低温脂肪酶（精选九篇）
低温脂肪酶 篇1
迄今为止, 研究的低温脂肪酶都是由低温微生物分泌产生的[6,8,9,10]。这些微生物主要分布于南、北极以及大洋底部等温度较低的区域, 大都属于假单胞菌属 (Pseudomonas) 和气单胞菌属 (Aeromonas) ;这类菌生长慢, 最适产酶温度较低;尽管已经克隆得到不少低温脂肪酶基因并表达成功[11], 但低温脂肪酶基因的异源性表达能力差, 仍需在低温条件下表达, 难以实现利用基因工程菌进行大规模工业化生产。低温脂肪酶的表达量低、难纯化及热稳定性差等问题大大限制了其在工业化生产中的应用。因此, 低温脂肪酶产生菌及高产菌株的选育越来越受到重视, 酶学结构与功能的研究[12]也受到了关注。
作者研究室从非极端环境中成功分离得到了一株产低温脂肪酶细菌, 优化了其产酶发酵条件, 并对酶的酶学性质进行研究。在实验室摇瓶培养条件下, 其酶活力可达到30.2U/mL, 与目前已报道的低温脂肪酶相比, 热稳定性好, 在pH 8.5、70℃条件下保温60min, 酶活力损失30%, 开发应用前景理想。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
从无锡惠山采集土壤, 经富集培养、筛选获得菌株。
1.1.2 试剂
p-NPB (对硝基苯丁酸酯) 购自美国Sigma公司, 其它试剂均为国药公司分析纯试剂。
1.1.3 仪器
UV-1600PC紫外分光光度计 (上海美谱达仪器有限公司) ;冷冻高速离心机 (日本日立公司) ;旋转式恒温摇瓶柜 (上海苏坤实业有限公司) ;立式压力蒸汽灭菌锅 (上海医用核子仪器厂) 。
1.1.4 培养基 (%)
(1) 富集培养基:
酵母膏0.3, 葡萄糖1, 蛋白胨0.5, 琼脂2, pH自然。
(2) 初筛培养基:
蛋白胨1, 酵母膏0.3, 氯化钠0.3, 琼脂2, 坚果油5, 维多利亚蓝B (1∶5000) 5, 表面活性剂 (OP) 1, pH 7.5。
(3) 复筛培养基:
蛋白胨1, 氯化钠1, 酵母浸出汁0.5, 坚果油4, 表面活性剂 (OP) 1, pH 7.2。
1.2 方法
1.2.1 菌种筛选
1.2.1.1 初筛——平板显色法[13]
初筛:将富集培养后分离得到的菌株接种到初筛培养基上, 30℃培养48 h后, 观察所长菌落周围有无蓝色水解圈, 水解圈直径愈大, 表示该菌株产脂肪酶能力愈强, 将其中水解圈直径与菌落直径最大者挑出来进行复筛。
1.2.1.2 复筛——摇瓶发酵法
复筛:将初筛挑出来的菌株接入复筛培养基中, 在30℃、200r/min培养2d, 然后用p-NPB法[14]测定酶活性, 将产酶能力较好的菌株挑选出来供下一步实验。
1.2.2 酶活的测定方法
脂肪酶活性的测定以p-NPB为底物, 参考Margesin Rosa等人[14]的测定方法并略作修改。反应体系的成分为0.1mol/L Tris-HCl (pH 8.5) 缓冲液, 10mmol/L 对硝基苯丁酸酯和适量的酶液。反应液于30℃保温15min后加入酶液, 在405nm下测定吸光值 (ε=1.86×104cm-1×M-1) , 每个样品重复3次, 取平均值。以1min内催化产生1μmol对硝基酚所需的酶量为1个酶活力单位 (U) 。
1.2.3 产酶菌株发酵培养基的优化[14,15]
菌株于LB固体培养基活化24h后, 接种与LB液体培养基30℃、200r/min培养12h制成种子液。转接于发酵培养基进行摇瓶发酵, 发酵条件为:温度30℃, 摇床转速200r/min, 装液量为5%。
(1) 碳源:
分别以大豆粉、葡萄糖、甘油、糊精、乳糖、酵母浸出汁、纤维素、玉米粉、淀粉、蔗糖、果糖及牛肉浸膏为碳源, 其他条件不变, 测定脂肪酶活力。每组处理重复3次, 结果取平均值。
(2) 氮源:
分别以蛋白胨、酒石酸铵、硝酸铵、尿素、酵母浸出汁、硝酸钠、豆粕及牛肉浸膏为氮源, 其他条件不变, 测定脂肪酶活力。每组处理重复3次, 结果取平均值。
(3) 无机盐:
分别加入KH2PO3、MnSO4、CuSO4、FeSO4、KCl、NaNO2、FeCl3、NaOH、KNO3、Na2SO4、ZnSO4、CaCl2、NaCl、NaNO3、Mg (NO3) 2及Al (NO3) 3, 其他条件不变, 测定脂肪酶活力。每组处理重复3次, 结果取平均值。
1.2.4 粗酶液酶学性质的研究[16]
摇瓶发酵液, 4℃低温离心机10 800g离心20min, 取上清液, 用p-NPB法[14]测定脂肪酶酶活进行粗酶酶学性质的研究。
1.2.4.1 最适pH及pH稳定性分析
粗酶液于不同pH (pH 6~10) 缓冲液中, 30℃水浴15min, 测定酶活, 以确定该酶的最适pH。此外在不同pH的缓冲液中4℃分别处理粗酶液24h, 在原测定条件下测定酶活以研究该酶的pH稳定性。每组处理重复3次, 结果取平均值。
1.2.4.2 最适温度及热稳定性分析
粗酶液按上述反应体系不同温度 (0℃~70℃) 水浴15min, 测定酶活, 以确定该酶的最适温度。并在不同温度下 (40℃、50℃、70℃及80℃) 进行热稳定性的研究, 间隔10min测定一次, 酶促反应条件如上, 持续1h。每组处理重复3次, 结果取平均值。
2 结果与分析
2.1 产脂肪酶细菌的筛选
从采集的土样中涂布富集培养得到55株生长较旺盛的菌株, 利用维多利亚蓝B平板进行初筛, 根据水解圈直径的大小挑选出16株形态各异的单菌落菌株作为复筛对象。将分离把分离得到的单菌落挑入复筛培养基摇瓶中, 30℃、200r/min培养24h, 发酵液经4℃、10 800g离心20min, 取上清液测定酶活。结果见表1。
注:D:水解圈直径;+:小;++:中;++++:大。
根据表1中各菌株产脂肪酶情况, 选择K菌进行下一步研究。初步命名K菌为sybc-li-1。经革兰氏染色, 确定其为革兰氏阴性菌, 电镜鉴定为短杆菌, 0.5μm×0.2μm, 见图1。平板上菌落呈圆形, 边缘整齐, 浅黄色, 表面光滑, 不透明。菌落形态和细胞形态符合假单胞菌属的特征, 但尚需进一步鉴定。
