三七总苷（精选七篇）
三七总苷 篇1
1 材料与方法
1.1 药物与试剂
三七总苷粉剂 (络泰) :昆明制药集团股份有限公司, 批号Z20026438;灯盏花素粉剂:衡阳恒生制药有限公司, 批号:2002ZFB0390;ICAM试剂盒, 购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 动物
Waster大鼠, 体重220 g～280 g, 由山西医科大学生理实验室提供。
1.3 分组及给药
将50只大鼠随机分为假手术组10只和实验组40只, 另将40只大鼠造模成功后随机分为模型组、灯盏花素组、三七总苷组和中药联用组, 每组10只。假手术组:完成全部操作, 只做颈总动脉和颈内动脉分离。模型组:造模成功后, 术后2 h开始腹腔注射生理盐水1 mL, 一日1次, 连用3 d。灯盏花素组:16 mg/kg, 稀释至1 mL, 腹腔注射, 每日1次, 连用3 d。 三七总苷组:80 mg/kg, 稀释至1 mL, 腹腔注射, 每日1次, 连用3 d。 中药联用组:将上述灯盏花素和三七总苷剂量各半, 共1 mL, 分别腹腔注射, 每日1次, 连用3 d。
1.4 模型制作
大脑中动脉线栓法模型制备:参照Zea Longa[5]的方法, 稍加改进。大鼠以10%的水合氯醛0.35 mL/100 g腹腔注射, 仰卧固定, 颈正中切口, 依次暴露右侧颈总, 颈内和颈外动脉, 结扎颈总动脉, 颈外动脉, 于颈总动脉分叉下方煎一切口, 将预先用酒精灯烧成圆头的尼龙渔线 (长4 cm, 直径0.2 mm) 置于颈内动脉18 mm到有轻微阻力感为止, 扎紧动脉线端, 缝合皮肤。假手术组大鼠麻醉后, 仅暴露颈内外动脉分支并分离, 不闭塞大脑中动脉。术中、术后室温控制24 ℃～25 ℃, 大鼠体温维持在36.5 ℃～37.5 ℃。麻醉清醒 (约术后2 h) 对大鼠神经缺损进行评分, 如评分在2分或2分以上者则认为模型成功并纳入实验。
1.5 检测指标及方法
1.5.1 大鼠神经缺损评分
参照Bederson 10分法[6]标准进行评分:①提起鼠尾, 观察前肢有无异常表现。凡有前肢内收, 内旋者, 视其轻重评分 (1分～3分) , 如果躯体向左侧旋转, 评为4分。②将大鼠置于金属网上, 向后轻提鼠尾, 观察大鼠两前肢张力, 根据左前肢张力下降程度, 评为0分～2分。③将大鼠置于光滑平面上观察侧向推动阻力, 根据向左侧推挡阻力下降程度评分 (0分～2分) 。④大鼠出现左眼上睑下垂, 左眼分泌物增多评为2分。动脉缺血72 h再评分, 其结果作为评价疗效的指标之一。
1.5.2 血清中ICAM-1含量测定
每组于6 h、24 h、72 h各时间点颈静脉取血, 取血清低温保存用ELISA法测定值, 方法详见ICAM-1试剂盒。
1.5.3 脑梗死体积测定
大鼠脑梗死面积百分比计算:末次评分采血完毕后, 每组随机取5只大鼠断头取脑, 去除小脑后, 将大脑平均冠状切片分5片, 放于TTC溶液中, 37 ℃温育10 min～15 min, 脑组织切片梗死区不着色, 正常脑组织染成红色, 用生理盐水冲洗后摄影, 在照片上用透明坐标纸测量梗死截面积和全脑截面积, 根据切片厚度计算出总的梗死灶与对侧总体积百分比。
1.6 统计学处理
所有数据用SPSS 11.5统计分析软件进行分析, 数据用均数±标准差
2 结 果
2.1 各组大鼠血清值
ICAM-1 含量比较 (见表1) 模型组ICAM-1值随脑梗死时间延长, 相应值渐升高, 中药各组随时
间延长, ICAM-1值逐渐下降。与模型组比, 中药各组ICAM-1值下降 (P<0.05) , 中药联用组比单用中药组下降更明显 (P<0.05) 。
2.2 各组大脑中动脉栓塞神经功能缺损评分比较 (见表2)
2.3 各组大鼠脑梗死面积的测定比较 (见表3)
3 讨 论
急性脑梗死系因脑循环部分或一侧循环障碍导致的中枢神经系统局部受累。在绝大多数病例中, 颈部和脑底部大的颅外动脉的粥样硬化是脑梗死的基本病因。动脉粥样硬化的发生机制尚未完全明了, 但内皮细胞的损伤及所引起的功能障碍被认为是早期阶段[7], 脑缺血损伤后机制是一个复杂的病理、生理过程, 脑血流中断造成局部脑组织的缺血、缺氧, 造成脑组织的能量障碍, 同时又存在着血流对脑组织的再灌注, 这些会使脑组织细胞产生损伤级联反应。在此级联反应中有许多不同的机制, 其中局部炎症因子, 趋化因子和黏附分子等表达上调构成了缺血损伤的基础, 起始因素虽是炎症因子, 但黏附分子在炎症因子、内皮细胞、血小板及损伤区均起到了关键作用。ICAM-1又称CD54, 属于免疫球蛋白超家族中的一员, 它介导白细胞、血小板和血管内皮细胞之间的黏附、聚集、促使血栓形成, 加重坏死区炎性反应, 使病情恶化。在白介素 (IL-1) 、肿瘤坏死因子等刺激下表达急剧增加, 与脑梗死发生的病程密切相关, 它的浓度不仅反应白细胞参与损伤的程度, 而且与梗死面积明显相关, 而与病变部位无明显关系[8]。原因是梗死面积越大, 受累血管的数量越多, 微血管内皮细胞受到刺激表达的ICAM-1越多, 因此, 动态观察血清ICAM-1的水平有助于利断脑梗死的发展趋势。故ICAM-1在脑梗死急性期炎性反应中起重要作用。本研究观察到随着大鼠脑梗死的病情发展, ICAM-1浓度增高, 随着用药改善脑供血, ICAM-1浓度逐渐降低。
