金属蛋白酶抑制剂-1

金属蛋白酶抑制剂-1（精选七篇）

金属蛋白酶抑制剂-1 篇1

1 材料与方法

1.1 材料

实验组选择本课题组2006～2008年使用二甲基苯并蒽(DMBA)涂抹金黄地鼠舌体建立的舌癌模型存档标本,其中涂抹4、8、12、16、20、24周各为一组,每组5例,共计30例;将上述标本切片行HE染色,在显微镜下观察。确定原位癌11例,进展期舌癌19例(包括浸润癌13例,转移癌6例);有淋巴结转移者17例,无淋巴结转移者13例。每例均按癌巢大小取取癌中组织(肿瘤中心区)、癌周组织(肿瘤边缘区);对照组取上述组织块中的正常组织各1块,共计30例。

1.2 试剂

兔抗人MMP-1、TIMP-1多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司;SP超敏试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司;DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法

HE染色法,光镜下观察切片,确定组织的病理分级:原位癌、浸润癌、转移癌。应用ABC免疫组织化学染色方法分别检测舌癌标本各取材部位中MMP-1、TIMP-1的定位及表达情况。

1.4 结果判断

MMP-1、TIMP-1均采用半定量积分法:以胞质内出现黄色颗粒状物质为阳性,根据肿瘤细胞胞浆染色的程度及染色细胞百分率进行评分:基本不着色者为0分;着色淡黄色为1分;棕色为2分;深棕色为3分。着色细胞占计数细胞百分率:≤5%为0分;6%～25%为1分;26%～50%为2分;≥51%为3分。将每张切片着色程度得分与着色细胞百分率得分相乘,为MMP-1、TIMP-1表达强度积分。≤1分为阴性(-);2～3分为弱阳性(+);4～5分为中等阳性(++);≥6分以上为强阳性(+++)。免疫组化ABC法进行结果判断,用已知阳性切片作阳性对照,以PBS代替一抗作空白对照,以正常血清代替一抗作阴性对照。

1.5 图像分析

采用image-pro plus全自动图像分析系统,观察、检测以上2种染色切片,在200倍放大下随机选取5个测定域,分别测定MMP-1和TIMMP-1表达的数密度(目标数/统计场面积)[2]。

1.6 统计学方法

所得数据采用SPSS 13.0软件进行统计分析,计量资料数据以均数±标准差表示,等级资料采用秩和检验。计量资料比较采用t检验,计数资料比较采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMP-1和TIMP-1蛋白在舌癌黏膜固有层中的表达

MMP-1在舌癌黏膜固有层的阳性表达率为90.0%(27/30),其中(+++)表达为43.3%(13/30),(++)表达为26.67%(8/30),(+)表达为20.0%(6/30),其阳性表达主要位于细胞浆内。TIMP-1在舌癌黏膜固有层的阳性表达率为86.7%(26/30),其中(+++)表达为33.3%(10/30),(++)表达为26.7%(8/30),(+)表达为26.67%(8/30),其阳性表达主要位于细胞浆内。MMP-1和TIMMP-1蛋白在实验组中的表达与对照组(阳性率分别为10.0%和13.33%)相比,差异有高度统计学意义(P<0.01)。在癌中、癌周组织中MMP-1和TIMP-1蛋白的表达比较,差异均有高度统计学意义(均P<0.01)),见表1。

2.2 MMP-1和TIMMP-1蛋白表达的关系

随着周龄的增加,舌癌标本组织中的MMP-1和TIMP-1的表达均增强,二者与舌癌大小无关(P>0.05),而与舌癌分化程度、有无转移等差异有高度统计学意义(P<0.05或P<0.01),见表2。

3 讨论

在生理情况下,细胞外基质(ECM)在维持正常组织结构与功能及细胞生长、分化过程中起到非常重要的作用。大量研究表明,它不再被认为是静止不动的,而是处在不断代谢更新、降解重塑的动态平衡中。近来在研究有关ECM合成和降解的代谢平衡调节中,引人注目的是MMPs和TIMPs两个酶系统的作用。ECM的主要成分由胶原纤维和弹性纤维构成,MMP-1在这一过程中起着分解胶原纤维的作用。TIMP-1除了是MMP-1的天然抑制剂外,还对所有类型MMPs均有抑制作用。在生理情况下,它可参与细胞外基质的改建及影响细胞生长[3]。本实验对照组的MMP-1、TIMMP-1含量差异无统计学意义(P>0.05),亦证明了二者同时存在于细胞的生理情况下,可参与细胞外基质的改建及影响细胞生长。

MMPs和TIMPs与肿瘤的发生、发展密切相关:大部分肿瘤中均可检测到MMPs和TIMPs的表达异常。有研究表明,在头颈部鳞癌中,肿瘤细胞可通过分泌MMPs降解细胞外基质,促进肿瘤的侵袭转移并影响患者的转归和预后[4]。本研究从表1中可发现MMP-1随着舌癌的进展,其癌中心区域高表达性愈来愈高(P<0.01),说明舌癌发生转移的趋势越来越高;当MMP-1表达为(++)～(+++)时,癌周围区组织的MMP-1表达比癌中心区表达要高,这是由于随着舌癌的进展,癌体积逐渐变大,癌中心区域会产生缺血性改变,中心区细胞缺血,减少分泌MMP-1的同时,还会分泌缺氧诱导因子(HIF-1)等细胞因子,诱导新生血管形成[5],而新生血管的发生必须侵及基底层到达癌体,此时癌周围区域受到缺血、细胞因子等因素刺激会使MMP-1分泌就会迅速升高,以溶解胶原纤维,促使新生血管的形成[6]。MMP-1增多的同时,TIMP-1也会相应增多,这是机体的应答机制,原位杂交也发现MMP的mRNA主要分布在肿瘤边缘的间质细胞中,或同时分布在瘤细胞和间质中[7],造成这种不同分布的机制可能就是由于肿瘤血管生成的需要,也说明MMP-1具有促血管生成的作用。但是从表1来看,虽然MMP-1和TIMP-1皆升高,但是后者的升高的程度较小。这主要是由于MMP家族有激活的级联效应[8],导致20周以后MMP-1表达明显升高。通过表2可以发现MMP-1和TIMP-1的表达与肿瘤大小无关(P>0.05),但与肿瘤的淋巴结转移、分化程度等具有密切联系(P<0.01),这是由于MMP-1参与破坏基底层的胶原纤维,以利于舌癌的转移,这与低分化细胞分泌高表达的MMP-1观点相一致[9]。Gunduz等[10]通过研究口腔纤维化,发现TIMP-1在纤维化的病损比正常高,可能MMP-1会使细胞外基质的合成和堆积增加,高表达的TIMP-1对MMP-1的抑制作用,从而破坏MMPs与TIMP的动态平衡,TIMP-1在口腔黏膜下纤维化的成纤维细胞中表达,随着口腔黏膜纤维化的严重程度加大而增加,因此TIMP-1可能与口腔黏膜纤维化的病理过程有关[11]。MMP-1和TIMP-1在舌癌的发生、发展过程中所起的作用不仅是通过降解细胞外基质和基底膜,促进肿瘤侵袭转移的,而且还可以促进肿瘤组织中新生血管的形成,增强了肿瘤侵袭能力和转移能力,抑制MMP-1具有抑制肿瘤侵袭转移和血管生成的双重作用。

金属蛋白酶抑制剂-1 篇2

1 资料与方法

1.1 实验对象的选择与分组

选择2007年8月～2007年11月在中南大学湘雅二医院口腔正畸科就诊的24例患者。男12名,女12名;年龄为12～16岁,平均13.8岁。要求身体健康,无其他系统性疾病,积极配合者。按照所加力值的大小,随机分为4组:A组0 g力组(对照组),B组75 g力组(轻力组),C组150 g力组(中度力组),D组300 g力组(重力组),每组6人。

