脾脏淋巴细胞增殖（精选七篇）
脾脏淋巴细胞增殖 篇1
1材料与方法
1.1供试植物和提取物浸膏的制备
1.1.1供试植物多穗柯 (Lithocarpuslitseifolius (Hance) Chun) , 采自溆浦县君健中药材专业合作社多穗柯栽培基地;翻白草 (PotentilladiscolorBunge.) , 采自湖南株洲市攸县网领镇北平村;显齿蛇葡萄 (Ampelopsisgrossedentata (Hand-Mazz) W.T.Wang.) , 采自湖南怀化市鹤城区中坡山国家森林公园;灰毡毛忍冬茶 (LoniceramacranthoidesHand.Mazz.) , 购自湖南溆浦县能庄湾乡;羊耳菊 (Inulacappa (Buch-Ham.ExD.Don) DC.) , 采于湖南怀化市鹤城区石门乡。
1.1.2药用植物提物浸膏的制备取过100目筛的植物粉末, 用70%乙醇, 按体积质量比乙醇∶样品=10∶1的比例浸泡24h, 置于超声仪中提取, 再经减压浓缩干燥得到浸膏。
1.2五种药用植物提取物对大鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响
1.2.1大鼠脾脏淋巴细胞的制备参照郭振环等 (2010) 和程晓霞等 (2003) 所述方法, 取健康SD大鼠, 采用放血法处死后取出脾脏, 放入盛有5mL新鲜的Hank’s液的培养皿中, 将其结缔组织刮干净, 再转移至盛有新鲜Hank’s液的培养皿中, 进一步将其剪碎, 用无菌的注射器头轻轻地挤压钢筛上的脾脏组织, 然后用200目钢筛对盛有脾脏组织的Hank’s液进行过滤, 向滤液中加入红细胞裂解液后裂解, 800rpm离心10min, 收集底部白色沉淀, 利用Hank’s培养液重悬细胞, 800rpm离心10mim, 收集底白色沉淀, 重复2次, 管底的白色沉淀即为淋巴细胞。
1.2.2大鼠脾脏淋巴细胞的培养淋巴细胞中加入含有10%小牛血清的淋巴细胞培养液 (培养液中加有青链霉素) , 用移液枪轻轻吹打并重悬细胞, 台盼蓝染色后, 在显微镜下对活细胞进行计数。加入适量的淋巴细胞培养液调至5×105个/mL。将上述培养液加入到细胞培养瓶中, 37℃、5% CO2+95%空气的培养箱中培养。定期的观察细胞的生长状况, 保证每2~3天进行一次细胞传代培养。
1.2.3大鼠脾脏淋巴细胞实验分组将淋巴细胞分别与5种提取物混合, 用淋巴细胞培养液调整至5×105个/mL。将上述添加了提取物的淋巴细胞培养液分别加入到96孔细胞培养板中, 各浓度设4个复孔, 每孔200μL。不加药液的淋巴细胞悬液为对照组, 经加入细胞培养基来调节未加药液的细胞悬液的细胞浓度, 保证二者的细胞浓度相同;同样向细胞悬液当中加提取物及ConA, 其对照组仍然为细胞悬液, 各浓度均设4个复孔;向培养板中加入200μL含ConA的细胞悬液, 其对照组仍为细胞悬液。以上含ConA的处理组中ConA的终浓度均为5μg/mL。
再将五种提取物溶于含10%小牛血清的改良型RPMI1640培养液中, 配成8000μg/mL药物母液, 再用含10%小牛血清及青链霉素的RPMI1640培养基分别将母液稀释成1600、800、400、200、100μg/mL。将细胞悬液与ConA混合, 调整细胞浓度为1×106个/mL, ConA的浓度为0.01mg/mL, 按表1加入培养板中置于37℃、5% CO2+95%空气的培养箱中培养72h。
1.2.4大鼠脾脏淋巴细胞增殖的检测72h后, 取出培养板, 向各孔中加入20μLMTT (5mg/mL) , 继续培养4h后, 1000rpm离心10min, 取上清液, 向各培养孔中加入100μLDMSO, 震荡10min, 以溶解沉淀于淋巴细胞内的紫色结晶甲瓒, 492nm波长测各孔的吸光值。
1.3 数据处理
实验数据用SPSS13.0统计软件进行单因素方差统计分析, 选用LSD进行多重比较。计算各平行孔的平均值和标准差。细胞存活率 (%) =实验组吸光值/对照组光吸收值。
2结果与分析
2.1形态学检测药用植物提取物对大鼠淋巴细胞的增殖作用
图版1可看出, 图a细胞的细胞核明显, 因为养料充足, 细胞间空隙较大。图b、c、d中随着时间增加, 细胞密度不断增大, 细胞体积变小。图版2到图版6显示, 同一种提取物随着处理时间的延长, 细胞的增殖效应越明显。48h后, 培养孔中的细胞数量多, 出现了层叠和聚集。因为细胞的大量增殖, 浓度过高, 出现细胞的沉淀并聚集。淋巴细胞受提取物刺激后, 增殖速度快, 出现聚集沉淀。表明提取物有促进大鼠淋巴细胞增殖的作用。
2.2 MTT法测定药用植物提取物对大鼠淋巴细胞的增殖作用
将培养了72h的细胞于492nm处波长检 测其OD值, 结果用SPSS13.0软件进行单因素方差分析如表2。每种提取物都有最佳的浓度, 当浓度高于或者低于最佳浓度时, 其增殖效果不理想。无ConA协同作用时, 多穗柯作用于脾脏淋巴细胞后结果的波动性大, 当浓度为800μg/mL时其增殖效果最佳。翻白草与脾脏淋巴细胞增殖之间存在剂量关系, 在浓度为400μg/mL时, 增殖效果最佳。灰毡毛忍冬茶提取物对脾脏淋巴细胞的增殖效果不如其它四种活性强, 但仍有增殖效果, 其最佳浓度为800μg/mL。羊耳菊对脾脏淋巴细胞增殖的最佳浓度为400μg/mL。显齿蛇葡萄提取物的细胞增殖效果最好, 其最佳浓度为800μg/mL。
当有ConA协同作用时, 羊耳菊与显齿蛇葡萄对淋巴细胞增殖的最适浓度为800μg/mL, 多穗柯、翻白草、灰毡毛忍冬茶的最适浓度分别为400、100、200μg/mL, 但同种药用植物提取物在促进淋巴细胞增殖效果的差异性并不明显 (P≥0.05) 。用MTT法检测细胞增殖活性的同时, 用显微镜对不同药物在不同时间下的对细胞增殖的影响也进行了观察, 结果显微镜下观察的结果与MTT法测得的结果完全相符。
注:* 表示与对照组相比 P≥0.05;* * 表示与对照组相比 P≤0.05。
3讨论
ConA能较好的刺激淋巴细胞的分裂增殖 (聂小华等, 2003;何宏文等, 2003;谢鹏等, 2005;阎莉等, 2009) , 研究表明, 各提取物均能刺激大鼠脾脏淋巴细胞分裂增殖。醇提物对促进大鼠淋巴细胞的增殖作用可能存在某种剂量关系, 只在某一浓度, 才在总体上表现出最好的增殖活性。各提取物与ConA协同作用的结果表明, 淋巴细胞的增殖效果并不显著, 且同种提取物各浓度间增殖作用的影响波动较大, 无法反映其剂量依赖关系。某些组织再生增强因子能抑制ConA诱导的淋巴细胞增殖作用 (陈曜, 2007;熊筱娟等, 2001) , 本研究中没有观察到ConA与这5种植物醇提物促进淋巴细胞增殖的协效应。显齿蛇葡萄与ConA协同作用时, 对脾脏淋巴细胞增殖较其单独作用时效果差, 可能是ConA能抑制显齿蛇葡萄的作用效果。
在众多的化学成分中, 黄酮类化合物作为一种免疫活性物质, 对机体的细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫有一定的刺激作用 (谢鹏和张敏红, 2005) 。结果表明, 上述五种植物醇提物的有效成分主要为黄酮类化合物 (孔祥峰等, 2004;王林青等, 2008;刘胜贵等, 2009;李胜华等, 2010, 2013) , 理论上这些药用提取物能有效的刺激淋巴细胞的增殖, 增强机体的免疫作用。我们将在下一步的研究中, 分别提取这些药用植物的黄酮类化合物, 进一步确定它们免疫调节能力的强弱是否主要由黄酮类化合物的差异决定。
参考文献
[1]王德云, 胡元亮, 孔祥峰, 等.中药成分对培养的鸡脾脏淋巴细胞增殖的影响[J].畜牧兽医学报, 2005, 36 (11) :1210~1214.
