基因图谱（精选八篇）
基因图谱 篇1
柑橘是世界最重要的果树之一, 其栽培面积和产量在所有果树中排名第一。甜橙是世界第一大柑橘类型, 产量占全世界柑橘产量的60%左右, 且橙汁是世界三大饮料之一。但甜橙具有多胚、雄或/和雌不育、遗传背景高度杂合等特点, 阻碍了遗传学及育种的发展。完整的基因组信息, 作为一个遗传框架, 将为柑橘遗传与育种改良提供依据。
据介绍, 甜橙有9对染色体, 基因组大小为367M。甜橙基因组测序采用全基因组鸟枪法 (WGS) 策略, 基因组注释结合了丰富的基因表达数据, 包括愈伤组织、叶、花和果实等组织的转录组, 并引入RNA-PET技术对基因转录产物注释, 获得注释的基因约3万个。通过遗传标记和染色体原位杂交分析, 将基因组序列整合到9条染色体。通过比较发现, 甜橙和葡萄、草莓的共有基因分别为81%和83%。还发现, 甜橙基因组中有51%的基因位点处于杂合状态。
我国是世界上重要的柑橘原生中心, 栽培柑橘类型十分丰富, 分为柑、橘、橙、柚、柠檬、金柑、枸橼以及观赏的四季橘。2010年我国总产量2645万吨, 种植面积为221万公顷, 是世界柑橘第一生产大国。
基因图谱 篇2
据报道，美国北卡罗来纳州大学已经完成了烟草基因组项目的第一阶段。北卡罗来纳州大学植物病理学和基因项目教授查尔斯·奥伯曼（Charles Opperman）说，“在烟草基因排序项目的最初阶段，我们比较了发现大多数烟草基因的几种不同方法。”
这就标志着烟草基因图谱的进展比较顺利。此项目是从 2002 年开展的。在 2002 年 12 月 11 日，北卡罗来纳州大学宣布，美国菲莫公司已同意向北卡罗来纳州大学提供 1760 万美元，用来绘制烟草基因图谱。烟草基因组计划将由该学院在四年半的时间内完成。根据估计，烟草的基因大约是在 25000 到 50000 个之间。
基因的破译，将会大大改变烟草的形象和命运。
在当今的社会已经把烟草等同于杀人的工具。在世界卫生组织的烟里，卷烟就是杀手，烟草则是“十恶不赦”的植物，并在世界上掀起了一场空前盛大的控烟运动。生产烟草的国家，也在控烟的压力下，研究烟草的替代作物。烟草的命运似乎已经走到尽头。基因的破译，无疑打开了烟草发展的另一扇窗户。
对于烟草公司，烟草仍意味着卷烟，意味着利润。美国最大的卷烟制造商菲莫公司说，破解遗传密码可以被公司用来找出改变烟草基因的办法，从而把吸烟对成年人健康造成的不利影响降低到最低限度。这也是菲莫公司赞助烟草基因图谱研究的初衷。
对于科学家来说，烟草研究有着更重要的意义。他们认为最终烟草基因图谱的绘制，可能使烟草植物生产有价值的化学物质或药物。这样的植物就可以收获和加工了，意味着人类的福音。
烟草，有一天，可能以另外的有益健康的方式让人爱不释手。
相关链接
美国烟草基因图谱项目第一阶段工作完成菲莫公司赞助烟草基因组图谱的绘制
家蚕基因图谱 篇3
2003年5月18日，在西南大学科技楼办公室里，中国工程院院士向仲怀和他的几位弟子夏庆友、周泽扬、鲁成、吴大洋等人，正面临着一个艰难而又紧迫的抉择。（图1）
两个月前，原本计划由中日双方联合攻关的家蚕基因组框架图，却由于日本单方面自行启动而终止，摆在向仲怀他们面前只有两条路：要么让日本科学家捷足先登；要么破釜沉舟，自冒风险，与日本方面展开竞争。
夏庆友（西南大学教授）：当时要回答一个问题，这件事能不能在规定时间内完成？把握只有七成左右，不是百分之百。当晚要做决定时，心里很矛盾。要做就得拼命，把七成做到十成。如果不做，压力小一点，但很遗憾。（图2）
那一夜，他们彻夜未眠，直到拂晓时分才做出一个决定，为了维护国家利益，立即启动中国家蚕基因组计划，这一刻，意味着他们开始了一场没有退路的攻坚战。
夏庆友：作为竞争对手，日本方面已有5年的准备，技术先进，资金充足，有好的团队，集全国之力在做。而我们没有太多技术，经费短缺，团队也没日方大。
不仅如此，当时人们对于家蚕基因框架图的概念还不熟悉，不能理解为了绘制这张框架图，要投入大量人力和物力，花费几千万元巨额资金，而结果却只有一张图谱，这似乎有点不值。
夏庆友： 稍微超前的研究，很多人不理解，同行、政府都可能不理解。但总得顶住压力，通过努力解决困难。
在此后的五个多月里，夏庆友带领整个团队，进驻中国科学院北京基因研究所，正式开始对家蚕基因组的测序工作，向仲怀院士则往返于北京和重庆之间，指导研究。
2003年6月，北京华大基因研究中心，测序仪器以每天产生10万条数据的速度高速运行，300多名工作人员和120多名技术人员，平均每天工作十四五个小时。
他们为何要花费如此大的精力，开展这项所谓超前研究呢？家蚕基因组框架图，究竟是一张什么图，值得如此劳师动众？
基因组研究是20世纪生物科学发展中最受关注的领域之一。地球上千姿百态的物种，其生命的一切奥秘，主要隐藏在自身DNA的碱基序列中。基因组研究的目的，就是阐明生物所拥有的全部遗传信息，在分子水平上探索所有生命现象的内在机制。
