反应体系

反应体系（精选十篇）

反应体系 篇1

SRAP(Sequence—related amplified polymorphism)是2001年由Li G和Quiros C F[3]开发的一种新型分子标记,具有操作简便迅速、成本低、可靠性好、重复性高、高稳定性等特点,适合进行基因定位、克隆、遗传图谱构建及遗传多样性分析等研究。近年来,SRAP技术在植物中的应用鲜见报道[4,5,6]。在桔梗研究中RAPD技术的应用有孙丽娜等[7]和严一字等[8,9]的报道,但SRAP技术在桔梗研究中的应用尚未见报道。为此,本研究旨在建立适宜的桔梗SRAP反应体系,为应用SRAP技术来研究桔梗种质资源和遗传遗传多样性等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料:

供试材料桔梗(Platycodon grandiflorum Jacq.A.DC)为在吉林省安图县周边采集,保存在延边大学农学院桔梗种质资源圃的野生桔梗。

1.1.2 试剂:

琼脂糖、CTAB、EDTA、dNTP、MgCl2、Taq酶、Tris、10×Taq酶配套缓冲液、引物、β-巯基乙醇等。以上药品均购于上海华美生物工程公司。

1.1.3 仪器:

凝胶成像系统、紫外分光光度计(U3010)、三恒多用电泳仪(北京六一仪器)、台式离心机(HERMLE2383K)、PCR仪(PCR System 9700)、超低温冰箱等。

1.2 方法

1.2.1 材料的取样:

在田间取干净的桔梗嫩叶,迅速放入封口袋密封,置于-70℃低温冰箱中保存备用。

1.2.2 DNA模板的制备与定量:

基因组总DNA的提取及定量,采用改进的CTAB法[10]。

1.2.3 SRAP反应成分用量:

首先确立基本反应条件,即PCR反应总体积为20μL,其中含模板DNA 10ng,引物0.2μmol/L,d NTP 100μmol/L,Mg Cl22.5mmol/L,Taq DNA聚合酶1unit,10×反应缓冲液2μL,其余以重蒸馏水补充至20μL。以此为基本反应条件,以me5和em6为上、下游引物对反应体系中的模板DNA、引物、d NTP、Mg Cl2、Taq DNA聚合酶分别设置不同浓度梯度(表1)进行优化并确定最适用量。

1.2.4 PCR程序:

PCR反应在Eppendorf PCR仪上进行,反应程序为94℃预变性5min;94℃变性1min,35℃退火1min,72℃延伸1min,5个循环;94℃变性1min,50℃退火1min,72℃延伸1min,35个循环;之后72℃延伸5min;最后4℃保存。

1.2.5 PCR产物检测:

:扩增产物用含有0.5μg/ml溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶进行电泳,用Dolphin凝胶成像仪照相。

2 结果与分析

2.1 模板浓度筛选

图1为模板DNA浓度对SRAP的影响,M为DL2000 DNA分子量标准,数字为对应与表1中的浓度。由图1可知模板DNA浓度对SRAP反应影响较大,模板DNA用量过低或过高,虽然能扩出产物但不够明亮,DNA用量在20ng时在扩增出比较明亮且条带清晰,多态性较高,因此模板DNA用量取20ng。

M:200bp DNA分子量标记,数字为DNA浓度梯度(表1)。Lane M,200bp DNA ladder;Lanes 1 to 5 correspond to concentration grades for template DNA listed in Table 1.

2.2 引物浓度筛选

试验中引物用量的变化对SRAP产物的多少和条带的亮度影响较大(图2)。引物浓度在0.2、0.4和0.6μmol/L时虽然能能扩出条带但较暗,引物浓度在0.8μmol/L时都能扩增出较明亮的条带,当引物浓度为1.0μmol/L时缺失500bp的条带,因此实验的引物用量取0.8μmol/L为较为理想。

M:200bp DNA分子量标记,数字为引物浓度梯度(表1)。Lane M,200bp DNA ladder;Lanes 1 to 5 correspond to concentration grades for primer listed in Table 1.

2.3 d NTP浓度筛选

图3为不同d NTP浓度对SRAP的影响,从图中可以看出本实验所选的d NTP浓度都可以扩增出条带,但当d NTP浓度在100、200、250μmol/L时条带不够明亮,当d NTP浓度为300μmol/L时,缺失680bp的条带,只有d NTP浓度在150μmol/L时扩增的条带清晰且明亮,所以实验的d NTP用量以150μmol/L为最适值。

图中数字为M为200bp DNA分子量标记,dNTP浓度梯度(表1)。Lane M,200bp DNA ladder;Lanes 1 to 5 correspond to concentration grades for d NTP listed in Table 1.

2.4 Mg Cl2浓度筛选

Mg Cl2浓度对PCR反应的特异性及扩增片段产率的影响较大。从图4中可以看出随着Mg2+浓度增加,对桔梗扩增条带亮度有所增加、扩增效果好,但到了一定浓度(2mmol/L)以后,扩增条带亮度不再增加且缺失680bp的条带,因此Mg Cl2浓度为2mmol/L时比较理想。

2.5 Taq聚合酶浓度筛选

Taq聚合酶用量过大易产生非特异扩增产物,过小则降低扩增产物的合成效率。Taq聚合酶浓度对SRAP反应影响如图5所示,Taq聚合酶浓度过低0.2单位时扩增不出产物,在0.5单位时缺失200bp的条带,当Taq聚合酶浓度在2.0单位时,缺失1000以上的条带,Taq聚合酶浓度浓度为1.0和1.5单位时扩增出条带最多、带型也清晰,同时也考虑到经济效率,Taq聚合酶浓度以1.0单位为宜。

3 讨论

乔燕春等[5]认为,在枇把SRAP分析体系中适当的模板DNA浓度、酶、d NTPs、Mg2+浓度及引物浓度直接影响PCR扩增的结果。过高或过低都会影响SRAP的效果,因此,进行SRAP体系的优化是获得较好研究结果的先决条件。

图中数字为M为200bp DNA分子量标记,Mg Cl2浓度梯度(表1)。Lane M,200bp DNA ladder;Lanes 1 to 5 correspond to concentration grades for Mg Cl2listed in Table 1.

图中M为200bp的DNA分子量标记,数字为Taq聚合酶浓度梯度(表1)。Lane M,200bp DNA ladder;Lanes 1 to 5 correspond to concentration grades for Taq DNAse listed in Table 1.

在优化桔梗SRAP反应体系的本实验中,成分用量的变化对SRAP图谱产生较大的影响,其中模板DNA浓度主要影响图谱的亮度和清晰度、引物浓度主要影响SRAP产物的量和条带的亮度、d NTP浓度主要影响图谱的清晰度和亮度、Mg Cl2浓度主要影响条带亮度、Taq聚合酶浓度主要影响条带的数量和带型的清晰度,从而影响SRAP分析的效果。

按照本实验建立起来的桔梗SRAP反应体系进行实验,重现性良好,其最佳桔梗SRAP分析体系为:在20L PCR反应体积中,模板DNA 20ng,引物0.8μmol/L,d NTP 150μmol/L,ML+2为2.0mmol/L,Taq DNA聚合酶1 Unit,10×Buffer 2.0μL。

参考文献

[1]刘德军,冯维希.桔梗[M].北京:中国中医药出版社,2001:1-10.

[2]中国药材公司.中国常用中药材[M].北京:科学出版社,1995:421.