1.2 正畸矫治器的安置和加力

每位患者均安置直丝弓矫治器,第一磨牙粘着带环,0.016英寸直径不锈钢圆丝结扎尖牙托槽。以磨牙为支抗,用钛镍拉簧拉尖牙向远中,力值分别为0、75、150和300 g。

1.3 龈沟液的收集及保存

嘱患者生理盐水漱口,放置开口器,以无菌棉球擦干实验牙颈部,棉卷隔湿,轻轻以气枪吹干牙面及周围牙龈黏膜,将事先置于无酶EP管内的滤纸条取出,轻轻插入实验牙远中龈沟内,遇轻微阻力即停止或不超过1 mm,在龈沟内保留1 min后取出,将其放入EP管中,送-70℃冰箱冷冻保存。按照以上方法分别于加力0、1、2、3、4、5和6 h依次取样。待样本取全后一次性检测。

1.4 MMP-1、TIMP-1含量测定

采用ELISA法试剂盒检测。使用R&D(R&D Research,USA)公司试剂,单位为ng/mL,酶标仪电脑分析系统:ELX808(USA),严格按说明书进行。

1.5 统计学处理

实验数据采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析,数据用表示,采用重复测量的两两比较方法——Bonferron法,比较不同力值加力前及加力后各时间点GCF中MMP-1、TIMP-1含量的变化。α=0.05,P<0.05差异有显著性。

2 结果

2.1 不同正畸力作用下GCF中MMP-1浓度的变化

以加力前GCF中MMP-1的平均浓度水平为基准,轻力组和中度力组MMP-1在加力后的浓度变化规律一致,具时间依赖性:加力后1 h开始升高,2h时持续升高,3 h时明显增高,并达到高峰,4 h时开始下降(P<0.05,0.01),5 h和6 h时恢复至加力前水平(P>0.05);而重力组MMP-1的浓度在加力前后未出现明显变化,差异无显著性(P>0.05),见表1和图1。

2.2 不同正畸力作用下GCF中TIMP-1浓度的变化

以加力前GCF中TIMP-1的平均浓度水平为基准,轻力组和中度力组TIMP-1在加力后的浓度变化规律一致,具有时间依赖性:在加力后1 h升高(P<0.05),3 h达高峰(P<0.01),4 h时开始下降,5 h和6 h时停止下降,维持在高于加力前的水平(P<0.05);而重力组TIMP-1浓度在加力后1 h明显增高(P<0.01),3 h时停止升高,4、5和6 h时持续维持在较高水平(P<0.01),见表2和图2。

注:1)与A组比较,P<0.05;2)与A组比较,P<0.01;3)与0 h比较,P<0.05;4)与0 h比较,P<0.01

注:1)与A组比较,P<0.05;2)与A组比较,P<0.01;3)与0 h比较,P<0.05;4)与0 h比较,P<0.01

3 讨论

牙周组织包括牙龈、牙周膜、牙槽骨、牙骨质,共同构成一个功能系统,其成分主要由细胞和细胞外基质组成。正畸牙周组织改建是一个复杂的生物学过程,其具体的细胞生物学机制尚不清楚。有研究表明[3]:在正畸矫治过程中,机械力引起的牙周组织深部的改变会导致龈沟液成分表达水平的变化。而机械力是启动牙周细胞生理反应,导致正畸牙齿移动的前提和关键,不同大小的作用力影响着正畸牙牙周组织改建的速度和方式。MMP-1和TIMP-1在维护ECM稳态及其代谢过程起着极其重要的作用。MMP-1属于胶原酶之一,是第一个被定性的基质金属蛋白酶,可表达于成纤维细胞、角质细胞、内皮细胞、单核巨噬细胞、成骨细胞和软骨细胞。MMP-1无胞内贮存,受刺激后由细胞临时合成释放,故在正常休眠组织中MMP-1表达量极少,一般难以检测,但在病理情况下如创伤愈合、修复或重塑过程中,MMP-1表达量增加[4]。MMP-1作用底物广泛,可降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ和Ⅹ型胶原明胶及蛋白多糖,有关研究表明[5]:MMP-1在牙周组织改建过程中起重要作用,启动胶原分解的过程。具体表现为:(1)MMP-1可直接降解ECM中纤维胶原的三螺旋结构,使纤维胶原对热不稳定,在生理温度下就可发生变性,随后被MMPs家族其他成员进一步降解。(2)MMP-1还可通过分解作用将细胞外基质中贮存的生物活性分子释放出来,使其发挥功能。在生理状态下,MMPs与TIMPs之间保持着一种动态平衡,协调ECM降解与重建,维持组织结构的完整和内环境的稳定。近年来有关应力作用对MMP-1及其抑制剂TIMP-1表达变化影响的研究较多,但大多局限于细胞实验和动物实验。M REDICH[6]通过人工培养牙龈成纤维细胞的体外实验表明,在压力作用下细胞较正常时表达较低水平的MMP-1mRNA。AL BOLCATO-BELLEMIN等[7]学者研究发现,以20 kPa持续12 h的牵张力作用于人牙周膜成纤维细胞和牙龈成纤维细胞时,发现可以诱导MMP-1、MMP-2、TIMP-1和TIMP-2的m RNA编码。以上实验提示机械信号是MMPs、TIMPs合成和释放的一个刺激因素。CARA-NO[8]发现牙周膜细胞在周期性张应力作用4 d后,MMP-1的量增加了一倍,而在持续性张应力作用下,MMP-1的量仅增加了50%,说明应力的大小、时间、作用方式对MMPs的产生有不同的影响。在动物实验研究方面,M REDLICH[9]的狗体内实验表明,压力和张力都可以导致MMP-1的m RNA水平和其活性的明显上升。随着力的使用,MMP-1mRNA表达的调节和酶活性的上升都具有时间依赖性。

在不同正畸力作用下人MMP-1/TIMP-1的调节随时间改变将会出现怎样的变化,从而对牙周组织的改建产生影响,这类研究在临床方面国内尚未见报道。本研究筛选24例经过减数拔牙的固定正畸患者为研究对象,应用ELISA实验方法检测在不同正畸力作用前后MMP-1和TIMP-1在龈沟液中的表达和变化趋势,结果发现:在不同正畸力作用下,MMP-1和TIMP-1的浓度随时间和作用力的大小出现了不同的变化,这种变化体现了外力以及不同外力刺激对MMP-1/TIMP-1表达的影响和TIMP-1对MMP-1的抑制作用。

在轻力组和中度力组,加力后GCF中MMP-1的表达在1、2、3和4 h时均高于加力前水平(P<0.05),同对照组相比具差异有显著性(P<0.05);说明适宜的作用力可能通过上调MMP-1的表达,诱发牙周组织的改建而加速正畸牙的移动。尽管在加力后各时间点TIMP-1的表达与之相似,但不足以抵抗MMP-1的作用。而重力组TIMP-1的浓度在正畸加力后1 h便出现明显增高,并且在以后的3～6 h内均维持在一个较高水平,MMP-1的浓度在正畸加力前后未出现明显变化。因此,受力牙牙周组织未能顺利改建,牙齿矗立不动。这可能正是临床牙齿受力过大,反而不易移动的原因。MMP-1和TIMP-1在牙齿受力后发生的这种不对称变化,提示MMP-1和TIMP-1的失衡在正畸牙齿移动早期参与牙周组织的改建,是牙周组织改建的始动因子之一。但其诱发下游反应的确切机制尚待进一步研究。

参考文献

[1]MEIKLE MC,HEMBRY RM,HOLLY J,et al.Immunolocaliza-tion of matrix metalloproteinases and TIMP-1(tissue inhibitor of metalloproteinases)in human gingival tissues from periodontitis patients[J].J Periodont Res,1994,29(2):118-126.

[2]LU Q,ZHOU XD,CAO J,et al.The expression of MMP-1,COX2induced by IL-1βin human dental pulp cells[J].J Pract Stomatol,2004,20(4):434-436.Chinese

[3]SAMUELS RH,PENDER N,LAST KS.The effects of orthodon-tic tooth movement on the glycosaminoglycan components of gin-gival crevicular fluid[J].J Clin Periodontol,1993,20(5):371-377.