2.2 细菌sybc-li-1产脂肪酶培养基的优化
2.2.1 碳源对sybc-li-1产脂肪酶的影响
以1%硝酸铵为氮源, 分别以1%的水平添加12种碳源, 其他条件不变, 测定脂肪酶活力, 将最大脂肪酶活力设为100%。结果见表2。
由表2可知, 不同碳源对sybc-li-1产脂肪酶的影响差异显著, 其中淀粉的效果最好, 葡萄糖、甘油、乳糖和蔗糖等不利于产酶, 与很多文献报道一致。
2.2.2 氮源对sybc-li-1产脂肪酶的影响
以1%淀粉为碳源, 分别以1%的水平添加8种氮源, 其它条件同上, 测定脂肪酶活力, 将最大脂肪酶活力设为100%。结果见表3。
由表3可知, 有机氮明显比无机氮更利于促进sybc-li-1产脂肪酶。添加牛肉浸膏效果最好, 蛋白胨和酵母浸出汁次之。无机氮源酒石酸铵、硝酸铵及尿素等都不利于产脂肪酶。大规模发酵产脂肪酶, 可考虑选用豆粕为氮源, 豆粕成本低廉, 产酶效果也较好。
2.2.3 无机盐sybc-li-1产脂肪酶的影响
分别以1mmol/L的水平添加16种无机盐, 其他条件同上, 测定脂肪酶活力。将空白酶活力设为100%。结果见表4。
由表4可知, 不同无机盐对菌株sybc-li-1产脂肪酶效果差异显著。钠盐对产酶效果较好, 其中NaNO3最好, NaCl次之。金属离子Mg2+、Ca2+及K+利于产脂肪酶, 发酵生产中可以适量添加Mg2+、Ca2+及K+以促进产酶。
2.3 菌株sybc-li-1脂肪酶粗酶的性质
2.3.1 sybc-li-1脂肪酶粗酶的最适pH及pH稳定性
在不同pH的缓冲体系, 30℃测定脂肪酶酶活 (图2) , 结果表明:酶活最高峰出现在pH 9.5处, 显示此pH为该酶的最适pH。脂肪酶在不同缓冲液4℃下处理24h, 再在原条件下测定剩余酶活 (图3) 。结果显示, 该酶在pH 3.5~9范围内比较稳定, 当pH低于3.5时酶活力将受到比较大的影响。
固定pH 9.5, 以5℃为一间隔, 设定温度梯度0℃~70℃, 测定酶活 (图4) 。结果表明:该脂肪酶酶活在0℃~20℃之间随着温度的增加而增加, 在20℃时达到最大, 在20℃~70℃之
间随着温度的增加而减小。此外在0℃时酶活仍有最大值的70%, 属于低温脂肪酶。热稳定性试验 (图5) 表明, 该酶在70℃以下保温60min稳定性较好, 80℃下保温酶活力急剧下降, 保温20min仅有30%剩余酶活, 60min后酶活几乎为0。
3 讨论
低温脂肪酶因其在较低温度时仍能保持较高的酶活力, 应用潜力广阔, 但目前已报道的低温脂肪酶都有着一个共同的特点——热稳定性差, 在40℃以上时会很快失活, 这大大限制了其在工业上的应用。迄今已报道的低温脂肪酶都是由低温微生物分泌产生的, 从极端低温环境筛选低温脂肪酶是当今脂肪酶研究热点之一[6,8,9,10,11,12,17]。如Fredrik H?!rdeman等[17]从波罗的海海底淤泥中分离出一株产低温脂肪酶细菌, 该菌株分泌的低温脂肪酶分子量为35.4kDa, 与Pseudomomas putida菌株所产的脂肪酶氨基酸序列有54%相似性。该酶在以p-NPB为底物时最适作用温度为35℃, 但热稳定性差, 25℃便不稳定, 40℃、5min酶活损失50%。国内张金伟等[6,18]从南极普里兹海湾深海沉淀物中分离得到一株产低温脂肪酶的菌株Psychrobacter sp.7195, 该菌株属于耐冷菌, 其最适生长温度范围为5~15℃, 产酶最适温度20℃, 分泌的脂肪酶最适温度30℃, 最适pH 9.0, 对热敏感, 60℃热处理10min剩余酶活仅为30%。从这些研究可以看出, 极端菌因其生存条件恶劣, 对生长和产酶条件通常也较苛刻, 所产的低温脂肪酶一般最适温度较低, 但对热不稳定, 通常在40℃便会很快失活, 不利于工业的扩大化生产。
本研究分离的产低温脂肪酶菌株sybc-li-1, 是从温和自然生境中筛选的非极端菌, 与已报道的产低温脂肪酶菌株相比, 其发酵产酶较为容易, 培养条件温和, 所产低温脂肪酶的粗酶活力高, 热稳定性好。在初始pH为8、30℃、200r/min旋转摇床培养72h, 所产粗酶活力可高达30.2U/mL。该酶最适pH 9.5, 最适温度20℃, 0℃下约有70%的酶活。该酶对热稳定, 温度低于60℃时保温1h粗酶酶活下降不大, 在70℃下保温1h, 粗酶仍能保持75%以上的酶活。这些特点较目前已报道的多数低温脂肪酶要好, 工业应用前景广阔。作者研究室正致力于产低温脂肪酶菌株sybc-li-1的分子生物学特性研究和工业应用中的开发。
摘要：目的:筛选产低温脂肪酶非极端细菌菌株, 扩大脂肪酶的应用范围。方法:利用维多利亚蓝B平板显色法和摇瓶发酵法, 从土壤中筛选产脂肪酶菌株, 通过菌落形态和菌体特征观察初步对菌种进行鉴定, 并对该菌株的产酶发酵培养基进行了优化。结果:得到一株产低温脂肪酶非极端细菌菌株sybc-li-1, 该菌株适宜产酶培养基 (%) 为淀粉1、牛肉浸膏1、NaNO3 0.08、CaCl2 0.04、MgSO4 0.04、橄榄油2和OP1;初始pH8、30℃、200r/min培养72h, 脂肪酶活力可高达到30.2U/mL;所产脂肪酶粗酶最适作用温度20℃, 最适pH9.5, 0℃时仍能保持70%的酶活性, 属于低温酶;该酶与目前报道的低温脂肪酶相比, 有较好的热稳定性, 粗酶在pH8.5、70℃条件下保温60min, 酶活力损失30%。结论:该菌株为自然环境中筛选的非极端细菌, 所产脂肪酶为低温脂肪酶, 在开发应用上有良好的前景。
激素敏感脂肪酶研究进展 篇2
激素敏感脂肪酶研究进展
激素敏感脂肪酶(Hormone-sensitivelipase,HSL)是一种细胞内的.中性脂肪酶,能够水解甘油三酯(TG)、甘油二酯(DG)、单酰基甘油、胆固醇酯以及其它脂质和水溶性基质.HSL水解TG和胆固醇酯底物的活性受可逆的磷酸化作用调控.HSL缺失小鼠的骨骼肌、肝脏脂肪组织的胰岛素敏感性受到损害.脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)与HSL共同促进储存于哺乳动物脂肪组织的TG的水解.