[3]Li G,Quiros C F.Sequence-related amplified polymorphism(SRAP).A new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica[J].Theor Appl Genet,2001,103:455-461.

[4]赵光伟,徐志红,徐永阳.SRAP分子标记及其在蔬菜作物上的应用[J].中国农学通报,2008,24(8):69-73.

[5]乔燕春,林顺权,刘成明,等.SRAP分析体系的优化及在枇杷种质资源研究上的应用[J].果树学报,2008,25(3):348-352.

[6]林忠旭,张献龙,聂以春.新型标记SRAP棉花F2分离群体及遗传多样性评价中的适用性分析[J].遗传学报,2004,31(6):622-626.

[7]孙丽娜,严一字,吴基日,等.桔梗RAPD反应体系的优化[J].广西植物,2007,27(3):410-413.

[8]严一字,吴基日,孙丽娜.桔梗种质资源的RAPD分析[J].安徽农业科学,2006,(16):3908-3910.

[9]严一字,吴基日.利用RAPD标记分析东亚地区桔梗的亲缘关系[J].植物研究,2007,27(3):308-312.

黄芪RAPD反应体系的优化 篇2

以蒙古黄芪和膜芙黄芪为材料,建立了黄芪RAPD反应优化体系.即在20μl反应体积中,模板DNA为5 ng,引物为0.2 μmol/l,dNTP为150μmol/L,MgCl2为2mmol/L,TaqDNA聚合酶为1 unit,1×Buffer,反应程序为预变性94℃ 5 min,94℃ 45 s,38℃ 60 s,72℃ 90 s,共循环40次,最后72℃延伸7min.

作 者：吴松权 孙丽娜 王立平吴基日 作者单位：吴松权(东北林业大学开放室,黑龙江,哈尔滨,150040;延边大学农学院,吉林,龙井,133400)

孙丽娜,王立平,吴基日(延边大学农学院,吉林,龙井,133400)

反应体系 篇3

【关键词】药品不良反应 药品检测体系 效果评价

【中图分类号】R722.12 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）03-0485-02

近几年，我国药品监测工作正在持续的发展。药品不良反应报告逐年上升，监测体系初步建立，但也存在着不良反应上报主体单一、报告质量参差不齐、风险预警滞后等诸多问题。本文就我国药品不良反应监测体系的实施效果评价进行简单总结。

1效果评价

1.1信息反馈评价

我国药品不良反应监测中心通过采取发布信息通报、药物警戒快讯等方式，有效的提示了医药企业、医务工作者及公众注意相关药品存在的安全性问题，预防了很多不必要的事故发生。

另外，国家药品不良反应监测中心在2009年开始发布《药品不良监测年度报告》，并定期通过举办全国监测中心主任会、各个企业相互沟通等方式进行信息共享，为风险管理计划制定和风险控制决策提供信息服务。

1.2审核评价

在审核效率方面，2004年颁布的《药品不良反应报告和监测管理方法》规定药品不良反应一般病例和严重病例的报告时限为3个月和15日，但是在2011年版将其改为30日和15日，且死亡病例必须立即报告。从调查可知，2012年一般病例报告时间距不良反应发生平均时间为23.6天，30日内报告比例达到83.8%；严重病例报告时间距不良反应发生时间平均为20天，15日內报告比例达到80.2%。

2结果指标

2.1 报告比率

发现药品安全风险的重要信息就是严重不良反应的信息报告。根据标准，成熟的药品风险评估中心报告的30%不良反应病例是新的、严重的病例。而我国目前收到的报告中，大部分是已知不良反应，新的、严重的报告较少，2005年仅占报告总数的3%—4%，2009年增至报告总数的16.3%，2014年达到28.2%，但是仍未达到监测体系发现信号并开展风险管理的要求，仍然不合格，这是我国存在的普遍问题。

在我国不同地区的药品不良反应报告肯定是有差别的。如陕西省西安市2011年第一季度的比例不到15%，同年湖南省的比例为17.1%，但部分省内城市接近35%。就不同省份进行比较可得和以往的报告来说，若省份参与在线呈报单位数越多，报告数量就越多，新的、严重的报告占比也越高。在同一省份内，新的、严重的报告比例的差异则反映出不同地市的新的、严重的不良反应发生的实际概率和合理用药水平的差异。

2.2报告数量

都知道，开展监测工作的基础是药品不良反应报告。近几年，我国的药品不良反应病例报告数量成持续增长趋势。1990-2000年，全国药品不良反应病例报告仅5000多份，2000年则为4700多份，2001-2005年报告数连续五年实现双倍增长，2008年达到60万份，2013年突130万份。

2.3 报告质量

我国在药品不良反应监测新系统上线后，通过系统的数据规整、标准化录入、抽样质量评估等功能，采集数据标准和规范性得到大幅提升，使我国各省份的药品不良反应报告有效性提升。系统使用前，商品名称规范化比例约为26.4%，生产厂家规范化比例约为54.1%，而使用后两者比例为别为73.4%和97.8%。

我国当前药品不良反应报告质量普遍偏低，来自我国ADR中心的报告显示，2002年共收到ADR报告1.7万份，2003年收到3.68万份，2004年则收到七万多份，2005年达到17.3万份。根据WHO对ADR报告的要求，各国每百万人口每年至少应有300份ADR报告，其中严重病例不少于30%。目前，我国百万人口的ADR报告数不足54份，仅为标准的1/6，其中药品生产企业的报告更是少之又少，主动报告的仅1%，98%以上来自医疗机构。

报告存在许多不足之处，主要表现为：患者基本信息存在一定缺失、专业术语不规范、不良反应名称和过程描述与处理过于简单、不良反应分析不够确切等。与此同时，在全国收集的药品不良反应报告中，有警戒意义的报告数量相对较少。

2.4报告集中度

在我国，虽然药品生产经营企业较多，但报送的药品不良反应报告数却相对较少。但是在国外，药品生产企业的报告占绝大多数。我国89%以上的药品生产企业对于不良反应主动上报的积极性不高，远远落后于国外。最近的几年里，我国各企业不良反应报告算是有所改变，2013—2014年企业不良反应报告率维持在22%以上。但是生产企业报告率仍偏低，以2014年为例，生产经营企业总占比23%，而其中生产企业仅占1.7%。

医疗机构报告单位中，基层医疗机构报告率相对较低。北京市2005年公布的各医疗机构上报的8275份药物不良反应报告中，60%的报告集中在24家三级医疗机构，有12家三级医疗机构年报告量不足20份，还有两家三级医疗机构、16家二级医疗机构存在零报告现象。

县级报告单位报告数量逐年提升。以2012年为例，全国药品不良反应县级报告比例为90.1%。2013年，基层药品不良反应监测机构建设进一步加快，药品不良反应报告县级覆盖率达到93.8%。

3总结

从效果评价的现状中可看出我国药品不良反应监测工作总体的发展速度还是比较快的，推进算良好，监测网络建设等方面表现优异，但也存在着许多不足，比如在风险控制措施、严重不良反应报告比等方面表现不尽如人意，有待进一步提高。所以全社会应该一起重视这项工作，及时报告、收集、发布药品不良反应信息，使这项工作不断趋于完善。

参考文献

[1]《中国执业医师》2009年12期

[2]《中华人民共和国药品管理法》2001年2月28日中华人民共和国主席令第45号公布，2001年12月1起施行

芒AFLP反应体系的建立 篇4

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料取自湖北省梁子湖地区,种植于武汉大学生命科学学院温室内。分别取3株芒的新鲜幼叶提取基因组DNA。