[4]BRINCKERHOFF CE,MATRISIAN LM.Matrixmetallo proteinas-es:a tail of a frog that became a prince[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2002,3(3):207-214.

[5]DOMON S,SHIMOKAWA H,MATSUMOTO Y,et al.In situ hybridization for matrix metalloproteinase-1and cathepsin K in rat root-resorbing tissue induced by tooth movement[J].Arch Oral Biol,1999,44(11):907-915.

[6]REDLICH M,PALMON A,ZAKS B,et al.The effect of cen-trifugal force on mRNA levels of collagenase,collagen type-Ⅰ,tissue inhibitors of metalloproteinases and beta-actin in cultured human periodontal ligament fibroblasts[J].J Peridontal Res,2004,39(1):27-32.

[7]BOLCATO-BELLEMIN AL,ELKAIM R,ABEHSERA A,et al.Expression of mRNAs encoding forαandβintegrin subunits,MMPs and TIMPs in stretched human periodontal ligament and gingival fibroblasts[J].J Dent Res,2000,79(9):1712-1716.

[8]CARANO A,SICILIANI G.Effect of continuous and intermittent force on human fibroblasts in vitro[J].Eur J Orthod,1996,18(1):19-26.

金属蛋白酶抑制剂-1 篇3

关键词：过敏性紫癜性肾炎,金属蛋白酶组织抑制物-1,ELISA 双抗体夹心法,肾损害

过敏性紫癜性肾炎 (Henoch-Schonlein purpura nephritis, HSPN) 是继发于过敏性紫癜的肾脏损害, 是造成儿童慢性肾损害的常见原因之一。病理改变以全身性小血管损害及肾小球系膜病变为主, 国际儿科肾脏病学会 (ISKDC) 推荐的诊断标准因更适用于临床而被广泛应用, 临床常见急进性肾炎及肾病综合症, 以血尿、蛋白尿为主要表现, 可伴高血压和肾衰竭。目前国内外临床深入研究紫癜性肾炎的发病机理, 预防慢性肾功能衰竭的发生, 已取得一定成果, 前瞻性看好。研究发现:HSPN患者肾小球细胞外基质 (extracelluar matrix, ECM) 的质和量的变化, 在肾脏纤维化过程中起了非常重要的作用。而金属蛋白酶组织抑制物 (tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs) 是其特异的抑制剂;其中广泛存在于组织和体液中的TIMP-1, 在肾脏纤维化中, 对细胞外基质及肾脏细胞凋亡有控制作用[1]。目前肾小球疾病临床多采用抗凝、促纤溶、免疫等方法治疗, 疗效并不十分满意。多项研究表明通过阻断TIMP-1的表达或抑制其活性, 抑制系膜细胞增殖和ECM合成, 防止肾小球纤维化, 可能为防止或减缓肾功能减退提供一个新手段。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取符合HSPN诊断标准的患者42例为试验组, 其中男25例, 女17例;年龄6~55岁, 平均 (24.50±13.59) 岁;病程6个月~10年。经肾穿刺活组织病理检查, 其中:Ⅰ级7例, 男5例, 女2例, 年龄6~16岁, 平均10.4岁;Ⅱ级11例, 男7例, 女4例, 年龄16~32岁, 平均21.3岁;Ⅲ级5例, 男2例, 女3例, 年龄19~39岁, 平均24.6岁;Ⅳ级6例, 男4例, 女2例, 年龄24~42岁, 平均32.1岁;Ⅴ级5例, 男2例, 女3例, 年龄28~46岁, 平均34.3岁;Ⅵ级8例, 男5例, 女3例, 年龄32~55岁, 平均38.5岁。健康对照组14例, 男8例, 女6例, 年龄16~38岁, 平均32.5岁, 均为健康志愿者。各组研究对象的年龄、性别比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2诊断标准

有过敏性紫癜病史, 或有典型的紫癜, 双下肢外侧及臀部对称分布的出血性皮疹伴荨麻疹, 伴或不伴有关节疼痛;病程在6个月内, 有轻重不等的血尿或蛋白尿;排除Ig A肾病和其他继发性肾脏疾病。

1.3 肾脏病理诊断

在超声科协助下超声引导定位, 采用经皮肾穿刺活检术, 应用16 G活检针经皮穿刺获得肾组织, 送病理检查。病理分类按ISKDC推荐的诊断标准[2]。Ⅰ级:无异常;Ⅱ级:单纯性系膜增生, a:局限性, b:弥漫性;Ⅲ级:系膜增生伴新月体形成<50%, a:局限性, b:弥漫性;Ⅳ级:系膜增生伴新月体形成50%~75%;Ⅴ级:系膜增生伴新月体形成>75%, a:局限性, b:弥漫性;Ⅵ级:系膜毛细血管性肾炎。

1.4 检测方法

(1) 实验方法采用ELISA双抗体夹心法 (检验室采用试剂由英国Biotra公司提供的TIMP-1、human、ELISA系统;试剂缓冲液选用磷酸盐缓冲液浓缩物) 。实验室人员采取患者和健康自愿者空腹血 (外周血5 m L) 置于实验试管内, 室温自然凝固10~20 min后, 离心20 min, 收集上清液, 按要求分别放置在-20℃冰箱中备用。然后将已溶解的各组血清, 严格参照有关文献[3-4]及试剂说明书执行有关操作。 (2) 采用ELISA双抗体夹心法反应, 获取在标准曲线对照范围内的OD值, 并由OD值和标准曲线应用计算机计算出相应的TIMP-1值。健康人TIMP-1含量正常值按平均1206 ng/m L参考。

1.5 统计学处理

应用SPSS 17.0统计学软件对数据进行处理, 计量资料以 (±s) 表示, 比较采用单因素方差分析和q检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

试验组Ⅱ~Ⅵ级血清中TIMP-1水平较对照组显著增高 (P<0.05) , Ⅲ~Ⅵ级血清中TIMP-1水平较Ⅱ级组显著增高 (P<0.01) , 而Ⅰ级血清中TIMP-1水平与对照组比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。

3 讨论

本文旨在探讨HSPN患者血清中TIMP-1水平变化与肾小球细胞间质纤维化严重程度的关联, 意在提醒临床医生在治疗HSPN患者时应注意到相关因素, 采取相应治疗新措施, 以减少终末肾病的发生几率。研究表明TIMP-1广泛分布于组织和体液中, 它是一种多功能的细胞因子, 不仅能通过抑制MMP而ECM的降解, 其活性的变化在一定程度上决定着ECM的积聚[5]。而且对细胞生长、增殖及多种细胞的凋亡有重要作用。另外, TIMP-1还是一种能刺激各种细胞生长的因子, 许多肾外疾病的研究发现, 它还与肿瘤细胞的生长密切相关[6,7,8]。TIMP-1的生成与活性发挥亦受多种细胞因子的调节, 在原发和继发性肾脏疾病中TIMP-1表达明显增加, 提示TIMP-1在肾脏纤维化发展进程中发挥了重要的刺激作用。

研究证明, 正常的ECM主要位于肾小球毛细血管袢基膜和系膜区, 肾小球毛细血管袢基膜区含有丰富的IV型胶原, 基质金属蛋白酶系统 (MMPs) 表达异常致IV型胶原合成和降解失衡, 肾小球基膜损伤, 致使ECM大量堆积[9]。而ECM的大量积聚引起的肾小球硬化与间质纤维化是多种肾病发展至终末期肾功能衰竭的共同病理表现, 这一致病过程的生理变化尚在研究之中。研究发现肾间质纤维化对肾功能的影响较肾小球病变更为重要, 因而被用做衡量慢性肾脏疾病进展的重要指标之一。而肾间质成纤维细胞的增殖活化是肾间质纤维化发生和维持的主要因素之一[10,11]。以往对ECM堆积的原因研究主要集中于ECM如何合成增加方面, 而忽视了ECM降解酶系统异常在此生理过程中有同样重要的作用。近年来研究ECM降解在肾脏硬化中的作用及其调控机制已成为重点课题。