急性脑梗死属于中医“中风”范畴, 其病因主要是积损正虚, 气血亏虚, 复因情志、饮食、劳逸失度, 使脏腑功能失调, 气血升降异常, 痰湿内生, 肝风内动, 挟痰挟火, 横窜经络, 上蒙清窍致中风发生, 因起病突然, 变化多端, 症状多变, 类似中医病因中的“风邪”特点, 加之急性期以痰瘀阻络为主。本着“急则治标”的原则, 为尽早恢复缺血脑组织的血供, 故笔者提出以辛温祛风化痰通络药物为主, 起到疏通经络, 祛除痰瘀, 使气血复健。因祛风药物具有辛、散、温、通、窜、透等多种特性, 能发挥开郁畅气, 发散祛邪, 燥湿化痰, 通络开窍, 化瘀通络等作用[9]。灯盏细辛是菊科短葶飞蓬的干燥全草, 盛产于云南。据《本草纲目》记载:灯盏花性辛, 微温, 具有散寒解表、活血舒筋、祛风除湿等功效, 用于心痛, 风湿痹痛, 瘫痪等。其有效成分是黄酮类物质, 具有扩血管, 改善微循环, 增加组织灌注, 改善血液流变性及改善脂质代谢等作用, 另有消除氧自由基, 对抗脂质过氧化, 抑制炎症介质的形成和释放, 防治神经元的缺血性损伤。三七总苷是三七的主要提取物, 三七为五加科人参属植物, 是中医治疗各种血症和血瘀的“圣药”。李时珍《本草纲目》记载:三七能治一切血症。味甘、性温、微苦, 归肝胃经, 具有络血化瘀, 止血定痛等功效。现代研究证明:三七含有24种三七皂苷和其他生物活性物质, 在血液系统、心血管系统、神经系统、免疫系统、代谢系统及抗炎、抗衰老等方面均显示了强大的生理活性, 被誉为“适应原样药物”。动物实验表明三七注射液对大鼠急性缺血缺氧后的脑细胞有明显的保护作用[10]。本实验将灯盏花素和三七总苷联合应用, 以灯盏花素偏于祛风化痰祛湿, 以散风为主, 三七总苷偏于活血化瘀, 以“破透”血络为主, 二者结合将散风与祛除痰瘀病理产物结合起来, 相互为用, 祛风有助于祛湿化痰, 行血, 而活血化瘀又有助于风药畅行无阻, 从而得以祛除全身之痰湿, 恢复失常之气血循行。“巅顶之上唯风可到”, 故风药又可起到引药入病所, 使阳气上升, 浊阴下降, 清气上充脑窍, 更加有利于缺血脑细胞功能的恢复。故风药与活血化瘀药结合比单纯使用活血化瘀药治疗脑梗死疗效要佳。本实验的结果亦证实了这一点。其作用机制可能与风药能有效抑制细胞黏附分子表达的上调, 从而减少炎症因子的释放及炎症因子、血小板与受损内皮间的黏附、聚集, 改善微血管闭塞, 减轻缺血缺氧有关。发挥中药有机结合后多途径、多靶点作用。
摘要：目的 探讨灯盏花素联用三七总苷对急性脑梗死大鼠细胞间黏附分子 (ICAM-1) 的影响。方法 将50只大鼠随机分为假手术组、模型组、灯盏花素组、三七总苷组、中药联用组, 每组10只, 采用线栓法制备大脑中动脉模型。术后2h给药, 每日1次, 连用3d。每组均于术后6h、24h、72h静脉取血, 最后1次采血、评分后1h断头取脑。用ELAIS法检测血清ICAM-1值。神经缺损评分采用Bederson10分法标准, 脑梗死体积采用百分比计算。结果 与假手术组比较, 模型组大鼠血清ICAM-1显著升高, 神经缺损评分高, 脑梗死体积大;与模型组比较, 灯盏花素组、三七总苷组、中药联用组血清ICAM-1值下降, 神经缺损程度轻, 脑梗死体积小;与三七总苷组和灯盏花素组比较, 中药联用组作用最显著 (P<0.05) 。结论 在脑梗死急性期, 运用辛温祛风化痰胜湿和活血化瘀中药有机结合, 能起到更好的恢复血流, 改善侧支循环, 减轻神经细胞坏死或凋亡的机制之一。
关键词：灯盏花素,三七总苷,急性脑梗死,大鼠
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三七总苷 篇2
然而近年来有研究显示三七总皂苷可能具有抗肿瘤活性, 有研究表明一定浓度的三七总皂苷能够抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞调亡及诱导肿瘤细胞逆转[2,3]。肝癌为全球高发肿瘤, 恶性度高, 生存率低, 目前尚缺乏特效药物, 目前已经有报道提示三七总苷对肝癌细胞的增殖具有一定的抑制作用, 但研究尚需进一步完善, 本研究拟以三七总苷作用于肝癌细胞, 以mcl-1L和Bak基因的表达情况为监测指标, 初步探索三七总苷对肝癌细胞的凋亡相关基因的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料
人肝癌细胞系QGY-7703, 正常人肝癌细胞系LO2购自中国科学院上海细胞所, 胎牛血清, RPMI-1640购自Gibco公司, β-actin引物、mcl-1L引物、Bak引物由上海上海生工合成, Taqman探针由广州达安基因合成, DNA片段胶回收试剂盒购自Qiagen公司, 三七总苷为购买所得, 主要实验仪器为ABI7500全自动荧光定量PCR仪 (美国ABI公司) , 9600PCR仪 (美国ABI公司)
1.2 实验方法
将肝癌细胞加入24孔培养板, 细胞浓度为1×104/mL, 200μL/孔, 培养48h;将三七总苷配制成3个浓度梯度高剂量 (800μg/mL) 、中剂量 (100μg/mL) 和低剂量 (10μg/mL) , 每个浓度梯度分别设5个平行孔, 每孔10μL, 分别培养24h、48h、72h后, 取3孔用于抽提RNA, 进行荧光定量PCR检测, 引物序列如下:mcl-1L-F:5′AGCGACGGCGTAACAA 3′, mcl-1L-R:5′GGAAGAACTCCACAAACCC 3′探针序列:5′CTTGAAGACCATAAACCAAGAAAGC 3′, Bak-F:5′GGGGACGACATCAACCG 3′, Bak-R:5′GCCGAAGCCCAGAAGAG 3′, 探针序列:5′GTACTTCACCAAGATTGCCACCAGC 3′;数据分析, 窗口下的标准曲线图达到最佳 (correlation数值介于-0.97~-1之间, correlation数值等同于|r|值) , 计算公式:A (拷贝数/μg总RNA) =B (拷贝数/μL cDNA) ÷OD260×5/6, 阳性对照β-actin (PCR方法获得, 并纯化, 定量) 浓度计算公式:浓度 (g/L) =OD260×稀释倍数×40/1 000;4℃低温低速离心后收集三七总苷作用后的肝癌细胞和对照组肝癌细胞, 分别用PBS溶液洗涤并重悬后, 加入Annexin V FITC标记液5μL, 混匀后避光20min, 流式细胞仪检测并分析结果, 阴性对照为未经处理的肝癌细胞QGY-7703细胞, 阳性参照物为抗癌药物顺铂 (DDP) 。