1.2 试剂

本试验采用的内切酶EcoRⅠ/MseⅠ(10U/μL )为Fermentas公司产品。T4连接酶(5U/μL)为Promega公司产品。基因组提取试剂盒、DL2000 marker、pBR322 DNA' MSPI marker均为天根公司产品。10×Taq Bufer(不含Mg2+),20 mmol·L-1 MgCl2,10 mmol·L-1 dNTPs,2 U/μL Taq DNA polymerase为北京鼎国生物技术有限公司产品,DNA Marker DL2000为宝生物(TaKaRa)公司产品。

AFLP采用通用引物(见表1)和接头,均由北京奥科生物技术有限责任公司合成,稀释至20μmol·L-1备用。

1.3 基因组DNA 提取

利用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取基因组DNA,具体操作参见说明书。通过紫外检测和琼脂糖凝胶电泳检测其质量和浓度,将部分稀释成50 ng/μL,置于-20℃冰箱保存。

1.4 AFLP 反应体系的建立

AFLP 反应体系的建立参照Vos P[4]等的方法。

1.4.1酶切与连接

采用EcoRⅠ和MseⅠ双酶切基因组DNA,共设立了四组酶切反应体系(表2)。

在37℃水浴酶切 3 h,65℃灭活酶15 min 以终止反应。酶切产物用1.2 %琼脂糖凝胶电泳检测。

然后,将接头与酶切产物16 ℃连接过夜。连接反应体系为:2.5 μL 10×T4 buffer、1.5 μL EcoRⅠ接头(25pmol/μL)、1.5 μL MseⅠ接头(25pmol/μL)、1 μL T4连接酶、12.5 μL 酶切产物、6μL ddH2O。

1.4.2 预扩增

将连接产物作为预扩增模板,采用引物ea00和mc00进行预扩增,预扩增反应总体积为25 μL,具体体系如下:2.5 μL Buffer、2 μL Mg2+、2 μL dNTP、1U Taq enzyme、2 μL ea00、2 μL mc00、0.5 μL 连接产物、13 μL ddH2O。

PCR 扩增程序为:预变性95℃5 min,95℃30 s ,56℃,30 s ,72℃1 min ,20个循环;72℃5 min,4℃保存。预扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4.3 选择性扩增

将预扩增后的产物稀释100倍后进行选择性扩增。扩增引物组合共5对,分别为ea06+cmc04、e07+cmc04、ea05+mc10、ea05+mc06 和e02+mc06。

选择性扩增反应基本体系如下:2.5 μL Buffer、2 μL Mg2+、1.2 μL dNTP、1U Taq 酶、引物各0.5 μL、1 μL 稀释后的预扩增产物、16.8 μL ddH2O,共25 μL。

在保持其它因子不变的情况下,分别对选择性扩增体系中影响实验结果的关键因素dNTP、Mg2+ 和Taq酶用量进行单因素设计,筛选其最佳浓度,每个因素均设定5个浓度梯度(表3)。

选择性扩增程序为:预变性95℃5 min;第一轮扩增参数:95℃30 s、65℃45 s、72℃1 min ,以后每轮循环温度递减0.7℃,共12 次循环;接着按95℃ 30 s,56℃ 45 s,72℃1 min,共28个循环;终延伸72℃ 5 min。4℃保存备用。

扩增产物用4%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取

从琼脂糖凝胶电泳结果看,所提取的基因组DNA 主带清晰,没有降解(图片未展示) 。经分光光度计测定,OD260/OD280 的比值在1. 7～1. 9范围内,说明DNA 质量完全能满足AFLP 分析对DNA 的要求。

2.2 基因组双酶切结果

芒基因组DNA经EcoRⅠ/MseⅠ双酶切后,产物经琼脂糖凝胶电泳检测显示,酶切3 h后原基因组DNA 主带消失,电泳条带呈均匀的弥散状(图1)。表明基因组DNA 酶切完全,可用于后续试验。利用AFLP的基本反应体系,使用5对选择性引物对不同酶切体系下所得到的DNA分别进行扩增,结果显示在同一引物对中经3种用量的限制酶酶切的DNA模板最后产生的AFLP带型相同(图2)。因此,本着降低试验成本的原则,我们最后确定基因组双酶切反应体系中各使用1U的限制性内切酶。

2.3 预扩增

预扩增产物经电泳后,在琼脂糖胶上呈连续成片分散均匀的弥散带,主要片段集中在250～800 bp 之间,说明基因组DNA 的提取和双酶切及连接的效果符合实验要求 (图3)。

2.4 Mg2+ 对选择性扩增体系的影响

经5对不同的引物在5 种不同的Mg2+浓度下对模版进行扩增,其产物在聚丙烯酰胺电泳所检测出的条带如图所示(图4)。从条带的清晰、稳定和丰富性综合分析后发现,10 μL总的PCR体系中加入0.7 μL Mg2+(20 mmol·L-1)即 1.4 mmol·L-1的浓度是进行芒AFLP分析的最佳Mg2+浓度。

M为marker, 1～5为不同Mg2+浓度,a为引物组合ea06+cmc04, b为e07+cmc04,c为ea05+mc10,d为ea05+mc06,e为e02+mc06。

2.5 dNTP对选择性扩增体系的影响

5 种不同的dNTP浓度下AFLP扩增的结果如图(图5)。从条带的清晰、稳定和丰富性综合分析后发现,10 μL总的PCR体系中加入0.4 μL dNTP (10 mmol·L-1)即0.4 mmol·L-1的浓度是进行芒AFLP分析的最佳d NTP浓度。

M为marker, 1-5为不同dNTP浓度,a为引物组合ea06+cmc04, b为e07+cmc04,c为ea05+mc10,d为ea05+mc06,e为e02+mc06。

2.6 Taq酶对选择性扩增体系的影响

5 种不同的dNTP浓度下AFLP扩增的结果如图(图6)。从条带的清晰、稳定和丰富性综合分析后发现,10 μL总的PCR体系中加入0.3 μL Taq酶 (2U/μL)即0.6U的工作浓度是进行芒AFLP分析的最佳Taq酶浓度。

M为marker, 1-5为不同Taq酶浓度,a为引物组合ea06+cmc04, b为e07+cmc04,c为ea05+mc10,d为ea05+mc06,e为e02+mc06。

3 讨论

芒是受世界广泛关注的生物质能源植物。早在上个世纪90年代,国外研究者就开始从现有的芒草品种中筛选、培育适宜作为火力发电厂燃料的理想品种。现在,多个国家已开始在大规模种植芒草,其中主要是三倍体杂交品种奇冈(Miscanthus x giganteus)[5]。关于芒的生物学研究全世界的起步均较晚,但是涉及的范围却比较广泛,包括了生态、细胞、生理、发育和遗传等领域[6,7,8,9,10]。但对于与芒遗传育种相关的应用基础研究几乎没有开展。这对于快速有效地选育芒的优良品种是一个严重的制约。由于缺乏芒的基因组DNA 序列信息,这就限制了微卫星(SSR)等以已知DNA 序列信息为基础的分子标记技术的应用; AFLP 技术无需预先知道被研究物种的DNA 序列信息,而且标记十分丰富,且克服了RAPD 技术重复性差的缺点,又比RFLP技术省时省力等[11],是目前可以应用于芒遗传学研究的一种较好的分子标记技术。