作 者：张志刚 刘国文 王哲 ZHANG Zhi-gang LIU Guo-wen WANG Zhe 作者单位：吉林大学畜牧兽医学院,吉林,长春,130062刊 名：畜牧与兽医 ISTIC PKU英文刊名：ANIMAL HUSBANDRY & VETERINARY MEDICINE年，卷(期)：200638(3)分类号：Q556关键词：激素敏感脂肪酶 脂肪水解 磷酸化 脂肪甘油三酯脂肪酶
低温脂肪酶 篇3
为了满足脂肪酶应用不断发展的需求,人们对脂肪酶耐热、耐酸、耐碱等酶学特性提出了更高的要求。由于对脂肪酶这类界面酶的催化作用方式和结构模型等分子机理了解甚少,仅用生化手段对它们进行分析有一定的难度,国内外学者已把注意力集中到采用分子生物学手段,着手进行脂肪酶基因的定位、克隆、重组表达和酶分子的改造工作,以改良脂肪酶的酶学性质[2]。芽孢杆菌产生的脂肪酶具有能耐受较高的温度、较宽的pH作用范围和对有机溶剂良好的耐受性等特点[3],比一般的中性脂肪酶具有更广泛的用途。但是在自然条件下,该菌的酶产量低,利用常规育种方法难以满足工业化生产的要求。针对于此,本文对实验室从高温环境中筛选出来的产耐热脂肪酶的芽孢杆菌FS32b菌株进行16S rDNA鉴定,利用PCR技术扩增出脂肪酶的基因序列,并建立该脂肪酶基因的进化树,进行了同源性比较和序列分析,为以后采用分子定向进化的家族改组[4]方法改造脂肪酶基因,为构建耐热高产脂肪酶工程菌奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒
FS32b(北方堆肥土样中分离筛选获得),克隆宿主菌E.coli DH5α为实验室保存菌种;载体pMD-19T vector试剂盒购自Takara公司。
1.1.2 试剂
DNA Ladder Marks、Taq DNA聚合酶、Ex Taq DNA 聚合酶、PCR试剂均购自TaKaRa公司;RNaseA购自Huagene;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司;胰蛋白胨、酵母浸膏、X-gal、IPIG、三丁酸甘油酯等生化试剂均为国产或进口分析纯。
1.1.3 培养基
(1)基础培养基(%):
牛肉膏0.3、蛋白胨0.5、葡萄糖1.0、酵母膏0.1。
(2)产酶培养基(%):
豆饼粉1.0、蛋白胨0.2、糊精0.4、CaCO3 0.3、(NH4)2SO4 0.03、MgSO4 0.03、K2HPO4 0.3。
(3)LB培养基(g):
胰蛋白胨10g、酵母浸膏5g、NaCl 10g,加蒸馏水至1 000ml,分装,高压灭菌,部分加氨苄青霉素钠至终浓度100μg/ml。
1.2 方法
1.2.1 菌株基因组DNA的提取
利用改良的苯酚-氯仿法提取FS32b的基因组DNA[6]。
1.2.2 菌株的16S rDNA鉴定
1.2.2.1 菌株FS32b的16S rDNA基因获得
根据细菌的16SrDNA基因的保守序列,设计一对通用引物,引物序列如下:
上游引物:5'-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3';下游引物:5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。以FS32b的基因组DNA为模板,进行PCR扩增,循环参数为:96℃预变性3min,94℃变性1min,50℃退火1min,72℃延伸2min,反应30个循环,最后72℃延伸10min。混匀后取5μl产物1%琼脂糖凝胶电泳检验,-20℃保存备用。
1.2.2.2 菌株16S rDNA基因的连接转化和阳性克隆子的菌落PCR鉴定
FS32b回收后的16S rDNA基因片段连接到pMD-19T Vector上,连接产物转化感受态细胞[7]E.coli DH5α,涂布在含有氨苄青霉素钠(100μg/ml)、7μl IPIG(20%)和40μl X-gal(2mg/μl)的LB平板上,37℃培养16h。经蓝白斑筛选,分别挑取数个白斑单菌落于2ml含100μg/ml Amp的LB培养基中,于37℃过夜振荡培养,用于菌落PCR鉴定。分别用pMD-19T的测序引物及16S rDNA的特异性引物利用菌落PCR技术[8]对筛选出来的阳性克隆子进行鉴定。其PCR的循环参数同1.2.3.1。
1.2.2.3 菌株16SrDNA序列分析和进化树构建[9]
将测序得到的FS32b的16S rDNA基因序列进行去载体、拼接处理后得到16S rDNA目的序列。应用ClustalW软件对目的序列进行比对和聚类分析,然后采用邻位相连算法(N-J法),用PHYLIP多功能软件包中的SEQBOOT、DNAML以及CONSENSE软件,构建FS32b的16SrDNA基因的进化树。
1.2.3 FS32b脂肪酶基因寡核苷酸引物的设计合成
根据NCBI上发表的Bacillus subtilis脂肪酶基因序列,利用Clustalx软件进行多序列比对,发现它具有很强的序列保守性,根据编码区序列设计合成了PCR扩增所需的2个引物。
上游引物:5'-GGCGCGGATCCATGAAATTTGTAAAAAGAAG- 3'(含BamHⅠ酶切位点);
上游引物:5'-CGCGGCTAGCTCATTAATTCGTATTCTGGC- 3'(含NheⅠ酶切位点)。
1.2.4 脂肪酶基因的获得
以FS32b的基因组DNA为模板,进行PCR扩增,循环参数为:95℃预变性5min,94℃变性45s,62.7℃退火 1min,72℃延伸1min,反应35个循环,最后72℃延伸10min。混匀后取5μl产物,1%琼脂糖凝胶电泳检验,-20℃保存备用。
1.2.5 脂肪酶基因的克隆和序列测定
方法同1.2.3.2和1.2.3.3,其PCR的循环参数同1.2.5。
2 结果与分析
2.1 基因组DNA的提取
所提取的基因组DNA经紫外检测和1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2.2 菌株的16S rDNA鉴定
2.2.1 FS32b的16S rDNA基因获得
以FS32b的基因组DNA为模板进行PCR扩增,30个循环后将PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳检测,以200bp DNA ladder作为Marker,在1500bp处有1条明显的特异性扩增带。结果如图3所示。
2.2.2 FS32b的16S rDNA基因阳性克隆子的筛选与验证
PCR产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收后,将回收产物与PMD-19T载体4℃连接过夜,连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞,涂布于氨苄平板上,过夜培养后,随机挑取2个白斑,37℃振荡培养12h后,通过菌落PCR验证筛选得到的阳性克隆子,琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。结果如图4所示,图中1、3号的菌落分别对应于2、4号的菌落。从图中可以看出1、3号中出现大小约为1 500bp的条带,2、4号中出现大小约为1 600bp的条带,其大小与16S rDNA基因PCR结果是一致的。
M为200bp marker;1、2为16S目的条带。
M为200bp marker;1、3为16S rDNA引物的PCR产物:1500bp左右;2、4为T载体上通用引物的PCR产物:1 600bp左右。
