动物蛋白质（精选九篇）
动物蛋白质 篇1
1 植物精油及其化学成分
1.1 植物精油的定义与性质
植物精油是一类植物源次生代谢物质，是通过蒸汽蒸馏从植物的挥发性部分提取的混合物。植物精油在植物学上称为精油或香精油，在商业上称芳香油，在化学和医药学上称挥发油。
植物精油具有以下理化性质：常温下易挥发;有特殊而强烈的气味;常温下多为液体;大多具有高的折光率和一定的旋光度;一般比水轻，比重在0.85～1.065间;易溶于石油醚等极性小的有机溶剂中，也能溶于高浓度乙醇，几乎不溶于水;对空气、日光及温度较敏感，易分解变质;有些植物精油在常温下可析出固体成分。
1.2 植物精油的组成成分
在化学上，植物精油的化学成分非常复杂，可分为4类基本成分：
1.2.1 萜烯类化合物
为精油的主要成分。据其基本结构又可分3类：单萜衍生物，如熏衣草烯和茴香醇等;倍半萜衍生物，如金合欢烯、广霍香酮等;二萜衍生物，如油杉醇等。
1.2.2 芳香族化合物
为精油中仅次于萜烯类的第二大类化合物。萜源衍生物，如百里草酚、孜然芹烯;苯丙烷类衍生物，如桂皮中的桂皮醛等。含这类化合物的精油在香料工业上常作辛香型香料。
1.2.3 脂肪族化合物
精油中分子量较小的化合物。几乎存在于所有的精油中，含量较少，如橘子、香茅等精油中的异戊醛等。
1.2.4 含氮含硫化合物
如具有辛辣刺激香味的大蒜素，洋葱中的三硫化物，黑芥子中的异硫氯酸醋等。
2 植物精油对瘤胃蛋白质代谢的影响
Borchers(1965)早期的研究表明，在含酪氨酸的瘤胃液中加入百里酚可以促进氨基酸(AA)沉积，降低氨氮浓度，说明能抑制瘤胃细菌的脱氨基作用。Broderick和Balthrop也发现百里酚能抑制AA脱氨基变成氨氮。McIntosh等(2003)发现，当酪氨酸水解产物在体外与每天饲喂含1 g精油化合物青贮日粮的奶牛的瘤胃液批量培养48 h后，能使AA的脱氨基作用降低9%。在相同的研究中，McIntosh等(2003)发现当离子载体莫能菌素加入到瘤胃液中，脱氨基作用没有另外降低，表明精油对细菌种群的影响同莫能菌素的抑制作用是相同的。在后来的研究中，McIntosh等(2003)证明精油能抑制一些高产氨菌(HAP菌)的生长。HAP菌在瘤胃中数量很少，但具有很高的脱氨基活性。McEwan等(2002)对采食了精油的绵羊瘤胃液进行纯培养，发现HAP菌数量减少;同时用DGGE法对芽孢杆菌梭菌属的HAP菌的16SrDNA进行了多样性分析，发现多样性降低。因此，推测精油对瘤胃蛋白质代谢的影响就是对AA降解的影响，并且这些影响可能是因为抑制了HAP菌的生长。
但也存在不一样的报道。Castillejos等(2005)采用双流量连续培养罐培养8 d，并保持恒定的pH，发现添加1.5 mg/L精油对NH3-N浓度、细菌、粗蛋白降解率，或者微生物蛋白合成率没有影响。Newbold等(2004)和Benchaar(2006)研究报道，每天分别添加110 mg或2 g混合精油，绵羊或奶牛瘤胃中大豆粉的蛋白降解动力学没有变化。
3 植物精油影响瘤胃蛋白质代谢的因素
3.1 植物精油组成成分对瘤胃蛋白质代谢的影响
Busquet等(2005)发现，在连续发酵罐中添加丁香芽2.2 mg/L能有效提高大型多肽的浓度，但对NH3-N的浓度没有影响，表明丁香芽精油能降低瘤胃细菌分解肽的活力。然而，添加相同浓度的丁香芽精油组分———丁香酚对N代谢没有影响，表明丁香芽精油中的抗肽基分解活性不是由它的主要成分决定的，而是取决于油中还未鉴别出的化合物。Busquet等(2006)报道，在体外分批培养中添加相同浓度的牛至油或它的主要成分———香芹酚都能降低NH3-N浓度，表明香芹酚在牛至油抗菌活性中起主要作用。Castillejos等(2006)发现，在瘤胃液24 h体外分批培养中逐步增加不同精油化合物的剂量水平(5、50、500 mg/L和5 000 mg/L)对瘤胃发酵产物的影响不同。当剂量为5、50、500 mg/L时，香草醛不改变NH3-N浓度，当柠檬烯剂量为500 mg/L时能降低NH3-N浓度，而丁香油酚和愈创木酚在所有的浓度都能降低氨氮浓度。这些研究表明，精油的化学成分可能影响精油对瘤胃N代谢的效果，而酚类化合物因其具有更高的抗菌活性，故可能具有更好的效果。