MMPs是参与肾脏细胞外基质降解的主要酶类, TIMP-1是其抑制剂。正常状态下, TIMP-1与MMP-9在血清或组织液中的比例是平衡的, 笔者用ELISA双抗体夹心法发现TIMP-1在Ⅲ~Ⅵ级HSPN患者血清中水平显著增高, 提示随着系膜细胞、系膜基质的增加及纤维化的加重, 肾脏固有细胞分泌MMP-9和TIMP-1水平失衡, 导致ECM异常堆积, 基底膜Ⅳ型胶原降解减少, 基底膜网络状结构破坏重塑, 肾小球结构重叠, 蛋白尿形成等病理变化, 直至肾功能损害。

本文初步探讨TIMP-1在HSPN中的水平变化及其与肾功能损害的关联。通过对HSPN不同病理分级中TIMP-1的表达与活性变化的检测, 笔者发现HSPNⅡ~Ⅵ级患者血清中TIMP-1水平较对照组显著增高, Ⅲ~Ⅵ级较Ⅱ级组显著增高, Ⅰ级与对照组比较无明显差异。目前已经认识到治疗肾小球疾病除常规治疗外, 抑制系膜细胞ECM合成和阻断TIMP-1的表达或抑制其活性, 是将来治疗肾脏纤维化的一个新手段。有研究者发现某些西药与中药具有一定的调节细胞外基质降解酶系统的作用, 如鳖甲煎丸及缬沙坦药物血清具有抑制正常培养条件及脂多糖刺激条件下TIMP-1表达的作用, 这可能是其延缓肾小球硬化的部分作用机制[12]。更多研究发现肽类或核酸药物对干预细胞外基质降解酶的活性和表达有其特异性, 可能为今后治疗肾脏疾病减轻肾脏纤维化开辟一条新的途径。

金属蛋白酶抑制剂-1 篇4

关键词：脊柱炎,强直性/针灸疗法,基质金属蛋白酶3/针灸效应,基质金属蛋白酶组织抑制因子/针灸效应,长蛇灸,人类

强直性脊柱炎(AS)是一种以骶髂关节和中轴关节慢性炎症为主的、原因不明的自身免疫性疾病,以侵犯脊柱为主,早期表现为滑膜炎和韧带附着点的病变。滑膜炎典型表现为滑膜细胞肥大和滑膜增生,有明显的淋巴细胞和浆细胞浸润,附着点的病变过程是以关节囊、肌腱、韧带的骨附着点为中心的慢性炎症。这两种病理过程都是间质成分被水解蛋白酶消化的过程,在此过程中,基质金属蛋白酶(MMPs)和金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)两个酶系统的作用尤为重要。近几年,笔者采用长蛇灸治疗强直性脊柱炎取得了较好的疗效,为了探讨其可能作用机理,观察了长蛇灸对AS患者血清MMP-3和TIMP-1水平的影响,现报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料

60例患者均来源于2008-05～2010-03本院门诊和住院病人,符合强直性脊柱炎诊断标准。按就诊顺序,查随机数字表,分为2组。治疗组30例,其中男26例,女4例;平均年龄(29.7±13.5)岁;平均病程(7.3±5.8)年。对照组30例,其中男27例,女3例;平均年龄(31.2±12.8)岁;平均病程(7.1±6.3)年。两组患者性别、年龄、病程、病情基本一致,经统计学处理,无显著差异(P>0.05),具有可比性。

1.2 诊断标准

参照1984年修订的纽约标准[1]。(1)临床标准:①下腰痛至少三个月,活动后可减轻,休息无缓解。②腰椎前屈、后伸、侧弯活动受限。③胸廓活动度较同年龄、同性别的正常人减少。(2)放射学标准:单侧骶髂关节炎≥3级或双侧骶髂关节炎≥2级。符合放射学标准和一项以上临床标准即可诊断。

1.3 纳入标准

(1)符合上述强直性脊柱炎诊断标准;(2)年龄在12岁以上的患者;(3)非妊娠或哺乳期妇女;(4)保证配合治疗,完成全部疗程的患者。

1.4 排除标准

(1)年龄在12岁以下的患者;(2)晚期脊柱强直或驼背固定,X线显示骶髂关节融合,脊柱呈竹节样改变的患者;(3)凡伴有发热,四肢关节红肿热痛,目赤肿痛或眩晕耳鸣,盗汗,手足心热的患者(即中医辨证分型为湿热痹阻证或肝肾不足证)不纳入治疗组;(4)精神病患者;(5)恶性肿瘤患者;(6)有结核或其他传染性疾病患者;(7)皮肤有严重破损或有皮肤过敏者或有严重皮肤病患者;(8)妊娠期或哺乳期女性患者;(9)未能按照实验计划完成治疗过程者。

2 方法

2.1 治疗用药

治疗组:采用长蛇灸治疗。操作方法:取大蒜(约500g)捣烂成泥及艾绒适量备用。患者俯卧,裸露背部,将脊柱及两侧皮肤(督脉及膀胱经)常规消毒后,在督脉大椎穴至腰俞穴涂上蒜汁,铺敷7cm宽、1.25cm厚的蒜泥,再将斑蝥粉3g、白芍粉10g、川乌粉10g、细辛粉10g沿督脉铺于蒜泥之上,然后铺长蛇形艾绒1条(约1cm宽、1cm厚),点燃头、身、尾3点,让其自行燃烧。燃烧过程中以患者有烧灼感为度,根据燃尽情况中间可适当添加艾绒。每次铺灸30分钟;灸毕,移去蒜泥与艾绒,用湿纱布轻轻将皮肤揩干;灸后局部皮肤出现微红灼热,属正常现象,无需处理;如局部出现水泡,可用消毒针刺破水泡放出渗液,并用药棉揩干,再涂以烫伤油,并以纱布包敷。隔日换药1次,直到结痂脱落;每周治疗1次,6次为1疗程,连续治疗两个疗程。对照组:采用西药口服治疗。口服柳氮磺胺吡啶(武汉同兴科技有限公司),1g/次,每日2次,严重者,配合非甾体抗炎药口服,连续用药3个月。

2.2 观测指标与检测方法

分别于治疗前和治疗后取空腹静脉血4ml,分离血清,置于-75℃保存待测。采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行MMP-3与TIMP1的检测。

2.3 统计学处理

实验检测数据用undefined表示,采用SPSS 17.0进行t检验。

3 结果 见表1。

与治疗前比较*P<0.05,**P<0.01;与对照组比较△P<0.05,△△P<0.01

4 讨论

MMPs是一组可降解细胞外基质的锌依赖性内肽酶,根据底物的不同,MMPs主要分胶原酶、基质溶解酶、明胶酶和膜型基质金属蛋白酶。MMP-3属于基质溶解酶,是对基质起广泛作用的一种蛋白酶,MMP-3由成纤维细胞、滑膜细胞和软骨细胞分泌,被认为是导致软骨降解的最重要的蛋白酶[2]。有资料表明[3],AS患者血清中MMP-3水平与其自身疾病活动性存在一定程度的相关性,可作为评估AS病情活动的另一个客观指标。金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)是组织中MMP活性的抑制分子,分为两个功能区,其N端功能区的半胱氨酸残基与MMP的锌离子活性中心结合,其C端功能区与MMP的其他部位结合,形成MMP-TIMP复合体,从而阻断MMP与底物结合,抑制MMP的活性。TIMP-1由巨噬细胞和结缔组织细胞产生,广泛存在于组织和体液中,能被多种细胞因子诱导产生,TIMP-1主要结合抑制活化的MMP-9和MMP-3。

长蛇灸是在督脉的脊柱段上施以艾灸的一种传统的中医外治法,集督脉、艾灸、中药、蒜泥的治疗作用于一体,发挥温肾壮骨、补精益髓、温通经络、活血化瘀等功效,其对缓解AS有显著疗效[4,5]。斑蝥粉药性温热,芳香走窜,通过热力能使药物直达病所,并有破血消癥、攻毒蚀疮、引赤发泡之功;白芍可以养血敛阴、柔肝止痛、平抑肝阳;川乌祛风除湿、温经止痛;细辛解表散寒、祛风止痛;艾灸温经通络、行气活血、补虚壮阳。现代药理研究表明[6],白芍、细辛、艾灸有调节免疫作用,且白芍、细辛、川乌还有抗炎作用。

本研究结果表明,长蛇灸能降低AS患者血清MMP-3水平,升高TIMP-1水平,调节MMP/TIMP平衡,减少致炎因子的释放,调整异常的基质降解和减少血管形成等炎症的病理因素,缓解AS炎症、减少软骨和骨质破坏,降低致残率,提高患者的生活质量。

参考文献

[1]张乃峥.临床风湿病学.上海:上海科学技术出版社,1999:165.