2.2.3 菌株的16S rDNA基因测序结果(见图3,深色部分为引物序列)
2.2.4 菌株的16S rDNA基因系统进化树分析
将测序得到的FS32b的16S rDNA基因序列应用ClustalW软件对目的序列进行比对和聚类分析,然后采用邻位相连算法(N-J法),用PHYLIP多功能软件构建FS32b的16S rDNA基因的进化树。
从图4中可以看出菌株FS32b与Bacillus subtilis聚为一类,与X60646的亲缘性最近,可初步鉴定为Bacillus subtilis。
2.3 脂肪酶基因PCR扩增
以FS32b的基因组DNA为模板进行PCR扩增,35个循环后将PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳检测,在663bp处有1条明显的特异性扩增带。结果如图5所示。
2.4 克隆与重组子的鉴定
将随机挑选的6个白斑,37℃振荡培养12h后,通过菌落PCR验证筛选得到的阳性克隆子,琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物结果如图6所示,图中1、3、5、7、9、11号的菌落分别对应于2、4、6、8、10、12号的菌落。从图中可以看出1、3、5、7、9、11号中出现大小约为800bp的条带,2、4、6、8、10、12号中出现大小约为600bp的条带,其大小与脂肪酶基因的PCR结果是一致的。
2.5 脂肪酶基因的测序结果
将阳性克隆子15%甘油保种后,送于上海生工测序。测序结果如图7(深色部分为引物序列)。
测序结果表明菌株FS32b包含长度为639bp的脂肪酶基因的完整开放阅读框架(ORF)。
1、2为脂肪酶基因目的条带。
1、3、5、7、9、11为T载体上通用引物的PCR产物:800bp左右;2、4、6、8、10、12为脂肪酶特异性引物的PCR产物:600bp左右。
2.6 根据测定的脂肪酶序列进行结构分析
2.6.1 基因序列的分析
应用NCBI的BLAST程序将所得脂肪酶基因的测序结果与核酸数据库中有关序列进行比对后可知该基因的保守性很高,来源于FS32b菌株的脂肪酶基因与来源其他Bacillus subtilis的脂肪酶基因相比分别只有3～6个碱基的差异,他们脂肪酶基因的同源性高达97%～99%。
2.6.2 编码蛋白的预测及分析
用ORF finder软件预测FS32b序列编码的蛋白(深色部分为酶活中心):
从预测的蛋白序列中可知FS32b的脂肪酶基因是由213个氨基酸残基构成的蛋白,计算其分子量约为23kDa。研究表明[10],尽管不同来源的脂肪酶具有不同的氨基酸组成,但由于生物的同源性和进化过程的保守性,其催化中心拥有相似或相同的特征区His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gly 或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)。
所测的FS32b氨基酸序列缺乏催化脂肪酶作用的保守五肽Gly-X-Ser-X-Gly,通过与其它微生物和哺乳动物脂肪酶序列的同源性比较,发现Bacillus subtilis脂肪酶中存在这样的保守五肽Ala-X-Ser-X-Gly, 第一个X为His或Gly,第二个X为Met、Glu、Leu 或是Ala。普遍认为保守五肽中的Ser是一种亲核残基,参与水解机理的一个过程。是催化中心三组合Ser/Asp/His的成员之一;而Ser侧翼的Gly在酶的催化过程中所起的作用不大,推测其作用为增加保守五肽的柔韧性和减少空间障碍,以便底物能与催化中心更好地结合、催化水解反应[11]。Ala取代保守五肽中的Gly并不会改变脂肪酶的活性,可知五肽Ala-His-Ser-Met-Gly为FS32b的脂肪酶活性中心。
3 讨论
笔者对实验室从高温环境中筛选出来的菌株FS32b的脂肪酶热稳定性和pH稳定性进行了初步研究,并对该菌进行了16S rDNA基因的鉴定和脂肪酶基因的克隆。根据16S rDNA序列同源性分析法鉴定菌株种属的原则,构建的进化树的同源性结果表明,FS32b菌株与基因登录号为X60646的Bacillus subtilis具有紧密的亲缘关系,同源性达到99%,初步鉴定为Bacillus subtilis。这个结果与已发表的文献[12,13]是高度一致的,说明我们所获得的结果是准确的。脂肪酶基因测序结果表明,FS32b的脂肪酶基因在GeneBank中未见报道,为新发现的Bacillus subtilis脂肪酶。
芽抱杆菌属是微生物中产脂肪酶的重要成员,其所产的脂肪酶具有能耐受较高的温度、较宽的pH作用范围和对有机溶剂良好的耐受性等特点,在非水相催化、手性化合物拆分等领域具有一定的发展前景。研究和开发本属微生物产生的脂肪酶,对于增加新酶种,扩大脂肪酶的应用领域具有现实意义。为了有效与合理的利用该菌株,有待于进一步建立该菌株脂肪酶基因的表达体系,为以后采用家族改组方法来进行脂肪酶的定向进化奠定基础。
摘要：目的:从北方堆肥土样中分离、筛选获得产耐热脂肪酶的嗜热菌株FS32b,确定该菌株的分类学地位及其所产耐热脂肪酶基因。方法:通过研究该菌株16SrDNA基因序列的系统进化树,进行菌种分类鉴定并利用PCR技术获得其脂肪酶基因。结果:FS32b与报道过的Bacillus subtilisX60646有紧密的亲缘关系,二者的16S rDNA序列相似性为99%,其脂肪酶基因经序列测定分析表明,该菌株含长度为639bp的耐热脂肪酶基因的完整开放阅读框架(ORF)。此片断编码有213个氨基酸的酶。结论:FS32b初步鉴定为Bacillus subtilis,其脂肪酶基因的克隆为以后高效基因工程菌的构建奠定了基础。
产脂肪酶菌株的筛选及酶学特性研究 篇4
产脂肪酶菌株的筛选及酶学特性研究
从富油土壤中分离筛选到58株脂肪酶产生菌,其中GXL02菌株产脂肪酶的能力较强,根据其形态特征及16S rDNA序列分析,初步鉴定为不动杆菌.GXL02发酵产酶需油脂的.诱导,同时也依赖Mg2+,培养基中不添加Mg2+时几乎不产酶,微量的Mg2+就能激活菌体产酶.葡萄糖、蔗糖等糖类物质不利于GXL02产脂肪酶.该酶的最适作用温度为50℃,最适作用pH为9.0,60℃保温90 min酶活基本不损失,在pH 3.0～10.0范围内稳定.
作 者：胡朝阳 韦晗宁 李春苑 武波 HU Zhao-yang WEI Han-ning LI Chun-yuan WU Bo 作者单位：广西大学,生命科学与技术学院,广西,南宁,530005刊 名：广西农业生物科学 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF GUANGXI AGRICULTURAL AND BIOLOGICAL SCIENCE年，卷(期)：200625(3)分类号：Q939 Q556关键词：脂肪酶 不动杆菌 筛选 酶学性质
低温脂肪酶 篇5
关键词：脂肪酶,假丝酵母,紫外诱变,酶学性质
脂肪酶已经被广泛地应用于脂肪和油脂的改性,它能够催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油。近年来,脂肪酶还被应用于非水相体系中进行光学纯物质的合成[1]。微生物脂肪酶因具有特定的立体专一性等优点,能够作为催化剂用于转酯反应和甘油三酯的合成而有着巨大的工业应用潜力。
人们研究了来源于酵母菌[2]、根霉[3]、假单胞菌[4]、黑曲霉[5]、不动杆菌、类产碱假单胞菌等的脂肪酶,发现它们具有不同的分子组成及催化活性。来源于假丝酵母的脂肪酶有着良好的酯化活性,生成的甘油三酯没有特定的立体专一性,因此在短链酯的合成来生产香料或者生物燃料例如生物柴油等方面[6]都具有很大的应用潜力。