AFLP分子标记利用某些内切酶位点的变异,导致酶切后产生大小不等的片段,从而反映出不同样品在DNA水平上的多态性[2]。所以,对基因组进行完全酶切,否则会出现扩增带型不稳定的现象。本研究选用了EcoRⅠ/MseⅠ酶切组合进行酶切。与其他的内切酶相比,MseⅠ是一种理想的多切点酶,可酶切真核生物基因组DNA产生分布更加均匀的较小片段;EcoRⅠ为少切点酶,且价格比较便宜[12]。根据本实验室的经验,我们进行了3 h的酶切,且不同酶的浓度组合均能达到良好的酶切效果。有研究表明AFLP 反应与其它分子标记相比对模板浓度的变化不敏感,DNA 浓度在1000 倍的范围内变化时对反应的影响都不太大,因此,本研究未对模板浓度这一因素进行研究[4]。Mg2+ 浓度是PCR反应中的一个关键因素。它不仅影响Taq 酶的活性,还能影响引物与模板的结合效率、模板与产物的解链温度以及产物的特异性和引物二聚体的形成[13]。本研究设定了5个选择性扩增中Mg2+ 浓度,结果表明不同的Mg2+ 浓度确实能够影响扩增的条带数目,并从中选择了最佳的芒AFLP反应的Mg2+ 浓度。此外,本研究还分别讨论了dNTP和Taq酶对选择性扩增体系的影响。这两种试剂价格相对较高,我们从实验的准确性和经济的角度出发,分别选择了其合适的反应浓度。

反应体系 篇5

用改良的CTAB法提取菜心基因组DNA,并利用紫外分光光度法测定其纯度和含量,用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的降解状况和纯度.结果表明:此法提取的DNA具有典型的天然DNA分子的标准紫外吸收光谱特点,且适于进行RAPD分析.RAPD分析的.优化反应体系为:25μL的反应液中含有0.8 U的Taq酶,0.28 μmol/Lprimer,30 ng的DNA,2.0 mmol/L Mg2+,0.20 mmol/L dNTPs.PCR扩增循环为94℃、5 min;94℃、1 min;36℃、1 min; 72℃、2 min,37个循环;72℃延伸10 min.

作 者：王丽 乔爱民 孙一铭 孙敏 WANG Li QIAO Ai-min SUN Yi-ming SUN Min 作者单位：王丽,WANG Li(西南大学,生命科学学院,重庆,400715;仲恺农业技术学院,园艺系,广州,510225)

乔爱民,QIAO Ai-min(仲恺农业技术学院,园艺系,广州,510225)

孙一铭,孙敏,SUN Yi-ming,SUN Min(西南大学,生命科学学院,重庆,400715)

反应体系 篇6

关键词：沙地云杉；叶基因组DNA；ISSR-PCR；优化

中图分类号：S791.180.1 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0048-03

沙地云杉（Picea mongolica）是中国稀有珍贵树种，集中成片地分布在生态环境恶劣的内蒙古自治区以克什克腾旗的白音敖包自然保护区，形成了罕见的沙地森林。沙地云杉具有耐旱抗寒、防风阻沙、调节气候等特点，并且生存年代久远，所以被称为沙漠上的“绿宝石”和“生物活化石”^[1]。自引种到辽宁、北京、呼和浩特成功之后^[2]，沙地云杉不再是内蒙古草原的特有树种。目前，沙地云杉的研究仍停滞在生态学水平，对其遗传多样性的研究尚未见报道。

简单重复序列间区标记技术（inter-simple sequence repeat，ISSR）是由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等于1994年发展起来的一种微卫星的分子标记^[3]。ISSR标记呈孟德尔式遗传，大部分ISSR标记为显性标记。它结合了SSR和RAPD的优点^[4]，具有模板 DNA用量少、质量要求低，扩增产物特异性强，重复性高，试验操作简便，费用较低等特点，又比RFLP、RAPD、SSR能更多地提供遗传信息，已被广泛应用于品种鉴定、遗传多样性、系统进化关系、遗传作图、基因定位、标记辅助选择^[5]等研究，通过遗传多样性手段对沙地云杉作进一步研究。本试验以沙地云杉叶基因组为模板DNA，分析引物、dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶浓度、退火温度对ISSR-PCR扩增的影响，建立适合沙地云杉ISSR-PCR的反应体系，为研究沙地云杉的系统进化、物种鉴定和种間杂交育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料 试验材料来自内蒙古浑善达克沙地，种子于40 ℃烘箱中烘干后取出，浸于75%甲醇中一段时间，然后放在培养箱中培养。将长出的嫩叶放入-80 ℃保存，以备取用。

1.1.2 试剂 提取基因组DNA：CTAB提取液，β-巯基乙醇，1×TE缓冲液。引物参照哥伦比亚大学（University of British Columbia，UBC）公布的ISSR引物序列，由北京华大基因有限公司合成。本试验反应体系优化试验固定引物UBC 835的序列为：AGAGAGAGAGAGAGAGC。用于ISSR-PCR的试剂：dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer、DNA Marker（DL2000）购自天根（TIANGEN）生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 本试验采用CTAB法提取沙地云杉基因组DNA。

1.2.2 DNA浓度及纯度检测 用紫外分光光度计测定DNA样品在260 nm和280 nm处的吸光度，检测其浓度和纯度。用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量并进行PCR扩增，最后稀释至50 ng/μL保存在-20 ℃中备用。

1.2.3 PCR单因素试验 单因素试验是其他因子保持不变，其中1个因子按照一定浓度梯度变化，从而筛选出各因子适合继续优化的最适浓度。本试验是为了筛选出适合于沙地云杉ISSR-PCR反应体系的各因素最佳浓度。不同因素浓度水平见表1。

1.2.4 PCR反应条件 94 ℃预变性4 min，94 ℃变性45 s，UBC 835的退火温度是50 ℃，退火45 s，72 ℃延伸2 min，40个循环，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存备用。

1.2.5 扩增产物检测 1.2%的琼脂糖凝胶在0.5 ×TBE缓冲液中电泳检测，用UVP凝胶成像系统照相保存。

2 结果与分析

2.1 引物浓度的优化

引物浓度是影响PCR结果的重要变量之一。浓度过低阻碍引物与模板DNA的结合，不能产生有效扩增条带。浓度过高会引起非特异性扩增产物和引物二聚体等的形成^[6]，使目的DNA片段扩增量下降，条带不清晰。由图1可见，浓度为0.15 μmol/L时，扩增条带较弱，不清晰；0.20、0.30 μmol/L 条带比0.15 μmol/L清晰，但有弥散现象，不是很稳定，所以20 μL反应体积中确定条带稳定的 0.25 μmol/L 为最适引物浓度。

2.2 Mg2+浓度的优化

Mg2+浓度对PCR扩增的特异性和产物有显著的影响，Mg2+作为Taq DNA 聚合酶的依赖性因子，不仅影响Taq酶的活性，反应体系中的dNTPs、模板DNA及引物都会与Mg2+结合^[7]。Mg2+浓度过高反应特异性降低，出现非特异扩增；浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。由图2可知， 4个Mg2+浓度， 即2.0、1.0、1.5、2.5 mmol/L条件下均有扩增产物，但是Mg2+浓度在1.0、1.5 mmol/L时，条带较少；浓度在2.5 mmol/L时出现非特异性扩增，浓度在 2.0 mmol/L 时条带清晰，稳定性高。所以Mg2+用量为 2.0 mmol/L 是最佳浓度。

nlc202309021547

2.3 Taq DNA聚合酶的优化

Taq DNA聚合酶的用量是影响扩增的重要因素，浓度过低会使酶过早地消耗完造成合成效率下降，浓度过高容易产生非特异性扩增且增加成本。从图3可见，不同Taq DNA聚合酶浓度从0.5、1.0、1.5、2.0 U/μL均有扩增产物，浓度在0.5 U/μL条带相对较弱，1.0、1.5、2.0 U/μL时扩增出的条带无显著差异，考虑稳定性和成本，而且1.5 U/μL的条带亮度高和稳定性强。最终确定Taq DNA聚合酶用量为1.0 U/μL。