2001年，由日本组织，在法国里昂召开了国际鳞翅目昆虫基因组计划筹备会议，家蚕基因组国际合作组织开始启动。然而，令人意外的是，蚕丝产量占世界总量70%的中国竟然未被邀请参加，这让向仲怀院士感到很不是滋味，由此也产生了一种危机感。
家蚕起源于中国，是由古代栖息于桑树的原始蚕驯化而来，早在四、五千年前，我们的祖先就学会了栽桑养蚕，是举世公认的伟大发明之一。
然而近一百年来，世界蚕丝业的中心发生了几次大转移，现代蚕业的技术体系最终在日本形成。虽然，目前我国茧丝量和出口量分别占世界的70%和80%以上，但蚕业科学基础研究方面仍落后于日本。
向仲怀：我们的传统技术，都是上世纪二、三十年代所用的技术，蚕的科技发展处于平台期，产品的品质、蚕自身的抗性，特别需要新的材料去改善品种，需要新的技术去研究。
实际上，早在人类基因组公布的前5年，也就是1995年9月，向仲怀院士和中国科技大学李振刚教授就提出了家蚕基因组计划的设想，并于2002年联合多位院士发表了《院士建议》，呼吁尽快启动中国家蚕基因组计划。
向仲怀：研究家蚕基因的目的，一是想从根本上改变传统产业。另一个是，想通过研究蚕的缺陷，建立一个模式生物系统，跟人类健康有关的模式。如果取得成功，可用家蚕筛选药物。
为此，西南大学迅速启动了大规模的家蚕EST测序研究，经过四个月的努力，完成了10万条测序工作，为家蚕基因组框架图的绘制，奠定了良好基础。
鉴于中国取得的成就，日本方面表现出积极态度，表示愿意与中国合作。此后双方达成协议，确定由日本和中国牵头，共同开展家蚕基因组框架图的绘制工作，双方各完成任务的一半。
然而，就在向仲怀院士和同事们即将与日本展开合作时，阴影却不期而至。2003年初，日方突然单独启动了这项工作，并提出集中全日本的优势，以家蚕基因组计划开创由日本出发的丝绸之路，还将2003年命名为日本丝绸之路元年。
中国是丝绸的故乡。我国西南地区的巴蜀盆地和成都平原，由于气候条件适宜，蚕桑业一度得到长足发展。早在秦汉时期，蜀地产出的丝绸就以精美而著称于世，商旅穿行于高山峡谷之间，将巴蜀的丝绸远销到欧亚各国。
古代丝绸之路开启了中国乃至人类历史上中西文明的碰撞与交汇的先河，随着驼铃声的远去，它逐渐淡出人们的视线。但是，作为传播文明火种的通道，它永久载入了人类与社会发展的史册。
向仲怀：丝绸之路是中华文明的一个符号。一提起丝绸之路世界上每个角落都知道，对中华文明的传播起到了重要作用。
夏庆友：丝绸之路是一个重要的文化交流现象，我们要记住它，继承它。在丝绸方面我们仍然是一个重要国家，有能力作出贡献。
然而，这样一个深烙在中国的文化标记，却遭遇到所谓“由日本出发的丝绸之路”的挑战，面对日方的不守信用与傲慢，向仲怀他们没有别的选择，只有迎难而上。
这是一场关系到我国在家蚕基因的国际竞争中，能否占据主动地位，21世纪的丝绸之路是从中国开始，还是从别的地方开始的问题。
向仲怀院士当机立断，决定把西南大学蚕桑学重点实验室多年积累的全部家当拿出来，作为启动资金，由此拉开了他们在北京的背水一战。
那段时间，夏庆友和同事们几乎没睡过一个完整觉。夜以继日，历时5个月的艰辛工作，共完成550万个测序反应，每个测序反应获得平均测序长度为610碱基对，2003年10月7日，家蚕基因组测序最后拼接完成。（图3）
根据基因结构的普遍规律和家蚕基因组的特殊性，经过反复研究校正，最终确定了18510个家蚕基因，在此基础上，绘制出一张包含家蚕全基因组序列信息，DNA序列排列特征，基因的位置和结构等内容的图谱，这就是家蚕基因组框架图。（图4——1 图4——2）（图5）
夏庆友：这让家蚕研究提前了五六年。这些基础研究进展，可带来很多成果，我们是最大的受益者，因为中国有最大的养蚕业，是缫丝产量最大的国家。（图6）（图7）
2003年11月15日，重庆市政府和中国科学院联合在重庆召开新闻发布会，向世界宣布家蚕基因组框架图绘制完成。这是世界上首张家蚕基因组框架图，是我国科学家继完成人类基因组1%测序工作，水稻基因组框架图和精细图之后，向人类贡献的第三大基因研究成果，标志着我国迈入了基因组科技强国的行列。而此时，日本方面仍没有传出测序完成的消息。
夏庆友：认识家蚕、改造家蚕，利用家蚕为人民服务，在分子层面来讲就是认识蚕的基因，利用蚕的基因，改造蚕的基因，为人类服务。
代方银（西南大学教授）：在蚕的整个发育周期里，所有的遗传性状，都有不同特点。每一个遗传表现，都是由基因支配的，基因特点不同，它的功能就不同，表型也不同。
家蚕是雌雄异体昆虫，正常情况下各占50%，但由于雌蚕需要消耗营养产卵，因此产丝量小，人们曾想如果能改变家蚕的性别，多产雄蚕，就能增加产丝量。
通过对家蚕基因图谱的研究，现在，西南大学已经找到数十个性别开关的基因，以这些基因为线索，可以对家蚕性别进行控制。
