1.2.2 免疫亲和柱的使用方法
将氯霉素亲和柱取出, 室温平衡10min后依次加入1m L PBST、2m L PBS、200μL洗脱液、1m L PBST清洗柱子, 用5m L PBS平衡柱子后加入待测样品, 自然重力下流出, 弃去流出液, 待样品滴净后, 依次加入2m L PBST、2m L PBS清洗, 然后加入适量洗脱液 (0.2m L—1m L) , 用2m L的离心管收集洗脱液, 待测。
1.2.3 样品的加标回收
称取阴性牛奶样品5g (精确至0.01g) , 置于50ml离心管中, 加入100ng氯霉素标准品和等量的氯霉素氘代内标 (氯霉素-D5) , 混匀后加入乙腈30m L, 匀浆, 离心5min。将上清液移250m L的分液漏斗中, 加入15m L的乙腈饱和的正己烷, 振荡5min, 静置分层, 转移乙腈层至100m L的圆底烧瓶中, 残渣中再加入30m L的乙腈, 振摇3min, 离心5min, 取上清液转移到同一分液漏斗中, 振荡5min, 静置分层, 转移乙腈层至同一圆底烧瓶中。向烧瓶中加入5m L正丙醇, 于40℃水浴中旋转蒸发近干, 分次加入15m L PBS溶解, 全部转移至离心管中, 取饱和tris溶液调节提取液使p H值接近中性, 待亲和柱净化。
1.2.4 检测方法
按照GB/T22338-2008动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定方法, 采用液相色谱-质谱/质谱测定洗脱液中的氯霉素含量。
2 结果与分析
2.1 容量试验
将氯霉素标准品用PBS配制成5m L浓度为2μg/m L的氯霉素溶液作为待测样品, 待测样品过柱后加入1m L洗脱液洗脱, 检测洗脱液中氯霉素质量, 计算出动态柱容量 (指每毫升填料对氯霉素的最大吸收值) 。上述实验重复3次, 结果见表1。
3次重复实验的结果表明, 该25μL的微型氯霉素免疫亲和色谱柱的平均动态柱容量为1.318μg/25μL, 即52720μg/L填料。说明该微型氯霉素免疫亲和色谱柱的吸附能力很强, 能有效富集氯霉素分子。
2.2 极限试验
将氯霉素标准品用PBS配制成10m L浓度分别为100ng/L、200ng/L的氯霉素溶液作为待测样品, 并以10m L PBS作为空白待测样品。待测样品分别过柱后加入0.2m L洗脱液洗脱, 将洗脱液定容至1m L后, 检测洗脱液中氯霉素的质量, 测试微型氯霉素免疫亲和色谱柱的富集极限。上述实验重复2次, 结果见表2。
由上表可以看出, 该微型氯霉素免疫亲和色谱柱的富集极限可以达到100ng/L, 即0.1ppb, 样品经色谱柱富集浓缩后, 样品浓度由由原来的100ng/L、200ng/L富集到1001ng/L、2430ng/L, 富集率可达10倍。在仪器检出限不变的情况下, 使用该色谱柱可以使样品分析方法的检出限降低10倍。
2.3 回收率试验
将氯霉素标准品用PBS分别配制成100m L浓度为100ng/L、20m L浓度为500ng/L、4m L浓度为2.5μg/L的氯霉素溶液作为待测样品, 并以20m L PBS作为空白待测样品。待测样品分别过柱后加入0.2m L洗脱液洗脱, 检测洗脱液中氯霉素的质量, 计算回收率。上述实验重复2次, 结果见表3。
由上表可以看出, 该微型氯霉素免疫亲和色谱柱对氯霉素的回收率较高, 达到了98.5%以上。
2.4 使用次数试验
将氯霉素标准品用PBS配制成10ml浓度为1000ng/L的氯霉素溶液作为待测样品, 待测样品过柱后加入0.2m L洗脱液洗脱。同一根微型柱使用1次之后再重复使用2次, 总共使用次数为3次。分别收集每次过柱后的洗脱液, 检测洗脱液中氯霉素的质量。上述实验重复3次, 结果见表4。