3.2 剂量对于植物精油改变瘤胃N代谢效果的影响
精油和它们的组分已被证明对N代谢的影响存在剂量依赖性。例如，Busquet等(2006)证明一些精油(如茴香油，杜松油，辣椒油，肉桂油，丁香芽油，莳萝油，大蒜油，生姜油，牛至油和茶树油)和它们的主要成分(即茴香醚，苄基水杨酸，香芹酚，香芹酮，肉桂醛和丁香酚)在高浓度条件下(3 000 mg/L)能显著抑制NH3-N浓度，但中等剂量(300 mg/L)的影响就很小，低剂量(3 mg/L)甚至没有影响;并且证明瘤胃N的流动没有因为大蒜精油或肉桂醛的添加而改变，但是在体外连续培养中被肉桂叶精油降低。
由于精油复杂的化学组成，关于精油的适宜添加剂量还存在争议。Newbold等(2004)发现，每天饲喂110 mg精油的绵羊十二指肠中细菌N的流动没有改变，但能显著抑制瘤胃中的脱氨基作用，降低NH3-N浓度。而McIntosh等(2003)报道，BEO对体外瘤胃细菌的有效浓度在35～360 mg/L，在体内则更高。这些研究结果的差异可能是因为精油的化学组成和实验条件不同所造成的。
4 植物精油对反刍动物生产性能的影响
4.1 对奶牛的影响
已有少数研究报道了精油和它们的组分对奶牛产奶量和组成的影响。Benchaar等(2006,2007)发现，给奶牛每天饲喂750 mg或2 g精油，对DM摄入量、奶产量和奶成分没有影响。相似的，给奶牛补充薄荷油20 g/kg，对DM、奶产量和奶成分也没有影响。最近，Yang等(2006)在奶牛日粮中添加大蒜油(5 g/d)和杜松实油(2 g/d)，发现它们对DM摄入量、奶产量或奶成分也没有影响。陈会良等的实验结果显示，试验组(10%牛至油预混剂)牛奶乳脂率提高了7.57%(P<0.05);产奶量和乳蛋白率差异不显著(P>0.05)。黄玉德等在奶牛日粮精料中添加大蒜素粉0.1%，结果每头奶牛日产奶量增加2.03 kg，提高了8.42%(P<0.05)，乳脂率提高了4.3%，精料用量每头牛日平均下降0.8kg。这些研究中所得的结果不同可能与所用的精油成分不同有关。
4.2 对绵羊的影响
井明艳等(2005)用大蒜素饲喂绵羊，发现大蒜素可以提高绵羊体增重，且不同的饲喂水平对绵羊的体增重产生不同的效果，25%大蒜素的最佳饲喂水平为1.3～1.5 g/只·d。贺剑忠等研究了大蒜素对卡拉库尔羊日增重的影响，在精料中添加150mg/kg水平的大蒜素，结果与对照组相比平均日增重降低了22.90 g，说明大蒜素对绵羊无增重作用，在一定程度上还会抑制绵羊的生长。这与前人的研究结果相矛盾，可能是因为大蒜素剂量过大，从而抑制了绵羊瘤胃内的真菌，导致绵羊消化功能下降，最终抑制了其生长。
4.3 对肉牛的影响
精油及其化合物对肉牛生产性能影响的研究很少。贾玉山等在日粮中加入不同剂量的大蒜和大蒜素饲喂西门塔尔杂交后代公牛，得出的结论为：大蒜及大蒜素对肉牛增重有显著的促进作用，这可能是因为大蒜在激活肉牛体液免疫和细胞免疫系统过程中表现出了较强的生物活性，减弱了肉牛机体感染布氏杆菌后引起的能量和物质消耗，从而促进了肉牛增重。此外，香精油还可以影响肉牛的免疫性能。大蒜中影响肉牛机体免疫功能的主要成分是大蒜素，低剂量的大蒜素促进机体免疫调节，中剂量大蒜素的生物活性与机体免疫反应的强度趋于一致。
5 结语
植物精油可能是改善反刍动物中蛋白质利用率的一种有效方法。但在反刍动物上针对香精油所进行的研究大多还是在体外进行的，实际生产中这些活性物质的最佳剂量，瘤胃微生物菌群对这些物质的适应特性以及植物精油在动物体内的转化机理等还需要进一步研究。
摘要：随着抗生素作为饲料添加剂被禁用,寻求能够改善瘤胃代谢从而提高饲料效率和动物生产性能的抗生素替代品一直是研究热点。植物精油被认为是代替饲料中抗生素的有效产品之一,它能够通过抑制某些微生物的生长发育来改善瘤胃发酵。本文就近几年来植物精油对瘤胃蛋白质代谢及其对反刍动物生产性能的影响作一综述。
关键词：植物精油,蛋白质代谢,生产性能
参考文献
[1]张克英.植物精油在家禽营养中的应用进展[J].新饲料,2006,(12):41-44.