[2]孔祥峰, 胡元亮, 李祥瑞, 等.9种中药成分对新城疫IV系疫苗免疫雏鸡血清中血凝抑制抗体水平的影响[J], 畜牧兽医学报, 2004, 35 (4) :468~472.
[3]李胜华伍贤进向晓军多穗柯有效成分的提取及抑菌效果研究, 食品科技2010 35 (3) :211-214.
[4]Li Shenghua, Zeng Junying, Tan Juan, et al.Antioxidant and hepatoprotective effects of Lithocarpus polystachyus against carbon tetrachloride-induced injuries in rat[J]Bangladesh J Pharmacol 2013;8:420-427.
[5]伍贤进, 毛倩, 刘胜贵, 等.翻白草提取物的抑菌作用研究[J], 辽宁中医杂志, 2007, 34 (9) :1295~1296.
脾脏淋巴细胞增殖 篇2
一、有丝分裂与减数分裂
1. 有丝分裂与减数分裂染色体数目和DNA含量比较（假定正常体细胞的细胞核中DNA含量为2a，染色体数目为2N）
[&染色体行为&同源
染色体&染色
单体&细胞名称&DNA数目&染色体数目&有丝分裂&间期&复制&N对&0→4N&体细胞&2a→4a&2N&前期&螺旋化&N对&4N&4a&2N&中期&着丝点排列于赤道板&N对&4N&4a&2N&后期&着丝点分开，染色单体成为染色体&2N对&4N→0&4a&2N→4N&末期&解螺旋化&N对&0&4a→2a&2N&减数第一次分裂&间期&复制&N对&0→4N&初级性母细胞&2a→4a&2N&前期&联会、四分体&N对&4N&4a&2N&中期&同源染色体排列于赤道板位置&N对&4N&4a&2N&后期&同源染色体彼此分离&N对&4N&4a&2N&减数第二次分裂&间期&无或很短&0&2N&次级性母细胞&2a&N&前期&螺旋化&0&2N&2a&N&中期&着丝点排列于赤道板&0&2N&2a&N&后期&着丝点分开，染色单体成为染色体&0&2N→0&&N→2N&末期&解螺旋化&0&0&性细胞&a&N&]
2. 有丝分裂和减数分裂染色体、DNA的变化曲线的比较。
[减数分裂染色体的变化
二、种子及胚胎的形成、发育、生长
1. 被子植物的个体发育
胚体][胚柄][多次分裂][胚][消失][ 或者消失][胚乳][种皮][种子][果实][植株][子叶][胚芽][胚轴][胚根]
2. 动物的个体发育
神经系统、感觉器官][卵裂][幼体][骨骼、肌肉及循环、
排泄、生殖系统等][肝脏、胰脏等腺体
消化道、呼吸道上皮][爬行类、鸟类、哺乳类和人类在胚胎发育的早期形成的羊膜，内有羊水，为胚胎发育提供水环境，防止震动、保护胚胎][胚后发育][幼体][幼体与成体相似][幼体与成体不同][直接发育][变态发育][成体]
三、细胞工程
1. 动物细胞工程和植物细胞工程
[细胞工程&植物细胞工程&动物细胞工程&基本原理&细胞生物学和分子生物学的原理和方法，工程学手段改造细胞&操作水平&细胞整体水平、细胞器水平操作&实质内容&改变遗传物质、产生新的性状，获得细胞产品&技术手段&植物细胞杂交技术
植物细胞融合技术
植物组织培养技术&动物细胞培养
动物细胞融合、单克隆抗体制备技术
胚胎移植、核移植等&理论基础&植物细胞全能性&细胞增值&诱导手段&物理法：离心、振动、电刺激
化学法：聚乙二醇&物理：电刺激
化学：聚乙二醇
生物：灭活病毒（灭活仙台病毒）&诱导过程&1.纤维素酶、果胶酶去除细胞壁
2.原生质体融合，获得杂种原生质体
3.植物细胞培养，获得细胞产品&1.用胰蛋白酶处理，获得分离的单个动物细胞
2.诱导融合，获得杂种原生质体
3.动物细胞培养，获得细胞产品&应用&白菜—甘兰等杂交植物&单克隆抗体的制备（杂交瘤细胞）&]
2. 动物细胞培养与植物细胞培养比较
[ &动物细胞培养&植物细胞培养&原理&细胞的增殖&细胞的全能性&细胞来源&胚胎或幼龄动物组织、器官&离体植物器官、组织或细胞&培
养
基&状态&液 态&固 态&成分&天然培养基&合成培养基&组成&葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清&矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素、有机添加物&器皿&培养瓶&锥形瓶&过程&原代生长，传代生长&更换培养基，细胞增值分化&生长特点&贴壁生长，细胞增值不分化&诱导形成愈伤组织，细胞增值分化&细胞进行异养需氧代谢&接种
前处理&灭菌、用胰蛋白酶使组织分散成单个细胞&灭菌&培养条件&恒温、无菌、无需光照&常温、无菌、光照条件&培养目的&1.生产蛋白质生物制品
2.获取大量细胞
3.检测有毒物质&1.快速繁育无病毒植株
2.生产药物、食品添加剂、香料、色素、杀虫剂等&培养结果&细胞株→细胞系&愈伤组织→植株&]
【考情分析】
1. 细胞增殖部分的考题主要涉及不同细胞的增殖方式、有丝分裂和减数分裂各个时期的主要细胞结构特征、DNA和染色体数目的变化规律以及分裂各个时期图像的识别等方面内容。
2. 生殖与发育部分在近几年高考试卷出现较多的有：有性生殖的概念及意义、无性生殖的概念和意义、植物胚和胚乳的发育、动物的胚胎发育与胚后发育等。要求同学们能从分子水平、细胞水平、个体水平、物种水平等层面理解生物生殖和发育，并形成知识网络结构。能运用本专题相关知识，对某些生物问题进行解释、推理，做出合理的判断或得出正确的结论。
3. 细胞工程是当前生命科学研究的热点和前沿内容之一，本考点主要考查动植物细胞工程的原理、过程、方法及在实践中的应用，内容极易与细胞的结构和功能以及基因工程等内容综合出题，以考查同学们的综合分析能力。试题常以选择题的形式出现，也可以非选择题形或图文信息转换题的形式呈现。
【考点例析】
例1 （09天津）下列选项中，两类细胞的染色体数目均可呈周期性变化的是（ ）
A. 蛙的红细胞与淋巴细胞
B. 小鼠骨髓瘤细胞与杂交瘤细胞
C. 人的胚胎干细胞与成熟红细胞
D. 牛的精细胞与精原细胞
解析 染色体数目呈周期性变化，一定是处于分裂期的细胞。题中蛙的红细胞、淋巴细胞、成熟的红细胞、牛的精细胞均不再分裂；小鼠骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞以及精原细胞都具有细胞周期，能进行分裂，所以B正确。
答案 B
点评 本题考查细胞增殖在各种细胞中的发生情况。同学们应明确哪些细胞能分裂，哪些细胞不能分裂；间接考查了组成生命个体的细胞存在状态的多样性。不熟悉特定细胞的特征是同学们做错该题的主要原因，在复习备考过程中同学们在复习细胞的增殖、分化过程中，应注意各种细胞的特征。
例2 （10安徽）雄蛙的一个体细胞经有丝分裂形成两个子细胞（C1、C2），一个初级精母细胞经减数第一次分裂形成两个次级精母细胞（S1、S2）。比较C1与C2、S1与S2细胞核中DNA数目及其贮存的遗传信息，正确的是（ ）