研究人员利用家蚕基因，已经培养出转基因的彩色蚕茧，有绿色、黄色、红色、白色等。传统的彩色蚕茧需要经过染色才能着色，转基因的彩色蚕茧则是纯天然的，不需要经过任何化学染色。（图8）
不仅如此，利用家蚕基因，还可以扩大家蚕的食源，使家蚕摆脱几千年来只吃桑叶，不吃其它食物的习性。通过转基因技术，逐渐培育出新型优质蚕种，解决蚕丝易皱脱色等先天缺陷，使蚕丝这一纤维皇后彻底摆脱长期占纤维消费总量不足1%的尴尬局面。
向仲怀：21世纪是由传统学科改变为现代学科的时期。从摘桑养蚕做服饰，到对人类健康服务的产业。学科的改变，既是民族文化的传承，又是科技文化的弘扬。
古代丝绸之路是中国对人类文明作出的重大贡献，是以蚕桑为基础的绢丝产业。而21世纪的新丝绸之路，则是以现代科技为核心，以基因组研究为平台，从家蚕入手，找到并构筑蚕业科技的突破之路，寻求人类对鳞翅目类农林害虫的根治之路，开发生物药品和防控人类疾病的健康之路。
夏庆友：过去的丝绸之路从中国出发，走向全世界，创造了非常辉煌的历史。现在希望以科学技术重走一条丝绸之路，新的丝绸之路让中国人在丝绸、家蚕的利用研究上找回过去的自信，在产业、文化、科技上为人类作出贡献。
目前，西南大学已建成国际上规模最大的家蚕基因资源库，保存有家蚕突变遗传系统700个，也是国际上最全的家蚕基因库。家蚕基因数据库日访问量达到200万人次以上。（图9）
美国绘出头皮屑真菌全基因组图谱 篇4
美国宝洁公司科学家表示，他们已成功破译了球形马拉色菌的全部基因组，该真菌能导致人们产生头皮屑及脂溢性皮炎等皮肤疾病。相关文章发表在近期美国科学院院刊网站上。
球形马拉色菌是迄今被测序的最小的自由生存(非寄生或共生)真菌类有机体之一。科学家的测序和分析结果显示，它由大约4285个基因构成，它的全基因组碱基对数量仅相当于人类基因组碱基对数量的三百分之一左右。它是一种存在于人体皮肤上的常见真菌，以人体外部油脂为食，平均每个人能容纳1000万个球形马拉色菌。科学家表示，人体出现头皮屑和脂溢性皮炎通常需要3种条件并存，即对炎症遗传性易感、头皮上有皮脂和存在球形马拉色菌。
科学家说，全球有一半以上人口存在不同程度的头皮屑和脂溢性皮炎等问题。球形马拉色菌全基因组图谱的绘制成功，有助于科学家从分子水平上重新认识这种真菌，理解真菌和人体之间的相互作用，进而开发治疗头皮屑以及脂溢性皮炎等的新疗法。(科技日报)
首个黄种人基因组图谱问世等 篇5
据美联社10月9日报道，美国的一项最新研究表明，接种流感疫苗，将使老人因流感及其并发症死亡的风险降低48％，还能使老人因病住院的风险降低27％。
研究人员称：“感染流感后，人体内会产生大量自由基，它们会破坏心、肺等器官，引起严重的并发症，或加重原有病情，甚至导致死亡，而流感疫苗可以很好地避免这一点。”根据中国疾控中心发布的《2007～2008流行季节流感预防控制技术指导意见》，应优先接种流感疫苗的人群包括：6～50个月的婴幼儿；年龄不小于60岁的老人：慢性肺病、心血管疾病、肾病、肝病、血液病或代谢性疾病患者；有免疫抑制状况的成人和儿童；呼吸功能和呼吸道分泌物排出功能可能受损的成人和儿童(如认知障碍、癫痫等)；长期接受阿司匹林治疗的儿童青少年；准备在流感季节怀孕的妇女。此外，经常接触上述人群的人也应优先接种。但对鸡蛋或疫苗过敏者、正在急性发热的患者、曾患格林巴利综合征者，不能接种流感疫苗。
首个黄种人基因组图谱问世
首个黄种人基因组图谱在深圳揭开面纱。这是全球第一例中国人标准基因组序列图谱，也是全球20亿黄种人的第一个个人基因序列图。该项目是我国科学家继承担国际人类基因组计划1％的任务、国际人类单体型图谱10％的任务后，用新一代测序技术独立完成的100％中国人基因组图谱。专家表示，这项基因组科学领域里程碑式的科学成果，对于中国乃至亚洲人的DNA、隐形疾病基因、流行病预测等领域的研究具有重要作用。近期“炎黄一号”黄种人基因组序列图谱以一系列神秘的符号在深圳第九届高交会一号展馆展示。该项目由来自深圳华大基因研究院、生物信息系统国家工程研究中心及中国科学院北京基因研究所的科学家共同发起并承担。
戒烟新招——尼古丁替代疗法
日前，北京市政府发布《在餐饮业开展控烟工作的通知》。通知指出，各大、中型餐厅，2008年6月前应提倡全面禁烟，确有特殊情况不能达到全面禁烟的，要实行分区管理。这是为实现北京“无烟奥运”而做出的重要举措。
吸烟危害很大，但香烟又有很大成瘾性，所以戒烟成功率很低。北京呼吸疾病研究所副所长王辰教授说：“之所以吸烟成瘾，是因为尼古丁的作用，所以戒烟的重要一点就是戒掉尼古丁给人带来的成瘾性。尼古丁替代疗法是目前国际上普遍使用的治疗方法。它一方面可使戒烟者逐渐递减对尼古丁的依赖，同时又避免了吸入有害物质而引发的慢性病和致癌的可能性。”
目前，诺华公司生产的尼古丁替代疗法处方药“尼派”已在我国正式上市。