[2]Borchers R.Proteolytic activity of rumen fluid in vitro[J].J.Anim.Sci.,1965,24:1033-1038.
[3]McIntosh F M,Williams P,Losa R,et al.Effects of essential oils on ruminal microorganisms and their protein metabolism[J].Appl.Environ.Microbiol.,2003,69:5011-5014.
动物蛋白质 篇2
可放入烤箱中，速度较快。
2、 裂解液配制：RIPA：PMSF=100：1，现配现用。(1000ulRIPA+10ulPMSF)。置入4℃冰
上。
3、抽蛋白(应冰上进行)：
a、适量组织(最好放入液氮中反复研磨成粉状)加入裂解液中。一般10ml管体系中加入：7-8粒磁珠、100mg组织、1mlRIPA+10ulPMSF、1 tablet Cocktail。 b、匀浆。
手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次(6～8分钟)，充分研碎，使组织匀浆化。
机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10%组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备(匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行)，皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。
超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。
反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右(即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右)，但有部分酶活力会受影响。 c、将组织匀浆转入1.5ml的EP管中(eppendorf 管、离心管)。1r/min 4°C 离心15min。 d、离心后EP管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的EP管中。可-80℃保存。 4、蛋白浓度测定。
a、配工作液：溶液A：溶液B=50：1(200ul：4ul)。
需测试复孔。标本X，则需A量=2*(
X+1+1)*200;B=2*(X+1+1)*4。
c、复孔，取蛋白6ul加入0.6mlEP管，再加入54ulH2O，混匀。即10倍稀释。
d、取20-25ul 10倍稀释蛋白样本加入96孔板平底板内，再加入200ulAB工作液，混匀振荡后，37℃ incubate 30min。
注：应现加蛋白样本，再加工作液。因为每次加蛋白后需换tip，再加入工作液即起反应，应缩短时间。
e、酶标仪检测562nm吸光度。Program f、计算蛋白浓度。
根据标准曲线，如 Y=1.2745X-0.1684 其中Y：蛋白浓度;X：吸光度。 最终蛋白浓度为：10*Y(ug/ul、mg/ml) g、蛋白样本放-80℃冻存。
大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化，这一变化可由分光光度计或酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标
准曲线作比较。博士德为大家提供两种蛋白测定手段，每种都有其独特的优点。如果样品数量较多，可以同时使用两种测定用酶标仪自动检测。当你选择一种蛋白测定方法时需要考虑两个因素：缓冲液的化学组成和检测的蛋白量。
Commassie法(Bradford法)： 原理：在酸性条件，蛋白质与考马斯染料G-250结合，颜色从棕色变为蓝色，在595nm处检测吸光值然后与标准曲线对比，即可计算出待测蛋白的浓度。
BCA法：
原理：在碱性条件下，蛋白将Cu++还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
现对这两种方法进行比较： 一、实验材料：
细胞总蛋白提取试剂盒(AR0103) M231
BCA蛋白定量试剂盒(AR0146)
Commassie改良增强型蛋白质定量试剂盒(AR0145) 二、操作步骤： Commassie法： 1.将BSA冻干标准品(10mg/支)用生理盐水或PBS稀释成2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml八个浓度的蛋白标准溶液。
2.M231用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。
3.各取20ul蛋白标准品和待测M231样品至相应标记的微孔板中。 4.滴加200ul考马斯增强型试剂(溶液A)至每孔混匀并充分震荡30S 5.停止震荡，在室温孵育样品10min 6.在酶标仪中测量595nm时的吸光值。
7.绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。 BCA法：
