生精上皮细胞（精选六篇）
生精上皮细胞 篇1
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性SD大鼠48只,清洁级,35日龄,体重(120±10)g,购于第三军医大学大坪医院野战外科研究所[许可证号:SCXK-(军)20020008]。随机分为6组,每组8只。分为低剂量(15 mg/kg)、高剂量(30mg/kg)MnCl2染毒和空白对照组(生理盐水),均为腹腔注射,5 d/周、1次/d,饲养及实验温度(20±1)℃,湿度30%～50%,光照12 h/d。
1.2 主要试剂
MnCl2·4H2O(中国医药集团上海化学试剂公司);cyto-c兔抗鼠多克隆抗体,VM兔抗鼠单克隆抗体,即用型SABC免疫组织化学试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);Leica DMLB2HC型细胞图像分析系统(德国Leica公司)。
1.3 标本采集
大鼠分别于第4和第6周末处死。立即分离双侧睾丸、附睾,生理盐水冲洗,滤纸吸干水分后睾丸称重,测定睾丸脏器系数,附睾测定精子数量和精子畸形率。之后双侧睾丸用10%中性甲醛固定,脱水,石蜡包埋。冠状位连续切片4张,片厚4μm,免疫组织化学检测生精细胞cyto-c和支持细胞VM的表达。
1.4 观察指标及方法
1.4.1 cyto-c和VM阳性率测定
生精细胞cyto-c阳性产物和支持细胞VM阳性产物均位于细胞质,呈棕黄色或棕褐色。光学显示微镜下每张切片在冠状位近长轴,从左至右连续观察10个生精小管横切面,以有细胞核的生精细胞和支持细胞为标准,分别计数cyto-c表达阳性的生精细胞数占总生精细胞的比例和VM表达阳性的支持细胞占总支持细胞的比例,即分别为cyto-c和VM阳性率。
1.4.2 睾丸脏器系数和精子数量及精子畸形率检测
睾丸称重后按照公式[睾丸脏器系数=睾丸重(g)/大鼠体重(g)×100%]计算睾丸脏器系数。取一侧附睾置于1 ml生理盐水中剪碎制成精子悬液,60℃水浴处死精子。按红细胞计数法,计数5个中方格内精子数,记为R,然后按公式(R×500 00)计算精子数量(107/ml)。取精子悬液500μl伊红染色涂片,甲醇固定,油镜下观察每只动物的1 000个精子,用‰表示精子畸形率。精子畸形参照黄幸纾等[6]的方法,分为头部畸形和尾部畸形,头部畸形包括无钩、胖头、双头、香蕉头和不定形等;尾部畸形又分为双尾和尾折叠等。
1.5 统计学分析
所有数据以表示,采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析,描述两变量之间的关系采用直线相关分析,检验水准α=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 锰对大鼠生精细胞cyto-c和支持细胞VM表达的影响
与空白对照组比较,各染锰组生精细胞cyto-c和支持细胞VM阳性率均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。染锰剂量相同,6周组与4周组比较,cyto-c阳性率和VM阳性率均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。染锰时间相同,高剂量MnCl2组与低剂量MnCl2组比较,cyto-c阳性率和VM阳性率均明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。
2.2 锰对大鼠生精功能的影响
与空白对照组比较,高剂量组染锰4周睾丸脏器系数显著降低(P<0.05)。自低剂量组染锰4周起,肉眼可见大鼠睾丸体积缩小,高剂量组染锰4周睾丸脏器系数降至最低(P<0.05)。随着染锰时间的延长,睾丸重量继续降低,但同时体重已出现不同程度下降,睾丸脏器系数维持在较低水平或略有回升。同时各染锰组精子数量显著降低,精子畸形率显著升高(P<0.05)。染锰剂量相同,6周与4周组比较,精子数量显著降低(P<0.05),精子畸形率的差异无统计学意义(P>0.05)。染锰时间相同,高剂量MnCl2组与低剂量MnCl2组比较,精子数量显著降低,精子畸形率显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。
2.3 染锰大鼠精子数量与生精细胞cyto-c和支持细胞VM表达相关关系
2.3.1 精子数量与生精细胞cyto-c表达相关关系
直线相关关系分析显示,各染锰组大鼠精子数量与生精细胞cyto-c阳性率之间存在线性正相关,r=0.799,P<0.05。