玉兰油等被曝含致癌物
香港消费者委员会近日测试30款面霜和润肤乳液，结果发现7款样品含有可能引致神经中毒及致癌的化学物——丙烯酰胺单体残留量，其中6款产品超过了内地和欧盟标准，包括玉兰油(Olay)、巴黎雪完美、H2O+、碧欧泉等品牌。
香港消委会称，根据内地和欧盟采用的标准列明，有6款的丙烯酰胺残余量由0.25mg/kg至1.6mg/kg，高于有关上限。香港消委会同时也强调，消费者无须过分担心使用含微量丙烯酰胺单体的护肤品会引致中毒。香港卫生署认为，在正常情况下使用这些被检测含微量丙烯酰胺单体的面部护理产品，应该不会对健康构成显著的风险。玉兰油所属的宝洁中国公司相关负责人梁小姐表示，被查出的玉兰油润肤乳液是在泰国生产的，内地没有销售。
美实验室抽检结果显示：欧莱雅等美产口红铅超标
美国一家独立实验室今年9月抽检了美国市场上33个品牌的红色系唇膏。检测结果显示，61％的口红含铅，含铅量从0.03ppm至0.65ppm不等。但没有一种口红在包装上标注含铅。ppm为显示成分含量的计量单位，1ppm相当于每千克中含1毫克。这份报告称，含铅量较高的口红包括：欧莱雅纷泽滋润正红色唇膏、欧莱雅纷泽滋润经典酒红色唇膏、封面女郎Ineredifull鲜红色唇膏、迪奥魅惑暗红色唇膏，而诸如露华浓等品牌的口红不含铅，价格也相对便宜。报告显示，三分之一的口红含铅量超过美国食品和药物管理局的糖果含铅量标准——0.1ppm。安全化妆品运动组织认为，尽管食品和药物管理局并未制定口红的含铅量标准，但口红如同糖果，可被人体直接吸收，因此糖果含铅量标准适用于口红。
研究表明：过度肥胖最高平均使人少活13年
基因图谱 篇6
团队专家指出, 家蚕基因组精细图谱的完成, 使大家能更深地认识吐丝、食性、发育及变态等家蚕特异的生物学过程, 将为识别、筛选具有重要价值功能基因提供重要支撑。
预测出14623个家蚕基因
家蚕基因组精细图和之前发布的框架图相比, 具有基因覆盖深度高、基因组组装更加完整、基因鉴定更加准确等特点, 其基因组的序列覆盖度达到8.48倍, 基因的覆盖度达99.6%, 基因组装更加完整。通过精细分析, 科学家共预测出了14623个家蚕基因, 并以此为基础完成了精细图谱和分子连锁图谱的整合, 目前已将76.7%的基因组片段和82.2%的基因定位到了家蚕染色体上。
绿色蚕丝能发荧光
西南大学家蚕基因组研究团队, 成功开发出一种转基因新型有色茧品种, 这也是我国首次获得的转基因新型有色蚕丝。团队专家指出, 天然彩色茧中除了绿色茧的部分色素存在于丝素中外, 其他色素大都存在于丝胶中, 在缫丝、精炼的过程中极易损失和破坏, 这也是人们在长期的品种选育中选择无色素的白色茧而淘汰有色茧的根本原因。
西南大学目前已成功建立了高效、实用的家蚕转基因技术体系, 在此基础上开发了转基因新型有色茧开发技术, 并与广西蚕业技术推广总站合作, 育成了一对色彩稳定的新型绿色茧品种, 完成批量缫丝和茧丝的性能鉴定, 缫出的生丝不但在自然光下具有美丽的绿色, 而且在紫外光下能发出绚丽的绿色荧光。成果一旦推广, 将产生巨大的经济效益和社会效益。
西南大学家蚕研究团队通过5年刻苦攻关, 还相继取得了绘制完成30种蚕类基因组变异图谱、绘制完成家蚕重要病原微生物微孢子虫基因组精细图谱等2项重大研究成果。
苦干5年盒饭方便面相伴
“5年来觉得最对不起家人, 都泡在实验室里了, 和他们在一起的时间真的是太短暂了。”西南大学家蚕研究团队一名成员, 对记者诉说了成果背后的辛劳。从2003年框架图谱绘制完成后, 他们马不停蹄地继续投入到更深入的研究中, 5年来与他们相伴最多的是盒饭和方便面。
为了早日完成精细图, 团队的每一位成员都主动放弃了休息时间, 加班到凌晨两三点是常有的事情, 有的同事还经常通宵工作。5年下来, 1万多个家蚕基因遗传上的分析和鉴定终于完成。
“这又是一个新开始, 我们还会有更多的产业运用上的成果。”对于未来, 西南大学家蚕研究团队的成员们充满了信心, 家蚕基因研究的成果将一项一项地变成大家生活中的一部分。
西南大学蚕基因研究成果时间表
2003年, 蚕桑学重点实验室成功绘制出家蚕基因框架图, 被誉为21世纪蚕业科学研究的里程碑, 奠定了我国在家蚕基因组研究中的世界领先地位。该成果2004年12月10日在《科学》上发表, 这是近百年来我国在《科学》杂志发表家蚕研究论文“零”的突破, 也是世界昆虫学界的一件大事。
2006年1月2日, 蚕桑学重点实验室研制成功家蚕基因芯片与表达图谱。这是我国在家蚕基因研究领域取得的又一项重大进展, 将为我国家蚕产业的发展以及人类防病找到有效途径。
2008年12月, 世界首张蚕基因组精细图谱在西南大学完成, 我国为世界家蚕基因组研究作出又一重大贡献。