A. DNA数目C1与C2相同，S1与S2不同
B. 遗传信息C1与C2相同，S1与S2不同
C. DNA数目C1与C2不同，S1与S2相同
D. 遗传信息C1与C2不同，S1与S2相同
解析 本题考查有关细胞分裂相关知识C1、C2是细胞有丝分裂形成的，而有丝分裂重要特征是亲代细胞的染色体经复制后平均分配到两个子细胞中，保持遗传物质的稳定性，所以C1和C2的遗传信息相同；而S1和S2是减数第一次分裂形成的两个次级精母细胞，减数第一次分裂的重要特征是同源染色体平分子细胞，染色体数目减半，有染色单体，无同源染色体，所以遗传信息不同。
答案 B
点评 本题以DNA和染色体数目、细胞分裂状态为情景，考查细胞增殖过程中DNA、染色体数目的变化规律和同学们对分裂各个时期的特征及生物学意义的理解。
例3 （09江苏）对性腺组织细胞进行荧光标记，等位基因A、a都被标记为黄色，等位基因B、b都被标记为绿色，在荧光显微镜下观察处于四分体时期的细胞。下列有关推测合理的是（ ）
A. 若这2对基因在1对同源染色体上，则有1个四分体中出现2个黄色、2个绿色荧光点
B. 若这2对基因在1对同源染色体上，则有1个四分体中出现4个黄色、4个绿色荧光点
C. 若这2对基因在2对同源染色体上，则有1个四分体中出现2个黄色、2个绿色荧光点
D. 若这2对基因在2对同源染色体上，则有1个四分体中出现4个黄色、4个绿色荧光点
解析 本题考查的是减数分裂过程中出现的四分体的结构特点。在减数第一次分裂时，同源染色体联会形成四分体。等位基因位于同源染色体上，若这2对基因在一对同源染色体上，由于经过了间期DNA的复制，则1个四分体中有2个A，2个a，2个B，2个b，即1个四分体中出现4个黄色、4个绿色荧光点。若在2对同源染色体上，则四分体中只有A、a或者只有B、b，不能同时存在。
答案 B
点评 本题考查的是减数分裂过程中出现的四分体的结构特点，属于分析推理层次。要求同学们能准确把握四分体的形成。对四分体概念不清易误选D。
例4 （09全国）下列关于植物体细胞杂交或植物细胞质遗传的叙述，错误的是（ ）
A. 利用植物体细胞杂交技术可克服生殖隔离的限制，培育远缘杂种
B. 不同种的植物原生质体融合的过程属于植物体细胞杂交过程
C. 两个不同品种的紫茉莉杂交，正交、反交所得F1的表现型一致
D. 两个不同品种的紫茉莉杂交，F1的遗传物质来自母本的多于来自父本的
解析 植物体细胞杂交可以用两种不同的植物细胞，从而可克服生殖隔离的限制，A正确。植物体细胞杂交的过程，实际上是不同植物体细胞的原生质体融合的过程，B正确。紫茉莉枝叶的性状的遗传是细胞质遗传，两个不同品种的紫茉莉杂交，正交、反交所得F1的表现型应与母本一致，F1的遗传物质来自母本的多于来自父本的，因为受精卵中的细胞质几乎全部来自母本，C错误，D正确。
答案 C
点评 本题综合考查了植物体细胞杂交和植物细胞质遗传的相关内容。要求同学们能从细胞学角度对通过植物体细胞杂交或植物细胞质遗传产生的后代的遗传特性进行分析，得出科学结论。同学们对植物体细胞杂交或植物细胞质遗传的本质不理解作错该题的主要原因，在复习过程中应注意这两个过程的理解。
例5 （09全国）下列有关哺乳动物个体发育的叙述，错误的是（ ）
A. 胚胎发育过程中也会出现细胞衰老
B. 幼鹿经过变态发育过程长出发达的鹿角
C. 胚后发育过程中伴有细胞分化
D. 来自原肠胚同一胚层的细胞经分化发育成不同的组织
解析 多细胞生物体内的细胞总是在不断地更新着，总有一部分细胞处于衰老或走向死亡的状态，因此胚胎发育过程中也会有细胞衰老，A正确。变态发育指成体与幼体在形态上的差别比较大，而这种形态的改变又是集中在短期内完成的，因此B不正确。细胞分化发生在整个生命进程中，在胚胎时期达到最大程度，C正确。原肠胚中胚层的细胞可以发育为皮肤的表皮，感觉器官，神经系统，内胚层发育为呼吸道的上皮、消化道上皮、肝脏及胰腺，其它的基本都是由中胚层发育而来，D正确。
答案 B
点评 本题考查哺乳动物个体发育过程。要求同学们在正确区分胚胎发育和胚后发育的基础上，能从细胞水平对动物发育的过程的重要阶段的变化做出合理的解释。同学们对植物胚和胚乳的发育，动物的胚胎发育与胚后发育不熟是作错该题的主要原因。复习过程中要求同学们在理解生物个体发育过程的同时，能从分子水平、细胞水平、个体水平、物种水平等层面去解释生物生殖和发育，并形成知识网络结构。
【实战演练】
配套练习五
一、选择题（5题，每题6分）
1. 下图是按顺时针方向表示的4种植物细胞的细胞周期，其中叙述正确的是（ ）
A. 观察植物细胞有丝分裂的实验材料最好是选植物甲
B. 在植物乙的a→b段，DNA和染色体数目均增加一倍
C. 温度对植物丙a→b段的生理活动没有影响
D. 甲植物和丙植物的b→a段所用的时间可能一样长
2. 假设将含有一对同源染色体的精原细胞的DNA分子用15N标记，并供给含14N的原料，该细胞假设进行2次有丝分裂产生的4个精原细胞和假设进行减数分裂产生的4个精子中，含15N标记的DNA的精原细胞、精子所占比例可能分别为（ ）
A. 25%，0 B. 50%，25%
C. 75%，50% D. 100%，100%
3. 下列关于生物个体发育的叙述，正确的是（ ）
A. 被子植物的个体发育包括胚的发育和胚乳的发育两个阶段
B. 荠菜受精卵经过4次分裂可形成8个细胞的球状胚体
C. 脊椎动物胚胎发育过程中都形成羊膜
D. 人的受精卵在卵裂过程中所需要的能源物质由母体提供
4. 植物细胞工程通常采用的技术有植物组织培养和植物体细胞杂交，两大技术共同的理论基础是（ ）
A. 植物细胞能进行有丝分裂
B. 植物细胞具有全能性
C. 植物体的生命活动受激素调节
D. 细胞膜的流动性
5. 下面是“白菜-甘蓝”杂种植株培育过程示意图。在提供的几种说法中正确的是（ ）
体细胞][白菜
原生质体][甘蓝
体细胞][甘蓝
原生质体][正在融合的
原生质体][杂种细胞][愈伤组织][白菜甘蓝
幼苗]
A. 在杂种细胞形成杂种植株的过程中，只有细胞分裂，没有细胞分化和器官形成
B. 杂种细胞、愈伤组织和幼苗都能进行光合作用，在由杂种细胞形成杂种植株的过程中始终需要适宜的光照、适宜的温度、植物激素和无菌等条件
C. 植物组织培养和动物细胞培养的培养基、培养目的完全不相同
D. 诱导动物细胞融合不同于诱导原生质体融合的方法是可用灭活的病毒作为诱导剂
二、填空题（3题，每空X分，共计42分）
6. 1855年德国学者魏尔肖（R. Virchow）提出“一切细胞来自细胞”的著名论断，即认为个体的所有细胞都是由原有细胞分裂产生的。现在除细胞分裂外还没有证据说明细胞繁殖有其他途径，可以说细胞分裂是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。以下是与细胞分裂有关的一些图像，请据图回答相关问题：
（1）若图①表示某植株体内的一个正在进行分裂的体细胞，则此细胞的下一个时期的主要特点是 。