[2]Xie DL,Hui F,Meyers R.Cartilage chondrolysis by fibronectin fragments is associated with several proteinases;stromelysin plays a major role in chondrolysis.Arch Biochem Biophys,1994,311:205.

[3]申明.基质金属蛋白酶与强直性脊柱炎.临床医药实践杂志,2006,15(11):805.

[4]曾庆利,陈春明,李胜利.华佗夹脊辅以督脉敷灸治疗强直性脊柱炎32例疗效观察.四川中医,2006,24(12):98.

[5]吴建军,戚玲娟.走罐加针灸治疗强直性脊柱炎18例.中国中医药科技,2009,16(3):219.

金属蛋白酶抑制剂-1 篇5

关键词：四环素,动脉粥样硬化,斑块,基质金属蛋白酶-2

动脉粥样硬化斑块的不稳定性使斑块易于破裂、出血和血栓形成是导致急性冠脉综合征的主要原因。近年研究发现,动脉粥样硬化斑块的稳定性与斑块表面纤维帽的厚度和脂核的大小密切相关,纤维帽的厚度与脂核厚度的比值越大,斑块的稳定性越高,反之稳定性越小[1]。基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)是一种酶活性Zn2+依赖性肽链内切酶,它们能降解所有的细胞外基质成分,包括纤维帽的纤维组织。MMPs的表达和活性增强,促进纤维帽的降解使其变薄,是引起动脉粥样硬化斑块不稳定性的重要原因之一[2]。国外的研究表明,MMPs抑制剂可以抑制动脉粥样硬化的血管重构,而国内至今未见报道。四环素是一种非选择性MMPs抑制剂,本研究旨在观察四环素对兔动脉粥样硬化组织中MMP-2活性和表达的影响,探讨其对动脉粥样斑块稳定性的作用。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

胆固醇(上海生物化学试剂总公司),四环素(昆明制药集团股份有限公司),兔抗MMP-2多克隆抗体,SP免疫组化检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 仪器与设备

HIMAC SCR20B/18B日立高速冷却离心机(日本日立公司),DYY-8B型稳压稳流电泳仪和DYCZ-21型电泳槽(北京市六一仪器厂),凝胶成像扫描仪扫描分析,DM4000B Leica显微摄像仪(德国莱卡公司),Mivnt显微图象分析软件。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组:

30只雄性新西兰白兔,体重2.0～2.5kg/只,随机分为正常组(n=10)、模型组(n=10)和四环素组(n=10)。分别喂正常饲料、高胆固醇饲料、高胆固醇饲料,加四环素250mg·d-1·只-1。饲养12w后处死,取出降主动脉分成两份,一份置于10%的中性甲醛溶液中固定,另一份置于液氮中保存。

1.3.2 酶谱法(Zemography)测定动脉组织基质金属蛋白酶-2活性:

用SDS-PAGE电泳方法测定动脉组织基质金属蛋白酶-2活性:取500mg动脉组织,加入组织提取液(Tris-HCl 0.1mol/L,PH 7.6,NaCl 20mmol/L,CaCl 210mmol/L,0.01%TritonX-100) 1ml,4℃下匀浆、离心,取上清液,用酚试剂改良法测定蛋白浓度。按文献方法,制作含0.01%明胶的分离胶,作为明胶酶的水解底物,然后,上样→电泳→洗脱→孵育→0.05%考马斯亮蓝R-250染色→脱色至背景清晰。用凝胶成像扫描仪扫描分析。计算出正常组、模型组和四环素组62kD(MMP-2)泳带的条带面积和条带灰度值,结合蛋白质含量计算出比活性,即比活性=(条带面积×条带灰度值)/蛋白质含量。

1.3.3 动脉标本Masson’s三色染色和HE染色,评价动脉粥样硬化斑块稳定性:

麻醉后剖开兔的胸腔,用生理盐水置换出动脉血,以10%中性甲醛恒压灌注,取出降主动脉,用10%的中性甲醛固定24h,常规石蜡包埋、切片(厚4～5μm),Masson’s三色染色和HE染色,应用计算机Mivnt显微图象分析软件分别测出动脉粥样硬化斑块组织纤维帽厚度、脂质池厚度、纤维帽面积及脂质池面积。计算斑块纤维帽厚度与脂质池厚度的比值和脂质池面积与纤维帽面积的比值。评价动脉粥样硬化斑块的稳定性。

1.3.4 免疫组织化学法:

应用免疫组织化学SP法检测动脉组织中MMP-2的表达,具体步骤参照试剂盒说明书。每只动物取2张切片,每张切片动脉中层和内膜各取5个200倍视野,用Mivnt显微图象分析软件分析灰度值,取其平均值,灰度值随MMP-2表达量的增多而减小。镜下观察细胞胞浆出现棕黄色颗粒为阳性。

1.3.5 统计分析:

数据以均数()±标准差(s)表示,用SPSS 11.5统计软件,三组间均数的比较采用方差分析,两组间的比较应用t检验,P<0.05为有统计学意义,P<0.01为有显著性差异

2 实验结果

2.1 动脉组织内MMP-2活性的测定(见图1)

动脉组织SDS-PAGE电泳所得蓝色背景下,分子量为62kD处有1条白色的消化条带灰度值从0到255共分为256个等级,明胶电泳消化条带越亮,则灰度值越大,反之,则灰度值越小。

箭头所指处的蛋白质分子量为62kD,1～2泳道是正常组,3～4泳道是四环素组,5～6泳道是模型组。

2.2 动脉粥样硬化斑块稳定性评估

病理图象分析显示,模型组和四环素组动脉中层平滑肌变薄,内膜明显增厚,内弹力板被降解、中断甚至消失(见图2A～2B)。四环素组内膜厚度略小于模型组,但二者差异无统计学意义(P>0.05);动脉粥样硬化斑块纤维帽和脂质池厚度也无差异(P>0.05),但两组间纤维帽和脂质池厚度及纤维帽和脂质池面积的比值有显著差异性(P<0.01)。

动脉内膜明显增厚,斑块纤维帽由平滑肌细胞及胶原纤维构成。

动脉内膜明显增厚,斑块纤维帽较薄,其内胶原纤维含量较少。

2.3 免疫组织化学法检测MMP-2蛋白表达

正常组动脉组织MMP-2表达为阴性,模型组和四环素组,内膜细胞特别是单核巨噬细胞内MMP-2较中层平滑肌明显增多,MMP-2染色阳性率达100%(见图3A,3B,3C),Mivnt显微图象分析软件分析灰度值(见表3),三组之间中层灰度值差异无统计学意义(P>0.05),而内膜灰度值差异具有统计学意义(P<0.05),提示粥样斑块组织内MMP-2的表达明显升高。四环素抑制粥样斑块内MMP-2的表达。内膜粥样斑块中的单核巨噬细胞内阳性染色最强,而炎症细胞浸润区域内明显增强,表明为炎症细胞具有很强的产生MMP-2的作用。

注:a.与正常组相比较,P<0.01;b.与模型组相比较P<0.01。

动脉组织Masson’s三色染色结果:胶原纤维呈蓝色,平滑肌细胞呈红色,弹力纤维呈棕色,细胞核呈黑蓝色。正常动脉组织内膜平滑光整,只见一层很薄的内皮细胞,内弹力薄膜完整。