2.3.2 精子数量与支持细胞VM表达的相关关系
直线相关关系分析显示,各染锰组大鼠精子数量与支持细胞VM阳性率之间存在线性正相关,r=0.895,P<0.05。
注:cyto-c为细胞色素c,VM为波形蛋白。各染锰组生精细胞cyto-c和支持细胞VM阳性率均与空白对照组比较,aegF=76.253,afpF=114.04;hegF=200.807,blgF=1235.190;cegF=164.26,efgF=367.73;degF=582.41,dfgF=1147.65;P值均<0.05。H为高剂量组与低剂量组比较。
注:染锰剂量相同,6周与4周组比较,adF=0.83,P>0.05,F=2.82,P>0.05,F=63.03,P<0.05,F=54.64,P>0.05;F=0.92,P>0.05,F=17.70,P<0.05。g为低剂量组与对照组比较,H为高剂量组与对照组比较,I为染锰时间相同,高剂量组与低剂量组比较。
3 讨论
细胞凋亡与增殖共同维持机体的正常发育。在正常生精过程中,由于生殖细胞的不断凋亡而导致丢失的精子数量占精子生成总量的25%～75%。细胞凋亡的信号转导通路有:线粒体通路,死亡受体通路,内质网通路3种[7],需要不同的caspase家族成员参与。
Cyto-c是呼吸链中的一个基本成分,1996年,王晓东首先发现并提出线粒体释放cyto-c途径是caspase-3活化的主要方式[3]。更重要的是,在caspase家族与cyto-c之间存在正反馈关系。二者相互结合,具有放大cas-pase瀑布效应及促进凋亡的作用[8]。本实验显示,各染锰组cyto-c主要表达在初级精母细胞细胞质,在cyto-c的表达下降的同时,caspase-3表达反而升高[9],说明cyto-c的释放要早于caspase-3表达。生理状态下,cyto-c作为呼吸链的重要成分主要存在于细胞质的线粒体,随着染锰剂量加大和时间延长,其不断释放并在激活caspase-3后逐渐消退;同时原本位于细胞质中的caspase-3表达增加并向细胞核内转移,最终导致生精细胞凋亡。
支持细胞以中间纤维为主构成其骨架系统[10],该系统由细胞内高度不溶解的直径为10 nm左右的丝网状结构所构成,C端连接于核膜,N端连接于细胞膜,维持支持细胞的形态和桥粒的完整性[11]。VM是支持细胞中间纤维的主要成分,密集环绕于核周,并与核膜下的核纤层相连,参与维持细胞形态及固定胞内亚细胞结构等[12]。任军慧等[13]证实青春期大鼠受己烯雌酚(DES)持续作用后,成年大鼠的睾丸支持细胞和间质细胞VM表达量显著下降,且呈剂量-效应关系。因此任何影响VM表达的因素都将影响支持细胞的功能,使其不能为生精细胞的分化成熟提供支架和能量及营养物质[14]。Niemi-nen等[12]研究认为,VM对血睾屏障的渗透功能有重要的作用。VM表达减少,细胞骨架破坏以及紧密连接复合体缺损,血睾屏障的功能遭到破坏。本实验显示,低剂量染锰4周后VM阳性率开始下降且与精子数量呈正相关(r=0.895,P<0.01)。推测锰可以抑制支持细胞VM表达而破坏细胞骨架,减弱支持细胞与生精细胞之间黏附力,使生精细胞无法利用支持细胞的能量及营养,以及VM失去了正常的收缩功能,阻碍了生精细胞向管腔移动和精子释放,从而诱发生精细胞凋亡,导致精子数量减少。同时影响血睾屏障的功能,使生精内环境遭到破坏直接引起或诱导生精细胞凋亡导致精子数量减少。
牛乳腺上皮细胞体外培养研究进展 篇2
牛乳腺上皮细胞体外培养研究进展
为研究乳腺上皮细胞增值和分化特性,通过有效的培养方法,实现了牛乳腺上皮细胞的体外培养,并且所获细胞具有正常的生理特性及功能.本文综述了近年来关于牛乳腺上皮细胞体外分离、培养的.研究进展.并对牛乳腺上皮细胞在不同培养体系中的生长状态、分化差异;牛乳腺上皮细胞对各种激素和生长因子的应答进行了讨论.
作 者：于婷 陈志伟 刘东武 Ting Yu Zhi-wei Chen Dong-wu Liu 作者单位：于婷,Ting Yu(山东师范大学,生科院,山东药品食品职业学院,山东,淄博,255011)陈志伟,刘东武,Zhi-wei Chen,Dong-wu Liu(山东理工大学,山东,淄博,255011)
刊 名：生命科学仪器 英文刊名：LIFE SCIENCE INSTRUMENTS 年，卷(期)：2009 7(3) 分类号：Q2 关键词：牛乳腺上皮细胞 体外培养方法 影响因素 综述生精上皮细胞 篇3
[关键词]语文素养；农村小学生；语文教师；发展要求
一、教材分析
《观察人的口腔上皮细胞》人教版《生物学》七年级上册第二单元第一章第三节《观察细胞的结构》——《观察动物细胞》