（2）若图②表示某高等雄性动物睾丸里的一个正在进行分裂的精原细胞，其细胞内染色体上的基因A、a、B、b分布如图，那么此细胞分裂得到子细胞其基因型是 。
（3）如图③是某高等雌性动物体内的一个细胞，它的名称是 ，该细胞有 条染色体， 条染色单体。
（4）图中④中AB段对应细胞周期的 ，该时期的主要特点是 。
7. 现有供实验用的三组番茄：甲、乙两组在开花之前进行了去雄和套袋处理；甲组在套袋之前将雌蕊涂抹了一定浓度的生长素溶液；丙组不作任何处理。试就该实验进行分析：
（1）将来能够发育成果实的是 ，而 将发育为无子果实。
（2）甲、乙组结果对比，说明 。
（3）乙、丙组结果对比，说明了传粉后，子房能发育成果实，可能与正常受粉后能结出种子有关。为进一步验证这一结论，还应有的操作是，在丙组的幼小子房阶段，除去里面的 ，结果子房停止发育。
（4）将甲和第（3）小题的处理对比研究，得出的结论是：正常子房发育成果实需要的 来自 。
8.下列是制备分泌抗X抗体的过程，根据图解回答问题：
下只能存活几天）][（在正常培养基中无限增殖，在选择培养基中死亡）][①][②][③][④][⑤][⑥][融 合][放在多孔培
养板中生长][在选择培
有杂交瘤][养基中只
细胞生长][检测上清液中
阳性细胞克隆][抗X抗体并用
每孔一个细胞][让细胞繁殖，检测
阳性细胞连续培养][上清液中的抗X抗体；
提供抗X抗体]
（1）制备单克隆抗体的步骤：
①将 注入小鼠体内，从小鼠脾脏中获得淋巴细胞，其中至少1个淋巴细胞带有抗该抗原的抗体；
②将步骤①获得的B淋巴细胞与步骤②培养的骨髓瘤细胞可用特有的 诱导融合；
③将诱导后产生的多种细胞，放在含 培养基的多孔培养板上培养，筛选；
④这样获得的杂交瘤细胞具有 的能力；
⑤检测和分离带有抗X抗体的阳性细 胞，培养板中每孔放一个细胞进行培养；
⑥将阳性细胞进行 或 培养，从而制备出大量单克隆抗体。
（2）用本法制备出的单克隆抗体仍具有局限性，因为它是用小鼠的 细胞制备的，具有 性，对人类会产生免疫原性。
配套练习六
一、选择题（5题，每题6分）
1. 科学家在研究蚕豆根尖分生区细胞的有丝分裂周期时，分别用放射性同位素15N标记胸腺嘧啶脱氧核苷酸（15N-TdR），用32P标记尿嘧啶核苷酸（32P-UdR），把两种核苷酸被细胞利用的速率绘成曲线如图一所示。已知蚕豆根尖细胞有丝分裂周期为20h。培养20h后，根据细胞DNA含量不同，将细胞分为三组，每组的细胞数如下图二。下列对结果的分析，不正确的是（ ）
A. 乙组细胞处于ce段，此阶段细胞最容易发生基因突变
B. 蚕豆根尖细胞有丝分裂周期中，分裂期时间不超过6h
C. 丙组中只有部分细胞的细胞膜从中部向内凹陷
D. 甲组有部分细胞处于ac段，RNA聚合酶活性高
2. 细胞分裂是生物体一项重要的生命活动，是生物体生长，发育，繁殖和遗传的基础。据图叙述不正确的是（ ）
A. 若某植株的一个体细胞正在进行分裂如①，此细胞的下一个时期的主要特点是着丝点分裂
B. 假设某高等雄性动物睾丸里的一个细胞分裂如②，其染色体A、a、B、b分布如图，此细胞产生染色体组成为AB的精子概率是1/4
C. ③是某高等雌性动物体内的一个细胞，在分裂形成此细胞的过程中，细胞内可形成3个四分体
D. ②对应于④中的BC段，③对应于④中的DE段
3. 下图表示在不含放射性元素的环境中，大豆（体细胞中染色体数2N=40）的生殖与发育过程中发生的一些重要变化。下列有关分析中，不科学是（ ）
[植物体（2N）][细胞甲（N） 细胞丙（3N） 结构戊（可储存营养）][细胞乙（N） 细胞丁（2N）][结构庚][球状胚体 结构己] [①] [②][③][①][②][③][⑤][⑥]
A. 处于①的减数第二次分裂过程中的细胞含有20条染色体
B. 如果土壤中严重缺硼，则该植物将不能顺利地完成过程②
C. 结构庚可以从结构戊中吸收并运送营养物质供球状胚体发育
D. 若细胞丁中某个核DNA双链含15N，则己中一个细胞含15N
4. 在动物细胞培养的叙述中，错误的是（ ）
A. 动物细胞培养的目的不仅是为了获得大量的分泌蛋白
B. 培养至细胞系时遗传物质已发生了改变
C. 培养液中加入动物血清是为了诱导细胞脱分化
D.将鼠骨髓瘤细胞与经过免疫的B淋巴细胞融合成杂交瘤细胞可制备单克隆抗体
5. 下表为植物组织培养和动物细胞培养有关内容的比较，其中错误的有（ ）
A. 0处 B. 1处 C. 2处 D. 3处
二、填空题（3题，每空X分，共计42分）
6. 下图甲是某种高等生物在生殖发育过程中细胞内染色体数目变化曲线，图乙是该生物体内若干细胞的结构模式图。请分析回答：（[ ]中填罗马数字或者阿拉伯数字， 上填名称。）
（1）该生物个体发育的起点是受精卵，它是通过甲图中的[ ] 过程形成的。受精卵发育成为完整个体过程中主要依靠 过程，这是由于细胞体积不能无限增大，细胞体积越大，相对表面积 （越大、越小、不变）。
（2）同源染色体的分离发生在甲图中的 阶段（填Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）。乙图A、B、C中含有同源染色体的是 （填字母）。乙图A细胞所示时期对应在甲图中 阶段（填阿拉伯数字）。
（3）乙图B细胞所处的分裂时期有 个染色体组；C细胞叫做 。形成该细胞的场所是 。
（4）利用显微镜观察该生物体细胞中的染色体数，最多可观察到 条。若该生物的遗传组成如乙图所示，在不考虑基因突变等因素的情况下，该生物体能够产生 种配子。
7. 下图为蛙受精卵的发育过程示意图，据图回答问题：
（1）按蛙的胚胎发育过程排列图的次序，应该是
（2）标号①和②分别表示 和 ，在卵裂过程中 极的细胞分裂周期短。标号③内的腔是 。
（3）标号⑦是不断缩小的 腔，用同位素标记标号③上方的细胞，这些标记将会出现在D图中的 处细胞中。
（4）机体运输养料和废物的系统由[ ] 发育而来，只能分泌蛋白酶的消化腺体由[ ] 发育而来。
8. 自然界的细胞融合产生有性后代，细胞工程中细胞杂交被广泛应用于培育杂种植株和生产单克隆抗体等方面。请回答以下相关问题：
b][c][d][细胞融合][有性杂交后代
体细胞杂种植株
单克隆抗体]
（1）若a、b分别为精子和卵细胞，则产生a、b的分裂方式是 。
（2）若a、b表示体细胞，则由d细胞形成杂种植株的原理是 ，其中使用了植物组织培养技术，该技术的中心环节是形成愈伤组织，然后诱导它再分化形成植株，再分化的原理是 ，植物体细胞杂交的意义是该技术能克服 。
脾脏淋巴细胞增殖 篇3
应用组织学和免疫组织化学方法研究了单色光对产蛋期蛋鸡脾脏组织结构及脾细胞增殖的影响。结果显示:在白光条件下饲养的蛋鸡, 各周龄脾小体直径间差异不显著 (P>0.05) , 37周龄脾动脉周围淋巴鞘面积比29周龄减小13.34% (P<0.05) 。29周龄和37周龄蓝光组脾小体直径比白光组分别极显著增加20.94%和20.27% (P<0.01) , 29周龄和37周龄蓝光组脾动脉周围淋巴鞘面积比红光组分别极显著增加42.01%和36.46% (P<0.01) 。蓝光组29周龄和37周龄脾小体直径均极显著高于20周龄和52周龄脾小体直径 (P<0.01) ;蓝光组29周龄脾动脉周围淋巴鞘面积极显著高于其他周龄 (P