2 实验结果
2.1 实时荧光定量PCR检测mcl-1L基因的表达
结果显示三七总苷作用QGY-7703后, mcl-1L基因的表达水平明显下调, 且与浓度和作用时间呈反变关系, 而对LO2中的mcl-1L基因的表达影响甚微, 见表1。
2.2 实时荧光定量PCR检测Bak基因的表达
三七总苷分别作用QGY-7703和LO2后, 前者的Bak基因表达明显上调, 且与三七总苷浓度和作用时间呈正变关系, 而后者的Bak基因表达水平变化甚微, 见表2。
2.3 细胞增殖检测结果
肝癌细胞在经过不同浓度的三七总苷分别作用24h、48h、72h后, 以未做任何处理的肝细胞为参照, 流式检测结果显示, 三七总苷促进肝癌癌细胞凋亡, 抑制其增殖。作用72h后, 10μg/mL、100μg/mL和800μg/mL三七总苷对肝癌细胞的增殖抑制率分别达到12%、22%和51%, 细胞增殖抑制率与三七总苷的浓度和作用时间呈正相关, 见图1。
3 讨论
目前已经有研究提示三七总苷对于肿瘤细胞具有一定的抑制作用, 尚西亮等人[4]发现三七总皂甙对肝细胞增殖的具有明显抑制作用, 抑制效果与三七总皂甙浓度及作用时间呈正相关, 呈明显的浓度-时间依赖关系, 此外有相关研究提示三七总皂苷对胃癌细胞具有明显的抑制作用, 并且以Bcl-2/Bax为研究对象, 初步探索三七总皂苷的作用靶点及变化调控模式[5]。Bcl-2是目前研究较为明确的抗凋亡蛋白, Bax基因是Bcl-2基因的拮抗基因, Bcl-2/Bax的比值对于细胞存活具有较为重要的意义[6]。本实验中选择Bcl-2的同类功能基因mcl-1L和Bax的同类功能基因Bak进行研究, 观察三七总苷对这两个分子的影响, 从而为进一步研究三七总苷的体内作用靶点提供线索。
荧光定量PCR结果可以得出, 在三七总苷作用前, 相对于LO2, 肝癌细胞QGY-7703的mcl-1L表达显著增强, 而Bak基因表达相对较弱。三七总苷作用后, 肝癌细胞中的mcl-1L表达水平开始受到抑制, 并与作用浓度和作用时间呈反变关系, 相反, 随着三七总苷作用浓度的提高及作用时间的延长, 肝癌细胞中的Bak表达水平明显上升, 总之, 三七总苷对肝癌细胞具有明显的促凋亡作用, 这与尚西亮等人研究相符, 其作用机制应该是比较复杂的过程, 而本实验只是初步探索了三七总苷对mcl-1L和Bak表达量的影响, 为进一步研究三七总苷的细胞内作用靶点提供一点线索。此外本实验只从基因水平对这两种分子进行了初步的检测, 下一步应观察三七总苷对这两种基因蛋白表达量的量效动态关系。
参考文献
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DNS法对三七总多糖含量测定 篇3
关键词：三七,总多糖,3,5-二硝基水杨酸比色法,含量测定
中药三七为五加科植物人参三七(Panax notoginseng( Burk.)F H.Chen)的干燥根,主产于云南、广西等地,野生或栽培,其性温,味甘、微苦,具有活血化瘀、消肿定痛的功效[1],是我国传统名贵中药材,目前多用于冠心病、心绞痛等心血管系统疾病的防治。近年来,通过对三七多糖的药理研究,发现三七多糖具有增强免疫功能等活性作用[2,3]。目前多糖的含量测定方法有苯酚-硫酸比色法、蒽酮-硫酸比色法、DNS法等。崔秀明等[4]运用苯酚-硫酸比色法测定了三七中总多糖成分的含量,但本实验发现苯酚-硫酸法在实验过程中结果不稳定,另外,硫酸具有较强的腐蚀性,给实验操作带来极大不便。DNS法操作简单,结果稳定。本文采用DNS法对三七中总多糖进行含量测定,建立三七总多糖的含量测定方法,以期为系统评价三七药材的质量提供一定的资料。
1 材料
1.1 仪器
Aquapro艾科浦u系列纯水机,CP225D十万分之一电子天平(德国sartorius公司);KQ5200DA型数控超声清洗器(昆山市超声仪器公司);Thermo Helios r紫外分光光度仪。
1.2 药材与试剂
D-无水葡萄糖对照品(批号:1108333-200503,购于中国药品生物制品检定所);三七饮片(批号:090921、091001、091125,购于广州致信饮片公司,由广州中医药大学赖小平研究员鉴定);3,5-二硝基水杨酸,NaOH溶液,酒石酸钾钠,苯酚,亚硫酸钠,HCl溶液等试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 DNS试剂的配制[5]
称取3,5-二硝基水杨酸3.15g,溶于131mL 2mol·L-1 NaOH溶液中,再将其加入到250mL含91.0g酒石酸钾钠的热水溶液中,搅拌使其溶解,然后加入2.5g苯酚和2.5g亚硫酸钠,充分搅拌,溶解,冷却后定容至500mL棕色容量瓶中储存,室温放置1周稳定后使用。
2.2 三七供试品溶液的制备
2.2.1 三七总多糖样品制备
精密称取三七粉末5.0g,置250mL容量瓶中,加入蒸馏水200.0mL,超声提取2h,冷却至室温,加蒸馏水至刻度,4 000r·min-1离心10min。精密移取上清液100.0mL,置250mL茄形瓶中,减压回收至干,用蒸馏水少量多次将其溶解至10mL容量瓶中,加水定容至刻度。将浓缩液用40.0mL无水乙醇洗至100mL三角锥形瓶中,充分振摇混匀,置冰箱中冷藏放置过夜。将上述溶液转至离心管中4 000r·min-1离心5min,残渣用80%乙醇洗涤4次,每次10mL。将上述残渣用蒸馏水溶解至100mL容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,即得总多糖样品。每个样品平行3份。