本节内容是在学生初步具备使用显微镜的基础上，学会观察动植物细胞的结构。尤其是初步学会观察植物细胞结构时，学会如何制作临时装片，达到进一步巩固基础实验的流程及规范性，为学生主动探究学习提供良好的实践机会，从而体现实验目的的真正意义。
二、学情分析
本节实验教学对象是七年级学生，他们在解决、分析问题和动手实践方面存在很大的欠缺，但由于刚进入初中初次接触实验教学，教师应在学生实验过程中，要多查多看，及时指出问题，予以纠正，耐心指导。
三、教学目标， 知识目标
（一）进一步了解并掌握使用显微镜的方法。
（二）初步学会认识动物细胞的基本结构，并能通过实验观察的结果，总结动物细胞与植物细胞的相同点和不同点。
（三）能力目标
（1）掌握制作临时装片的操作方法。
（2）培养学生实验探究的科学精神。
（3）训练学生大胆思考和完成操作任务的能力。
四、情感目标
培养学生敢于动手勤于动脑的实验操作能力，树立学好生物的信心，形成理论来源于实践的探究意识。
五、教学重点
（4）通过显微镜观察动物细胞的实验过程。
（5）认识动物细胞的基本结构。
六、教学难点
制作临时装片的过程。
如何区分动植物细胞的异同点。
七、教学方法
现场示范法 ： 教师可以一边讲步骤一边进行实验操作，并引导学生观察其实验结果，激发学生学习兴趣。
得力助手培训法： 在本堂实验的课前，培训几位小老师，在课堂上请他们讲讲此次实验的体会，有助于帮助其他学生能做好实验的信心，并能在实验操作过程中起到指导、榜样的作用。
小组合作法： 以小组形式为活动单元，每三人为一实验小组。在实验的同时都动脑思考，动手操作，动口讨论，充分调动学生的主体性和合作探究性。
八、实验课前的准备
1.学生需要准备的
2.预习实验内容。
3.上课前漱净口腔。
4.带好铅笔和绘图纸。
九、教师需要准备的（材料用具）
生理盐水、稀碘液、消毒牙签、滴管、纱布、镊子、吸水纸、载玻片、盖玻片、显微镜、清水。
十、教学过程
（一）导入
在有多媒体教学系统的实验室里，可充分利用多媒体课件播放视频：《观察洋葱表皮细胞的结构》实验过程。把学生从实验桌上转移到大屏幕上，边看边思考，自己如何进行本节课的实验操作。这不仅初步熟悉了实验过程，从中起到很好的指导作用，巩固了上节实验所学的内容，也为本节实验将要观察的动物细胞结构做很好的铺垫作用。同时，教师提问：通过上节实验的观察，我们知道植物细胞的基本结构组成，本节实验中动物细胞又是由哪些基本结构组成呢？我们亲自来验证吧。
（二）实验
1.实验目的
2.进一步掌握制作临时装片的方法。
3.巩固正确使用显微镜观察自己制作的临时装片。
4.认识人的口腔上皮细胞的基本结构。
5. 进一步掌握绘制生物图的画法，初步学会绘制动物细胞的结构简图 。
6.实验步骤“擦、滴、刮、涂、盖、吸、观、绘”
7.制作人的口腔上皮细胞临时装片（学生边操作，教师边指导并提醒学生本步骤的注意事项。）
8.用洁净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净。
9.在载玻片的中央滴一滴生理盐水。
10.用消毒牙签在自己漱净的口腔内侧壁上轻轻刮几下。
11.把牙签上附有碎屑的一端，放在载玻片上的生理盐水中涂抹几下。
12.用镊子夹起盖玻片，使它们一边先接触载玻片上的水滴，然后缓缓地盖在水滴上，注意避免载玻片下面出现气泡。
在盖玻片的一侧滴加稀碘液，用吸水纸从盖玻片的另一侧吸引，使染液浸湿标本的全部。
用显微镜观察人的口腔上皮细胞（在此过程中老师要认真观察学生使用显微镜观察的步骤是否正确，然后要求学生尝试区别与上节实验中洋葱表皮细胞的结构有哪些异同点）
将临时装片放在显微镜下观察。（重点观察一个口腔上皮细胞）
通过显微镜观察人的口腔上皮细胞结构后，学生们分组讨论，自己看到的人口腔上皮细胞与上节实验课观察到的洋葱表皮细胞结构上有什么异同点，并请几位学生代表回答，然后老师总结其观点：它们都有细胞膜、细胞核、细胞质；不同的是洋葱表皮细胞有细胞壁和液泡，而人口腔上皮细胞却没有。然后让学生们阅读课本上的本节内容，让他们证实一下自己得出的结论是否与书本上的知识是一致。
十一、注意事项
（一）此次实验前，一定要将口腔用清水洗簌干净
获取口腔上皮细胞时，不要用牙签在牙齿里刮动，而是要在口腔壁上刮动。（因为从牙缝里或牙齿上刮下的是食物碎屑而不是口腔上皮细胞）
（二）选择合适的口腔取材部位
以口腔两侧颊部为好。（因为这一部分能刮取到较多的口腔上皮细胞，而在其他部位选材，要么细胞数量较少，要么引起不适感）
选择用恰当的染液浓度，这样才能较明显地显示出口腔上皮细胞的细胞膜、细胞核和细胞质。
十二、教学后记