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转基因蚕丝不易皱不易褪色
据新华社电本次开发的有色茧实用品种是我国首次获得的转基因新型蚕丝, 这不仅是对天然彩色丝的突破, 标志着利用转基因技术改造蚕丝结构、克服蚕丝易皱、褪色等新型素材创新工程进入一个新阶段, 而且还将对蚕丝业产生重大影响。
基因图谱 篇7
而肠毒素及R质粒的基因主要由大肠杆菌的质粒所编码[4],笔者在对广西地区规模化猪场56株大肠杆菌分离株进行培养及生化鉴定的基础上,并对所有分离株的菌毛基因进行多重PCR检测及质粒指纹图谱分析,为研究仔猪致病性大肠杆菌腹泻病的快速诊断和分子流行病学调查奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
56株大肠杆菌来源于广西壮族自治区不同规模化猪场临诊发生典型仔猪黄、白痢猪只的肛拭粪样或死亡猪只心血和肝中分离,在普通肉汤中呈均匀混浊,液面有菌膜,管底有白色沉淀,振荡呈云雾状散开;普通琼脂平板上生长呈灰白色、半透明,表面隆起,光滑湿润,边缘整齐的圆形菌落,直径1~3 mm;麦康凯上生长呈粉红色菌落;伊红美兰上生长菌落呈紫黑色带金属光泽;能使三糖铁斜面变黄,底柱产气,但不产H2S;均能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖等多种糖类,产酸产气,能运动,不分解尿素,M.R试验阳性,V.P试验和枸橼酸盐利用试验均为阴性。这些特性与大肠杆菌相符,可初步鉴定这56株为大肠杆菌株,并经小白鼠致病性检测、生化反应鉴定为致病性大肠杆菌。营养琼脂斜面保存于广西兽医研究室细菌研究室。猪场分别是:RS(融水)6、RS8、RS10、RS11、RS13、RS14、RS16号,ZY(资源)2、ZY3、ZY4、ZY9、ZY10,GY(灌阳)1、GY3、GY5、GY9,YS(阳朔)3、YS8,LP(荔浦)2、LP4、LP6、LP8,LX(柳鑫)1、LX2、LX4、LX4-1、LX4-2、LX4-3、LX4-4、LX4-5,WX(武宣)11、WX12,NN(南宁)1、NN2、NN3、NN4、NN5、NN6,PL(平乐)6、PL 7,FC(防城)2、FC7、FC8、FC11,QZ(钦州)1、QZ2、QZ3、QZ4、QZ5、QZ6、QZ7、QZ8、QZ9、QZ10、QZ11、QZ12(猪场地区相同、编号不同表示来自于同一地区不同猪场)。
1.2 供试培养基及药品试剂
麦康凯、营养肉汤干粉培养基和肠道菌科细菌微量生化鉴定管购自杭州天和生化仪器公司。λDNA/Hind III、PCR Taqmix、DNA MarkerⅡ购自自广州东盛生物科技有限公司,溶菌酶、细菌基因组DNA提取试剂盒与质粒小提中量试剂盒均购自天根生物公司。
1.3 多重PCR检测
1.3.1 引物合成。
K88、K99、987P引物参照华荣虹等[4]方法。K88上游引物5′-AATGGTTCG GTCGATATCG-3′,下游引物5′-TACTGGCGTAGCAAATGC-3′,预计扩增片段长度为210bp左右;K99上游引物5′-TAT TATCTTAGGTGGTATGG-3′,下游引物5′-GGTATCCTTTAGCAGCAGTATTTC-3′,预计扩增片段长度为314 bp左右;987P上游引物5′-CTGCCAGTC TATGCCAAGTG-3′,下游引物5′-ACGGTGTACCTGCTGAA CGAATA G-3′,预计扩增片段长度为519 bp左右。各引物均由大连宝生物公司合成。
1.3.2 细菌DNA的提取。
参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行。
1.3.3 PCR扩增。
以所提取各细菌DNA 1μL为模板进行PCR。PCR循环条件为:95℃预变性4 min,然后94℃变性40 s、50℃复性40 s、72℃延伸1 min进行,35个循环,72℃延伸10 min。反应结束后取20μL产物用于1%琼脂糖凝胶电泳分析。
1.4 质粒DNA的提取
参照质粒小提中量试剂盒提取说明书进行。
1.4.1 琼脂糖凝胶电泳。
采用水平式琼脂糖凝胶板电泳,凝胶浓度为0.7%,电泳缓冲液为TBE,电压90V。于含0.5g/100m L溴化乙锭溶液中染15~20 min,用凝胶成像分析系统观察。
1.4.2 质粒片段大小的估算。
质粒DNA及酶切片段大小估计按Hanse等[5]的方法进行。以标准λDNA的Hind III酶切片段(其分子分别含有23 100、9 400、6 600、4 400、2 300、2 000 bp)的电泳结果为标准系统,以相对迁移率为自变量,碱基数的对数为因变量,建立回归方程,换算出质粒及酶切片段的碱基数。每次电泳均设有标准λDNA的Hind III酶切系统作标准。