目前国内外已有大量关于脂肪酶方面的研究报道,但有关利用紫外诱变方法提高脂肪酶产量却很少报道。本研究对来源于假丝酵母属的1444粗壮假丝酵母进行紫外诱变,获得了2株脂肪酶产量提高的诱变株并研究了其酶学性质,为进一步的研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 出发菌株
购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)的粗状假丝酵母(Candida valida)1444,斜面菌种在2～8℃保存。
1.1.2 试剂
罗丹明B,北京瀛海精细化工厂;橄榄油,上海润捷化学试剂有限公司,化学纯; 聚乙烯醇,分析纯,国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 仪器
摇床、培养箱、精密水浴锅等均由上海森信实验仪器有限公司生产。
1.1.4 主要培养基
种子培养基(g/L):葡萄糖10,蛋白胨10,酵母粉2,pH自然。
发酵培养基(%):橄榄油4,蔗糖0.5,玉米浆4,硫酸铵0.1,磷酸氢二钾0.1,硫酸镁结晶0.4,吐温-80 0.05,调起始pH值为5.0。
普通固体培养基(%):麦芽汁培养基5.42,琼脂粉2。
罗丹明显色培养基(%)
a) 硫酸铵0.1,磷酸氢二钾0.1,硝酸铵0.1,氯化钠0.1,硫酸镁0.05,硫亚铁0.001,调pH值为9.0,琼脂粉2.5,0.1%罗丹明1ml;
b)PVA橄榄油乳化液。
a)和b)分别灭菌后,100ml a)与12ml b)混合即为罗丹明显色培养基。
1.2 方法
1.2.1 紫外诱变
采用功率为20W紫外灯,照射距离为30cm,对菌悬液进行不同时间的诱变处理。诱变处理时先打开紫外灯,预热20min,以稳定波长。取制好的菌悬液5ml于直径为7cm的无菌培养皿中,内加磁力转子(无菌),在磁力搅拌下,开盖用紫外光照射不同时间,每隔2min定时取出菌液,于冰浴中保存1h,同未经紫外照射的菌液用无菌水进行梯度稀释,每个稀释度做3个平行,涂布于普通固体平板,用黑色胶袋包好于30℃恒温培养2d,观察不同处理时间的平板菌落数,计算致死率。
1.2.2 筛选
初筛:把诱变后的菌液进行梯度稀释,取0.1ml适宜梯度的菌液涂布于罗丹明显色平板,用黑色胶袋包好于30℃恒温培养5～6d后观察水解透明圈的大小,把透明圈较大的菌落接入普通平板培养后备用。
复筛:选取初筛中透明圈较大的菌株斜面保存,活化一次后以1%接种量接入发酵摇瓶中培养48h,测定发酵液中的酶活。
1.2.3 脂肪酶活力测定法[7]
采用经典的聚乙烯醇乳化液橄榄油滴定法,酶活力单位定义为,在40℃、pH 7.5,以每分钟从橄榄油中释放1μmol脂肪酸的酶量定义为1U。
2 结果与分析
2.1 紫外线诱变剂量的确定
出发菌株1444粗壮假丝酵母经紫外线照射不同时间的致死曲线如图1所示;紫外线照射不同剂量下的诱变情况如图2所示,可知,随着照射时间的延长,负变率逐渐增大,不变率逐渐降低。照射时间为6min时正变率最高,为41%。确定紫外照射6min为最佳诱变剂量,此时致死率达85%。
2.2 高产菌株的筛选
对1444粗壮假丝酵母进行紫外诱变得到酶活较高的诱变株Y2,对Y2再进行紫外诱变后,根据测量单菌落水解圈和菌的直径比,挑出30株进行摇瓶初筛,从中挑出10株复筛,再从中选出4株。这4株菌种的摇瓶结果如表1所示。
2.3 诱变菌株稳定性的研究
菌株在经过诱变后,其优良的性能可能会在传代的过程中丢失,即发生回复突变。因此,本实验对诱变株Z1、Z4、Z6、Z8进行了对筛选出的菌株进行传代试验,考察其稳定性,结果如表2所示(酶活U/ml)。
这4株诱变株的遗传稳定性分析实验结果表明,突变株Z1、Z4的产脂肪酶能力在传代过程中逐渐减弱,而突变株Z6、Z8则具有良好的遗传稳定性,经连续5次传代,脂肪酶活性仍然很稳定,因此作为进一步实验研究的菌株。
2.4 诱变株生长状况的研究
由图3可知,Z6、Z8在罗丹明平板上产生的水解圈大于出发株的,说明Z6、Z8的酶活较出发株有所提高。由图4可知,诱变株在生长过程中会产生棕色的水溶性色素。
2.5 1444粗壮假丝酵母、Z6及Z8脂肪酶的酶学性质
2.5.1 酶作用最适温度
在30～55℃范围内测定同一发酵液的脂肪酶活性,结果表明,1444粗壮假丝酵母脂肪酶的最适温度为40℃,Z6所产酶的最适温度为45℃,Z8所产酶的最适温度为50℃。
2.5.2 酶作用的最适pH
配制pH 3.0～10.0磷酸盐缓冲液(0.025mol/L)为酶反应缓冲液,测定不同pH值下脂肪酶活力,结果(图6)表明1444粗壮假丝酵母脂肪酶、Z6及Z8所产酶的最适pH都为8.0。
2.5.3 酶的热稳定性
以50、60℃为实验温度,分别取20mL酶液置于50、60℃恒温水浴处理60min,每隔10min取一次样测定其残留酶活力(以未经处理的酶液作对照),实验结果如图7、8示。Z6和Z8所产酶的热稳定性较出发株都有了明显提高,在50℃下处理60min酶活力基本不变。
2.5.4 酶的pH稳定性
取发酵液2mL和等体积的pH5～9的各种缓冲液混匀,置于4℃冰箱存放24h后,用0.5mol/L的NaOH或HCl将pH调至7.5,测定残留的酶活,结果如图9示。结果表明,Z6、Z8所产酶在4℃、pH6～9下酶活力基本不损失,较出发株酶的pH稳定性有了改善。
3 讨论
产脂肪酶的1444粗壮假丝酵母经连续两次紫外诱变,成功地得到酶活分别提高了126%、150%的突变株Z6和Z8。初步的酶学性质研究表明,Z6和Z8的最适反应温度分别为45℃、50℃,最适pH都为8.0,突变株的pH和热稳定性较出发菌株均有了较大幅度的改善。该酶活高于假丝酵母L22[8]和Jw4[9]的产酶能力,但低于假丝酵母99-125[10]的产酶能力。不过由于不同研究者使用的脂肪酶酶活测定方法有所不同,因此给菌株的产酶能力的比较与评价带来了一定的困难[11]。虽然本研究中得到的突变株产生的脂肪酶酶活仍不甚理想,但为进一步的菌种的基因组重组育种、酶相关基因的克隆等研究打下了一定基础,有关实验正在进行中。
参考文献
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低温脂肪酶 篇6
同时, TLIM脂肪酶目前在我国食品工业已经有所应用, 但因为对其研究不够, 尚处于初级阶段, 所以本研究利用TLIM脂肪酶作为反应用酶得到甘油二酯产品, 对TLIM脂肪酶应用于食品工业生产提供较好的科学依据。
1 试验材料与方法
1.1 主要原料及试剂
稻米油, 购于家乐福超市;Lipozyme TLIM脂肪酶, 购于诺维信公司。
1.2 主要试验仪器
反应釜, 东北农业大学自行研制;DK-98-1型电热恒温水浴锅, 天津市泰斯特仪器有限公司;SHB-3型循环水多用真空泵, 郑州杜甫仪器厂。
1.3 试验方法
1.3.1 酶水解反应步骤
称取10.00g的稻米油于100mL的圆底烧瓶中, 依次加入一定试验用量的去离子水和脂肪酶, 置于反应釜中, 一定温度下将反应釜在水浴锅中加热, 经过一定时间, 其混合液即为稻米油水解液, 其主要成分为甘油二酯, 取定量产品待测。
1.3.2 脂肪酸转化率的测定
脂肪酸转化率= (反应起始的酸值-某一时间段的酸值) /反应起始酸值×100%
1.3.3 酸值的测定
酸值的测定按照GB/T 5530-2005执行。
2 结果与讨论
2.1 酶解时间对稻米油酶解的影响