2.4 dNTPs浓度的优化

dNTPs浓度与PCR扩增效率有密切关系，dNTPs能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。浓度高会导致片段缺失，而浓度太低又会导致扩增产率下降^[4]。从图4中可见，dNTPs浓度为0.15、0.20、 0.25、0.30 mmol/L均有扩增条带，dNTPs浓度为0.15、0.30 mmol/L时，扩增出的条带较少；在0.20、0.25 mmol/L时扩增条带较多，但0.25 mmol/L比0.20 mmol/L 条带清晰。因此确定dNTPs浓度为0.25 mmol/L。

2.5 退火温度的优化

为了确定引物的最适退火温度，参照所选引物序列计算理论退火温度Tm，Tm=4（G+C）+2（A+T）^[8]。温度低于Tm值，扩增产物特异性降低，扩增出来的条带较弱；温度过高不利于引物扩增。在本试验中所用引物的Tm值为53 ℃， 从

3 结论与讨论

试验结果表明，通过各个因素的综合对比分析，得出反应体系中4个因子的最佳浓度：0.25 μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、50 ng/μL 模板DNA。PCR反应条件：94℃预变性4min；94 ℃ 变性 45 s，UBC 835退火温度是50 ℃，退火45 s，72 ℃延伸2 min，40个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

ISSR-PCR具有高重复性的优点，但其扩增仍受多种因素的影响，如Mg2+用量、引物浓度、Taq[KG*3]DNA聚合酶用量、退火温度、模板DNA等。试验研究发现，模板DNA对ISSR-PCR扩增的影响不是很大，而Taq DNA聚合酶和Mg2+对其有很大的作用。Mg2+浓度控制Taq DNA聚合酶的活性，Taq DNA聚合酶的活性又是ISSR-PCR扩增的关键。而dNTP是PCR反应的原料，浓度过高时容易导致错配，同时dNTP会对Mg2+产生拮抗作用^[9]，退火温度高低制约扩增条带的分辨率。上述因素相互依赖、相互抑制。为获得重复性好、可靠性高的扩增条带^[10-11]，本试验采用单因素试验方法来确定各因素的最佳浓度。单因素试验设计可对每个影响因子不同水平进行直观的判断。确定了沙地云杉ISSR-PCR各因素的最适浓度，试验结果对沙地云杉进行遗传多样性分析等研究奠定了基础。

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菠萝SRAP反应体系的建立及优化 篇7

SRAP是一种基于PCR技术的新型分子标记,其原理是针对基因外显子中GC含量丰富,而启动子、内含子中AT含量丰富的特点来设计两组引物进行PCR扩增,因不同个体的内含子、启动子与外显子间隔区长度不等而产生多态性[1]。对不同植物类群而言,SRAP的最佳反应条件会有所差别。对于SRAP反应体系的某些影响因子已有一些初步研究,但在菠萝中少见报道,且主要为单因素实验法[2,3,4]。在Taq酶、Mg2+、随机引物、dNTPs、DNA模板5种组分中,逐一变化其中1种组分浓度而固定其余4种,从中分析得到每一组分的最佳浓度,最后组合成为最佳反应体系。这种方法在短时间内可得到一个反应体系,且简单有效。笔者通过试验设计对菠萝SRAP反应体系进行建立与优化,建立了一套适合于菠萝SRAP-PCR分析的反应体系,利用SRAP标记对菠萝种质资源进行分析,丰富菠萝种质资源的合理分类,并为后续建立菠萝遗传图谱打下基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验所用品种取自中国热带农业科学院南亚热带作物研究所基地(简称南亚所),取菠萝幼嫩叶子的基部稍白部分,用改良CTAB法提取DNA,0.6%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性,根据样品OD260/OD280分析纯度;根据OD260值计算样品DNA浓度,稀释至10ng/μL,4℃短暂保存备用。

1.2 SRAP扩增程序的选择

根据Li G和Quiros C F[1]的SRAP扩增程序(图1)。

在MX3500P型荧光定量PCR仪上扩增,扩增产物点样10μL用1.8%的琼脂糖凝胶检测,电泳完后EB染色在BIO-RAD EQ型紫外凝胶成像系统上观察、照相。

1.3 实验方法

参考Li和Quiros[1]的SRAP扩增程序,选用引物Me4-Em4组合,利用“台湾有刺”品种20ng为DNA模板,对Taq酶、Mg2+、随机引物、dNTPs这4种组分,逐一变化其中1种组分浓度而固定其余3种,从中分析得到每一组分的最佳浓度,最后组合成为最佳反应体系。并用此建立的体系对19个品种进行体系稳定性检验。

2 结果与分析

2.1 NTPs浓度对SRAP-PCR结果的影响

dNTPs的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTPs浓度过低会降低PCR产物的产量,过高还会引起碱基错配。由图2可见,不同dNTPs浓度(0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45和0.50mmol/L)扩增结果差异很大。在0.1mmol/L时,条带较弱,随着dNTPs浓度的增高条带逐渐清晰及丰富,而后条带又变弱变少,在0.45、0.50mmol/L时,扩增条带更少。dNTPs是PCR扩增反应的原料,必须达到一定浓度才能满足要求,但过高也会与Taq 酶竞争,与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低,对扩增不利,综合各种因素dNTPs选用0.20mmol/L。

2.2 Mg2+浓度对SRAP-PCR结果的影响

Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。如图3所示,当Mg2+浓度小于1.5mmol/L时基本无扩增产物,2.0mmol/L时谱带较弱;2.5、3.0mmol/L时扩增谱带均清晰且稳定。因此Mg2+浓度选用2.5mmol/L。

2.3 引物浓度对SRAP-PCR结果的影响

引物是PCR特异性反应的关键,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。在所选的引物浓度梯度中,0.1μmol/L条带弱且少,随着引物浓度的提高,扩增条带渐清晰稳定,在0.3、0.4μmol/L时扩增条带清晰稳定。考虑到引物量过大易形成引物二聚体,所以引物浓度确定为0.3μmol/L。

2.4 Taq酶浓度对SRAP-PCR结果的影响

Taq酶浓度对PCR结果影响很大,酶浓度过高可引起非特异性扩增,产生大量弥散带,从而使背景加深,浓度过低则合成产物量减少,本实验中发现,随着浓度的增高,条带亮度增强,条带会出现模糊拖影,在1.0U～2.0U之间均能扩增成功,并没有显著差异。本着经济高效的原则,最终选择Taq酶浓度为1.2U/20μL。

2.5 菠萝SRAP反应体系的建立

以上述所确定的条件, 用引物Me4-Em4组合在供试菠萝19个基因型中扩增(图6)。由图可见扩增谱带清晰,多态性条带丰富,能很好地区分各个供试材料。综合各种因素,最后确定菠萝的最佳SRAP-PCR反应体系为:20μL反应体系中含1×PCR buffer,2.5mmol/L Mg2+、1.2UTaq DNA聚合酶、0.2mmol/L dNTPs、0.3μmol/L随机引物、20ng DNA模板。