2 结果与分析
2.1 多重PCR
以各株致病性大肠杆菌DNA为模板,优化PCR条件,成功扩增出与预期结果相符的相应特异性片段,试验结果见图1。用常规分离培养方法,分离得到56株猪源大肠杆菌,以多重PCR方法进行基因分型,检测结果为K88有49株,K99有6株,K88+987P有1株。
2.2 56株大肠杆菌的质粒特征指纹图谱
整理56株大肠杆菌质粒DNA电泳结果,得到17种质粒图谱谱型(表1)。从表1可以看出,只有1条质粒带的有6株,有2条质粒带的有12株,有3质粒带的有25株,有4条质粒带的有7株,具有5条或6条质粒带的各3株,以有3条质粒带的菌株为优势菌株。各株大肠杆菌均有1条大约23 100 bp的质粒带,来自相同地区猪场的菌株大多具有更多相同大小的质粒条带,提示各地区流行菌株所含质粒可能具有一定的同源性,具有相近的亲缘关系。
3 结论与讨论
猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一种仔猪肠道传染病。大肠杆菌致病与其具有粘附性菌毛和产肠毒素密切相关。猪源肠毒素性大肠杆菌常具有K88、K99、987P粘附性菌毛中的1种或几种。常规检测大肠杆菌菌毛的方法有电子显微镜观察,D-甘露糖抵抗血凝试验,细胞粘附试验和免疫血清学技术。这些方法操作繁琐,特异性不高,大部分还不能对菌毛进行分型检测。对病原菌的分子生物学检测包括多种方法,如PCR技术、基因芯片技术、噬菌体分型技术、脉冲场凝胶电泳分析技术等[6]。华荣虹[4]以粘附性菌毛结构基因的保守区段为模板,建立了1个多重PCR反应体系,对各种菌毛阳性标准菌株及其不同组合和菌毛阴性对照菌株的扩增结果表明此体系特异性好。本试验通过56株仔猪致病性大肠杆菌进行菌毛基因的多重PCR检测,进一步证实了多重PCR的方法在对各类大肠杆菌野生菌株的检测也是可行的,该方法可用于仔猪大肠杆菌性腹泻病的快速诊断和流行病学调查。
运用多重PCR检测发现流行于广西自治区规模化猪场的致病性大肠杆菌所具有的粘附性菌毛通常以K88为主,此次所调查的56株致病性大肠杆菌中K88菌毛49株,K99菌毛6株,K88+987P菌毛1株。这与许建民等[7]是猪源ETEC的一种主要粘附素的相关报道一致。在特定环境及宿主条件下,致病性大肠杆菌菌株在小肠上皮的粘附程度是导致胃肠功能紊乱的主要原因,检测粘附性菌毛对大肠杆菌性腹泻的诊断十分重要,因此利用多重PCR等方法建立快速检测粘附性菌毛基因无疑有着重要的意义。
流行病学调查在细菌性传染病的研究中占有重要位置。对于病原菌的追踪、分型,人们根据其生物学特征已经建立了许多表型分型方法,如生化指纹分型、噬菌体敏感性分型、抗生素敏感性分型、菌毛分型、外膜蛋白图谱分型、血清学分型等。这些分型方法依赖于细菌的表型,其稳定性差,且敏感度低,有些必要的试剂也不易得到。为了克服这些不足,有必要将分子生物学技术用于流行病学调查。据报道,质粒指纹图谱分析用于暴发流行菌株的鉴定,特异性与噬菌体分型相当,远优于血清学、生化指纹分型、药敏试验等[8,9]。朱向玲等[10]了解大肠杆菌分离菌株的分子特征,建立了随机扩增多态性和质粒指纹图谱种分型方法,对从粪便和动物组织分离的大肠杆菌进行了分型研究,结合主要毒力基因的检测和药敏试验,以进一步验证分离菌株之间的亲缘关比较随机扩增多态性和质粒指纹图谱种分型方法发现它们虽具有相似的结果,但质粒图谱法分析更能反映出菌株之间的亲缘关系。
本试验中分离菌株的质粒获得率为100%,说明大肠埃希氏菌适合用质粒指纹图谱法进行分析。对56株致病性大肠埃希氏菌进行质粒分型,共分为17种质粒谱型。同一来源的菌株大多具有类似的质粒谱型,同一地区暴发流行的菌株含有相似的流行质粒。因此,可以推测细菌的暴发流行可能是某些流行质粒的流行。可以根据不同起暴发流行菌株是否含有相同的流行质粒来判断这些菌株之间的相关性。本试验分离到的56株致病性大肠杆菌的质粒指纹图谱显示来自相同地区猪场的菌株大多具有更多相同大小的质粒条带。这与赵宗胜等[11]认为一般在同一地区流行的大肠杆菌病均以少数几个流行质粒为主的结论相一致。此次调查所有菌株都含有1条大小约为23 100 bp的质粒带,这提示广西地区近年来流行致病性大肠杆菌优势菌株可能具有高度同源性。从图谱谱型上还可发现流行菌株间,即使是来源于同一地区的菌株其质粒图谱也不完全相同,存在一定的差异。这种差异可能是传染病暴发流行时细菌在广泛传播过程中发生了分子生物学的演化所致[12]。
参考文献
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[10]朱向玲,严亚贤,陆承平,等.运用随机扩增多态性和质粒指纹图谱法进行大肠杆菌O157的分子多态性分析[J].上海交通大学学报:农业科学版,2008,26(4):259-263.