内膜细胞MMP-2表达量较模型组明显减少,MMP-2染色阳性率64%,中层动脉平滑肌MMP-2表达为阴性。

内膜细胞特别是单核巨噬细胞内MMP-2染色阳性率达100%,炎症细胞浸润区域明显增强。

3 讨论

近年的研究显示,动脉粥样硬化斑块中MMPs的表达和活性明显升高[3],本研究结果与文献报道相似,发现四环素组和模型组的动脉粥样硬化组织中,MMP-2酶的表达和活性明显高于对照组。MMP-2酶是一种明胶酶,能降解动脉内皮细胞基底膜的主要成分Ⅳ型胶原,使内膜的通透性增加,导致低密度脂蛋白沉积以及巨噬细胞和单核细胞渗入。巨噬细胞吞噬低密度脂蛋白后形成泡沫细胞,此外,巨噬细胞和单核细胞产生许多细胞因子,促进平滑肌细胞增生、迁移,从而导致动脉粥样硬化的发生、发展[4]。因此,MMP-2在动脉粥样硬化的形成和发展中可能起着重要的作用。

四环素作为一种非选择性MMP抑制剂,它能与MMP催化结构域的Zn2+部位结合,使基质金属蛋白酶失活。国外研究表明,四环素可抑制MMP活性及表达[5]。国内的研究也指出,四环素和强力霉素通过抑制MMP-2酶的活性和表达,抑制实验动物腹主动脉瘤的形成和发展[6,7]。但四环素对动脉粥样硬化斑块及其稳定性的影响,目前国内外均未见报道。本研究结果显示,四环素组MMP-2酶的活性及表达比模型组明显降低,表明四环素对MMP-2酶的活性及表达有明显的抑制作用。四环素对动脉粥样硬化血管的内膜和中层厚度,以及对粥样硬化斑块纤维帽和脂质池厚度的影响,与模型组相比较,虽然没有显著性差异,但进一步研究发现,血管内膜厚度与中层厚度的比值(内膜厚度/中层厚度)和内膜面积与中层面积的比值(内膜面积/中层面积)明显小于模型组;而纤维帽厚度与脂质池厚度的比值(纤维帽厚度/脂质池厚度)和纤维帽面积与脂质池面积的比值(纤维帽面积/脂质池面积)明显大于模型组,提示四环素对动脉粥样硬化的血管重构和斑块的稳定性有明显作用。四环素可能通过抑制MMP-2酶的活性和表达,抑制血管内壁细胞基底膜和粥样斑块纤维帽的降解而发挥作用。

参考文献

[1] Zorina S.,Galis.Vulnerable Plaque.Circulation,2004;110(3):244 -246

[2] Galis ZS,Khatri JJ.Matrix Metalloproteinases in Vascular Remodeling and Atherogenesis.Circulation Research,2002;90(3):251～262

[3] Molloy KJ,Thompson MM,Jones JL,et al.Unstable Carotid Plaques Exhibit Raised Matrix Metalloproteinase-8 Activity.Circulation,2004; 110(3):337～343

[4] Jason L,Johnson,Andrew H,et al.Suppression of Atherosclerotic Plaque Progression and Instability by Tissue Inhibitor of Metalloprotein- ase-2.Circulation,2006;113(20):2435～2444

[5] Reddy HK,Tjahja IE,Campbell SE,et al.Expression of matrix mentallo- proteinase activity in idiopathic dilated cardiomyopathy:a marker of car- diac dilatation.Mol Cell Biochem,2004,264(1-2):183～191

[6]赵新，景在平，熊江，等．四环素抑制实验性大鼠腹主动脉瘤形成的初步研究．中华普通外科杂志，2002；17(11)：663～665

金属蛋白酶抑制剂-1 篇6

1 资料与方法

1.1 病例选择

选择2008年8月~2009年8月在我院住院的产妇 (总数2 422例) 因各种因素行剖宫产者15例作为正常组, 平均年龄 (27±4) 岁, 平均孕周 (38.9±1.8) 周;ICP患者15例, 平均年龄 (28±6) 岁, 平均孕周 (37.4±1.1) 周。对2组年龄、孕周进行比较, 均无显著性差异 (P>0.05) 。

1.2 标本采集

2组剖宫产术中胎盘娩出后即刻取胎盘母面组织1 cm×1 cm×1 cm, 以甲醛固定备检。

1.3 实验试剂

实验试剂有MMP-9兔抗人单克隆抗体、MMP-2兔抗人单克隆抗体、TIMP-1兔抗人单克隆抗体、TIMP-2兔抗人单克隆抗体、相应二抗及B液, 抗体释液均购自北京中衫金桥生物技术有限公司。

1.4 实验方法

病理光镜观察比较其组织及形态。每份标本HE染色和免疫组织化学染色均取3张切片。实验标本均经10%甲醛固定, 石蜡包埋, 4微米切片, HE染色。免疫组织化学染色采用SP法。

1.5 阳性结果判定

标本镜下细胞有棕黄色颗粒沉着视为阳性反应。应用免疫组织化学SP法检测胎盘组织中MMP-9、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2的阳性表达强度, 与背景大致相同, 无阳性细胞为 (-) , 记0分;胞浆内可见少量棕黄色颗粒, 显著高于背景, 阳性细胞百分率<25%为 (+) , 记1分;胞浆内可见较多棕色颗粒, 阳性细胞百分率25%~50%为 (++) , 记2分;胞浆内可见大量棕色颗粒, 阳性细胞百分率>50%为 (+++) , 记3分。

1.6 统计处理

应用SPSS 11.0统计软件分析系统。结果以x±s表示, 2组均数间进行t检验。

2 结果

光镜观察结果为:胎盘组织切片HE染色后光镜观察发现, 正常妊娠胎盘组织结构清楚, 胎盘绒毛、绒毛间腔、胎盘小叶间腔、蜕膜细胞及蜕膜血管清晰可见。胎盘小叶血管周围为间质和菱形细胞, 蜕膜细胞肥大, 是椭圆形或多边形。胞浆丰富, 有空泡形成, 核卵圆居中, 呈蓝色。ICP胎盘绒毛间腔狭窄, 绒毛有明显水肿, 绒毛血管合体膜增厚, 蜕膜细胞似乎也较正常更肥大。

结果显示, 胎盘MMP-9、MMP-2的阳性表达ICP组高于正常组, 有显著性差异 (P<0.05) , 胎盘TIMP-1、TIMP-2的阳性表达ICP组低于正常组, 有显著性差异 (P<0.05) 。

3 分析与讨论

细胞外基质是细胞生存的重要内环境, MMP是降解细胞外基质的重要酶类。在正常稳定状态的组织中MMP表达量极少, 而在涉及人体多种生理和病理过程如胚胎发生、肿瘤侵袭转移时其表达上升。TIMP是MMP的天然抑制剂, 通过对MMP的抑制, 在正常细胞外基质改建和各种病理过程中发挥作用。MMP-2、MMP-9同属明胶酶类, TIMP-1、TIMP-2均为可溶性分泌蛋白。一般认为, TIMP与活化的MMP结合产生作用, 但TIMP-2可与潜在的MMP-9结合, TIMP-1可与潜在的MMP-2结合。MMP与TIMP在体内维持细胞外基质降解平衡中起主要作用。

近年来, 母胎界面理论逐渐被多数学者所关注。在妊娠过程中, 胚胎滋养细胞侵入到母体蜕膜, 并侵入其中的螺旋动脉, 替代血管内皮细胞, 建立母体-胎儿的交互式循环, 为胚胎的发育提供营养。在绒毛外滋养细胞侵入母体的过程中, 细胞外基质系统MMP/TIMP发挥了重要作用。滋养层细胞对子宫蜕膜的侵入及子宫螺旋小动脉的“血管重铸”, 是胎盘建立的关键步骤, MMP是一组含有Zn2+并能降解绝大多数细胞外基质的多肽链内切酶, MMP-2和MMP-9是滋养层细胞侵入子宫内膜和胎盘形成的关键因子。