这节课的实验是在学习使用显微镜及观察洋葱鳞片叶表皮细胞结构中，怎样制作临时装片后的教学设计内容，因有了前两次的实验经验，所以这次的实验课堂教学是比较成功的，但本节实验也存在不足之处：有少数学生由于取材部位没有把握好，导致选取到的口腔上皮细胞要么过少，要么是食物残渣。当然，在时间允许的情况下，还可让学生多尝试几次，组与组之间进行相互讨论与观察，不断发现问题，探索真理，努力培养学生自主探究、科学创新精神，达到“学以致用”，启迪学生思维，勤于动手的教学效果。
本文為“湖南省教育科学‘十二五’规划省级重点资助课题阶段性成果之一”、“课题名称：湖南省中小学生实验能力评价体系构建与应用研究”、“课题批准号：XJK014AJC 002--046”
精液生精细胞检查的临床意义分析 篇4
1 通过精液生精细胞检查, 判断患者的睾丸生殖能力
传统的生精细胞形态学检验中, 主要采用睾丸活检的方式进行, 这种方式一方面会使患者体内产生一定的抗精子抗体, 一方面会给患者带来极大的痛苦。通过精液生精细胞检查, 能够有效取代睾丸活检, 在临床实践中, 意义重大[3]。相关研究资料证实, 在健康生育组研究对象中, 约73.3%的人群检测出生精细胞, 约86%的人群具有3~4种生精细胞, 精子细胞95%;而在不育组患者中, 约有78.4%的人群检测出生精细胞, 约90.1%的人群具有3~4种生精细胞, 精子细胞100%。对生育组的生精细胞进行大体分类:约1.9%的精原细胞, 9.3%的初级精母细胞, 7.5%的次级精母细胞, 81.1%的精子细胞。根据上述检验结果, 建立正常参考值。结合生精细胞的形态、多少、有无等特征, 把生精情况合理划分成异常细胞形态型、异常细胞比例型、细胞异常型, 以此作为评价睾丸生精功能的重要标准。
不管是不育症患者还是正常生育男性精液中, 都会有生精细胞或精子存在。如果在精液中无法找到生精细胞或精子, 则诊断为生精细胞异常, 也就是无精子症。无精子症主要由两方面因素:第一, 在精原细胞开始发育阶段, 睾丸生精小管发生障碍, 属于原发性生精障碍。第二, 输精管阻塞, 无法将正常生成的精子排除体外[4]。如果患者精液中检测出异常的生精细胞, 则结合a-糖苷酶或精浆果糖测定, 就能判断是睾丸生精障碍还是输精管病变。
在男性精液中, 会有25%男性检测出精液中含有生理性生精细胞, 主要包括:6.0%的精原细胞, 7.6%的初级精母细胞, 7.8%的次级精母细胞, 3.0%的精子细胞。如果其中一种或几种细胞比例在正常比例之外, 就会出现生精细胞异常比例。随着人类年龄的增长, 有机体激素水平也会发生变化, 能够在精液中检测出衰老的生精细胞[5]。在酒精肝患者、肾衰竭患者中, 会检测出异常形态的生精细胞。抗肿瘤类药物会进一步影响男性正常生殖细胞的生长、分化, 不仅会损伤分化细胞, 还会损伤生精干细胞。
2 通过精液生精细胞检查, 判断无精子症或少精子症
生精细胞停滞是导致睾丸不育的最主要原因, 在精子生成、生长的过程中, 精子生成停滞。没有或很少的精原细胞分裂成精子、精子细胞或精母细胞, 抑或精母细胞的成熟生长受到障碍, 或者只有少数精子生成。根据精子停滞发展的程度, 分为无精症或少精症。相关研究资料证实, 多种药物都会影响到睾丸的生精功能, 尤其是化疗类药物, 对生精功能影响更为突出, 对早期精子细胞与初级精母细胞有较强抑制作用[6]。棉酚则对中晚期精母细胞或变态期精子细胞产生作用。结合生精细胞类型, 能够进一步评价睾丸功能, 为分析少精症或无精症提供依据。相关研究资料证实, 183例不育症患者, 70例精液少精子或无精子, 23例患者三次精液均未见生精细胞与精子, 部分患者有生精细胞但无精子, 部分患者有生精细胞但少精子。提示我们判断少精子症或无精子症, 除了要检测精子数量外, 还需要对生精细胞进行检测。
3 生精细胞凋亡
在有机体生长发育的过程中, 伴随着精子的产生、发育、成熟与凋亡。一般来说, 细胞凋亡是生精细胞正常的更新过程与代谢过程。在病理状态下, 会发生生精细胞的突发性坏死、病变, 导致精子中断发育。正常情况, 最容易发生凋亡的就是精母细胞, 其次是精原细胞, 精子细胞则很少凋亡。相关研究资料证实, 对4477个凋亡细胞检验中发现, 检出4.27%的精原细胞, 46.95%的初级精母细胞, 11.59%的次级精母细胞, 37.19的精子细胞。对少精患者凋亡的生精细胞进行检测, 检出42.3%的精原细胞, 90.1%的初级精母细胞, 69.0%的次级精母细胞, 85.9%的精子细胞。初级精母细胞相比于其他细胞, 均有差异统计学意义。在正常生精以及自然状态下, 化学药物、温度、激素、肿瘤、放射等外在因素会加速细胞凋亡。在生育男性与不生育男性中, 都会出现生精细胞凋亡现象, 但是, 凋亡的比例是不一样的, 疾病与过渡凋亡有直接关系。正常男性凋亡细胞比例为0.1%左右, 不育男性凋亡比例则显著上升, 隐睾症患者凋亡比例为20%, 感染者凋亡比例为10%, 随着睾丸受损程度的加重, 细胞凋亡速度就加快[7]。