3 讨论

SRAP技术自2001年发明以来,凭借它简单、高效、高共显性、重复性好、易测序等优点已经在在芹菜[1]、桃[5]、莲藕[6]、黄瓜[7]、甘薯[8]、棉花[9]、花生[10]、油菜[11]和西瓜[12]等植物的种质资源鉴定评价、遗传图谱构建(包括转录图谱)、重要性状标记乃至基因分离克隆等方面得到了应用。但是专门对其技术体系优化的研究并不是很多。不同作物所适合的SRAP体系不同。刘立军[3]认为不同的植物SRAP最佳的反应体系差别很大,需构建同一物种在相同仪器设备和一定操作规范下的最佳的优化技术体系,才能更好地进行SRAP研究;武志朴[13]等对小麦基因组SRAP 扩增体系进行初步研究,指出SRAP 最佳扩增体系的建立应根据自己所用仪器及药品对影响扩增的主要因子调整,以建立一套适合测试植物使用的体系及反应程序。作者在参考前人方法后,对扩增结果影响重要的反应组分Taq酶、Mg2+、随机引物及dNTPs进行单因素体系优化,确定了最佳菠萝SRAP反应体系,结果表明,这种方法是可行的,体系组成成分没有太大差别,说明SRAP技术简单、高效,通用性强,重复性好,可以用于种质资源鉴定评价、遗传图谱构建等分子方面的研究。

M:Marker DL2000.

由于SRAP标记对模板的要求不是很高,为此本文并未对DNA模板进行优化,而只是参考王燕[14]等所得出的结论选取DNA模板量为20ng,结果表明,这并未对实验体系产生较大的影响,同样能得到很好的结果,节约时间、成本。

反应体系 篇8

1 针对不同药物特点加强监测措施[3~7]

首先, 重点加强毒性中药使用中ADR的监测。根据科研实验数据及临床药理学资料, 对可能引起ADR各类反应的药物进行归纳分类, 并将有毒、性烈的中药分为不同等级, 严格管理。

其次, 针对不同剂型的中成药、中西药组合药引发ADR可能性的差异, 有重点、有针对性地进行监控, 使有限的监测资源得到有效利用。从中药ADR流行病学调查来看, 中药剂型发生药源性疾病的可能性大, 针剂引发的不良反应快且重、过敏反应多、全身症状多、后果较严重。故相比之下, 针剂尤应引起注意。中药生产厂家应遵循《药品生产质量管理规范》, 加强对中药制剂生产过程与产品质量的把关与技术鉴定。药品监督管理机构要加强对ADR防范、规范制剂生产、销售和临床应用的各环节的监管力度, 根据各类剂型自身的特点采取相应ADR监测措施。

2 加大力度宣传中药ADR监测工作及设立报告表制度

首先, 提高医务工作者对中药ADR监测工作的认识。中药ADR的监测是一项复杂的系统工程, 应加大宣传力度, 利用专栏、药学通讯及讲座等形式宣传中药ADR监测工作的目的、意义、作用;宣讲ADR监测工作的重要性和ADR的危害性, 尤其是临床使用中药发生ADR的可能性。使医务人员真正认识到为用药安全有效、为提高病人的生存质量、为提高医疗诊治技术水平, 有责任和义务开展ADR监测工作[8~10]。

其次, 设立中药ADR监测报告表制度。中药ADR监测报告表基本内容包括[11]:中药ADR的表现 (症状、出现时间、发生发展特征以及症状出现、加重、缓解与用药的关系等) 、病人一般情况、治疗过程 (病人症型、药物适用证型、治疗效果) 、可疑药物、ADR救治过程及其他情况等。一旦发生ADR, 做好ADR监测报告表填报工作, 为中药ADR原因的分析提供参考。

3 建立中药ADR集中监测体系

中药ADR的集中监测更能集中反应ADR发生的特点、流行病学趋势、药物ADR特征等。在设立ADR监测报告表填报制度的基础上, 大力开展中药ADR集中监测并设立试点医院进行抽查, 以此获得医院内有关ADR的详细资料。同时, 在资料积累的基础上进行总结分析, 进行有关药物和流行病学研究等, 并总结报告ADR的情况。通过监测了解中药ADR的易发因素并建立中药ADR数据库, 为中医临床医生提供准确、可靠的参考数据。这对全面提高中药的安全性、有效性、指导临床正确合理使用中药具有重要的意义[12~14]。

4 建立相应中医护理对策

医生与药师在药物疗效与ADR发现中起着重要的作用。但护理人员与病人对用药情况的关注也非常重要。护理工作直接与病人接触, 发现ADR的时间也可能更早。其对中药ADR的早发现、早诊断、早治疗起重要作用[15]。

中医护理[16]具体操作内容如: (1) 对处方进行复审, 核对医嘱的用药途径、用法、用量、给药时间; (2) 询问病人有无过敏史; (3) 宣传中药知识, 如, 正确煎煮、服用等方法; (4) 对于采用中西药物联合治疗的病人要特别交代清楚服用方法和注意事项; (5) 新药、新剂型投入临床使用时, 医护人员要认真学习有关资料, 做好宣传、解释、说明等工作, 要注意观察病人服药后的反应。

5 协调监测体系的多方面因素

对中药ADR监测体系的规范化管理, 应通过立法及法规性文件使实际工作有法可依[17]。由于我国这项工作起步较晚, 迫切需要健全和加强中药药品管理体系, 并对中药ADR的程度进行评级。使医、药、护人员明确开展中药ADR监测工作的重要性和必要性, 在实际临床诊疗过程中使医、药、护人员明确责权、各有侧重、相互配合协调工作;对于ADR监测工作做得好的医护人员应适当给予精神或物质奖励, 充分调动他们开展这项工作的积极性。

华中五味子AFLP反应体系的建立 篇9

AFLP分子标记[4]检测出的多态位点覆盖整个基因组, 易于标准化, 且稳定性好、谱带丰富和灵敏度高[5]。近年来, 已普遍应用于药用植物DNA指纹图谱的构建[6,7]、种质资源的鉴定[8]和遗传多样性分析[9]等方面的研究, 而AFLP对华中五味子研究未见报道。本研究以华中五味子为试材, 初步建立华中五味子AFLP反应体系, 为华中五味子DNA指纹图谱构建和遗传多样性分析等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料:

华中五味子Schisandra sphenanthera Rehd. et Wils.嫩叶, 2008年3月采自陕西柞水县凤凰镇, 经硅胶干燥处理带回实验室备用。

1.1.2 试剂:

AFLP接头及引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成, MseⅠ、EcoRⅠ和T4 DNA Ligase (NEB公司) , Taq DNA聚合酶 (TaKaRa宝生物工程 (大连) 有限公司) , 甲叉双丙烯酰胺和尿素 (Genview公司) , Repel Silane和Binding Silane (西安舟鼎国生物技术有限公司) , TEMED (Aldric公司) 。

1.1.3 仪器:

Microfuge 22R离心机 (BECKMAN公司) ;PTC-200 PCR仪 (BIO-RAD公司) ;DYY-7型、DYCZ-20 C型电泳槽及DYY-12型电泳仪电源 (北京六一仪器厂) 。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取:

参照顾蔚等[10]的改良CTAB法, 略做改进:①在核裂解之前加入4℃预冷的CTAB-free Buffer (0.2mol/L Tris-HCl (pH 8.0) , 0.05mol/L EDTA, 0.25mol/L NaCl, 2% β-巯基乙醇 (V/V) ) 1mL, 冰浴30min, 5 000r/min离心弃上清, 重复2次。②无水乙醇沉淀DNA之前加入1/10倍体积的3mol/L NaCl。

1.2.2 酶切:

总体积为20μl, 包括500ng基因组DNA、NEB缓冲液2μL、100×BSA (10mg/mL) 0.2μl、EcoRⅠ10U、MseⅠ 10U、加超纯水至20μl。混匀后置于PCR 37℃恒温孵育6h, 65℃加热15min立即置于冰上备用。其中取出5μl于1.6%琼脂糖凝胶电泳检测 (4～5V/cm) 。

1.2.3 连接:

接头的准备:EcoRⅠ接头 (5pmol/μl) , 取25μl的正向接头5’CTCgTAgACTgCgTACC 3’ (100pmol/μl) , 25μl的反向接头5’AATTggTACgCAgTC 3’ (100pmol/μl) , 加450μl TE至总体积500μl;MseⅠ接头 (50pmol/μl) , 250μl的正向接头5’gACgATgAgTCCTgAg3’ (100pmol/μl) , 250μl的反向接头5’TACTCAggACTCAT 3’ (100pmol/μl) , 总体积500μl。混匀后, 95℃变性5min, 随后于37℃缓慢复性, 立即置于冰上备用或-20℃保存。连接体系:总体积为20μl, DNA双酶切产物10μl、EcoRⅠ接头 (5pmol/μl) 2.5μl、MseⅠ接头 (50pmol/μl) 2.5μl、1×T4 Buffer 2μl、T4 DNA Ligase 1μl、加超纯水至20μL。混匀后置于PCR 16℃反应12h (过夜) 。连接完成后, 65℃变性10min, 去除连接酶活性。

1.2.4 预扩增:

采用E+0/M+0引物组合。连接产物分别稀释20、10、5、2.5倍, 取稀释产物5μl, 加入15μl混合液, 包括EcoRⅠ引物E00 (50ng/μl) 1.0μl、MseⅠ引物M00 (50ng/μl) 1.0μl、dNTPs (2.5mmol/L) 2.0μl、MgCl2 (25mmol/L) 1.5μl、10×PCR Buffer (Mg2+ free) 2μl、Taq DNA酶 (5U/μl) 0.2μl和7.3μl超纯水, 最后加入l滴矿物油。扩增程序为94℃ 2min, 94℃ 30s, 56℃ 30s, 72℃ 60s, 共30个循环。

1.2.5 选择性扩增:

采用E+3/M+3引物组合。预扩增产物分别稀释20、10、5、2.5倍, 取稀释产物5μl, 加入15μl混合液, 包括EcoRⅠ引物 (50ng/μl) 0.8μl、MseⅠ引物 (50ng/μl) 0.8μl、dNTPs (2.5mmol/L) 2.0μl、MgCl2 (25mmol/L) 1.6μl、10×PCR Buffer (Mg2+ free) 2μl、Taq DNA酶 (5U/μl) 0.2μl和7.6μl超纯水, 最后加入1滴矿物油。扩增程序为94℃ 2min, 94℃ 30s, 65℃ 30s (每循环降低0.7℃) , 72℃ 60s, 共13个循环;94℃ 30s, 56℃ 30s, 72℃ 60s, 共23个循环。最后于72℃延伸10min。

1.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染:

选择性扩增后样品加入10μl Loading Buffer (98%甲酰胺、10mmol/L EDTA (pH 8.0) 、0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯蓝) , 94℃变性10min立刻转移至冰浴中冷却。以80W恒定功率于6%聚丙烯酰胺凝胶电泳2.5～3h, 含预电泳 (30min) 。银染参照邹喻萍等方法[5]。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA

改良CTAB法提取的基因组DNA主带清晰, 无降解, 点样孔干净无残留 (图1) , 试材1和试材2经紫外分光光度计检测OD260/OD280值分别为1.80和1.92, 在1.80～2.00之间, 表明DNA样品纯度高, 完全能满足AFLP分析要求。

2.2 酶切

EcoRⅠ/MseⅠ双酶切后主带消失, 成均匀的弥散状, 酶切产物主要集中在250～2 000bp (图2) , 表明酶切充分、彻底, 适于AFLP分析。

2.3 连接

由于连接体系中DNA浓度较小, 不易通过琼脂糖凝胶电泳直接检测连接效果, 但可通过预扩增间接检测。

2.4 预扩增

连接产物经20、10、5、2.5倍稀释, 其预扩增产物通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测 (图3) , 主带集中在250～1 000bp之间, 同时也间接表明连接反应成功;各稀释倍数间差异不明显, 均可扩增出清晰的条带, 表明预扩增反应对模板DNA浓度变化不敏感。本研究选用连接产物稀释10倍用于预扩增。

M为Maker DL2 000;1和2分别为试材1和试材2。M: DL2000; 1: sample1; 2: sample2.

M为Maker DL2 000;1和2分别为试材1和试材2。M: DL2 000; 1: sample1; 2: sample2.

M为DL2 000;1-4和5-8分别为试材1和试材2连接产物稀释20、10、5、2.5倍。M: DL2 000; 1-4 and 5-8:20, 10, 5, 2.5 dilute times of ligation product from sample 1 and sample 2 respectively.

2.5 选择性扩增

预扩增产物经20、10、5、2.5倍稀释, 选用E-ACT/M-CAT和E-ACA/M-CAG 2对选择性引物分别扩增, 通过0.8%琼脂糖电泳检测 (图4、图5) , 二者均扩增出特定的DNA片段, 其扩增主带分别在250～375bp与500～750bp之间。不同稀释倍数扩增后的电泳条带均清晰整齐, 但随着稀释倍数的减少, 非特异性扩增增加, 稀释10倍和20倍差异不明显, 表明选择性扩增反应对模板DNA浓度变化较敏感。本研究选择预扩增产物稀释10倍用于选择性扩增。

2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染

E-ACT/M-CAT和E-ACA/M-CAG引物对供试材料选择性扩增产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳, 银染呈现清晰可辨的AFLP条带 (图6) , 且扩增信号基本一致, 扩增片段分布密度均匀。

3 讨论

高质量基因组DNA的制备和避免DNA部分降解是AFLP分析成功的关键。针对华中五味子富含糖类、蛋白质、多酚等物质, 作者采用改良CTAB法, 即用CTAB-free Buffer清洗试材2次, 并在DNA沉淀之前加入1/10体积3mol/L NaCl, 有效地去除凝胶状物质[10], 获得高质量DNA。酶切反应必须完全彻底, 否则将导致条带检出率降低。本研究采用EcoRⅠ (低频剪切酶) 和MseⅠ (高频剪切酶) 双酶切, 试验中将EcoRⅠ和MseⅠ用量增加至10U, 酶切6h, 酶切完全、充分。扩增体系中各因子均可影响扩增效果, 其中以模板、Mg2+和dNTPs的浓度变化最为明显, 预扩增对模板DNA浓度变化不敏感而选择性扩增对其敏感;Mg2+浓度过高会造成大量的非特异性扩增, 浓度过低扩增产物减少或无;dNTPs作用效果则与Mg2+相反, 这与连莲等[11]和焦浈等[12]报道一致。聚丙烯酰胺凝胶制备的质量直接影响到电泳结果, 其中尿素质量是关键, 质量不好不能使样品DNA变性, 易产生拖尾现象, 条带模糊不易分开;同时避免气泡产生, 否则会使条带变形, 不易观察。此外, 银染应注意:①胶板不宜过厚, 否则不利于染色和显影。②银染液转换至显影液时, 水漂洗的时间不宜过长, 否则会导致条带模糊甚至消失, 一般漂洗时间3～5 s。③显影时间要适宜, 过长会导致背景颜色太深, 条带模糊难以观察, 过短会使条带显影不完全。AFLP分析是一种高效的DNA指纹图谱技术, 具有多态性强、灵敏度高、稳定可靠等优点, 在华中五味子指纹图谱构建和遗传多样性分析等相关研究中具有广阔的应用前景。