2.2.2 三七总多糖样品水解
精密移取上述三七多糖样品溶液20.0mL,置三角锥形瓶中,加入10mL 6mol/L HCl溶液(现配),封口,于沸水浴上加热30min,取出冷却至室温,用6mol/L NaOH溶液调pH值至8.0,4 000rpm离心5min,残渣用水洗涤,上清液与水洗涤液一并置50mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,摇匀即得三七多糖水解液样品。
2.3 测定波长的选择
2.3.1 对照品溶液显色扫描
精密移取葡萄糖对照品溶液0.8mL置具塞试管中,加水至2.0mL,加入1.5mL DNS试剂,摇匀,于沸水浴中加热5min,取出后迅速冷却,随行以2.0mL蒸馏水作空白,用紫外-可见分光光度计于200～800nm进行全波长扫描,结果见图1。
2.3.2 三七供试品显色扫描
精密移取三七多糖水解液样品2.0mL置10mL容量瓶中,加水稀释至刻度,精密移取上述溶液0.3mL置具塞试管中,加蒸馏水至2.0mL,加入1.5mL DNS试剂,摇匀,于沸水浴中加热5min,取出后迅速冷却,随行以2.0mL蒸馏水作空白,用紫外-可见分光光度计于200～800nm进行全波长扫描,其吸收曲线见图2。
对比以上两个样品扫描图可知,二者的最大吸收峰一致,均在510nm处左右,因此选择510nm为检测波长。
2.4 方法学考察
2.4.1 标准曲线的绘制
精密称取干燥恒重D-无水葡萄糖对照品适量,加水溶解使成400.0mg/L,精密移取葡萄糖对照品溶液0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mL,置具塞试管中,分别加水至2.0mL,加入1.5mL DNS试剂,摇匀,于沸水浴中加热5min,取出后迅速冷却,以第一份样品作空白,于510nm下测定其吸光度,每个样品浓度平行3份,以每3.5mL溶液中所含的葡萄糖质量(mg)为横坐标,以其平均吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,回归方程:Y=5.859X-0.355 9(r=0.999 2)。结果表明,D-无水葡萄糖溶液在0.117 6～0.313 6mg/3.5mL范围内与吸光度有良好的线性关系。
2.4.2 精密度试验
精密吸取对照品溶液0.5mL,按标准曲线制作方法测定吸光度,重复测定6次。平均吸收度为0.744,RSD为0.21%,结果表明精密度良好。
2.4.3 稳定性实验
精密称取三七样品5g,按“2.2”项下操作制备溶液,依法显色,显色后分别于0、5、10、15、20、25、30 min测定其吸光度,平均吸收度为0.835,RSD为1.66%。结果表明样品溶液在30min内稳定。
2.4.4 重现性试验
取三七样品6份,按“2.2”项下操作制备溶液,依法测定,平均含量为9.30%,RSD为1.9%,结果表明重现性良好。
2.4.5 回收率试验
取已知含量的样品5份,每份取约2.5g,精密称定,每份样品分别加入精密称取的葡萄糖对照品0.1mg,按“2.2”项下方法制备供试品,按“2.4.1”项下方法操作,算得样品的平均加样回收率为98.87%,RSD为2.6%,表明本方法准确度良好。结果见表1。
2.5 三七供试品总多糖含量测定
精密移取不同等级的三七多糖水解液样品1.0mL(根据实验结果调整取样量),置具塞试管中,加水至2.0mL,加入1.5mLDNS试剂,摇匀,于沸水浴中加热5min,取出后迅速冷却,随行以2.0mL蒸馏水作空白,用紫外-可见分光光度计于510nm测定吸光度。按公式1计算,结果见表2。
多糖含量%=m/(m样品/250×V多糖/100×V水解液/50×1000)×0.9
其中,m样品为样品取样量,V多糖为水解时多糖取样体积,V水解液为显色时所取水解液体积;多糖水解成单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子水,故在计算单糖含量时需乘以0.9校正。
注:计算公式1:样品显色时所含葡萄糖重量m=(A+0.355 9)/5.859。
3讨论
多糖并不具有还原性,跟DNS无法反应,因此需要对总多糖溶液进行水解后再用DNS法显色测定其吸光度,此时测定的为三七中总糖含量;同时,水提醇沉法可以将三七中的还原糖沉淀出来,因此需先对三七多糖溶液用DNS显色后测定其吸光度,此时测定的为三七中还原糖含量;总糖含量减去还原糖含量即为三七中多糖含量。在试验中对未水解的多糖进行显色测定后发现其吸光度极低,对结果影响不大,因此本实验没有对其进行测定。多糖的含量测定方法有苯酚-硫酸法[5]、硫酸-蒽酮法[6]、3,5-二硝基水杨酸法等。本文采取了DNS法测定三七总多糖的含量,对不同批次三七中总多糖进行含量测定,以期为系统评价三七药材的质量控制提供资料。
参考文献
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三七总皂苷对脑缺血的药理作用研究 篇4
1 资料与方法
1.1 诊断依据
(1) 诊断标准:参照1995年中华医学会第4届全国脑血管病学术会议修订的诊断标准, 且符合国家中医药管理局脑病急症协作组《中风病诊断与疗效评定标准 (试行) 》中气虚血瘀证的诊断标准。 (2) 纳入标准: (1) 符合诊断标准; (2) 脑出血或缺血已经住院治疗控制稳定者; (3) 血压控制稳定者, 心功能Ⅲ级及以上并已控制心衰者; (4) 中医辨证为气虚血瘀型者, 证见:患肢痿软无力, 纵缓不收, 或伴麻木, 面色萎黄, 舌淡紫或有瘀斑, 苔白, 脉细涩或虚弱。