4 生精细胞凋亡与微生物细胞感染
病毒感染, 通常会侵犯腮腺引起腮腺炎, 同时, 还常常导致睾丸炎。在组织学上, 睾丸通常表现为巨噬细胞和浆细胞浸润, 如果炎症比较严重, 还会入侵生殖器官。如果睾丸内压上升, 会导致实质性睾丸缺血, 导致不可逆的生精上皮纤维化和玻璃化。在急性期过后, 会出现慢性病理学变化, 也就是生精小管硬化、透明化, 生精细胞缺失。这种病理性的变化时一个长期的过程, 如果最大限度的损害睾丸, 则需要10~20年的时间显露出来。在急性期过后, 会呈现较为缓慢的睾丸损伤过程, 可以结合精液生精细胞的胀亡和凋亡百分比, 评估对睾丸的损害程度, 为临床诊断与治疗提供指导性意见, 以便及时治疗, 预防病情的进一步发生以及不育症的出现。相关研究资料证实, 对腮腺炎患者116例进行生精细胞凋亡检测, 7例凋亡率为0, 8例患者凋亡率<10%, 29例患者凋亡率>20%。在腮腺炎病史之后, 约有94%的患者检测出凋亡的生精细胞, 部分患者在患病20年之后, 还会出现生精小管的空化、萎缩。因此, 在临床医学上, 必须警惕腮腺炎对睾丸的损伤延时。
摘要：通过精液生精细胞检查, 详细分析精液细胞, 能够对抗精子免疫、精子发生、精子感染等进行全面了解, 能够准确、及时的了解睾丸以及其他腺体的不同疾病。能够准确反映出患者睾丸生殖功能状态以及其他因素对睾丸的损害, 以及其他多方面综合征, 精液生精细胞检查在临床研究中, 有非常重要的意义。
关键词：精液,生精细胞,临床检查
参考文献
[1]谷翊群, 陈振文, 于和鸣, 等, 译.人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册[M].4版.北京:人民卫生出版社, 2011:123-124.
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[6]王江平, 叶德立, 张明辉, 等.睾丸内生精细胞与精液生精细胞之研究[J].江西医学检验, 2012, 5 (14) :520-521.
生精上皮细胞 篇5
1 材料
1.1 试验动物
清洁级7～8日龄雄性昆明乳鼠, 由辽宁医学院实验动物中心提供。
1.2 生精胶囊提取液的制备
取生精胶囊粉40 g, 用乙醇法提取其水溶性成分, 浓缩后调整其浓度为50 mg/mL (pH值为6.8～7.0) , 4 ℃冷藏保存。
1.3 主要试剂
生精胶囊, 廖元和堂药业有限公司生产;Ⅳ型胶原酶 (Col Ⅳ) 、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸 (EDTA) 、固红、α-萘酚磷酸盐, Sigma公司生产;PBS, 辽宁医学院畜牧兽医学院实验室自制;胎牛血清 (FBS) , 杭州四季清生物工程材料有限公司生产;细胞分离液 (Percoll) , Pharmacia公司生产;c-kit兔抗人抗体、Integrin β1兔抗人抗体、生物素化羊抗兔IgG、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒, 武汉博士德生物工程有限公司生产;干细胞生长因子 (SCF) 、GDNF, Invitrogen 公司生产;LA-Taq、dNTP, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;TRIZOL试剂、反转录试剂盒Thermo ScriptTM RT-PCR System, 购自Invitrogen公司。
1.4 培养液的配制
M1培养液 (DMEM+10%FBS+1%双抗) 用于饲养层细胞的培养, M2培养液 (DMEM+7.5%FBS+7.5% FBS+1%双抗+1%谷氨酰胺+1%非必需氨基酸+1%丙酮酸钠+80 μg/mL 维生素E + 200 μg/mL 维生素C+0.1 mmol/L β-巯基乙醇) 用于乳鼠SSCs的培养, M3培养液 (M2培养液+50 ng/mL GDNF) 和M4培养液 (M2培养液+生精胶囊提取液) 用于乳鼠SSCs的增殖培养。
2 方法
2.1 睾丸单细胞悬液的制备