有文献报道, MMP-9、MMP-2的作用底物是Ⅳ型胶原及纤维粘蛋白 (FH) 、层粘连蛋白 (LH) , 而后2者正是子宫内膜、蜕膜基质的主要组成成分。在胚胎植入早期, MMP-2起主要作用, 当胚胎进一步向子宫肌层侵入的过程中, MMP-9起主要作用[1~2]。有研究表明, MMP-9、MMP-2及其抑制物是滋养细胞侵蚀的重要生化介质[3~4], 滋养细胞对子宫基质的侵入与肿瘤细胞浸润有许多相似之处。如果侵入行为异常即可导致妊娠相关疾病[5]。ICP胎盘中MMP-9的高表达说明绒毛外滋养细胞侵袭、异常增生在胎盘中, 从而造成绒毛间隙狭窄。

ICP患者的诸多因素可致胎儿早产、宫内窘迫、死胎、死产[6], 所有单一因素均无法完全解释胎儿出现这些并发症的原因。ICP患者在分娩过程中, 可能因为宫缩和屏气等因素, 改变了血液动力学, 影响胎盘血流, 对于临界状态的ICP患者, 狭窄绒毛间隙缺氧, 导致母胎界面供氧失调, 加上高浓度的胆汁酸血症引起胎盘绒毛血管痉挛, 使胎儿处于急性缺氧状态。剖宫产可以避免这些因素, 故应尽早结束妊娠, 使胎儿迅速脱离宫内不良环境, 降低围产儿死亡率。

本课题选择正常妊娠和ICP病例各15例, 剖宫产取胎盘, 免疫组化法测定MMP-9、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2的蛋白表达水平。结果说明, 母胎界面MMP-9、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2表达差异与比例失衡, 改变了组织的基质结构, 使滋养细胞及合体细胞增生, 绒毛间腔狭窄、水肿, 血管合体膜增厚, 可能与ICP发生、发展和不良妊娠结局有关。

参考文献

[1]Berthold H, kertschanska S.Immuahistochemistry of materir metallo-proteinase Cmmpsdariny[J].Trophoblast invasion in human placental Celltissue Res, 1998 (29) :133～148.

[2]姚强, 刘淑芸.妊娠肝内胆汁淤积症患者蜕膜功能的初步研究[D].成都:四川大学, 2004.

[3]Dong-Mok Lee, Tae-Kyun Lee, Hai-Bum Song, et al.Theexpression ofmatrix metalloproteinase-9 in human follicular fluid is associated with invitro fertilisation pregnancy[J].BJOG, 2005, 12 (7) :946～951.

[4]BISwas C, Zhang Y, De Castro R, et al.The human trmor cellderivedcollogenase stioulatory (remaned EMMPRIN) is a member of the huncle 10bulin superfnmily[J].Cance Res, 1995 (55) :34～39.

[5]王渠源, 邵艳萍, 朱凤全.基质金属蛋白酶及其抑制物在妊高征患者母胎界面的表达[J].中国妇幼保健, 2006, 21 (1) :109～110.

金属蛋白酶抑制剂-1 篇7

1 Materials and methods

1.1 Specimen collection

Surgical specimens of human ovarian tissue were obtained from January 2002 to June 2004 in the Department of Gynecology and Obstetrics of Shengjing Hospital affiliated China Medical University.A total of 69 epithelial ovarian tumors were studied,including38 EOC,16 borderline epithelial ovarian tumors,and15 benign epithelial ovarian tumors.In addition,11normal ovarian tissues were studied for comparison.All the patients with EOC did not receive preoperative radiotherapy or chemotherapy.Among the patients with EOC(6 StageⅠ,10 stageⅡ,9 stageⅢ,13stageⅣ;24 positive lymphatic metastasis,14 negative lymphatic metastasis;26 with ascites,12 without ascites).The median age of the patients was 52.1 years(ranging 18～74).All the cases were surgically staged according to FIGO criteria(2000).All the specimens were divided into two portions,for one portion pathological examination was performed after HE staining,and the other was preserved in-70℃refrigerator for further use after quick freezing in liquid nitrogen.

1.2 Major reagents

Trizol agent was bought from American Promega Company,RT-PCR kit and Taq DNA polymerase were bought from Dalian BAO Bioengineering Limited Company,MMP-9 and TIMP-1 primers were synthesized in Beijing Aoke Bioengineering Limited Company.

1.3 Methods

1.3.1 Extraction of total RNA

100 mg were taken from each freezing sample and cut into trivial portions,then 1 mL Trizol solution was added to split,total RNA was extracted using one step method according to Trizol reagent instruction,concentration and purity of RNA were determined by DNA/RNA radiometer.1.3.2 Synthesis of cDNA 2μL total RNA was taken,the followings were added in turns:10×buffer 10μL,25 mmol/L MgCl22.4μL,10 mmol/L dNTP 1μL,RNase inhibitor 0.5μL,22 U/μL AMV Reverse Transcriptase 1μL,0.5 g/L Oligonucleotide(dTMP)1μL,ddH2O 2.5μL,cDNA synthesis was accomplished according to the instruction.

1.3.3 PCR amplification

The primer sequences for MMP-9 were as follows:sense:5′-GGCCCTTC-TACGGCCACTA-3′,anti-sense:5′-CAGA-GAATCGCCAGTACTT-3′.The primer sequences for TIMP-1 were:sense:5′-CTTCCACAGGTCCCA-CAACC-3′,anti-sense:5′-CAGCCCTGGCTCCC-GAGGC-3′.Reaction conditions for MMP-9 were94℃30 seconds,60.5℃60 seconds,72℃90 seconds,and reaction conditions for TIMP-1 were 94℃30 seconds,63℃60 seconds,72℃90 seconds.Both were extended at 72℃for 7 minutes after 30 circles.β-actin was used as an internal comparison to detect transcription efficiency.2%agarose gel electrophoresis and EB coloration were carried out for RT-PCR productions.The fragment lengths of MMP-9,TIMP-1andβ-actin PCR production were 138 bp,285 bp and 592 bp,respectively.The positive strips of agarose gel electrophoresis were confirmed by DL-2000 DNA relative molecular mass marker.The appearance of amplification strip presented positive expression,and automatic running gel image analyzer Chemi Imager 5500 software was used to analyze the content of each amplification product,the ratios of MMP-9 or TIMP-1/β-actin content were used to indicate the relative expression levels of MMP-9 or TIMP-1 mRNA.

1.3.4 Statistical analysis

All the statistical analyses were performed using SPSS 11.5 software.χ2 test and Fisher precise probability calculation were used to determine the rate comparisons;T and F tests were employed for the comparisons of MMP-9 and TIMP-1mRNA expression levels between each group.

2 Results

2.1 Expression of MMP-9 and TIMP-1 mRNA in different ovarian tissues

Both positive expression rates and expression levels of MMP-9 or TIMP-1m RNA in EOC and bor-derline tumors were higher than those of benign tumors and normal ovarian tissues(P<0.05).Moreover,there was an extremely significant difference between the first two groups(P<0.01).No significant difference was found between the benign epithelial ovarian tumors and normal ovarian tissues(P>0.05).See Figure 1,2and Table 1.

M:marker,1-4:epithelial ovarian cancers,5-7:epithelial ovarian borderline tumors,8&9:benign epithelial ovarian tumors,10&11:normal ovarian tissues

M:marker,1-4:epithelial ovarian cancers,5-7:epithelial ovarian borderline tumors,8&9:benign epithelial ovarian tumors,10&11:normal ovarian tissue

Note:1)Comparisons of EOC or borderline tumor with benign ovarian epithelial tumor2)Comparison of benign ovarian epithelial tumor with normal ovarian tissue

2.2 Expression of MMP-9 and TIMP-1 mRNA inEOC with different clinicopathologic characteristics

Both positive expression rates and expression levels of MMP-9 mRNA in advanced stage EOC(Ⅲ～Ⅳ)were obviously higher than those of the early stage EOC(Ⅰ～Ⅱ,P<0.05),but no associations were found with age,lymphatic metastasis and ascites(P>0.05).Positive expression rates and expression levels of TIMP-1 mRNA did not correlate with clinicopathological variables of EOC(P>0.05).See Table 2.