1.2 一般资料
全部180例患者均为住院患者, 治疗组男60例, 女44例;年龄42~79岁, 平均 (64.61±13.92) 岁;病程6~34个月, 平均 (15.30±3.71) 个月;脑血栓形成50例, 脑栓塞30例, 多发性腔隙性脑梗死24例。对照组76例, 男性40例, 女性36例;年龄44~80岁, 平均 (66.14±14.65) 岁;病程6~41个月, 平均 (16.13±4.60) 个月;脑血栓形成50例, 脑栓塞20例, 多发性腔隙性脑梗死6例。2组上述资料差异无显著性 (P>0.05) , 具有可比性。
1.3 治疗方法
治疗组给予三七总皂苷 (血塞通) 注射液[河南东风制药有限公司镇平东风制药厂生产, 豫卫药准字 (1994) 133033号]4m L (含三七总皂苷200mg) 加入10%葡萄糖注射液500m L内静脉滴注, qd, 连续用药20d;对照组给予复方丹参注射液[上海中西药业股份有限公司生产, 沪卫药准 (1995) 第014021号]20m L (含丹参20g) 加入10%葡萄糖注射液500m L内静脉滴注, qd, 连续用药20d。
1.4 疗效标准
按照文献[1]计分方法, 满分28分, 起点分最高不超过18分, 着眼于神志、语言、运动功能的恢复程度。基本痊愈:症状消失, 患肢肌力基本恢复, 生活能自理, 语言清晰, 积分达24分以上。显效:症状明显减轻, 患肢肌力达到Ⅲ~Ⅳ级, 能独立活动, 生活可基本自理, 语言欠清晰, 积分增加超过10分。有效:症状减轻, 肢体功能部分恢复, 肌力在原来基础增加Ⅰ级左右, 积分增加超过9分以上。无效:症状、患肢肌力、积分与治疗前相比无变化。
1.5 红细胞膜的制备
取空腹静脉血3m L肝素抗凝, 以2000rpm速度离心5min, 吸去血浆及白细胞层, 按1∶2比例加入生理盐水反复冲洗离心3次, 得红细胞悬液, 按1∶10比例加入预冷10mmol/L Tris-Hcl, 轻摇2min, 放置20min, 使其充分溶血。4°C下12000rpm速度离心20min, 去掉含血红蛋白的上清层及离心管底层的硬沉淀物, 用10mmol/L TrisHc l液反复洗涤离心3次, 制得白色红细胞膜, 悬浮于0.5 m L50mmol/L Tris-Hcl缓冲液中, 放入-70°C冰箱中保存。整个过程于0~4°C下进行。所用仪器为Sigma3k30型低温高速离心机及日本SANYO低温冰箱。
1.6 红细胞膜ATP酶活性测定
采用化学比色法测定红细胞Na+-K+-ATP酶活性和Ca+-Mg+-ATP酶活性。ATP酶活性单位以每小时每毫克膜蛋白中的ATP酶分解ATP产生无机磷的量 (μmo l/L) 表示, ATP酶试剂盒购自南京建成生物工程研究所, 测定步骤严格按照说明书进行, 检测仪器为惠普6010型紫外-, 可见分光光度计。
1.7 统计学处理
应用SPSS 10.0统计软件。采用t检验和卡方检验。
2 结果
2.1 2组临床疗效比较
治疗组104例中, 临床治愈24例 (23.09%) , 显效34例 (32.69%) , 好转36例 (34.42%) , 无效10例 (9.61%) , 总有效率90.01%。对照组76例中, 临床治愈10例 (13.15%) , 显效24例 (31.57%) , 好转20例 (26.31%) , 无效22例 (28.94%) , 总有效率71.03%。2组总有效率比较, 差异有显著性 (P<0.05) , 治疗组疗效优于对照组。
2.2 2组治疗前后ATP酶的变化
治疗组治疗前后Na+-K+-ATP酶和Ca+-Mg+-ATP酶活性有明显提高 (P<0.05) , 对照组治疗前后Na+-K+-ATP酶和Ca+-Mg+-ATP酶活性虽有提高, 但是差距无统计学意义 (表1) 。
3 讨论
中风后遗症多由于气虚脉络瘀阻而致经脉不通, 肢体肌肉失于气血濡养, 废而不用, 久之脏腑运化功能失调, 气血不足, 肢体脉络空虚, 瘀阻加剧。因此气虚血瘀是中风后遗症病机关键[2]。三七在我国南方多用于补气, 素有参三七之称, 三七功能活血化瘀, 对于脑缺血有很好的疗效。三七中含有三七总皂苷, 能增加脑血流量, 扩张脑血管, 改善血流动力学, 降低脑缺血再灌注损伤所致的卒中指数, 减轻脑水肿, 抑制血栓形成, 对缺氧所致的脑损伤有保护作用。经研究证实, 三七皂苷可延缓缺血期间细胞内高能磷酸化合物的分解, 改善缺血引起的脑能量耗竭, 有明显的脑保护作用。
脑缺血后离子通道通透性的异常和神经细胞内外离子平衡的紊乱是缺血性脑损伤的重要机制。Ca+广泛存在于机体的各种组织中, 在体内参与许多重要的生理活动, 在保护神经元结构、功能完整方面起着重要的作用。脑缺血后脑组织发生严重的Ca+内流紊乱, 大量Ca+蓄积在神经细胞内产生严重的毒性作用, 诱发一系列病理反应, 促发和加剧继发性脑缺血损害, 是神经细胞死亡的“最后共同通路”[3]。细胞膜Ca+-Mg+-ATP酶酶活性对于维持细胞内Ca+浓度的稳定起重要作用, 其活性的变化可影响到细胞的许多生理功能及细胞的完整性。K+是维持细胞正常生理功能必需的离子, 为细胞内主要电解质并参与糖原及蛋白质的合成过程, 又参与酶的活动, 尤其是Na+-K+-ATP酶酶, 没有K+的参加就不能完成ATP去磷酸化过程。因此, 在脑血管调节方面起着重要作用。钾通道的改变能导致血管扩张障碍, 为发生发展血管痉挛和脑缺血的重要原因Na+-K+-ATP酶是最重要的Na+, K+运输机制, 其活性减低会造成细胞内Na+增高, 通过启动Na+/Ca+交换而促进Ca+内流增加。可见, 细胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca+-Mg+-ATP酶酶是维持细胞内环境稳定的重要机制。Na+-K+-ATP酶和Ca+-Mg+-ATP酶活性降低时, 就会引起细胞内高Na+高Ca+, 从而导致细胞内外阳离子代谢异常。