在2%脂肪酶, 10g去离子水, 酶解温度60℃, 酶解时间分别为4、6、8、10和12h条件下进行试验, 试验结果如图1所示。
由图1可知:甘油二酯的酸值起初随酶解时间的延长而增加, 当到达8h时达到最大值。由于脂肪酶易失活, 对热不稳定, 所以酶解时间不宜过长。故采取酶解时间为8h, 此时脂肪酶活性较好, 对稻米油酶解的较彻底, 且用时相对较短, 脂肪酸转化率较高。
2.2 加酶量对稻米油酶解的影响
在为10g稻米油, 10g去离子水, 酶解温度60℃, 酶解时间6h, 加酶量分别为1%、2%、3%、4%、5%和6%条件下进行试验, 试验结果如图2所示。
酶解反应速度的快慢, 直接和酶的浓度相关。酶浓度高, 参与反应的酶的分子就多, 相应的酶解速度就快。由图2可知:随着加酶量的增加, 转化率明显增高, 但是当加酶量超过3%时, 增长趋势减缓。
2.3 酶解温度对稻米油酶解的影响
在10g稻米油, 加入2%脂肪酶, 10g去离子水, 酶解时间6h, 酶解温度分别为40、50、60、70和80℃条件下进行试验, 试验结果如图3所示。
由图3可知:脂肪酶催化酶解稻米油的温度在60℃时效果较好。酶解温度的高低直接影响酶的活力, 温度高, 分子运动快, 酶解速度快;反之则慢。但温度过高, 会影响酶的稳定性和活力, 甚至使酶失活。当酶解温度大于70℃时, 转化率下降较快。
2.4 加水量对稻米油酶解的影响
在10g稻米油, 加入2%脂肪酶, 酶解温度60℃, 酶解时间6h, 加入去离子水量分别为2、6、10、14和18g条件下进行试验, 试验结果如图4所示。
由于油脂水解属于界面反应, 总界面面积的大小直接决定着反应的速度。当其他条件不变时, 增加水的比例可以增加界面面积。当加水量较少时, 体系是油包水体系, 界面面积较小、黏度较大, 溶解在水相的酶液水解连续相的油相效率较低。随着加水量的增加, 产物酸值有明显的提高。由图4可知:当加水量大于10g时, 转化率却下降, 原因是虽然界面面积增加, 但是酶的相对浓度下降也较大, 造成产物酸值下降, 转化率也随之下降。
2.6 正交试验
根据酶水解单因素分析结果, 设计四因素三水平L9 (34) 正交试验, 反应结果见表1。
由表1可知:各因素对甘油二酯酸值的影响主次顺序为:酶解温度>加水量>酶解时间>加酶量。由极差分析结果可知, 酶解温度对甘油二酯酸值的影响最大。由正交试验得出最佳试验条件为A3B3C2D2, 即酶解时间为10h、酶解温度为55℃、脂肪酶用量为4.5%和去离子水用量为10g。经验证按此参数试验得出的甘油二酯的脂肪酸转化率为90.3%。
3 结论
试验结果表明:TLIM脂肪酶酶解稻米油制备甘油二酯, 其水解程度受酶解温度等条件的影响较大。在单因素试验的基础上, 通过正交试验得到TLIM脂肪酶催化酶解稻米油最佳反应条件:酶解时间为10h、酶解温度为60℃、脂肪酶用量为4.5%和去离子水用量为10g。在此参数下试验, 酶解转化率为90.3%, 得到的甘油二酯含量较高。通过本研究, 为稻米油酶解制备甘油二酯及TLIM脂肪酶在食品加工中的产业化应用提供了较好的理论依据。
参考文献
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讨论脂肪酶催化药物的合成及进展 篇7
1 脂肪酶的概念
脂肪酶也叫三酰基甘油酰基水解酶, 可以催化天然底物油脂发生水解, 进而生成甘油、脂肪酸、甘油单酯或二酯。脂肪酶的基本单位为氨基酸, 大多只有一条多肽链, 催化活性仅取决于其蛋白质结构。脂肪酶为是一类具有催化能力的酶, 可催化三酰甘油酯、水不溶性酯类发生水解、酯化、醇解、转酯化、酯类逆向合成[2], 同时还可表现出一些其他酶的活性, 例如:溶血磷脂酶、磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶的活性等。
2 脂肪酶的催化原理
和传统的化学催化剂相比较, 脂肪酶具有所高催化活性, 较强专一性, 较强选择性, 反应副产物较少, 可在温和条件下反应, 耗能少, 对环境没有污染等显著优势。常规情况下, 脂肪酶活性部位会被一个螺旋片段所包住, 不会发生催化反应, 当在底物存在的条件下, 酶的构象会出现变化, 螺旋片段会打开, 脂肪酶含有活性的部位就会暴露出来, 进而使底物和脂肪酶的结合能力发生增强[3], 底物会就进入到疏水性通道内和活性部位进行结合, 形成酶-底物的复合物。
3 抗炎镇痛药物
抗炎镇痛类药物主要用于临床治疗多种疾病导致的发烧、疼痛、持续性炎症, 这类药物大多因为手性中心存在对映体, 例如:布洛芬、萘普生、酮洛芬等, 通过研究发现使用脂肪酶在手性药物拆分上所具有的一定优势, 对这一类抗炎镇痛药物进行生产工艺合成优化, 取得了比较理想的效果。萘普生是一种世界范围内临床应用最为广泛的一种非甾体抗炎镇痛类药物, 临床药理研究表明脂肪酶催化合成-萘普生的药理活性是对映体的28倍[4]。研究报道使用皱褶假丝酵母脂肪酶在超临界二氧化碳存在下的水缓冲液/异辛烷反应体系中可以立体选择性水解消旋萘普生甲酯, 其对映体比率会随着反应时间的延长而进一步升高, 可见在超临界二氧化碳中选择合理的实验条件和反应体系, 可以使产物对映体过剩值、对映体比率、酶活性、稳定性、转化率、酶活性等均达到十分理想的水平。
酮洛芬的羟基α-碳为手性中心, 有 (R) -和 (S) -对映体, 但是 (R) -酮洛芬和 (S) -酮洛芬具有不同的药理活性作用, (S) -酮洛芬可以减轻疼痛、炎症, 但是 (R) -对映体的药理活性较 (S) -酮洛芬明显要低, 并且还存在副作用和药理毒性作用。
4 抗菌药物
甲霜林为一种丙胺酰胺, 经体内药理试验证明具有十分理想的杀菌作用, 并且没有不良反应, 但是只要 (R) -甲霜林有杀菌活性, 有报道使用固定在丁基纤维素上洋葱假单胞杆菌脂肪酶可高效合成 (R) -甲霜林的中间体, 可显著提高产率。
穿心莲内酯为中药穿心莲的重要活性成分, 具有较强的抗菌活性, 已经广泛应用在多种疾病的抗菌治疗上, 有报道使用洋葱伯霍尔德杆菌脂肪酶固定后在丙酮中催化制成14-乙酰基穿心莲内酯, 发现产量达95%。
5 维生素类药物
维生素可以帮助人体维持正常的生理功能, 是一种十分重要的药物类型。将维生素酯化合成维生素酯类衍生物不但可以得到更多维生素类的治疗型药物, 还可以避免维生素存在的缺点。有报道使用固定化假丝酵母脂肪酶催化维生素A醋酸酯、棕榈酸反应, 合成了维生素A棕榈酸酯。
将维生素E进行酯化修饰转化成其衍生物, 可以有效改善其水溶性、稳定性、表面活性。有报道使用酶催化维生素E的酰化反应, 催化醋酸乙烯酯和维生素E进行酯交换反应, 试验发现, 吸附于离子交换树脂的南极假丝酵母脂肪酶B的催化效果比较理想。
6 抗肿瘤药物
脂肪酶催化药物在肿瘤等重大疾病的治疗上也具有重要意义, 例如:5-氟尿苷主要用于治疗直肠癌、结肠癌、白血病, 但是其具有一定的细胞毒性, 如果通过脂肪酶催化反应生成其衍生物, 可有效避免其不良反应的发生, 降低其细胞毒性。
7 抗抑郁药物
在抗抑郁药物的中有很多常用药物具有手性中心, 例如:氟西汀、达泊西汀、西酞普兰等, 均存在 (S) -对映体及 (R) -对映体, 有不同的生理、药理活性。有报道证明固定化节杆菌属螺菌脂肪酶在动力学拆分氟西汀中间体时有良好的催化作用, 使用固定化酶催化反应中, 对映体过剩值、转化率、对映选择性全部具有显著性提高。
8 脂肪酶催化药物展望