2.3 Ratios of MMP-9/TIMP-1 mRNA in differ-ent ovarian tissues

The ratios of MMP-9 toTIMP-1 mRNA in normal ovarian tissues,benign,borderline,and malignant ovarian epithelial tumors were 0.89,0.99,1.06 and1.22,respectively.The ratio of MMP-9/TIMP-1 was the lowest in normal tissues,and the ratios increased from benign to borderline further to malignant epithelial ovarian tumors.Moreover,the ratios were>1 in both borderline and malignant ovarian epithelial tumors.If the ratio of MMP-9/TIMP-1 in normal ovarian tissues is standard,the imbalance between MMP-9and TIMP-1 in EOC was the most obvious.

3 Discussion

Invasion and metastasis of malignant tumors are thought to be a multi-step process,involving proteolytic degradation of extracellular matrix(ECM),altered cell adhesion and immigration of tumor cells.In addition,the formation of new blood vessels is essential both for tumor growth and for successful tumor invasion and metastasis.MMPs play a central role in all these processes[1].ECM consists of basement membranes(BM)and matrix.Normal BM is a kind of uniform and undivided extra cellular structure,composed of type IV collagen,laminin,fibronectin and so on.All the components of ECM are substrates because almost all of them can be degraded by MMPs[1].Gelatinase-B(MMP-9)is of particular importance in tumor cell invasion because it can specifically degrade gelatin and type IV collagen that are major components of the basement membrane,which constitutes an important barrier to tumor cell invasion[9].CAPO-CHICHI et al.[10]reported,loss of collagen IV and laminin may be an initial event in ovarian tumorigenicity,and that restoration of collagen IV and laminin expression may promote metastasis of ovarian tumors.

MMP-9(gelatinase B)localizes to chromosome20 q11.2-q13.1,which can degrade major components of ECM--type 1,4,5,7,11 collagens and gelatin.It exists both in active(82-kDa)and pro forms(92-kDa)in tumor tissues.After pro-MMP-9(92-kDa)is secreted from the cells,it turns into an active form(82-kDa)by protease hydrolysis.MMP-9 may make important contributions to metastasis process such as regulating cell migration,promoting tumor growth and angiogenesis[11].TIMP-1 is a 28-kDa glycoprotein,which acts to inhibit MMP-9 activity by forming a 1∶1complex with active MMP-9.The major expression sites of TIMP-1 are ovary and bone[11].

Our results indicated that MMP-9 mRNA was over-expressed in epithelial ovarian tumors.Moreover,the expression levels of MMP-9 mRNA increased from benign,borderline,further to malignant epithelial ovarian tumors.The expression level of MMP-9 mR-NA in EOC was associated with surgical-pathologic stage,and MMP-9 mRNA expression level in advanced stage EOC was significantly higher than that of early stage EOC.The results were in line with the report of HU XIAO-XIA et al[6],demonstrating MMP-9is correlated with epithelial ovarian tumorigenesis,invasion and metastasis.Another study reported[5]that increased MMP activity was an etiological factor for ovarian cancer risk.SYMOWICZ et al[12]suggested MMP-9 induced E-cadherin function initiated by cell-matrix contact to promote EOC metastatic dissemination.In addition,since surgical stage of EOC is a major prognostic factor,we concluded higher expression of MMP-9 may have a prognostic significance in EOC.The report of DAVIDSON et al[13].also indicated,MMP-9 was avalid marker of poor survival in advanced-stage ovarian carcinoma.SILLANP魧魧S et al[4].Reported,MMP-9 had a dual prognostic significance in EOC,acting against tumor advancement when it was in tumor epithelium and promoting tumor progression while it was in the stroma.KAMAT et al[14].also reported,high stromal expression of MMP-9 was an independent predictor of poor prognosis in EOC.The importance of MMPs in the processes of tumor invasion and metastasis is now widely acknowledged[1],but almost all the clinical trials of matrix metalloproteinase inhibitors(MMPIs)used in anticancer treatment have been disappointing[15,16].Therefore,it may be helpful by choosing MMPIs that specifically control the activity of MMPs in tumor stroma to improve MMPIs therapeutic efficacy.Further clarification of the mechanisms of MMPs functional role in tumorigenesis and progression will be important in the development of novel therapeutic strategies against metastases.

This research demonstrated the levels of TIMP-1mRNA expression increased from benign to borderline,and further to malignant ovarian neoplasm,and no correlations were found with clinicopathologic variables in EOC.The results were consistent with the report of HUANG et al[9].The study of RAUVALA et al[5].indicated an elevated preoperative serum TIMP-1 concentration correlated to the aggressive behavior of ovarian cancer.The role of TIMP-1 in tumor progression is complicate.On one hand it can inhibit the activity of MMP-9,on the other hand it also has the activity to promote cell growth,which may be one of the reasons for overexpression of TIMP-1 in some invasive tumors[3].In present study,we found the ratio of MMP-9/TIMP-1 enhanced from benign to borderline,and further to malignant epithelial ovarian neoplasm;moreover,the ratio of MMP-9/TIMP-1 was over 1 in both malignant and borderline epithelial ovarian tumors.And it suggested the expression levels of both MMP9 and TIMP-1 mRNA enhanced in epithelial ovarian tumors,since the increase amount of TIMP-1was far below that of MMP-9,the dynamic balance between MMP-9 and TIMP-1 was destroyed.We concluded that imbalance between MMP-9 and TIMP-1may play a role in ovarian tumorigenesis,invasion and metastasis.It was reported the molar ratio of MMP-9to its inhibitor(TIMP)is the critical determinant of whether activation of MMP-9 will occur.MMP-9 activation is observed to proceed at MMP-9/TIMP ratios greater than 1∶1[11].

In conclusion,MMP-9 and TIMP-1mRNA expressed both in normal ovarian tissue and epithelial ovarian tumors,overexpression of MMP-9 mRNA and imbalance regulation between MMP-9 and TIMP-1may lead to tumorigenesis,invasion and metastasis in epithelial ovarian tumors.In addition,overexpression of MMP-9 mRNA may have a prognostic significance in advanced stage EOC.

摘要：目的探讨基质金属蛋白酶(MMP-9)及其组织抑制物(TIMP-1)mRNA与卵巢上皮性癌的发生、发展的关系。方法采用RT-PCR技术检测69例卵巢上皮性肿瘤(38例恶性、15例交界性、16例良性)及11例正常卵巢组织中MMP-9及TIMP-1mRNA的表达,并分析其与各临床病理特征的关系。结果MMP-9mRNA在卵巢上皮性癌及交界性肿瘤组织中的阳性表达率(分别为76%、44%)及表达水平[分别为(154.14±4.42)、(96.87±3.04)]均显著高于良性肿瘤及正常卵巢组织[分别为13%、9%和(8.26±2.67)、(2.34±1.02);P<0.05];且MMP-9mRNA在晚期卵巢上皮性癌组织中的阳性表达率和表达水平明显高于早期癌组织(P<0.05)。TIMP-1mRNA在卵巢上皮性癌及交界性肿瘤组织中的阳性表达率(分别为68%、38%)及表达水平[分别为(126.35±3.81)、(90.62±5.54)]均显著高于良性肿瘤及正常卵巢组织[分别为13%、9%和(8.32±2.02)、(2.63±1.35);P<0.05];TIMP-1mRNA在卵巢上皮性癌组织中的阳性表达率和表达水平与各临床病理特征均无相关性(P>0.05)。结论MMP-9mRNA的高表达及MMP-9/TIMP-1平衡的调节失衡导致卵巢上皮性肿瘤的发生、侵袭和转移;MMP-9mRNA的高表达对卵巢上皮性癌有预后意义。