本观察显示, 补阳还五汤不但可提高中风后遗症的临床疗效, 而且可以提高红细胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca+-Mg+-ATP酶活性, 与文献报道[4]的结果相符。可以认为, 补阳还五汤治疗中风后遗症的作用机制之一是通过改善患者红细胞膜酶活性、纠正离子代谢紊乱而实现的。
摘要：目的 观察三七总皂苷注射液对于血瘀型脑缺血的红细胞ATP酶的影响。方法 将180例气虚血瘀型患者随机分为2组, 治疗组104例, 以三七总皂苷注射液4mL, 对照组76例, 以丹参20mL, 两者均加入10%葡萄糖注射液500mL中静脉滴注, 每日1次, 连续滴注20d。结果 治疗组和对照组总有效率分别为90.01%和71.03%, 2组总有效率差别有统计学意义P<0.05) , 治疗组治疗后红细胞膜ATP酶有明显上升, 有统计学意义, 对照组虽有上升, 但无统计学意义。结论 三七总皂苷治疗脑缺血优于丹神注射液, 并且具有改善红细胞ATP酶活性, 纠正离子紊乱的作用。
关键词：三七总皂苷,脑缺血,红细胞ATP酶
参考文献
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三七总苷 篇5
1 材料与仪器
DU-800紫外可见分光光度计 (Beckman公司) ;RE旋转蒸发仪 (上海亚荣生化) 。
三七药材采自湖北恩施;标准品人参皂苷Rg1 (98%) 购自北京生物制品研究所;5%香草醛溶液 (现配) ;正丁醇、高氯酸等化学试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1提取工艺研究
2.1.1对照品溶液制备
精密称取干燥至恒重的人参皂苷Rg1对照品2.50mg于25mL容量瓶中, 加甲醇溶解并稀释到刻度, 摇匀, 即为0.10mg/mL人参皂苷Rg1的对照品溶液。
2.1.2标准曲线绘制
精密吸取0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3.0mL的对照品溶液, 分别置于10mL具塞试管中, 挥干溶剂, 加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL, 高氯酸0.8mL, 在60℃水浴中加热15min, 立即置冷水中冷却, 加入冰醋酸5.0mL摇匀, 放置15min, 以相应试剂做空白对照, 在560nm处测定吸光度A, 以A值为横坐标, 人参皂苷Rg1含量 (mg) 为纵坐标, 绘制标准曲线[5]。
2.1.3供试样品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的恩施三七药材粉末0.60g, 加入一定倍数一定浓度的乙醇后, 浸泡12h;然后, 在一定温度下超声提取一定时间, 过滤, 滤渣以同样倍数的乙醇混匀, 超声、过滤, 将滤液合并, 定容, 按标准曲线方法项下显色, 测吸光度值, 根据标准曲线计算总皂苷含量。
2.1.4 Box-Benhnken设计优化提取工艺
2.1.4.1 Box-Benhnken设计优化实验
结果见表1。
实验编号1～12为析因实验, 实验编号13～15为中心实验。其中:A= (乙醇体积分数-70) /20, B= (提取时间-15) /5, C= (固液比-10) /2。各因素水平依据单因素实验选择, 能反映整个因素变化, 得到较好的回归方程。
2.1.4.2回归模型建立
对表1中三七总皂苷提取率R1及3个因素A、B、C的数值, 利用MATLAB中的多元回归函数进行拟合, 得到回归方程:
R1=3.843342+0.162632A+0.339284B+0.412188C-0.469203A×A+0.198149B×B-0.429947C×C-0.229928A×B-0.095336A×C+0.302832B×C
回归模型方程的方差分析见表2。
回归方程相关系数R2=0.9342, 表明回归拟合良好, 由F检验, 当Prob>F值小于0.05即可认为该指标显著, 当小于0.01时即为高度显著 (Prob>F即为F检验的P值) , 由表中数据可以看出, 固液比对提取率的影响是高度显著的。利用MATLAB的求导函数 (diff) 对方程模型求一阶偏导得到最优化值对应的方程, 再利用线性方程函数 (solve) 求出最优化值。即乙醇浓度为72%、超声辅助提取时间为12min、固液比为1∶11时, 该模型预测的总皂苷提取率最大, 提取率预测值为6.97%。
2.1.4.3验证实验
当乙醇浓度为72%、超声辅助提取时间为12min、固液比为1∶11时, 三七总皂苷提取率为6.92%, 与预测值6.97%相吻合, 说明该模型可以较好地预测总皂苷提取情况。
3 讨论
用超声法对湖北恩施产三七总皂苷进行了提取研究, 优化研究表明三七总皂苷最佳提取工艺为:乙醇浓度为72%、超声辅助提取时间为12min、固液比为1∶11。在此实验条件下三七总皂苷提取率为6.92%, 与预测值6.97%相吻合, 说明该工艺可以较好地提取总皂苷。
摘要：目的 优化超声法提取三七总皂苷工艺。方法 采用Box-Benhnken设计优化三七总皂苷超声提取工艺。结果 优化的提取工艺参数为:乙醇体积分数72%、固液比1∶11、提取时间12min。在此工艺条件下三七总皂苷的提取率为6.92%, 与模型预测值6.97%基本相符。结论 超声提取法是一种高效提取恩施三七总皂苷的有效方法。