脾脏淋巴细胞增殖 篇4
1 材料
DSS, 购自Pharmacia公司;活性氧探针双氯荧光黄乙酸乙酯 (DCFH-DA) , 购自碧云天生物技术公司;Annexin-V和PI双染凋亡检测试剂盒, 购自e Bioscinedce公司 (美国) ;Balb/c小鼠, 雄性, 体重为18~22 g, 购自吉林大学实验动物中心。
2 方法
2.1 DSS诱导小鼠结肠炎模型
对照组和模型组各10只小鼠。用1%DSS灌胃诱导建立结肠炎模型:每次1 m L, 每日3次, 2周后观察小鼠腹泻、血便情况。
2.2 脾脏指数的测定和脾脏淋巴细胞的收集
取小鼠, 称量体重;脊髓离断后, 剪开小鼠腹腔, 取出脾脏, 称其重量, 计算脾脏重量与小鼠体重的比值, 即脾脏指数。将脾脏剪为小组织块, 在200目筛网上研磨分散组织, PBS冲洗并收集细胞悬液, 离心洗涤2次, 细胞悬液定容为10 m L。
2.3 细胞计数和细胞凋亡
取2 m L细胞悬液, 加入等量的红细胞裂解液, 室温条件下处理5 min, 待红细胞裂解后, 离心洗涤2次。用结合缓冲液调整细胞密度为2×106/m L, 取190μL细胞悬液, 加入10μL FITC-标记AnnexinV, 室温条件下避光反应15 min;离心弃上清液, 加入结合缓冲液500μL, 再次洗涤后用475μL结合缓冲液重悬细胞, 接入PI溶液25μL, 混匀后立即用流式细胞仪分析。
2.4 细胞内POS
用PBS调整细胞悬液的密度为2×106/m L, 取500μL细胞悬液, 加入DCFH-DA储存液, 至其终浓度为5μmol/L, 混匀后于37℃避光反应30 min, PBS洗2次后用流式细胞仪分析。
2.5 统计学分析
采用SPSS 10.0软件对试验数据进行处理, 试验数据以±s表示, 采用t检验进行统计学分析。
3 结果与分析
3.1 DSS对脾脏指数的影响
用1%DSS灌胃处理2周后, 小鼠出现活动量减少和血便等现象, 说明小鼠结肠炎模型构建成功。对照组和模型组脾脏指数分别为 (0.005 64±0.000 31) 和 (0.004 21±0.000 27) , 即DSS诱导后小鼠免疫器官脾脏呈衰退表现。对照组和模型组脾脏淋巴细胞数分别为 (2.53±0.21) ×106/m L和 (1.77±0.16) ×106/m L, 即DSS诱导后小鼠脾脏中淋巴细胞数量减少。
3.2 DSS对脾脏淋巴细胞凋亡的影响
经流式细胞仪分析发现, 对照组和模型组凋亡细胞率分别为 (4.8±1.3) %和 (32.5±4.7) %, 即DSS诱导后小鼠脾脏淋巴细胞凋亡率增加。
3.3 DSS对脾脏淋巴细胞ROS的影响
经流式细胞仪分析发现, 与对照组比较, DSS诱导后ROS的相对含量显著增加, 见图1。
4 讨论
IBD是一组病因不明的慢性肠道炎症性疾病, 免疫功能紊乱在其发病机制中占主导地位, 在IBD患者肠道中渗透着大量炎症细胞, 包括巨噬细胞和中性粒细胞[10]。研究表明, 炎症细胞产生的ROS不仅将炎症肠道暴露于氧化应激之中, 同时还导致组织损伤、肠道通透性增加、菌群失调, 肠道微生态失衡可能改变局部免疫应答的平衡, 使肠道局部免疫应答向病理性应答转化[11,12]。DSS是最常用的诱导IBD动物模型的化学诱导剂, 具有操作简单、成模率高、病理表现与人IBD相近等优点。本研究发现, DSS诱导小鼠结肠炎后, 脾脏指数下降, 脾脏淋巴细胞数量减少, 脾脏淋巴细胞凋亡率增加, 淋巴细胞ROS水平显著增加。有学者报道, DSS对体外培养的淋巴细胞呈双相作用, 浓度较低时促进B淋巴细胞和T淋巴细胞的活化、增殖;而高浓度时可导致细胞凋亡或坏死。本试验结果表明, 在DSS诱导结肠炎模型建立的用量下, 小鼠淋巴细胞大量凋亡。一定浓度的ROS是细胞生长、增殖的刺激剂, 但高浓度的ROS可启动JNKs等应激细胞, 导致细胞发生凋亡和坏死。
概括而言, 在本研究的DSS用量下, 小鼠淋巴细胞可能因为过量的ROS而死亡, 从而使淋巴细胞数量减少, 导致免疫功能紊乱。DSS诱导后ROS对细胞内凋亡相关信号途径和信号转导分子的影响还需要深入研究。
参考文献
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脾脏淋巴细胞增殖 篇5
目前, 实验室中常用于检测淋巴细胞转化和增殖的方法主要有3H-Td R掺入法和MTT法[1,2]。3H-Td R掺入法虽然敏感性较高, 但需要实验室具有使用放射性材料的资质并且操作人员需取得相应的操作合格证书。因此, 难以在大范围内推广。相比较而言, MTT法虽然具有操作简便、快捷和安全等优点, 但却难以排除不同群体淋巴细胞之间存在的干扰因素, 因此在适用范围上也受到了一定的限制。羧基荧光素乙酰乙酸 (CFSE) 是近年来使用较为普遍的一种用于检测细胞增殖的荧光染色标志物[3,4]。它可以穿透活细胞膜并不可逆地与活体细胞内蛋白质结合。当细胞分裂时, CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中, 其荧光强度也变为亲代细胞的一半。因此, 在一个增殖的细胞群中, 各个连续细胞代的荧光强度呈2倍递减。将CFSE标记的淋巴细胞通过流式细胞术进行分析, 可以快速准确地检测出特定亚群淋巴细胞的转化和增殖情况。与MTT法相比, CFSE标记法不但具有准确、快捷等优点, 还与MTT法之存在良好的关联性。
胶原蛋白海绵是近年来开发上市的一种新型动物源性功能敷料。该产品的胶原成分一般取自牛跟腱, 经不同加工工艺处理制得胶原蛋白海绵, 主要用于创面止血和创伤修复, 为可降解植入类医疗器械产品, 并且具有良好的生物相容性。但是作为动物源性医疗器械产品, 其在加工处理过程中无法彻底消除免疫原性。因此, 选用合适的免疫原性评价方法对该类产品进行评价, 将会有助于消除其潜在的免疫毒理学风险。根据ISO10993-20[5]中推荐采用的淋巴细胞增殖试验来评价医疗器械对淋巴细胞免疫功能的方法, 本研究分别在体外利用MTT法和CFSE法研究胶原蛋白海绵浸提液对小鼠脾脏淋巴细胞转化和增殖作用的影响, 旨在评价胶原蛋白海绵的免疫原性并探索建立一套体外评价医疗器械免疫原性的优化方法。
1 材料与方法
1.1 动物和细胞
雌性BALB/c小鼠, (6~8) 周龄, (18~22) g, 购自山东鲁抗实验动物中心;L929细胞系购自中国实验细胞库。
1.2 试剂和器具
所以试剂刀豆蛋白AⅣ型 (Con A) 和脂多糖 (LPS) (Sigma公司) ;MTT (Sigma公司) ;CFSE (Invitrogen公司) ;PE-CD3抗体 (e Bioscience, USA) ;RPMI1640培养基 (GIBCO公司) 。所用器具倒置显微镜 (Olympus TH4-200) ;快速细胞分析仪 (CASY-TT, 德国innovatis AG) ;全自动酶标仪 (Multiskan MK3) ;流式细胞仪 (Becton Dickinson, USA) 。