1.按50体积BCA试剂A加入1倍体积BCA试剂B配置适量BCA工作液，充分混匀。 2.将BSA冻干标准品(10mg/支)用生理盐水或PBS稀释成2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml八个浓度的蛋白标准溶液。
3.M231用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。
4.各取20ul蛋白标准品和待测M231样品至相应标记的微孔板中。 5.滴加200ulBCA工作液至每孔混匀并充分震荡30S 6.停止震荡，在37度孵育样品30min 7.在酶标仪中测量562nm时的吸光值。
8.绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。 三、实验结果
其中1到8为2000ug/ml，1000,500,250,125,62.5,31.25,15.625的标准 浓度的BSA蛋白，9为空白孔，样品1为8倍稀释M231总蛋白，样品2为32倍稀释M231总蛋白
Commassie法：
为了测试准确，应在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。 由标准曲线可以算出样品原始浓度为14.4mg/ml
Commassie法优点是：
1.灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1ug。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
2.测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
3.干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
1.由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g―球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
2. 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1M的NaOH。(如同0.1M的酸干扰Lowary法一样)。
3. 标准曲线也有轻微的非线性，在0-1000ug/ml浓度范围内有较好线性。因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
BCA法：
由标准曲线可以算出样品原始浓度为14.28mg/ml BCA法特点： 1. 灵敏度高，检测浓度下限达到25μg/ml，最小检测蛋白量达到0.5μg，待测样品体积为1-20μl 。 2. 测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80。 3. 在20-2000μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。 4. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。 5. 受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响：EDTA小于10mM。DTT小于1mM巯基乙醇低于1mM
BCA法和Commassie法各有优势，在不知道蛋白样本缓冲液成分的情况下可以两种方法配合使用，以消除定量的误差。
(Radio Immunoprecipitation Assay)RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一种传统的细胞组织快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的Western、IP等。 RIPA使用方法
对于培养细胞样品：
1. 融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
2. 对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。 对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。 裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入150微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200微升或250微升。 对于组织样品：
1. 把组织剪切成细小的碎片。
2. 融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
3. 按照每20毫克组织加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)
4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。
5. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
6. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
注：RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组
DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验;如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的.转录因子，例如NFκB、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。 各种RIPA的差别及用途
蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全 摘要：
破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常
用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。
蛋白酶抑制剂
破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。
常用抑制剂
PMSF Phenylmethanesulfonyl fluoride(剧毒)
1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶);
2)10mg/ml溶于异丙醇中;
3)在室温下可保存一年; 2-8℃可以存放数月之久。欲长期保存，可冻存在-20℃ 4)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L); 储存液浓度为100或200mM
5)在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。 EDTA
1)抑制金属蛋白水解酶;
2)0.5mol/L水溶液，pH8~9; 3)溶液在4℃稳定六个月以上;
4)工作浓度:0.5~1.5mmol/L. (0.2~0.5mg/ml);
5)加入NaOH调节溶液的pH值，否则EDTA不溶解。 胃蛋白酶抑制剂(pepstantin)
l)抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管紧张肽原酶，组织蛋白酶D和凝乳酶; 2)1mg/ml溶于甲醇中;
3}储存液在4℃一周内稳定，-20℃稳定6个月; 4)1作浓度:0.7ug/ml(1umol/L) 5)在水中不溶解。
亮抑蛋白酶肽(leupeptin)
1)抑制丝氨酸和巯基蛋白酶，如木瓜蛋白酶，血浆酶和组织蛋白酶B; 2)lOmg/ml溶于水;
3)储存液4℃稳定一周，-20℃稳定6个月; 4)工作浓度0.5mg/ml。 胰蛋白酶抑制剂(aprotinin)
1)抑制丝氨酸蛋白酶，如血浆酶，血管舒缓素，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶; 2)lOmg/ml溶于水，pH7~8
3}储存液4℃稳定一周，-20℃稳定6个月; 4)工作浓度:0.06~2.0ug/ml(0.01~0.3umol/L); 5)避免反复冻融:
6)在pH>12.8时失活。 蛋白酶抑制剂混合使用
35ug/ml PMSF…………………………………丝氨酸蛋白酶抑制剂 0.3mg/ml EDTA…………………………………金属蛋白酶抑制剂
0.7ug/ml胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)…………酸性蛋白酶抑制剂 0.5ug/ml亮抑蛋白肽酶(Leupeptin)……………广谱蛋白酶抑制剂 常用蛋白酶抑制剂表
PMSF(Pheylmethylsulfonyl fluoride)是很常见的抑制剂，使用浓度为1 mmol/L。不可逆抑制丝氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶。
AEBSF 丝氨酸抑制剂，使用浓度为4 mmol/L。AEBSF的抑制活性与PMSF相近，但它更易溶于水而且毒性低。因此是PMSF最佳的替代品，但价格较高。
磷酸酶抑制剂 NaF氟化钠 溶解性：溶于水 分子量：41.99
使用：贮存液5M，工作浓度10~20mM。
Na3VO4 原矾酸钠
分子量：183.91
溶解性：溶于水，我们购买过来的是原矾酸钠。原矾酸钠需要经过处理以后才能成为激活的矾酸钠，激活的矾酸钠才具有抑制去磷酸化的作用。
原因：原钒酸钠有一定程度的聚合，使用前要激活使之变成单体才有最大抑制效价 原矾酸钠变成激活的矾酸钠的过程是：100mM 原矾酸钠激活储存液配制
(1). 取0.183克的原矾酸钠溶解于10ml的双蒸水中，加酸调节PH至10(颜色变黄)。 (2). 煮至无色 (3). 室温冷却 (4). 重调pH至10
(5). 重复(1)(2)(3)(4)直至溶液保持无色，并且pH稳定于10，分装100ul/管，每10ml裂解液加一管。
使用：贮存液100mM， 工作浓度1mM，-20度保存。
Beta-glycerophosphate 甘油磷酸钠 溶解性：溶于水 分子量：306.11
使用：贮存液100mM， 工作浓度25mM。