关键词：三七总皂苷,Box-Benhnken设计,超声提取
参考文献
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三七总苷 篇6
关键词：三七总皂苷,缺血-再灌注,损伤,下肢
血塞通的主要成分是三七总皂苷(PNS),PNS是我国传统的珍贵药材,具有活血祛瘀、通脉活络止血、活血、散癖、消肿止痛之功效,其药理机制可能与抑制脂质过氧化反应、保护组织抗氧化能力、扩张血管、改善微循环、影响自由基生成等有关。从中提纯的有效活性成分PNS,对肢体缺血-再灌注的损伤及其后遗症有确切疗效。研究证实,PNS是五加科人参属植物三七的提取物[1,2,3,4],经过长期艰苦的探索,已有成熟的静脉与口服剂型广泛应用于血管、心、脑、肝等疾病治疗中。Wu等[5]研究证实,PNS具有促进热休克蛋白(heat stress protein,HSP)的表达、保护SOD酶活性、减少MDA生成的作用。本实验通过建立大鼠缺血-再灌注的动物模型,观察缺血前后及用药前后大鼠体内MDA及SOD的变化,从而探讨PNS对大鼠肢体缺血-再灌注的保护作用。
1 材料与方法
1.1 药物和试剂
SOD、MDA试剂盒均购于南京建成生物技术公司,三七总皂苷,蒸馏水,冰醋酸,无水乙醇。
1.2 动物
50只雌性Wistar大鼠,体重(200±50)g,购于山西医科大学生理教研室。
1.3 仪器
721型可见分光光度计(上海医用仪器厂),恒温水浴锅,台式离心机,微量式移液器,光学显微镜(日本Olympus公司)。
1.4 方法
1.4.1 动物模型的建立
动物麻醉(乌拉坦40 mg/100 g,腹腔注射麻醉),麻醉满意后行腹正中切口开腹,全身肝素化,在髂总动脉分叉处上方0.5 cm处用动脉夹阻断腹主动脉,阻断力量以阻断平面以下管腔变扁平、动脉搏动消失为标准。阻断时间为1、2 h,再灌注时间为放开阻断后2 h。假手术组步骤基本同实验组,但不做腹主动脉阻断。
1.4.2 标本的采集
各组动物分别于阻断前、再灌注时间点、再灌注后从尾静脉收集静脉血2 ml,以1 500r/min离心后取血清,装入干净的Eppendorf管中,-40℃冻存备用。
1.4.3 生化指标检测
MDA的检测采用硫代巴比妥酸法(TBA法),SOD的检测采用黄嘌呤氧化酶法。具体操作严格按试剂盒说明书进行。
1.5 统计学方法
数据以均数±标准差表示,所有数据通过SPSS13.0软件分析测定,两样本均数比较用t检验,组间比较用单因素方差分析,组内比较采用t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠缺血后及缺血用药后血液中SOD及MDA的含量
见表1。
与假手术组比较,▲P<0.05
大鼠缺血1 h后,血液中MDA升高,但SOD降低不明显,差异无统计学意义。而缺血2 h后,随着缺血时间的延长,血液中MDA明显升高,SOD明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。缺血1 h+PNS组血液中MDA降低,但SOD升高不明显,差异无统计学意义。缺血2 h+PNS组血液中MDA明显降低,SOD明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。
2.2 各组大鼠再灌注2 h后血液中SOD及MDA的含量
见表2。
与假手术组比较,▲P<0.05
缺血1 h组大鼠再灌注2 h后血液中SOD及MDA与其他各组相比,差异无统计学意义。缺血1 h+PNS组大鼠经PNS处理后血液中SOD含量与缺血1 h组相比,其升高不明显,MDA含量降低不明显,差异无统计学意义。其他各组与假手术组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。
2.3 缺血2 h对腓肠肌的损伤
见图1。
2.4 缺血2 h PNS处理后腓肠肌的恢复情况
见图2。
3 讨论
缺血-再灌注后,大鼠血液中的MDA含量升高,线粒体是对再灌注损伤最敏感的细胞器,其损伤表现为跨膜电位耗散,细胞能量代谢障碍,细胞进入不可逆的死亡过程。活性氧是指来源于氧分子被少于4个电子还原的化合物[6],例如超氧阴离子自由基、过氧化氢和氢氧自由基都是活性氧,它们分别被1、2、3个电子还原。缺血-再灌注引起组织的损伤原因是多方面的:氧自由基的产生增加,组织内的超氧化物歧化酶减少,抗氧化能力降低,氧自由基与细胞膜上的多聚不饱和脂肪酸发生反应,产生脂质过氧化物,其过氧化产物对膜有强烈的破坏作用,不断损伤组织、含巯基的蛋白质和酶引起的钙超载,导致细胞的不可逆性损伤甚至死亡[7,8]。内皮素(ET)是一种强烈的血管收缩肽,彭军等[9]通过建立大鼠双后肢缺血-再灌注模型,缺血时间各组均为4 h,证实再灌注后血浆及骨骼肌中ET-1都升高,并且再灌注4 h达高峰,以后逐渐下降。
超氧化物可以自发歧化生成过氧化氢,而超氧化物歧化酶可以大大地加速这一反应过程[10],从而减少超氧化物含量,减轻组织缺血-再灌注后的损伤。SOD对降低再灌注损伤有重要作用,在再灌注损伤中可使SOD的酪氨酸硝基化,从而易使缺血后细胞溃变,即使有大剂量SOD也丧失其保护作用。MDA是体内评价脂质过氧化反应的一个间接指标,其高低可反映体内过氧化反应发生的强弱。热应激预处理可减轻缺血-再灌注组织的损伤,其机制可能是热应激预处理后诱导组织内源性SOD增加,其活性增加,加速对缺血-再灌注过程中形成的氧自由基的清除,从而减少MDA的产生,减轻缺血-再灌注对组织的损伤[11]。
三七总苷 篇7