1.3 试验样品及处理
胶原蛋白海绵由合作单位提供。细胞毒性试验中阴性对照产品高密度聚乙烯和阳性对照SPU-ZDEC均购自日本Hatano研究所。按照ISO10993-12的原则[6], 取30 cm2无菌胶原蛋白海绵样品, 以RPMI1640完全培养基为浸提介质, 测定“吸收容量”后, 按照6 cm2/m L的比例, 在37±1 oC的条件下浸提72±2 h, 制备浸提液备用。
1.4 细胞毒性筛选试验
阳性对照组和阴性对照分别选取MEM完全培养基为浸提介质, 按照0.1g/m L的比例, 在37±1 oC的条件下浸提24±2 h, 制备浸提液, 按ISO10993-5[7]中要求, 对SPU-ZDEC、高密度聚乙烯和胶原蛋白海绵产品的浸提液进行体外细胞毒性筛选试验。
1.5 淋巴细胞制备
脱颈椎处死3只BALB/c小鼠, 无菌取脾, 研磨制备单细胞悬液, 收集细胞悬液, 混合后400 g离心5 min, 弃上清, 加5 m L红细胞裂解液, 混匀, 4oC孵育5 min, 加入含10%FCS的RPMI1640培养液终止反应, 400 g离心5 min, 弃上清, 加入含10%FCS的RPMI1640培养液调整细胞浓度至2×106 U/m L。
1.6 试验分组
试验共分为以下几组:
(1) 阴性对照组 (细胞对照, VC) ;
(2) 阳性对照组1 (细胞+Con A, 5µg/m L) ;
(3) 阳性对照组2 (细胞+LPS, 10µg/m L) ;
(4) 试验组1:细胞+第一种浓度抗原 (浸提液原液) ;
(5) 试验组2:细胞+第二种浓度抗原 (浸提液原液50%稀释) 。
1.7 试验步骤
1.7.1 MTT试验
将细胞悬液加入96孔板, 每孔200µL, 设6个复孔。阳性对照组1加入Con A至终浓度为5µg/m L, 阳性对照组2加入LPS至终浓度为10µg/m L, 试验平板在37 oC, 5%CO2培养箱中培养3 d后取出, 600 g离心5 min, 弃上清, 加入MTT (1 mg/m L) , 50µL/孔, 继续培养6 h, 加入DMSO, 150µL/孔, 振荡平板至甲臜颗粒完全溶解, 在酶标仪上570 nm波长处测定吸光度值 (OD) , 参照波长为630 nm。
1.7.2 CFSE试验
无菌制备小鼠脾脏淋巴细胞悬液, 用P B S至少洗2次, 用2 m L含0.1%BSA的PBS重悬细胞, 分别加入CFSE, 终浓度为5µMol/L。37 oC避光孵育15 min~30 min。加入3 m L预冷的含2%FCS的RPMI1640培养液终止染色反应, 冰上放置5 min后400 g离心5 min, 加入含10%FCS的RPMI1640培养液2 m L。按实验分组将细胞悬液加入24孔板, 1 m L/孔, 每组设3个复孔。试验平板在37 oC, 5%CO2培养箱中培养3 d后, 收集各孔细胞, 用PE标记的抗小鼠CD3单克隆抗体在4 oC避光条件下孵育30 min后, 应用流式细胞术进行分析。
1.8 统计学分析
1.8.1 MTT试验
记录各组吸光度A的平均值。应用t-检验法来判定试验结果。与阴性对照组相比, P<0.05具有统计学意义。
1.8.2 CFSE试验
记录各组淋巴细胞的增殖百分比。应用t-检验法来判定试验结果。与阴性对照组相比, P<0.05被认为有统计学意义。
2 结果
2.1 细胞毒性筛选试验结果
按ISO10993-5:2009的要求采用浸提液接触法进行细胞毒性试验, 结果显示, 空白对照组和阴性对照组细胞生长繁殖旺盛, 形态良好。阳性对照组细胞在48 h内100%细胞发生圆缩死亡。各试验样品组细胞生长繁殖旺盛, 形态良好。正常细胞数量不少于空白对照组的80%。因此, 定性判定试验样品浸提液对L929细胞的细胞毒性为I级, 表明该产品的浸提液无明显细胞毒性作用。
2.2 MTT法检测体外淋巴细胞转化的结果
在细胞毒性筛选的基础上, 根据试验分组利用M T T法进行体外淋巴细胞转化试验。结果显示, 与阴性对照组相比, 阳性对照组吸光度A显著增加 (P<0.05) , 而试验组与阴性对照组之间吸光度A值无明显差异 (P>0.05) , 表明胶原蛋白海绵产品浸提液不能在体外引起小鼠脾脏淋巴细胞发生明显的增殖和转化 (见图1) 。
2.3 CFSE法检测体外T淋巴细胞转化试验的结果
在MTT试验结果的基础之上, 我们进一步选用CFSE荧光掺入和PE-CD3抗体标记染色法分析试验样品对T淋巴细胞转化增殖的影响。流式结果显示, 与阴性对照组相比, 阳性对照组细胞发生明显增殖, 出现了多个增殖峰, 增殖百分率从 (6.01±0.9) %增加到 (14.7±0.1) %, 见图2 (a) 和图2 (b) , 而实验组细胞与对照组细胞间无显著性差异 (P>0.05) 。
3 讨论
多年来, 免疫应答的特性一直是研究的热点领域。然而, 关于医疗器械/材料免疫原性的研究却很少。并且, 目前还不清楚医疗器械/材料刺激机体产生的免疫应答对宿主有利还是有害。因此, 应用医疗器械/材料或其浸提物进行免疫应答研究来获取相关的信息是非常重要的, 特别是针对动物源性医疗器械, 由于缺少评价免疫原性的技术和方法, 很多该类产品在没有经过充分安全性评价的情况下上市, 为临床应用和患者的健康留下了隐患。因此, 亟需在传统组织学评价方法的基础上, 开发出新的安全性评价方法来评价该类器械潜在的免疫毒理学作用以及对临床使用后组织重建的长期影响。淋巴细胞增殖和转化能力是衡量机体细胞免疫功能的重要指标, 针对淋巴细胞增殖和转化能力的研究将有助于揭示医疗器械作用于人体后潜在的免疫毒理学反应。
在本研究中, 我们首先对所选取的动物源性胶原蛋白海绵浸提液进行了体外细胞毒性研究, 定性评价结果显示, 该产品浸提液无明显细胞毒性作用。这为进一步使用MTT和CFSE标记进行淋巴细胞增殖和转化研究提供了前提条件。在MTT试验中, 各实验组细胞吸光度值均小于阳性对照组, 提示试验组细胞增殖程度小于阳性对照组, 但各实验组之间无显著性差异 (见图1) 。在CFSE荧光标记法中, 阳性对照组细胞发生明显多峰增殖现象, 而与对照组相比, 各试验组细胞中CD3+T淋巴细胞未发生明显增殖 (见图2) , 这表明, MTT法与CFSE法之间存在良好的关联性。但是, 与MTT法只能分析全部细胞增殖情况不同, 结合荧光抗体标记及流式细胞术, CFSE法可以便捷、高效地分析出小鼠脾脏淋巴细胞中CD3+T细胞群体的增殖情况。例如, MTT法无法区分这一群细胞总体分裂一次与这群细胞中1/2的细胞分裂两次测得的结果, 而CFSE法则可以清晰追踪特定细胞群体的整个分裂增殖过程。这里需要注意的是, 实验组细胞的平均荧光强度高于对照组, 初步考虑为试验样品浸提液的处理促进了CFSE与淋巴细胞之间的结合, 但具体机制还需要进一步的研究。