由上表可以看出, 随着使用次数的增多, 微型氯霉素免疫亲和色谱柱的回收率逐渐下降, 在使用第3次后其回收率均明显下降, 因此该微型氯霉素亲和色谱柱最多可以使用2次。
2.5 样品加标回收试验
将添加了氯霉素标准品和等量氯霉素-D5的待测牛奶样品过柱后加入0.3m L洗脱液洗脱, 洗脱液经0.45μm的滤膜过滤后, 检测洗脱液中氯霉素的质量, 计算回收率。上述实验重复3次, 并设一个空白对照, 结果见表5。
以上实验结果表明, 该微型氯霉素免疫亲和色谱柱可以有效的富集牛奶中的氯霉素, 消除牛奶基质对仪器检测氯霉素的影响, 具有较好的回收率。
3 小结
实验证明, 本文研制的微型氯霉素免疫亲和色谱柱对氯霉素具有很高的富集率、灵敏度和回收率, 可以消除样品杂质的影响, 将样品中的氯霉素富集10倍以上, 对氯霉素的吸附容量达到52720μg/L填料, 富集极限可以达到100ng/L, 回收率达到98.5%以上, 可以重复使用2次。
免疫测定 篇9
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2012年1月-2014年1月来本院就诊的90例疑似沙眼衣原体感染患者作为研究对象, 其中男39例, 女51例, 年龄19~71岁, 平均 (38.2±3.7) 岁, 病程1~8周, 大部分患者无明显症状, 少数出现尿频、尿急现象甚至产生脓性分泌物, 所有患者排除淋球菌感染的可能。
1.2 方法
1.2.1取样方法
女性患者宫颈标本采集:首先以无菌大棉签清洁宫颈口处的分泌物, 再另取1根棉签插入到宫颈1~2 cm处, 缓慢旋转数次, 期间不能触碰到阴道内壁, 取出棉签后放入传送管中[4]。男性患者尿道样本采集:嘱患者采样前1 h勿小便。使用尿道拭子缓慢插入到尿道2 cm处, 稍用力旋转一圈后停留半分钟取出, 备用。如尿道中含有分泌物, 应先检查淋球菌。所有患者同时采集3份标本, 且室温下放置时间不超过4 h, 并分别根据检测方法的具体要求分类处理。
1.2.2检测方法
分别对3份标本采用细胞培养法、酶联免疫吸附测定法和免疫胶体金技术进行检验, 其中细胞培养法和酶联免疫吸附测定法严格按照临床要求、操作说明进行。ELISA检测:将棉签标本放入加有1000μL红色裂解液的裂解管中, 95℃水浴20 min, 冷却15 min后挤压棉签并取出, 仪器自动判别阴性或阳性结果。采用Micro Track XLSystem全自动酶免分析仪 (购自爱尔兰Trinity Biotech Plc公司) , 试剂盒由上海科华生物工程股份有限公司提供, 严格按照说明书进行操作;免疫胶体金检测:向裂解管中滴入无色裂解液A液5滴, 立即放入棉签, 以手指挤压裂解管中棉签头, 转动棉签15次并静置2 min;再向同一裂解管中竖直加入裂解液B液6滴, 以手指挤压裂解管中棉签头, 转动棉签15次并静置1 min。挤干裂解管中棉签头后弃去, 旋紧裂解管滴头加入加样孔进行测定。需要注意的是检测时应在10~20 min内查看结果, 超过20 min后结果无效, 如果出现2条红色条带则表示患者为阳性, 如果仅出现1条红色条带表示患者为阴性[5]。
1.3 计算方法
以细胞培养的检测结果作为“金标准”来计算酶联免疫吸附测定法和免疫胶体金技术的灵敏度和特异度, 灵敏度=真阳性例数/ (真阳性例数+假阴性例数) ×100%。特异度=真阴性例数/ (真阴性例数+假阳性例数) ×100%[6]。
1.4 统计学处理
采用SPSS 19.0统计软件对所得数据进行统计学处理, 计数资料采用χ2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两种方法检测结果的比较