经研究发现, 脂肪酶催化药物的研究具有着十分广阔的发展前景。虽然现有研究在深度以及广度上还具有一定的局限性。但是随着蛋白质工程、基因工程相关技术的不断发展, 可以为脂肪酶的进一步研究提供更广阔的发展空间, 可以有效降低脂肪酶的生产成本, 并进一步提高脂肪酶的选择性、活性、稳定性[5]。使得更多新型脂肪酶催化药物得到成功的研制, 并在临床上得以应用, 必将为人类的健康事业作出更大的贡献。
9 结论
本文通过对脂肪酶催化药物的合成及进展进行回顾性的总结分析。发现脂肪酶催化药物目前已经在抗炎镇痛药物、抗菌药物、维生素类药物、抗肿瘤药物、抗抑郁药物的合成方面发挥了一定的作用, 我们相信随着蛋白质工程、基因工程相关技术的不断发展, 可以为脂肪酶催化药物的进一步研究提供更加广阔的发展空间。有效克服因为脂肪酶种类不丰富、酶活性稳定性差、制备成本昂贵等方面带来的限制, 为脂肪酶催化药物的进一步发展提供更加可靠的理论依据。
摘要：脂肪酶可以水解三酸甘油酯, 进而产生单甘油酯、脂肪酸、双甘油酯以及甘油, 在有机溶剂中, 也可以催化一些逆水解反应, 例如:酯化、氨解、交酯化、交流酯化、肽解等相关反应。由于其具有的独特催化作用, 脂肪酶目前已经广泛应用在食品、皮革、造纸、洗涤剂、化工以及医药合成等多个领域, 而药物合成是脂肪酶研究的重点领域。本文对脂肪酶催化药物的合成及进展进行回顾性的总结分析。
关键词：脂肪酶催化药物,合成,进展
参考文献
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不同原料皮脂肪酶脱脂效果比较 篇8
脱脂是皮革生产中关键工序之一, 皮内天然脂肪脱除干净程度对最终成革的质量影响很大。天然油脂的存在将影响各工序化工材料的分散、渗透和结合速率, 影响皮革染色的均匀性[1]。传统脱脂方法有乳化法、皂化法、溶剂脱脂法等。随着皮革清洁生产技术的发展, 更高效、更环保的脱脂方法正在被不断地提出和研究[2~4]。近年来脂肪酶清洁化脱脂技术已经被越来越多的制革工程师所认识和采用, 关于脂肪酶脱脂技术的研究常有报道[5~8]。脂肪酶能够将天然油脂水解成游离脂肪酸和甘油 (或甘油单酯、甘油双酯) 而不会作用于皮胶原纤维。采用脂肪酶脱脂可以减少或消除表面活性剂的使用, 脱脂更均匀。
制革加工使用的原料皮不同, 组织结构不同, 脂肪含量及分布也存在较大差异[9]。猪皮毛囊几乎贯穿整个真皮层, 有非常发达的脂腺, 并有特殊的脂肪锥结构, 大量脂肪存在于脂腺和脂肪锥中[10], 此外在胶原纤维间还存在大量游离脂肪细胞;黄牛皮毛细, 脂腺较小, 胶原纤维间无游离脂肪细胞, 脂肪含量较小[11], 仅在每根针毛及绒毛毛囊旁有脂腺分布;山羊皮的胶原纤维束较细, 纤维编织也比较疏松, 山羊皮毛被稠密, 成簇分布, 毛囊两侧有发达的脂腺, 油脂含量较大;绵羊皮毛被稠密, 形成毛囊群, 每个毛囊周围都有发达的脂腺, 在乳头层和网状层的交接处还存在一条脂肪细胞带, 所以绵羊皮脂肪含量高[12]。
本论文采用脂肪酶对不同原料皮进行脱脂, 研究比较脂肪酶对不同动物皮的脱脂效果。
2 实验部分
2.1 主要原料及试剂
盐腌猪皮、盐腌牛皮、盐腌山羊皮、盐干绵羊皮, 购自成都当地制革厂。DH碱性脂肪酶 (酶活力50 000 U/g) , 深圳绿微康生物工程有限公司。分析用试剂均为分析纯, 其他试剂为工业级。
2.2 浸灰脱灰皮实验工艺
取一张浸水后的牛皮 (或猪皮, 或山羊皮, 或绵羊皮) , 称量, 作为以下工序用量依据, 大液比闷洗。
灰碱脱毛:100%水 (20 ℃) , 1.5%硫化钠, 0.2%JFC, 溶好后下皮转60 min。1.5%硫化钠, 2.0%石灰, 转120 min。2.0%石灰, 150%水, 转60min。以后转5 min, 停55 min, 转停5 次, 停鼓过夜。次日, 转30 min, 大液比水洗。
脱灰:100%水, 2.5%硫酸铵, 转60 min。当以酚酞指示剂检查臀部切口有1/5 红心, 且脱灰液p H在8.5~9.0 时, 脱灰停止, 水洗。
2.3 酶脱脂实验工艺
考虑到动物皮组织的纤维编织差异及脂肪分布差别, 为了保证平行试验的可比较性, 取浸水后的生皮或脱灰后的脱灰裸皮, 分别剪成面积为4 cm2左右的小皮块, 混合均匀, 备用。取上述准备的皮块一份, 称重, 作以下工序用料依据。
酶脱脂:200%水 (35~38℃) , 0.2%碳酸钠, 转15~20 min, p H值9.5。DH碱性脂肪酶100 U/g, 转2 h
停鼓, 大液比水洗。
2.4 油脂含量测定
用索氏提取法对皮块内油脂进行抽提, 抽提溶剂为二氯甲烷, 回流速率为7 次/h以上, 抽提6h以上。同时, 测定皮块水分含量, 并计算皮内油脂含量。
2.5 皮内脂肪分布组织学观察
脂肪酶脱脂前后的皮块用4%甲醛固定液 (磷酸盐缓冲液, p H值7.0) 固定24 h以上, 用Leica CM1950 冰冻切片机 (Leica, 德国) 进行冰冻切片, 切片厚度为20 μm。皮内脂肪用苏丹IV染液染色, 脂肪细胞及脂腺被染成红色。染色后的组织切片经甘油明胶封固后用Olympus CX41 光学显微镜 (Olympus, 日本) 观察并保存图像。
3 结果与讨论
动物皮组织可分为三层, 由外到内分别为表皮层、真皮层和皮下组织层。用于制革的主要部分, 真皮层分为乳头层和网状层, 乳头层上层胶原纤维细小编织紧密, 越向下胶原纤维编织越疏松, 网状层胶原纤维粗大编织相对紧密。脂腺多分布在乳头层和网状层交界处, 但不同的原皮种类, 胶原纤维编织和油脂分布不同。脂肪酶要对动物皮实现有效的脱脂, 首先需要渗透到脂腺分布处。表1 至表4 分别列出了不同原料皮和脱灰裸皮的油脂含量及经碱性脂肪酶DH脱脂后的脱脂率。
表1 所示为实验用猪、黄牛、山羊和绵羊原料皮的油脂含量。表1 中显示, 猪皮的油脂含量最高, 达到24.77%, 而黄牛皮油脂含量最低, 只有6.54%。
表2 列出的是各原料皮经碱性脂肪酶DH一次脱脂后的脱脂率。可以看出, 脂肪酶对猪皮的脱脂效果最为明显, 一次脱脂的脱脂率达到66.92%;而对其他来源的原料皮, 一次脱脂效果不佳, 其中对山羊皮和绵羊皮的一次脱脂率不到25%。
表3 中列出的是不同原料皮经脱毛、浸灰、脱灰后裸皮内的油脂含量, 结果显示与原料皮相比, 油脂含量得到不同程度的降低。表4 中列出的是不同脱灰裸皮经碱性脂肪酶DH一次脱脂后的脱脂率。可以发现, 脂肪酶对所有种类的脱灰裸皮脱脂率均达到50%以上。原料皮经浸灰膨胀并脱灰后, 脂肪酶的脱脂效果明显改善。图1 是脂肪酶DH对不同种类的生皮和脱灰裸皮脱脂率的对比结果。
由图1可见, 对于猪皮而言, 脂肪酶DH对生皮的一次脱脂效果与对脱灰裸皮的脱脂效果相当, 且都优于对其他种类皮的脱脂效果。这可能是由于猪皮中含有大量的游离脂肪, 而且脂肪锥底部在原料皮去肉时已经暴露在外, 有利于脂肪酶的作用, 使大量存在于此的油脂被脱除。经脂肪酶脱脂后的猪皮生皮的脂腺组织观察如图2所示。脂肪酶DH对牛皮原皮的脱脂率为34.02%, 而对脱灰牛裸皮的脱脂率达到53.17%。从牛皮组织结构特点进行分析不难发现, 虽然牛皮脂肪含量较少, 但脂肪绝大部分存在于脂腺中, 没有游离脂肪, 在脂肪酶脱脂过程中, 由于脂腺存在于乳头层和网状层交界处, 当酶从肉面进入时, 其渗透受到了较厚的网状层的阻碍;而当酶从粒面渗透时, 又因粒面层胶原纤维编织紧密而受到阻碍。然而, 牛皮经浸灰膨胀后, 纤维编织较生皮疏松, 有利于酶进入皮内到达脂腺部位作用于脂肪。图3为脱灰牛裸皮经脂肪酶脱脂前后, 皮内脂肪的分布情况。从图3中可以看出, 酶处理后的脂肪大多已经离开脂腺, 分散在皮纤维中。对于山羊皮生皮和绵羊皮生皮, 脂肪酶DH的一次脱脂效果均较差, 脱脂率不到25%。这是因为山羊皮和绵羊皮两者毛被较稠密, 毛囊成簇分布, 结构较紧密, 阻碍了酶对脂腺、脂肪细胞的作用。图4为山羊生皮经脂肪酶处理前后, 皮内脂肪组织切片图。由图4可见, 经脂肪酶处理后, 脂腺仍然较好的存在。但是, 山羊皮和绵羊皮经脱毛、浸灰后, 稠密的毛被已经被彻底清除, 皮纤维也得到适度的松散, 脂肪酶可以顺利作用于皮内的脂腺和游离脂肪细胞, 达到较好的脱脂效果, 脂肪酶对脱灰山羊皮和脱灰绵羊皮的脱脂率分别达到57.88%和53.73%。图5 为绵羊脱灰裸皮经脂肪酶处理前后的组织切片观察图。从图5 中可以看出, 脂肪酶作用后, 绵羊皮内的脂腺大部分已经被破坏, 油脂分散到皮纤维中。