影响本研究的关键因素包括C o n A和L P S的浓度、试验周期的长短和CFSE的标记条件以及细胞计数的准确性。试验中, 我们选用的Con A终浓度为5µg/m L, 这是在参考文献报道和预实验基础上给出的浓度[8]。结果显示, 5µg/m L的Con A能够较好地保证试验系统的正常工作, 同时也可用于比较T淋巴细胞对丝裂原和免疫原的免疫应答。而LPS的浓度则是依据预实验得出的。试验周期的选择是影响本研究的另一重要因素。针对淋巴细胞对生物材料中免疫原的应答, ASTM F1906标准[9]中推荐的试验周期为7 d, 我们先后选用3 d、5 d和7 d的培养体系, 综合考虑细胞增殖高峰期和荧光淬灭等多种因素的影响, 最终确定采用3 d的培养体系进行试验。但是具体到不同的试验样品, 建议实验者根据试验样品的特性、文献报道以及预实验的结果来确定具体的试验周期。CFSE的标记条件也是在参考文献报道和预实验的基础上给出的[10]。结果显示, 在选用终浓度为5µMol/L的CFSE时, 37 oC避光孵育15 min~30 min的标记时间符合该试验的要求。需要注意的是, 不同CFSE试剂盒中会有不同的标记浓度和标记时间, 实验者应根据预实验的结果来摸索具体的标记条件。本研究采用德国CASY-TT自动细胞计数仪, 将脾淋巴细胞计数到2×106 U/m L, 计数结果比手工计数更为准确, 有效保证了试验结果的严谨性和科学性。
另外, 试验中需严格遵守无菌操作规则。一般不建议在试验培养液中使用除青霉素/链霉素或庆大霉素以外的抗生素, 因为它们的作用方式有可能干扰到细胞免疫应答。本研究通过CFSE荧光标记术来研究动物源医疗器械对小鼠脾脏淋巴细胞转化和增殖作用的影响, 并将其与传统的MTT法进行比较, 为CFSE法在医疗器械免疫原性检测中的运用奠定了基础。
摘要：动物源医疗器械的免疫原性是评价其免疫毒理学安全性的关键和难点。该文利用MTT法和CFSE法体外研究动物源性胶原蛋白海绵浸提液对小鼠脾脏淋巴细胞转化和增殖作用, 并对两种方法的影响因素进行了分析。研究表明, 胶原蛋白海绵浸提液未引起小鼠体外脾脏淋巴细胞发生明显转化和增殖。
关键词：动物源性医疗器械,胶原蛋白海绵,免疫原,MTT法,CFSE法
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[9]ASTM F1906 (2003) Standard Practice for Evaluation of Immune Responses In Biocompatibility Testing Using ELISA Tests, Lymphocyte Proliferation, and Cell Migration.
脾脏淋巴瘤的CT影像学特征 篇6
1 资料与方法
1.1 临床资料
本组脾脏淋巴瘤均为非霍奇金淋巴瘤病例共16例, 男12例, 女4例, 年龄32～74岁, 平均54.6岁。临床主要表现为左上腹包块10例, 左上腹隐痛8例, 低热6例, 外周浅表淋巴结肿大6例, 腹水1例, 胸腔积液1例。所有病例均为病理证实, 其中穿刺活检病理证实13例, 手术病理证实3例。
1.2 扫描方案
所有病例常规空腹, 检查前常规口服800mL清水, 采用Siemens Somatom Sensation 4或16 CT扫描仪, 行3期增强扫描, 层厚5mm, 层间距5mm, 对比剂采用碘比乐300, 用量70～80m L, 注射速率2.5～3mL/s, 扫描范围包括整个脾脏在内的腹部。
2 结果
2.1 根据CT表现的脾脏淋巴瘤分型
(1) 弥漫浸润和粟粒结节型:本组2例, CT表现为平扫密度较均匀的脾脏增大, CT值正常或略低于正常脾脏, 增强后呈较为均匀的强化 (图1) 。 (2) 多发肿块型:本组6例, 表现为脾脏内多发结节状及类圆形低密度灶, 边界多较清楚, 直径1～5.5cm, 2例见肿块融合, 密度均匀, 增强后轻度均匀强化 (图2) , 3例伴腹腔及腹膜后淋巴结肿大, 无坏死 (图3) 。 (3) 巨块型:本组共8例, 表现为脾脏内单发巨大低密度肿块, 大小6～14cm, 边缘可规则, 部分见分叶, 增强后不均匀强化, 正常脾脏组织少量残留 (图4) 。5例可见腹腔及腹膜后多发肿大淋巴结, 均匀强化。
2.2 脾外CT表现
本组16例脾脏淋巴瘤中, 10例伴有脾外淋巴瘤, 其中淋巴瘤浸润肝脏2例, 表现为肝实质内类圆形低密度灶, 增强后轻度强化, 与脾脏病灶表现类似 (图5) , 1例伴少量腹水, 1例见胸膜累及并伴少量胸腔积液。
3 讨论
3.1 CT诊断
大部分累及脾脏的淋巴瘤在CT图像上表现为低密度影, 然而, 淋巴瘤弥漫浸润脾脏时可表现为类似正常脾脏密度而导致漏诊。Ahmann等认为, 均质性的脾肿大是淋巴瘤脾脏受累最常见的表现形式, 其次是多发弥漫局灶性结节 (<5mm) , 然后才是多发肿块 (2～10cm) 和单发肿块 (7～14cm) 。
早期的研究显示, CT对淋巴瘤累及脾脏的诊断敏感性仅为22%～65%[2,3], 这很可能是病灶与脾脏密度之间的对比差异不大导致的, 由于常规增强扫描动脉期脾脏本身的强化呈现花瓣样不均匀强化, 无法区分病灶与正常脾脏结构, 因此, 为了最大限度地减低干扰, 脾脏的扫描方案不强调动脉期扫描, 动脉期对于肝脏有无淋巴瘤浸润的诊断有较大的意义, 有报道指出脾脏受侵的淋巴瘤病例中有50%合并肝脏受累。
脾脏淋巴瘤的局灶性肿块在CT平扫上表现为相对正常脾脏而言的低密度, 增强后轻度强化或几乎不强化, 病灶的密度可以极低, 类似水的密度, 可能代表着液化性坏死或乏血管区, 环形强化较少见, 在见到环形强化的病例中, 不能肯定是肿瘤的强化, 还是由于邻近组织的受压形成的假包膜[4], 一般病灶的密度较均匀, 巨块型内有时可见坏死, 出血及钙化罕见。均匀弥漫型和粟粒结节型在CT上可仅表现为脾脏体积增大, 随着多层螺旋CT空间分辨率的提高, 一些粟粒样结节灶也可得到较好显示。合并脾外病变, 如腹腔及腹膜后淋巴结均质性肿大, 伴有其他腹腔脏器如肝脏、胰腺等累及, 对诊断有较大帮助, 也可伴腹水、胸水等, 但极少出现脾破裂。
3.2 鉴别诊断
脾脏淋巴瘤主要与肿瘤性病变如转移瘤、血管瘤、淋巴管瘤、错构瘤、血管肉瘤等, 非肿瘤性病变如脓肿、结核和梗死等相鉴别。转移瘤, 表现为脾内多灶性或融合性低密度, 增强后轻度环形强化或无强化, 且大多有明确的原发肿瘤病史, 一般当脾脏转移时肝脏也已有转移, 有时转移灶可表现为囊性病变, 可伴有增厚的囊壁, 这与原发肿瘤的生物学行为有关, 来源于卵巢癌、结肠癌及恶性畸胎瘤的转移偶尔可见点状、条索状钙化[5]。血管瘤, 平扫为边缘光整的均匀低密度肿块, 增强后以边缘强化开始, 呈渐进性充填式强化, 较大的海绵状血管瘤可见中央瘢痕。淋巴管瘤, 脾肿大伴多个散在低密度影, 多为囊性, 无强化, 常为薄壁, 伴有钙化, 并有分隔。错构瘤, 平扫可为低密度或等密度, 有时伴有钙化, 增强后通常无明显强化, 少数呈中度不均匀强化, 无钙化的错构瘤与淋巴瘤较难鉴别, 必须依靠临床。血管肉瘤, 其恶性度高, 发现时多有肝脏转移, 表现为境界不清的低密度影, 增强后实质成分不均匀强化, 易囊变。脾脓肿, 一般为脾脏单发低密度灶, 但脾脏不大, 邻近结构有粘连, 周围有渗出, 增强后病灶环形强化。脾结核, 一般可见低密度灶内散在点片钙化。脾梗死, 表现为脾内楔形低密度区, 尖端指向脾门, 边界清楚, 增强后无强化。此外, 弥漫型淋巴瘤需与其他原因引起的脾肿大如感染性及充血性脾肿大相鉴别, 结合病史及其他脏器受累情况不难排除。