采用颈椎脱臼法处死雄性乳鼠, 酒精消毒乳鼠全身, 无菌收集两侧睾丸, 放入盛有适量PBS的35 mm培养皿中;用尖头镊子去掉睾丸白膜, 并将睾丸撕碎;用吸管剧烈吹打, 吹散后静置3～5 min, 待曲细精管下沉后弃上清液;在沉淀物 (1 mL) 中加入Col Ⅳ10 mL, 37 ℃消化8～15 min;800 r/min 离心3 min弃上清液;加入适量透明质酸酶和胰蛋白酶, 37 ℃作用5～10 min, 加入少量血清终止消化;静置5 min, 已解离的睾丸细胞沉降后, 轻轻吸弃上清液;加入适量M3培养液, 反复轻轻吹打, 制成单细胞悬液, 调整细胞密度为 (1～10) ×105个/mL[2]。
2.2 睾丸细胞的分离
按密度由大到小将Percoll密度梯度液依次叠加于10 mL离心管中, 将待分离的细胞悬液置于梯度最上层, 1 400 r/min离心 20 min;27%～35% Percoll密度梯度之间界面上的细胞带主要为SSCs, 移至5 mL离心管中;加入适量PBS, 1 000 r/min 离心 3 min, 弃上清液;加入适量M3培养液轻轻吹打混匀成单细胞悬液, 调整细胞密度为3.0×105个/mL[2]。
2.3 饲养层的制备
按参考文献[2]中的方法制备。
2.4 乳鼠SSCs的接种培养与传代
将铺有饲养层细胞的24孔板作为试验组, 对照组用M2培养液培养;吸去试验组中M2培养液, 将制取的SSCs单细胞悬液接种其中, 分别添加M3和M4培养液, 置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。显微镜观察接种细胞的生长状况[4,5]。培养到产生明显的突起状集落时, 用细金属针将集落剥离并分割, 接种于新的培养液中进行传代。
2.5 乳鼠SSCs的碱性磷酸酶染色和β1整合素免疫细胞化学染色鉴定
按照参考文献[3]操作, 采用碱性磷酸酶染色、β1整合素免疫细胞化学染色鉴定乳鼠SSCs。
2.6 乳鼠SSCs的RT-PCR鉴定
培养乳鼠SSCs, 从出现克隆集落开始每天进行挑取, 采用RT-PCR方法鉴定SSCs是否表达c-kit、Oct-4, 直到集落消失, SSCs分化。根据GenBank中序列设计引物, c-kit (登录号为NM174375) 序列为5′-ATCTAAGAGCCCAGAACCCA-3′, 5′-TTACCCGCCAATGTACGAAA-3′; Oct-4 (登录号为AY490804) 序列为5′- GTTCAGCCAAACGACTATCT-3′, 5′-AGCTTCCTCCACCCACTTCT-3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
3 结果
3.1 乳鼠SSCs的培养特性
将SSCs接种于Sertoli细胞饲养层上后, 置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养, 添加GDNF 6～8 h后生殖细胞开始贴壁, 并保持其特有的形态学特征, 即圆形且周缘平滑 (见图1A) ;24 h后可见大部分细胞已贴壁;再培养一段时间后观察发现贴壁细胞已开始分裂、增殖, 增殖产生SSCs集结成团的克隆, 呈葡萄串状 (见图1B) 。不同培养液SSCs增殖情况见表1。
3.2 乳鼠SSCs的碱性磷酸酶染色和β1整合素免疫细胞化学染色鉴定
培养4 d后出现SSCs集落, 碱性磷酸酶染色呈阳性 (见图2) , β1整合素免疫细胞化学染色也呈阳性 (见图3) 。
A.3次纯化后的SSCs接种2 h开始贴壁 (×200) ;B.培养SSCs 4 d后出现细胞集落 (×100) 。
3.3 乳鼠SSCs的RT-PCR鉴定
RT-PCR扩增出长度为120 bp的Oct-4和280 bp的c-kit基因, 与目的基因片段大小一致 (见图4) 。
M. DL-1 000 Marker ;A, B.Oct-4 ;C, D.c-kit。
4 讨论
4.1 GDNF对乳鼠SSCs的作用
GDNF是转化生长因子-β超家族的一个相关成员。它的信号转导受体复合物包括酪氨酸激酶Ret受体和GDNF家族受体α1[6], GDNF能促进神经系统中多种类型神经元存活和分化。在中枢神经系统中, 胶质细胞为神经元提供营养因子;与此相类似的睾丸支持细胞为生殖细胞提供营养因子。睾丸支持细胞表达GDNF作为精子发生的旁分泌调节因子, GDNF受体在未分化型精原细胞中表达。试验在SSCs增殖培养过程中, 加入GDNF使SSCs贴壁时间缩短, 增殖迅速, 并能抑制SSCs的分化。
4.2 生精胶囊对乳鼠SSCs的作用