关键词：HPLC快速分析法,三七总皂苷
三七是五加科人参属植物, 是较为名贵的中药材之一, 具有活血化瘀、消肿止痛的功效。三七临床多用于治疗心脑血管疾病、吐血、衄血、跌打损伤等疾病, 其有效成分以人参皂苷Rg1、Re1、Rd以及三七皂苷R1等成分[1,2]。目前对与测定三七皂苷成分的方法有很多种, 包括薄层扫描法、胶束电动毛细管电泳法、高效液相色谱法 (HPLC法) 等。按照《中国药典》 (2010年版) 的要求, 应采用高效液相色谱法测定“三七”中人参皂苷和三七皂苷的含量。但是在临床操作中发现, HPLC测定法常常存在分析时间长、消耗有机溶剂多的缺点。为了改善HPLC的测定技术, 本课题采用HPLC快速分析法, 对三七提取液中人参皂苷和三七皂苷的含量进行分析和常规方法比较大大缩短了分析时间, 总结如下。
1 实验部分
1.1 主要仪器与设备
本研究采用美国Waters公司Alliance高效液相色谱仪, 包括2690分离系统 (四元泵、柱温箱及自动进样器) , 996紫外二极管阵列检测器, Millennium32色谱管理软件。甲醇:高效液相色谱专用 (Fisher公司生产) 。水为石英亚沸蒸馏水并用Milli2Q50 (美国Millipore公司) 超纯水仪处理, 电阻≥18Ω/cm。
1.2 药品
试验药:选择三七药材 (云南白药中药饮片分公司) , 自制, 经HPLC测定其三七成分 (三七皂苷R1, 人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、Rb1、Rd1) 。对照药:来自于中国药品生物制品检定所提取。
1.3 试验样本的制备
三七提取液, 自制, 精密称量0.2 g, 置于50 m L的量瓶中, 加入适量的70%甲醇, 采用超声提取20 min, 用70%甲醇稀释, 用0.45μm针头过滤器过滤。
1.4 色谱条件
色谱柱为安捷伦ZORBAX Stable Bound (4.6 mm×50 mm, 1.8μm) 色谱柱, 流动相选择甲醇-混合液 (乙氰∶1%醋酸∶0.4%磷酸=30∶35∶35) ;流速为1.0 m L/min, 检测波长为209 nm, 柱温:40℃, 进样量为20μL。
按照上述的色谱条件对试验品和对照品进行分析, 分离效果较为理想。
2 结果
2.1 线性关系结果
精密提取对照品溶液2、4、5、8、10、12μL进行色谱测定, 按照色谱条件进行峰面值测定。以峰面积与进样量进行线性回归, 得出标准曲线:三七皂苷R1 Y=294.31X-7.3424, r=0.9999, 人参皂苷Rg1Y=257.3X+23.45, r=0.9999, 人参皂苷Re Y=243.23X+2.54, r=0.9999, 人参皂苷Rb1 Y=224.52X+4.31, r=0.9999, 人参皂苷Rd Y=253.59X+3.67, r=0.9999。可见, 三七皂昔RI在0.24~23.7 pg、人参皂昔Rgl在0.83~89.0 pg、人参皂昔Re在0.13~11.2 pg、人参皂昔Rb1在0.74~74.0 pg、人参皂昔Rd在0.21~18.3 pg的波长范围内有良好的线性关系。详见图1、2。
2.2 精密度测试
采用精密吸取对照品溶液, 10μL, 测试6次, 其峰面积相对标准偏差分别为1.3%、1.1%、1.2%、1.4%和1.1%, 提示仪器精密度良好。
2.3 稳定性测试
取试验品10μL, 分别于0、2、4、6、8 h进样测定, 其峰面面积积分值相对标准差分别为0.43%、0.53%、0.72%、0.49%和0.52%, 提示试验样品溶液在8 h内比较稳定。
2.4 重复性试验
取三七提取液样品, 分别制备5份试验样品, 按照上述色谱条件测定三七皂苷RSD分别为1.56%、1.38%、1.78%、1.57%、1.64%。
2.5 加样回收率试验
取三七提取液样品0.75 g精密加入一定量对照品, 按照上述色谱条件测定含量, 计算其回收率, 结果三七皂苷R1, 人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的平均回收率分别为98.57%、97.63%、99.25%、99.13%、99.06%, 其RSD分别为1.64%、1.09%、1.53%、1.49%、1.63%。
3 讨论
三七市我国特有的中药材, 基于三七有效成分研制的三七制剂, 具有活血化瘀的功效, 广泛用于临床治疗, 具有良好的社会效益和经济效益。而其质量控制的方法学探索也一直是研究的热点。近年来, 国内已有不少学者采用高效液相色谱法检测三七及其制剂中皂苷类成分含量[3], 但绝大多数文献仅检测其中3种成分, 同时测5种皂苷的报道很少;而且在方法上存在分析时间长 (含平衡时间在90 min以上) 、消耗有机溶剂多等缺点, 虽然超高效液相 (UHPLC) 可以实现三七中多种皂苷的快速分离[4], 但由于设备昂贵, 难以在短期内普及。
实验证明, 采用HPLC快速测定法, 三七总皂苷与人参总皂苷等成分均具有良好的分离度和线性关系, 结果满意。与现有文献相比, 本方法简单快速, 灵敏度高, 结果重现性好, 可用于三七及其制剂的质量控制。尤其体现在试验时间上, 本方法能在10 min左右就能获得待测成分与其他干扰成分良好的分离要求。在试验中, 其最高效率的时间相比其他文献报道来说缩短了60%[3]。从有机溶剂使用量相比可以比常规的分析方法节约3倍左右。
本文方法简便、准确, 精密度和重复性较好, 可用于三七药材或其制剂的含量测定[4,5,6], 可以为以后的开发利用及质量标准的制定提供参考。
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