综上所述, 脾淋巴瘤的CT特点根据病理类型的不同可表现为脾肿大伴弥漫性密度减低, 粟粒小结节状均匀低密度灶, 多发、密度均匀、边界清楚的结节状肿块伴轻度均匀强化, 单发巨大肿块呈轻度不均匀强化。脾外淋巴瘤CT表现有助于继发性脾淋巴瘤的诊断, 并为临床的分期与治疗提供较好的影像学支持。
参考文献
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脾脏卡波西样血管内皮细胞瘤1例 篇7
1 材料与方法
1.1 临床资料
患者女性,36岁,左上腹饱胀不适半月余就诊。查体发现仰卧位时左上腹饱满,脾脏肋缘下4横指,中等硬度,无明显压痛。无腹水、肠梗阻和黄疸。B超:脾脏轮廓形态饱满不规则,包膜边界完整,于中上极实质内可见大小12.6cm×12.3cm×10cm的实质性偏低回声,肿块边界尚清,内回声不均匀。CDFI显示:内可见血流信号。MRI:脾脏外形增大,其内可见大小约12.6cm×10.1cm×11cm混杂信号影。手术所见:脾脏肿大约17cm×15cm×13cm,结节样外观,与周围脏器无粘连,剖开见脾脏实质性包块与脾脏组织界限欠清,并可见少许纤维脂肪组织分隔,质韧。
1.2 方法
切除标本4%中性甲醛固定,常规切片、染色。免役组织化学染色标记采用Envision法,一抗CD31、CD34、第Ⅷ因子、a-SMA、VIM、CD163、CD68、CD1a、CD35、CD21和S-100购自Dako公司和北京中衫金桥生物技术公司。DAB显色,操作缓冲液用PBS,采用防脱片处理、微波修复。
1.3 结果判定
肿瘤细胞胞质出现棕黄色颗粒为(+)。
2 结果
2.1 活检标本巨检
脾脏大小约16cm×11cm×10cm,已剖开,局部见一大小约13cm×11cm×14cm的结节状肿物,切面暗红、灰黄,夹杂多彩状,周界欠清,挤压脾实质,脾脏实质变薄,最薄处为1cm。
2.2 镜检
肿瘤呈结节状,由纤维间隔分割成隐约小叶结构,主要含有十字交叉排列的梭形细胞束,其中相间有毛细血管,细胞束或弯或直,排列紧密或较疏松,之间有裂隙状、筛状或月牙形血管腔,形态类似。细胞异型性和分裂活动不明显,其间散在的毛细血管衬覆有扁平或肥胖的内皮细胞,并且可形成肿瘤小叶,类似细胞性血管瘤或毛细血管瘤。裂隙状腔隙和毛细血管内可见纤维素血栓和红细胞碎片,有出血和含铁血黄素沉积。
2.3 免疫组织化学标记结果
CD31、CD34、第Ⅷ因子、a-SMA和VIM阳性,CD163和CD68散在阳性,CD1a、CD35、CD21和S-100阴性。见图1～图4。
3 讨论
3.1 临床表现
典型的卡波西样血管内皮细胞瘤发生于婴幼儿和10岁以内儿童,但发现有越来越多的成人患者[4,5,6,7,8,9]。腹膜后病变一般表现为腹部肿物、腹水、肠梗阻和黄疸。深部软组织病变表现为单个或多个肿物,可累及下方骨组织,少数累及局部淋巴结(可用局部蔓延或局部转移来解释)。皮肤病变表现为界限不清的紫色斑块[1,2]。较大肿物因肿瘤内血管凝血途径被激活伴发消耗性凝血病(Kasabach-Merritt综合征)。林隆等报道发生于头部、腰腹部、大小腿、小肠、腋胸部等部位的Kapos型血管内皮细胞瘤,多数有血小板减少性紫癜综合征(KMS)[4,5]。本例发生于脾脏,仅见腹部包块,血常规检查无异常,体检亦未发现明显紫癜样皮疹[1,2,3,4,5,6]。
3.2 诊断与鉴别诊断
卡波西样血管内皮细胞瘤大体形态为灰白至红色肿物,多结节状,可相连或包围周围组织,呈浸润性生长。镜下典型表现为结节状生长,由不成熟血管构成,主要含有卡波西肉瘤样束状梭形细胞结构,也可出现较为特征性的肾小球样结构。免疫组织化学表型梭形细胞一般第Ⅷ因子相关抗原及GluT1、CKPan阴性,但CD34、CD31阳性,尤其是衬覆血管裂隙的梭形细胞。SMA染色显示有些梭形细胞阳性,提示至少某些区域存在血管周细胞。Ki-67有少量阳性表达。
诊断主要根据镜下形态及免疫组织化学,同时结合临床表现和大体形态。但应与下列疾病进行鉴别:
3.2.1 脾脏血管内皮细胞瘤
脾脏血管内皮细胞瘤是用于脾中血管内皮肿瘤中的一个不太严谨的命名,它们既可以细胞较丰富,也可以被认为比血管瘤更具有侵袭性潜能,但并不完全符合血管肉瘤。这种肿瘤被描述为上皮样和梭形细胞,有些被描述为内皮细胞与肌样特征的混合。鉴于出现内皮细胞和组织细胞混合性标记,这些血管内皮瘤中有些被视为相当于脾脏衬细胞血管瘤的“交界性”(低度恶性)肿瘤。
3.2.2 Kaposi肉瘤
是一种具有局部侵袭性的内皮细胞肿瘤,典型病变表现为皮肤多发性半点状、斑块状或结节状病损,也可累及年末、淋巴结和内脏器官,此病和人类第8型疱疹病毒(HHV-8)感染有关。镜下表现与KHE相似,但梭形细胞有轻度异型性。免疫表型为梭形细胞CD34持续阳性,CD31常阳性,而第Ⅷ因子阴性。所有病例,不管属于那个流行病亚型,全部HHV8阳性。
3.2.3 上皮样血管瘤
是一种良性血管肿瘤,由管腔形成良好但经常不成熟的血管构成,大部分血管衬覆肥胖的上皮样(组织细胞样)内皮细胞,胞质嗜双染或嗜酸性,核大、浅染、有中位核仁。大部分病变伴有明显的炎性成分。免疫表型为上皮样内皮细胞CD31和第Ⅷ因子均阳性。
3.3 治疗及预后因素
卡波西样血管内皮细胞瘤无自发消退倾向,预后因肿瘤部位和大小而异。婴儿的大肿瘤因伴有Kasabach-Merritt综合征而预后差,尤其是发生于腹腔内的肿物。发生于躯体软组织的肿瘤可经完整切除而治愈,复发罕见[1,2,7]。也有用考的松、化疗、放疗等治疗卡波西样血管内皮细胞瘤的报道[8,9],但疗效不显著。
摘要：目的 探讨卡波西样血管内皮细胞瘤的临床病理学特征以及相关鉴别诊断。方法 对1例脾脏卡波西样血管内皮细胞瘤进行光镜、免疫组织化学观察并复习相关文献。结果 肿瘤由不成熟血管构成,主要含有kaposi肉瘤样束状梭形细胞结构,呈浸润性生长。免疫组织化学显示CD31、CD34、第Ⅷ因子、a-SMA和VIM阳性,CD163和CD68散在阳性,CD1a、CD35、CD21和S-100阴性。结论 脾脏卡波西样血管内皮细胞瘤较罕见,目前国内外未见报道,正确诊断和鉴别诊断对临床有指导价值。
关键词：脾脏,卡波西样血管内皮细胞瘤,临床病理学
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