采用酶联免疫吸附测定法检测90例疑似沙眼衣原体感染的患者, 结果阳性患者12例, 阳性检出率为13.3%, 其中男性阳性检出率为17.9% (7/39) , 占总数的7.8% (7/90) , 女性阳性检出率为9.8% (5/51) , 占总数的5.6% (5/90) 。免疫胶体金检测出阳性患者10例, 检出率11.1%, 其中男性阳性检出率为12.8% (5/39) , 占总数的5.6% (5/90) , 女性阳性检出率为9.8% (5/51) , 占总数的5.6% (5/90) 。两种方法在检测女性患者沙眼衣原体阳性率方面比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 在检测男性患者沙眼衣原体阳性率方面比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。
2.2 两种方法灵敏度和特异度的比较
采用细胞培养作为检测沙眼衣原体感染的“金标准”, 结果90例患者中阳性13例, 酶联免疫吸附测定法检测结果中假阳性患者1例, 假阴性患者2例, 灵敏度91.7%, 特异度97.4%;免疫胶体金技术检测结果中假阳性患者1例, 假阴性患者4例, 灵敏度90.0%, 特异度95.0%。两种方法在检测沙眼衣原体阳性率的灵敏度和特异度上比较差异均无统计学意义 (P>0.05) 。
3 讨论
沙眼衣原体属于一种极为常见的性传播疾病, 平均感染潜伏期为1~3周, 具有发病率高、危害大、易复发等特点[7,8]。目前全世界范围内由沙眼衣原体引起的性传播疾病发病率呈逐年上升趋势[9]。沙眼衣原体主要易感部位包括口腔、直肠、生殖道和眼结膜等, 可使患者产生沙眼、包涵体包膜炎、泌尿生殖道感染、性病淋巴肉芽肿等疾病。泌尿生殖系统被沙眼衣原体感染的患者会出现尿急、尿痛等症状, 女性患者还会并发宫颈内膜炎, 表现为黄色黏液脓性分泌物增多、触之易出血、水肿、充血及腹部不适等症状, 亦有相当数量患者症状轻微或无任何临床症状[10];男性患者常并发尿道炎, 表现为尿痛、刺痒、尿道分泌物增加等症状[11]。如果沙眼衣原体寄生在男性尿道或者前列腺上皮细胞内, 会破坏患者的产精和排精功能, 造成男性不育等情况。因此, 找到更为简便、快捷的检测方法来尽早的确诊沙眼衣原体的感染情况具有重要的意义。目前临床上检测沙眼衣原体的方法有很多种, 主要包括细胞培养法、ELISA法、荧光定量聚合酶链反应、免疫胶体金技术等。因为细胞培养法的敏感度和特异度非常高, 培养结果无假阳性, 常作为国际上检测沙眼衣原体的实验室诊断“金标准”, 但是细胞培养周期长、操作复杂、需要侵入性取材及成本高, 不适合作为基层医院的常规检测方法[12]。荧光定量聚合酶链反应敏感性及准确性高, 但检测成本及适用条件较高, 基层医院应用较少。ELISA法和免疫胶体金技术条件要求不高, 一般实验室即可满足, 故应用较为广泛。
免疫胶体金技术是以胶体金为标记物, 利用特异性抗原抗体反应对抗原或抗体进行定性、定量分析的标记方法, 按抗原抗体反应原理可分为双抗体夹心法、双抗原夹心法、捕获法以及竞争抑制法, 属于一种常见的固相标记免疫标记技术。免疫胶体金标记可用于常规光镜、透射电镜及扫描电镜, 可同时检测多种物质, 对组织细胞非特异性吸附作用小, 具有高敏感性及高特异性。胶体金本身为鲜艳橘红色, 是高电子密度颗粒性标记物, 可根据金颗粒数目于不同视野中对抗原进行本定量分析, 极少遮盖超微结构, 定位能力精确。金颗粒激发电子能力强, 用于X射线衍射及扫描电镜分析, 可对多糖、多肽、蛋白质、凝集素及抗体葡萄球菌蛋白A等生物大分子物质进行标记。研究表明, 免疫胶体金技术在食品安全检测领域得到了广泛应用。郭建等[13]采用国家标准方法验证粮食中玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇两种真菌毒素的胶体金快速测试卡效果, 证实了胶体金检测在粮食中的稳定性、准确性、适用性及重复性。另外, 真菌毒素及违禁药物检测中亦显示出它的优势。李月越等[14]对同一份标本甲型及乙型流感病毒采用间接免疫荧光法和胶体金免疫层析法进行检测, 显示一致性较好, 表明免疫胶体金技术操作简单, 可单份检测, 结果直观, 敏感性及特异性高。