4 结论
不同原料皮组织结构不同, 油脂在皮内分布不同, 脂肪酶对不同原料皮的脱脂效果有差异。猪皮特殊的脂肪锥结构有利于脂肪酶的渗透和作用, 酶法脱脂效果良好, 酶对生皮的脱脂率达到67%。牛皮皮厚, 胶原纤维编织较紧密, 脂肪分布于粒面层下层与网状层之间, 脂肪酶难以渗透, 酶对生皮的脱脂率只达到32%。山羊皮、绵羊皮油脂含量较大, 脂肪分布于粒面层下层毛囊周围及粒面层与网状层之间, 脂肪酶难以渗透, 酶对山羊生皮的脱脂率只有22%, 对绵羊生皮的脱脂率只有24%。脱毛浸灰脱灰后裸皮组织结构松散, 脂肪暴露, 有利于脂肪酶的脱脂。
参考文献
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根霉脂肪酶系统分离优化实验研究 篇9
脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶, 可将脂肪分解成甘油和脂肪酸, 机理主要是脂肪酶对甘油三酸酯的催化水解反应是亲核反应, 脂肪酶也是一种弱的亲核试剂[1]。脂肪酶广泛应用于食品、轻纺、皮革、精细化工、有机合成、医药等领域[2~4]。根霉属微生物是脂肪酶的重要生产菌, 从根霉菌中已分离到30多种脂肪酶, 且有多种根霉脂肪酶已被制成商品化酶制剂[5]。此外, 根霉脂肪酶大多具有高度的1、3位置专一性, 因而常用于油脂加工, 以提高油脂的品质[6]。
目前, 脂肪酶的分离纯化方法主要有双水相萃取分离法[7]、膜分离法[8]、硫酸铵—丙酮协同法[9]、免疫纯化法[10]、界面亲和层析法[11]。但这些方法都有各自的缺点, 如双水相萃取分离法的关键是找到与该种脂肪酶对应的双水相;膜分离法存在易堵塞的现象, 重复使用率不高;硫酸铵—丙酮协同法有酶回收率较低的现象;免疫纯化法是一种价格较昂贵的方法;界面亲和层析法的载体较昂贵, 机械强度低[12]。
本实验根霉脂肪酶成功筛选的基础上进一步对该酶的分离纯化方法进行研究, 旨在找出一种分离步骤少, 方法简单, 成本低廉, 分离能力强的分离纯化方法, 为该类脂肪酶性质的研究开拓道路。
2 实验的材料与方法
菌种:实验室自筛根霉。
仪器与设备:蛋白质纯化仪 (GE公司) 。
2.1 粗脂肪酶液制备
培养基:斜面培养基;产孢培养基;产酶基础培养基[13]。
粗脂肪酶液的制备:根霉菌株接种于斜面培养基, 置于28 ℃恒温箱中培养96h, 转至产孢培养基, 置于28 ℃恒温箱中培养96h, 转至产酶基础培养基, 于250mL三角烧瓶中, 28 ℃培养96h, 后用离子浓度为1/15mol/L的磷酸盐缓冲液浸提后既得脂肪酶液。
2.2 酶活力的测定及活力单位定义
脂肪酶活力的测定及酶活定义参见Gandhi N N[14]等。
2.3 固液比的优化
称量130g经过发酵的固体发酵培养基并研碎后均分成五份, 放在五个三角烧瓶中, 分别按固液比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5顺序加入pH值为7.5的磷酸盐缓冲液浸提酶液, 时间为4h, 然后测定各瓶浸提液中的酶活并记录。
2.4 浸提时间的优化
称量26g的经过发酵的固体培养基并用将其研碎, 后加入90mL缓冲液浸提, 开始计时, 每隔0.5h测一次浸提液的酶活力。
2.5 硫酸铵盐析饱和度的优化
取五份脂肪酶液, 每份为100 mL, 分别按10%, 20%, 30%, 40%, 50% 饱合度加入粉末状的硫酸铵盐后, 搅拌均匀, 在5 000r/min离心15min, 沉淀用pH值为7.5的磷酸盐缓冲液10mL溶解。分别测定上清液和其对应的沉淀的酶活为U1, U2。
2.6 Sephacryl S-300 HR柱层析洗脱流速的优化
粗分离得到的脂肪酶样品经透析袋透析后取1mL样, 在10 000r/min下离心15min, 然后上样进行分析, 洗脱速度分别采用0.5 mL/min、1.0 mL/min、1.5mL/min, 2.0mL/min, 2.5mL/min。在紫外280nm下监测记录峰形, 收集最高峰对应的流出液, 检测其脂肪酶酶活。
3 结果与分析
3.1 脂肪酶粗分离的浸提固液比
从图1中可以看出, 随着浸提固液比的增大, 溶解在浸提液中脂肪酶的酶活力逐渐升高, 固液比为1∶3时浸提液中脂肪酶的酶活力最高, 以后随着浸提固液比的增大, 浸提液中酶活力逐渐变小, 为了脂肪酶能够最大程度的溶解在浸提液和减少脂肪酶下游分离的难度, 该固体发酵脂肪酶的最佳浸提固液比为1∶3。
3.2 脂肪酶粗分离的最优浸提时间
从图2中可以看出从120min起到180min时, 溶解在浸提液中脂肪酶的量已经稳定。在120min后, 浸提液中酶活力没有变化, 所以浸提120min就可以提取培养基中的大部分脂肪酶, 可定120min浸提时间为最优浸提时间。
3.3 硫酸铵分级沉淀最佳饱和度的确定
在硫酸铵饱和度梯度下分离的脂肪酶液, 所对应的上清液和沉淀的酶活力结果见图3, 由图可知随着硫酸铵饱和度的升高, 上清液的酶活力逐渐降低, 沉淀部分的酶活力逐渐升高, 从40%硫酸铵饱和度开始, 脂肪酶分离得到的上清液就未检测到酶活, 而沉淀部分的酶活趋于稳定, 所以最佳硫酸铵饱和度为40%。
3.4 Sephacryl S-300 HR柱层析分离脂肪酶最佳洗脱流速的测定
从图4中可以看出, Sephacryl S-300 HR柱层析在选定的五个洗脱流速下都可以分离得到纯的脂肪酶。随着洗脱流速的增加, 分离得到的酶液酶活力也是逐渐增高, 在洗脱流速达到1.5mL/min时, 分离的酶液酶活力达到最高, 后随着洗脱流速的增大, 分离的酶液酶活力反而变小, 同时与光吸收的变化也是一致的。在洗脱流速为1.5mL/min时, 280nm紫外光下收集的分离液不仅光吸收值最大, 而且脂肪酶活力最高, 从而可以得出洗脱流速为1.5mL/min时为Sephacryl S-300HR柱层析纯化粗脂肪酶的最佳洗脱流速。
4 结语
本文对根霉脂肪酶分离实验进行系统优化。经实验测得最佳浸提固液比为1∶3, 最优浸提时间为120min, 在40%饱和度的硫酸铵可使脂肪酶沉淀达到最大。最后选用美国GE公司的蛋白质纯化仪配置的Sephacryl-S 300HR柱层析, 优化了洗脱流速, 最佳洗脱流速为1.5mL/min。
从实验中发现, 该菌产酶量低, 通过Sephacryl-S300HR洗脱下来的脂肪酶不能直接检测, 只能采取冷冻干燥后检测酶活。这也使得我们的实验进展延迟, 没能继续对纯酶的性质进行研究。建议以后可以对根霉菌的发酵培养基进行优化提高产酶量, 也可以尝试通过各种诱变方法提高产酶量。
摘要：利用固态发酵法生产根霉脂肪酶, 对影响此酶分离的多种条件进行了优化研究, 其中包括浸提固液比、浸提时间、硫酸铵饱和度和分子排阻凝胶层析的洗脱流速。得出了优化后条件为浸提固液比为1∶3, 浸提时间为120min, 硫酸铵饱和度为40%, 洗脱流速为1.5mL/min的结论。