生精胶囊由鹿茸、枸杞、人参、冬虫夏草、 菟丝子、沙苑子、淫羊藿、黄精、何首乌、桑葚、补骨脂、骨碎补、仙茅、金樱子、覆盆子、杜仲、大血藤、马鞭草、银杏叶共19味中药组成。生精胶囊具有以下药理作用:促进性器官发育, 增加睾丸体积和重量;提高男性或雄性动物交配能力;通过增加精子数量, 改善精子活力、成活率、畸形率提高精子质量, 从而提高精子的受精能力, 提高受孕率;通过提高精浆中锌、镁元素含量, 从而提高精液质量;通过促进生精上皮细胞发育, 从而促进睾丸的生精功能。试验通过在培养液中添加生精胶囊提取液以达到促进SSCs增殖的作用, 使乳鼠SSCs产生克隆时间缩短, 并能提高传代次数。
4.3 乳鼠SSCs的表面标志
乳鼠的胚胎干细胞 (ES细胞) 分化产生SSCs, 并逐步分化形成雄性生殖细胞, 最后分化生成精子的过程中不同阶段受到不同基因的调控[7], 在一定分化阶段表达不同的分子标记蛋白, 未分化的ES细胞表达Oct-4[8,9]、 GDF3、nanog、stellar、PUM-1、PUMILIO-1、PUM-2、PUMILIO-2和NANOS-1。原始生殖细胞 (PGCs) 和性原细胞分化阶段表达的基因有DAZL、c-kit、stella和 Nanos。试验应用Oct-4作为SSCs未分化的标记基因, 应用c-kit作为SSCs分化的标记基因, 通过细胞形态生物学特性、免疫细胞化学染色和RT-PCR检测, 结果表现出很好的增殖与分化相关性, 为下一步筛选起始分化基因奠定了基础。
参考文献
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生精上皮细胞 篇6
1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级成年雄性Wistar大鼠50只, 体重220～240g, 浙江中医药大学实验动物中心提供。
1.2 实验试剂及药物
TUNEL原位末端标记试剂盒:武汉博士德生物制品公司。免疫组化检测试剂盒 (两步法) :美国 Lab Vision-NeoMarkers公司产品。DAB显色试剂盒:武汉博士德生物制品公司。通精灵药物组成:丹参、红花、菟丝子、五加皮、枸杞子、三七粉、柴胡、炒露蜂房、煅龙骨、煅牡蛎等, 将上述药物水煎浓缩配制成0.6g/ml (含生药量) 、1.2g/ml、2.4g/ml 3种浓度的药液, 灭菌后于4℃冰箱备用。
1.3 动物分组
大鼠称重后随机分组、编号, 即假手术组10只、模型组10只、通精灵低剂量组10只、中剂量组10只、高剂量组10只。
1.4 模型制作方法
将实验大鼠普通饲料饲养, 自由饮食、饮水1周, 观察无异常后, 即可造模。模型的制备方法参照Saypol法[3]。用3%戊巴比妥钠按40mg/kg体重腹腔注射麻醉, 常规消毒, 左侧腹部切口, 小心暴露左侧肾静脉, 用玻璃探针轻轻剥离靠近下腔静脉的左肾静脉、肾上腺静脉、精索静脉、下腔静脉;于肾上腺静脉和精索静脉的内侧、下腔静脉外侧, 用微血管钳小心分离左肾静脉深面, 置一直径1mm的光滑金属探针于左肾静脉之上, 将其和左肾静脉一起结扎, 借此使左肾静脉缩窄, 抽出探针, 使肾静脉部分复通, 结扎后, 可见左肾静脉迅速扩张, 逐层缝合腹壁。假手术组只行左肾静脉分离, 不结扎左肾静脉。
1.5 给药方法
假手术组与模型组:手术1个月后予以生理盐水, 按1ml/100g体重灌胃。通精灵低、中、高剂量组:手术1个月后, 分别予以含生药0.6g/ml、1.2g/ml、2.4g/ml通精灵水煎剂, 按1ml/100g体重灌胃。每日1次, 连续60天。
1.6 标本的制备
末次给药后, 将实验大鼠用乙醚吸入麻醉, 开腹取出左右侧睾丸, 用冷生理盐水冲洗, 除去血液, 去除被膜血管, 滤纸吸干, 电子天平称重后, 放入10%中性缓冲福尔马林 (pH7.4) 溶液固定, 24小时后梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 浸蜡、包埋备检。
1.7 观察指标及检测方法
1.7.1 组织病理学变化及超微结构改变
光、电镜观察。
1.7.2 生精细胞凋亡检测
脱氧核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记 (TUNEL) 法。检测严格按试剂盒说明书操作步骤进行。参考相关文献计分方法[4], 在光学显微镜200倍视野下计数正常细胞和调亡细胞, 并求出凋亡指数 (apoptosis index, AI) , 凋亡指数 (%) =视野内的阳性细胞数/视野内总细胞数×100%。
1.8 统计学处理
统计学处理用SPSS13.0统计软件完成, 采用t检验和单因素方差分析。
2 结果
2.1 通精灵对实验性精索静脉曲张大鼠睾丸组织形态学的影响
2.1.1 光镜观察