[11]赵宗胜,储岳峰,王晓兰,等.应用质粒图谱分析大肠埃希氏菌毒力差异的研究[J].中国兽医科技,2001,31(4):9-11.
基因图谱 篇8
研究背景及路线
金黄色葡萄球菌是牛奶中常见的一种致病微生物，因此，能够上市的牛奶产品中不允许检出金黄色葡萄球菌。生鲜乳中金黄色葡萄球菌主要来源是奶牛场。虽然奶牛场会定时对奶牛本身和牛舍进行消毒，但还是避免不了金黄色葡萄球菌对生鲜乳的污染，这主要是因为金黄色葡萄球菌对牛场中使用的抗生素产生了耐药性。经查阅文献得知，金黄色葡萄球菌也是引起奶牛乳房炎的主要致病微生物，奶牛患乳房炎是金黄色葡萄球菌污染生鲜乳最主要的原因，会引起牛奶的腐败变质。因此，想要控制牛奶的奶源质量，就必须对金黄色葡萄球菌的耐药性进行研究。我们对北京某牛场的牛群进行随机取样，对其中的金黄色葡萄球菌进行了分离鉴定，以及耐药性的基因分析，建立了多重耐药性的耐药基因图谱，可以更快速、合理地对奶牛场的用药进行指导。研究技术路线见图1。
实验过程
样品采集
从北京某牛场牛群中随机选择奶牛48头，分别收集乳头涂抹样品（见图2）、牛乳样品及粪便样品等144份样品，将其放入冰盒中冷藏，带回实验室，保存备用。其中，乳房涂抹样品：使用无菌拭子擦拭奶牛乳头后置于无菌生理盐水中保存，共采集48份；生鲜乳样品：用温水清洗奶牛乳房并使用75%酒精棉球对乳头进行消毒处理，然后收集第3把后的奶样保存于无菌试剂瓶，共采集48份；粪便样品：使用无菌手套从牛的肛门处采集新鲜粪便，分别装入无菌蓝盖试剂瓶中保存，共采集48份。
菌种预培养
配制营养肉汤培养基，在三角瓶中按瓶子上的用量要求进行配置，再加入适量的蒸馏水。121℃20min高温湿热灭菌。在无菌室挑取平板上的菌落，放入灭菌的营养肉汤培养基中，放入培养箱中37℃进行培养。
菌种分离纯化
配制Baird Parker琼脂培养基，在三角瓶中按瓶子上的用量要求进行配置，再加入适量的蒸馏水，121℃20min高温湿热灭菌，待温度冷却到50℃时，每95mL加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL，用于金黄色葡萄球菌的选择性分离培养。每个平板倒入大约20mL的培养基，加入已活化的液体培养基1 mL，放入培养箱中37℃进行培养。
菌体镜检和鉴定
镜检采用革兰氏染色法，一般包括初染、媒染、脱色、复染等4个步骤。
鉴定时，用取样棒挑取未知菌株的单菌落，悬浮于200 uL样品缓冲液中，95℃处理25min，分别加入5 uL裂解液A和裂解液B，选用EcoRI酶切程序。用全自动微生物鉴定设备运行约8h时后观察实验结果，得出待测菌株的信息。
药物敏感实验
使用比浊管对金黄色葡萄球菌肉汤培养物进行标定并校正。随后将培养物接种于营养琼脂平板中，涂布均匀后贴上药敏纸片，用镊子轻压纸片将其与培养基表面贴牢，15min内放入37℃恒温培养箱中培养48h后测量抑菌圈直径。并对金黄色葡萄球菌的耐药结果进行归类分析。
耐药基因图谱的建立
采用BioNumerics分析软件对全自动微生物鉴定结果进行分析，得出金黄色葡萄球菌的耐药基因图谱。
实验结果
培养特性
Baird Parker培养基培养24h后菌落为圆形，直径1～2mm，颜色灰或黑色，周围环晕约2～3mm。营养琼脂上培养24h后菌落为圆形，直径2～3mm，表面光滑、湿润、边缘完整，未见明显环晕。营养肉汤培养12h后液体浑浊，静止后底部有沉淀，轻摇后全部旋起溶解。
形态观察
将提纯培养的菌株进行革兰氏染色，镜检呈阳性结果。显微镜下菌株呈葡萄球状排列，边缘散落菌体呈短链状存在，不存在鞭毛、芽孢、荚膜。金黄色葡萄球菌在Baird Parker培养基上培养24h后的形态见图3。金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果见图4。
菌种鉴定结果
分别调取平板培养的单菌落，悬浮于40 uL缓冲液中，预热后加入裂解液，选用EcoR I酶，在全自动微生物鉴定系统中自动运行8h，自动酶切后得出杂交图谱，将122株疑似金黄色葡萄球菌菌株产生的条带型与鉴定数据库中的标准菌株的标准条带型进行比较，得出57株菌株为金黄色葡萄球菌，其检出率为46.7%。