M为DL2 000;1-4和5-8分别为预扩增产物分别稀释20、10、5、2.5倍经E-ACT/M-CAT和E-ACA/M-CAG选择性扩增的产物 (图5标注同上) 。M:DL2000; 1-4 and 5-8: E-ACT/M-CAT and E-ACA/M-CAG selective amplification from 20, 10, 5, 2.5 dilute times of pre-amplification.

1-4和5-8分别为试材1 E-ACT/M-CAT和E-ACA/M-CAG引物扩增结果;9-12和13-16分别为试材2 E-ACA/M-CAG和E-ACT/M-CAT引物扩增结果。1-4 and 5-8: E-ACT/M-CAT and E-ACA/M-CAG selective amplification from sample 1; 9-12 and 13-16: E-ACA/M-CAG and E-ACT/M-CAT selective amplification from sample 2.

摘要：目的:建立一个适于华中五味子研究用的AFLP反应体系。方法:以华中五味子硅胶干燥嫩叶为试材, 采用改良CTAB法提取到高质量DNA。通过琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳对MseⅠ/EcoRⅠ双酶切、连接、预扩增和选择性扩增过程中的关键因素进行分析。结果:双酶切6h, 片段主要集中在250～2000bp;连接产物和预扩增产物最适稀释倍数均为10倍;预扩增产物经选择性引物E-ACT/M-CAT和E-ACA/M-CAG扩增, 琼脂糖电泳检测其主带分别集中在250～375bp和500～750bp, 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及银染, 条带清晰可辨。结论:该体系具有稳定性高、重复性好等优点, 可用于华中五味子AFLP分析。

关键词：华中五味子,AFLP,反应体系

参考文献

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谈水相体系中电极反应的考查角度 篇10

关键词：水相体系,非水相体系,电极反应

纵观近几年高考试题, 电化学知识大部分以解决实际问题形式呈现, 题目情境新颖, 知识点分布广泛, 处处渗透绿色化学理念. 对培养学生接受、吸收、整合化学信息、在陌生情境下应用所学知识解决实际问题的能力大有裨益, 笔者从水相体系入手归纳电极反应的书写和相关计算.

一、电极反应书写的思维模板 ( 如图1 所示)

二、水相体系中的电极反应及相关计算

例1电解NO制备NH4NO3, 其工作原理如图2所示, 为使电解产物全部转化为NH4NO3, 需补充物质A, A是, 说明理由:___.

解析:阴极的NO转变成, 阴极反应为:

阳极反应为:

依据得失电子守恒和原子守恒得总反应:

显然, A是氨.

反思:题后若隐去图中阴阳两极提示, 让学生判断出阴阳两极名称, 再思考两极反应, 更能体现考察学生综合能力的命题意图, 也可进一步提高试题的区分度.

归纳: 阴极: 反应物+ 电子+ 阳离子= 还原产物 ( 带正电荷) ; 阳极: 反应物- 电子+ 中性环境分子=氧化产物 ( 体系带正电荷) .

例2人工肾脏可采用间接电化学方法除去代谢产物中的尿素, 原理如图3所示. (1) 负极为__ (填“A”或“B”) . (2) 阳极室中发生的反应依次为__、__. (3) 电解结束后, 阴极室溶液的p H与电解前相比将___;若两极共收集到气体13.44 L (标准状况) , 则除去的尿素为___g (忽略气体的溶解) .

解析: 这道试题未给出电源正负极, 但电解Na Cl溶液是学生熟悉的基础知识, 学生容易据题中电极产物判断出A、B两极名称, A阳极进入的是CO ( NH2) 2和Na Cl, 逸出的是N2和CO2, 显然尿素参与了阳极反应. 故阳极室反应依次为:

B为负极, 阴极反应为:

由上述反应可看出, 在阴、阳极上产生的OH-、H+数目相等, 阳极室产生的H+通过质子交换膜进入阴极室与OH-恰好反应, 所以阴极室电解前后溶液的p H不变.由反应可以看出, 转移6 mol e-时, 阴极产生3 mol H2, 阳极产生1 mol N2和1mol CO2, 故电解收集到13.44 L气体中, V (N2) =V (CO2) =2.688 L, 即n (N2) =n (CO2) =0.12 mol.根据化学方程式

CO (NH2) 2+3Cl2+H2O=N2+CO2+6HCl

可知消耗CO (NH2) 2的物质的量也为0.12 mol, 其质量=0.12 mol×60 g∕mol=7.2 g.

反思: 在电解NaCl基础上迁移到Cl2与CO ( NH2) 2的反应, 应用守恒的计算是该题的最大亮点.

例3全钒液流储能电池是利用不同价态离子对的氧化还原反应来实现化学能和电能的相互转化, 其原理如图4所示. (已知V2+呈紫色, V3+呈绿色;VO2+呈蓝色, 呈黄色.溶液中c (H+) =2.0 mol/L, 阴离子为)

①当左槽溶液逐渐由黄变蓝, 其电极反应为__.②充电过程中, 右槽溶液颜色变为色__.③充电时若转移的电子数为3.01×1023个, 左槽溶液中n (H+) 的变化量为___.

解析:首先应判断哪个方向的转化属于原电池, 哪个方向的转化属于电解池.从氧化还原电对的化合价高低判断, 显然左边V元素化合价较高, 所以VO2+与V2+的反应应是原电池的过程.①当左槽溶液由黄变蓝, 此时电池放电, 左边为原电池的正极, 反应为②充电过程中, A接外电源正极, B接外电源负极, 右槽电极反应为V3++e-=V2+, 故充电时右槽溶液由绿色逐渐变为紫色.③充电时, 左槽发生反应为, 当转移电子为3.01×1023个, 即为0.5 mol电子时, 生成氢离子为1 mol, 右槽发生反应为当右边消耗0.5 mol V3+生成V2+为0.5 mol, 即耗掉1.5 mol正电荷时, 只生成1 mol正电荷, 为了保持溶液中电荷守恒从左池应转移0.5 mol H+进入右池, 则左槽溶液中H+的变化量为1 mol-0.5 mol=0.5 mol.

归纳: 发生还原反应的电极: 还原剂- 电子+ 阴离子或者中性环境分子= 氧化产物 ( 产物体系可带正电、负电或中性微粒) ; 发生氧化反应的电极: 氧化剂+ 电子+ 阳离子或者中性环境分子= 还原产物 ( 产物体系可带正电、负电或中性微粒)

参考文献

[1]于永民.简易镁燃料电池教具的制作与应用[J].化学教学, 2016 (1) .