假手术组:左右侧睾丸曲细精管未见萎缩, 未见生精上皮脱落, 曲细精管结构清晰, 层次分明, 各级生精细胞形态正常, 曲细精管管腔内可见精子细胞及大量精子, 支持细胞, 间质细胞可见。模型组:左侧睾丸可见到正常与异常的曲细精管交错存在, 呈典型的“斑点样”改变 (病变部位呈局灶性) , 生精上皮变薄, 基底膜变厚, 各级生精细胞减少, 出现生精阻滞, 阻滞在精子细胞和精母细胞阶段, 未成熟的生精细胞向管腔内脱落, 曲细精管内可见到少量的精子细胞、精子;睾丸间质可见水肿, 间质细胞空泡样变性;右侧睾丸出现与左侧相似的病理改变, 但程度明显比左侧轻。通精灵低剂量组:左侧睾丸在低倍镜下见到典型的“斑点样”改变, 在高倍镜下见到部分曲细精管萎缩, 少见曲细精管塌陷。精原始细胞和支持细胞减少, 存在生精阻滞, 阻滞在精子细胞与精母细胞阶段;睾丸间质水肿, 间质细胞变性;右侧睾丸也出现相似病变, 但较左侧为轻。通精灵中剂量组:左侧睾丸在低倍镜下见到“斑点样”改变, 但异常曲细精管明显减少, 在高倍镜下见部分曲细精管萎缩, 管壁层次较为清晰, 精原细胞和支持细胞比模型组明显增多, 精子细胞多见;右侧睾丸病理改变与左侧相似, 程度比左侧轻。通精灵高剂量组:左侧睾丸在低倍镜下见到“斑点样”改变, 异常曲细精管较少, 在高倍镜下见部分曲细精管萎缩, 管壁层次较清晰, 精原细胞和支持细胞比模型组明显增多, 精子细胞较多;右侧睾丸也出现相似病变, 但较左侧轻。
2.1.2 透射电镜观察
假手术组:生精细胞与支持细胞之间的细胞连接正常, 支持细胞位于基膜上, 核膜清晰, 核周隙窄而均匀, 细胞器无变性;各级生精细胞排列层次清晰, 核形态正常, 核仁清晰, 核周间隙窄而均匀, 精子细胞细胞形态正常, 细胞器类型、位置、数目正常。模型组:生精上皮基膜明显增厚, 呈现波浪状, 界膜明显增厚, 胶原纤维增多;支持细胞结构改变不一, 线粒体增多, 肿胀, 内有大量大小不等的空泡及自噬体, 内质网扩张;各级生精细胞受到不同程度的损伤, 精原细胞排列紊乱, 核周隙增宽, 线粒体肿胀、髓鞘样变;精母细胞内可见核周隙明显, 胞浆内出现空泡, 部分内质网扩张, 甚至可见到核固缩、核消失;可见到凋亡小体, 生精细胞凋亡增加。通精灵低剂量组:界膜增厚, 支持细胞内见大量空泡, 线粒体肿胀, 各级生精细胞均不同程度损害, 损害程度较模型组减轻, 精子细胞较少, 且形态异常。中剂量组:病理损害较模型组明显减轻, 支持细胞及各级生精细胞的损伤减轻, 可见到较多的精子细胞、精子。高剂量组:生精细胞核膜、细胞膜完整, 细胞器变性较少见, 各级生精细胞可见, 支持细胞细胞器可见轻度变性。
2.2 通精灵对实验性精索静脉曲张大鼠生精细胞凋亡的影响
凋亡的阳性细胞细胞核呈黄色或棕色, 假手术组出现较少的、散在的生精细胞凋亡;模型组及通精灵各组均出现较多的凋亡细胞, 染色的阳性细胞主要分布在各级生精细胞, 凋亡主要发生在各级精母细胞, 精子细胞少见, 模型组及通精灵各组右侧睾丸也可见到凋亡的阳性细胞。各组凋亡指数比较见表1。
与假手术组比较△P<0.05, △△P<0.01;与模型组比较*P<0.05, **P<0.01
3 讨论
中医学理论对于精索静脉曲张不育症的认识, 尚存不同的观点, 笔者经多年前期临床研究, 认为精索静脉曲张不育症的病机当从肝肾立论, 肝络瘀阻、肾精不足是本病的基本病机;基本治则是疏肝通络强精。通精灵是笔者从多年治疗精索静脉曲张不育症处方中优选出来的有效组方, 临床研究表明, 手术后加服该方治疗能有效促进患者生精功能的恢复, 在精子密度、正常形态精子率及配偶妊娠率方面均优于单纯手术治疗者[5]。组方中, 柴胡、炒露蜂房入足厥阴肝经, 疏肝通络;红花、丹参活血化瘀、祛瘀生新;菟丝子、枸杞子、五加皮、三七粉补肾强精;煅龙骨、煅牡蛎入肝经, 疏散郁结;全方具有疏肝通络祛瘀、补肾强精之功效。
正常的生精过程存在生精细胞凋亡, 这是维持生精细胞与支持细胞适当比例从而保证正常生育的重要调节机制。但凋亡过多, 可导致生精障碍, 甚至不育。夏强等进行成年大鼠精索静脉曲张生精细胞凋亡的实验研究时, 发现实验组患侧睾丸生精细胞凋亡增多, 凋亡指数改变较对照组相比差异有显著性。提示生精细胞凋亡在精索静脉曲张不育机制中具有重要作用[4]。本实验结果表明, 实验性精索静脉曲张直接导致了大鼠睾丸组织结构及超微结构的改变, 引起生精细胞的过度凋亡, 从而影响了睾丸的生精功能。通精灵能不通程度地减轻精索静脉曲张对睾丸的组织形态学影响, 减少生精细胞的凋亡, 说明通精灵对精索静脉曲张引起的睾丸病理损伤有保护作用。
参考文献
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