金黄色葡萄球菌的耐药性
将从牛场取得的样品中筛选出的57株金黄色葡萄球菌进行药物敏感实验。由实验结果得知，分离得到53株菌株对多种药物具有不同程度的耐受性，耐药性的检出率为92.9%，对氨苄西林和青霉素G耐药的比率分别高达为78.9%和77.1%，而对克林霉素、红霉素、氯霉素及四环素的耐药性较低。
金黄色葡萄球菌耐药基因图谱
使用BioNumerics生物软件对鉴定结果的图谱进行分析处理，建立金黄色葡萄球菌多重耐药性的耐药基因图谱（见图5）。由图谱可知，5耐菌株图谱为金黄色葡萄球菌对氨苄西林、青霉素G、克林霉素、红霉素、氯霉素耐药的基因图谱，4耐菌株图谱为金黄色葡萄球菌对氨苄西林、青霉素G、克林霉素、红霉素耐药的基因图谱，3耐菌株为金黄色葡萄球菌对氨苄西林、青霉素G、氯霉素耐药的基因图谱；2耐（a）菌株为金黄色葡萄球菌对氨苄西林、青霉素G耐药的基因图谱；2耐（b）菌株为金黄色葡萄球菌对氨苄西林、四环素耐药的基因图谱；2耐（c）为金黄色葡萄球菌对四环素、头孢哌酮耐药的基因图谱；1耐菌株为金黄色葡萄球菌对青霉素耐药的基因图谱；0耐菌株无明显耐药性。通过金黄色葡萄球菌多重耐药性的耐药基因图谱可以更简捷分辨出从奶牛场分离出的金黄色葡萄球菌的耐药情况，可以更快速、合理地指导奶牛场对奶牛的合理用药。
讨论与结论
讨论
目前，寻找奶牛乳房炎发病原因最常用的方法是病原菌的分离鉴定，以往的研究发现金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要致病微生物，本文使用全自动微生物鉴定系统针对从奶牛乳头涂抹点、牛乳、粪便等样品分离纯化的疑似122株菌株进行了快速鉴定，鉴定出57株为金黄色葡萄球菌，其检出率为46.7%，说明金黄色葡萄球菌是该奶牛场存在的主要致病微生物。目前治疗奶牛乳房炎的常用方法是使用抗生素，但大量抗生素的使用会使金黄色葡萄球菌产生耐药性，因此，针对分离纯化鉴定得到的57株菌株分别进行了药敏实验，结果显示，53株菌株对多种药物具有不同程度的耐受性，耐药性检出率为92.9%，其中51株菌株具有多重耐药性，主要集中在4耐和5耐，占总菌株的64.9%，而对氨苄西林和青霉素G耐药的比率分别高达78.9%和77.1%，对克林霉素、红霉素、氯霉素及四环素的耐药性较低，说明该牛场的奶牛近期发生过乳房炎疾病且波及范围较大，在此期间使用了大量的抗生素药物，特别是青霉素类的抗生素。因此，建议奶牛场不要经常或单独使用含氨苄西林和青霉素的抗生素。
另外，对于奶牛乳房炎，除药物防治外，还应以预防为主，因此建议该牛场注意加强饲养管理、注重挤奶卫生、平衡日粮、并进行定期检测，做到早发现早治疗，从根本上降低乳房炎的发病率。此外，还要加强干奶期的预防，干奶期是奶牛泌乳周期的一个重要阶段，是对奶牛机体和乳房健康的重要调整期，也是控制和治疗乳房炎发生的重要环节，在此阶段，药物可以长时间作用于乳房，对降低下一泌乳期乳房炎发病率具有显著作用。
结论
本研究通过对从北京某牛场采集的乳头涂抹样品、牛乳样品及粪便样品等144份样品进行金黄色葡萄球菌的分离纯化，得到122株疑似金黄色葡萄球菌菌株，使用全自动微生物鉴定系统快速确定了57株金黄色葡萄球菌，其检出率为46.7%。耐药性实验结果表明其中53株菌株对多种药物具有不同程度的耐受性，耐药性检出率为92.9%，而其中51株菌株具有多重耐药性，主要集中在4耐和5耐，占总菌株的64.9%。根据全自动微生物鉴定系统的结果图谱，使用BioNumerics生物软件进行图谱的分析处理，建立了金黄色葡萄球菌多重耐药性的耐药基因图谱。因此，建议该奶牛场不要经常或单独使用含氨苄西林和青霉素的抗生素，而改用其他类抗生素，该实验方法与结果可用于指导奶牛场合理用药，以降低金黄色葡萄球菌的耐药性，保证生鲜乳的质量安全。
创新点
◇全自动微生物鉴定系统用于快速鉴定金黄色葡萄球缩短了鉴定时间，分析了奶牛场金黄色葡萄球菌的耐药情况，可快速调整奶牛场用药。
专家评语