另外, 该检测方法不需要任何仪器设备和试剂, 几分钟即可得到实验结果并用肉眼可以观察到, 试验结果可随时保存, 适合于大面积普查、大批量时间紧及野外作业人员检测, 可在基层医院及单位推广。酶联免疫吸附测定法是一种在免疫酶技术基础上发展起来的新型特殊试剂分析方法, 属于将抗原抗体免疫反应及酶高效催化作用原理有机结合起来的检测技术, 基本原理为借助于酶的高效性使某种固相载体与具有免疫活性的抗原或抗体结合, 检测时加入受检样品和酶标记物, 洗涤后加入酶催化底物, 进而实现对物质的定性及定量检测。酶联免疫吸附测定法中酶活性易受反应条件影响, 因此存在重复性及准确性差等问题。此外, 酶联免疫吸附测定法需低温保藏, 试剂寿命短, 但操作方便, 在疾病预防、食品检测及临床检验诊断中意义重大, 具有重复性好、特异强、敏感性高及漏检率低等显著优势。宿俊彪等[15]采用酶联免疫吸附测定法对乙肝病毒患者标记物进行检测, 得到各项血清标志物检测较好, 人为干扰因素较少, 提示酶联免疫吸附测定法有助于提高检测特异性及灵敏度。研究表明, 酶联免疫吸附测定法与免疫胶体金技术灵敏度基本相近, 多数试验敏感度均可达到1 ng/m L或更低水平[16], 证实了两种检测方法较高的应用价值。
为了找到更为简便、快捷的检测方法, 本研究选取2012年1月-2014年1月来本院就诊的90例疑似沙眼衣原体感染患者作为研究对象, 探讨酶联免疫吸附测定法与免疫胶体金技术在沙眼衣原体检测中的应用情况。结果发现酶联免疫吸附测定法与免疫胶体金技术对于沙眼衣原体检测均为非常有效的方法, 两种方法在检测沙眼衣原体阳性率灵敏度及特异度上无显著差异, 但酶联免疫吸附测定法男性阳性率明显高于免疫胶体金技术, 表明酶联免疫吸附测定法在检测男性沙眼衣原体感染方面更具优势, 与此同时, 免疫胶体金技术耗时时间较酶联免疫吸附测定法明显缩短。因此临床上两种方法灵活运用, 患者较少而且急需结果时可以选用免疫胶体金技术检测, 患者较多时, 用酶联免疫吸附测定法检测。对于不急于要求检验结果的男性患者, 可以积攒到一定数量后集中进行检验, 不但可以保证男性患者的感染检出率, 也可以大大节省成本、提高效率。
综上所述, 酶联免疫吸附测定法和免疫胶体金技术均是检测沙眼衣原体较为快捷、有效的方法, 基层医院可以根据实际情况灵活应用。
摘要：目的:探讨酶联免疫吸附测定法与免疫胶体金技术在沙眼衣原体检测中的应用情况。方法:选取2012年1月-2014年1月来本院就诊的90例疑似沙眼衣原体感染患者作为研究对象, 所有患者均采用酶联免疫吸附测定法、免疫胶体金技术和细胞培养方法检测沙眼衣原体感染情况, 对比酶联免疫吸附测定法和免疫胶体金技术的检测结果, 并以细胞培养方法作为金标准计算两种方法的灵敏度和特异度。结果:酶联免疫吸附测定法与免疫胶体金技术在检测女性患者沙眼衣原体阳性率方面比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 在检测男性患者沙眼衣原体阳性率方面比较差异有统计学意义 (P<0.05) ;两种方法在检测沙眼衣原体阳性率的灵敏度和特异度上比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。结论:酶联免疫吸附测定法与免疫胶体金技术对于沙眼衣原体检测均有效, 但是前者对男性沙眼衣原体的检出率明显高于后者, 因此应根据实际情况, 灵活应用。