Na2P2O4 焦磷酸钠 溶解性：溶于水 分子量：265.9
动物蛋白质 篇3
在朋友圈晒一晒健身馆里挥汗如雨，或是若隐若现的马甲线和平坦小腹，日渐成为都市生活新风尚。如今，运动健身已成人们抵抗亚健康、追逐乐活身心状态的有效方式，钻研科学健身的方法也因此成为许多都市人群的一大乐趣。人们常说“三分练，七分吃”，在运动健身的同时注重科学的饮食安排显得尤为重要。
文_杨桃
蛋白质是维持机体健康的重要营养素，当肌肉的蛋白质合成速率高于降解速率时，肌肉组织便会一定程度地增加，也就是运动健身人群所追求的增肌。
氨基酸是组成蛋白质的基本单位，共有20种，其中8种在体内不能自行合成，需要从食物蛋白中或其他路径获取，因此，额外摄入适量的蛋白质就显得尤为必要。运动人群应该选择动物蛋白还是植物蛋白来获取全面的氨基酸和营养素的补充呢？
大豆蛋白
优质的运动营养补给
一种常见误区是：大豆蛋白不如乳清蛋白能促进肌肉的增长，于是许多人选择仅摄入乳清蛋白，而放弃了大豆蛋白。国际运动营养学杂志曾登载一项实验，让两组研究对象进行为期12周的肌肉群重量训练，并分别摄取50克的大豆蛋白及等量的乳清蛋白。研究发现两组对象的身体状态没有显著差异。多项研究表明，若单纯以增加肌肉组织量的论点来看，大豆蛋白与乳清蛋白同样有效。
杜邦营养与健康事业部的科学研究显示，与乳清蛋白相比，大豆蛋白的谷氨酰胺含量高30%，精氨酸含量高300%。谷氨酰胺是人体重要的氨基酸，与机体的运动能力有着密切的联系，必须保证其额外且及时的补充，以防止肌肉蛋白的分解；精氨酸则能够帮助调节人体免疫系统并提高运动表现。
此外，德克萨斯大学加尔维斯顿医学分部营养和新陈代谢系教授拉斯穆森博士的研究表明，相较于乳清蛋白的单一摄入，食用组合蛋白质能够为人体肌肉提供更持久的氨基酸供应，是抗阻运动后的最佳选择。对此，已在大豆蛋白食品应用研究领域深耕60年的杜邦营养与健康也有其独到的见解，其所推行的大豆蛋白营养理念中的“黄金蛋白比例”和“双蛋白”概念即是以科学验证倡导蛋白质平衡摄入，建议在健身饮食中搭配不同的蛋白质，合理发挥各种蛋白质的功效。
健康的身体状态既是健身的目的，也是有效锻炼的基础。许多科学研究表明，与低胆固醇的饮食配合，摄入一定量的大豆蛋白可有效降低胆固醇并减少罹患冠心病的风险，这一结论也得到了美国食品与药物管理局的认可，其早在1999年就已正式批准食品制造商可以在含有大豆蛋白的产品标签上标注如下声明：“每天食用含25克大豆蛋白且低胆固醇、低饱和脂肪酸的膳食，可通过降低血液中的胆固醇水平，减少冠心病发生的可能性。”大豆蛋白有助于降低胆固醇、控制血糖，还有益心脏健康，为运动健身人群提供持续不断的运动营养。同时，对于想要纤体塑形的运动健身人士来说，大豆蛋白不仅能够增加饱腹感，还能维持肌肉状态并减少腹部脂肪， 以达到控制体重的目标。
根据运动诉求合理摄入蛋白质
不同的运动群体有着不同的健体需求，热爱运动的你应该根据自身需求，有针对性地摄入合适的蛋白质。
A 专业健身者
专业健身者大多有着长效增肌的需求，蛋白质的摄取量应高于普通人，尤其需要重视在运动前后进行蛋白质的摄取，以促进肌肉蛋白的合成。拉斯穆森博士通过同一研究发现，大豆蛋白一般在摄入后3～5小时内对肌肉蛋白合成发生作用，且相较于乳清蛋白，其效用更为持久。此外，经科学研究证实，摄取不同消化与吸收速率的蛋白质混合物，相较于单一种相同速率的蛋白质能更有效地帮助肌肉群增长。作为运动营养领域的专家，除了提供丰富多样的大豆蛋白产品，杜邦营养与健康还通过积极探索向健身者传递运动营养新理念，其所倡导的“黄金蛋白比例”均衡营养的理念便是其中之一，即大豆蛋白、乳清蛋白和酪蛋白的合理搭配能为健身人群更大限度地增加肌肉。事实上，越来越多的专业运动员和定期运动者开始食用含大豆蛋白和乳清蛋白混合物的产品，以达到更好的健身效果。
B业余健身者
一些热衷于锻炼的业余健身者有着活动量稍低的运动习惯，如散步、慢跑、打高尔夫等。建议这类人群将蛋白质的摄取合理分布在日常生活饮食中，如果因为繁忙的工作节奏而无法保证一日三餐的均衡膳食，可选择一些大众消费型的蛋白质产品，如含有大豆蛋白的碳水化合物饮品或营养棒等。
C
休闲运动者
还有一部分运动较少，却又渴望健康形象，希望减掉身体各部位多余脂肪，让衰老来得晚些的休闲运动者。大豆蛋白能够提供更长时间的饱腹感，有助减少能量摄入，控制体重，还能缓慢释放能量，保持精力充沛。
动物蛋白饲料开发及应用分析 篇4
1 动物性蛋白饲料的定义及营养构成
1.1 含义
动物性蛋白质是蛋白质饲料的一种, 主要是用于区别植物性蛋白质如豆类蛋白等, 国内的动物性蛋白质饲料主要有鱼粉、骨粉肉粉、奶制品、动物水解蛋白和其他种类的动物蛋白产品。
1.2 营养构成
动物性蛋白质饲料具有极其丰富的营养成分, 主要包括粗蛋白质、碳水化合物、多种矿物质、丰富的维他命以及一些其他的有利于牲畜生长的营养物质。其中粗蛋白质的成分是所有成分中含量最高的, 一般可达50%左右, 其生物学营养价值和利用价值都比较高。碳水化合物在动物性蛋白饲料当中没有占据很大的比重, 数量少较少, 一般最为辅助成分发挥效用。动物性蛋白质饲料中的矿物质含量非常丰富而且配比较为平衡, 能够实现较高的利用效率, 其中的钙元素 (Ga) 和磷元素 (P) 都比普通植物性蛋白饲料含量高出许多, 是对牲畜生长及其有好处的两种矿物质。动物性蛋白质饲料中的B族维生素和D、A等含量也相对较高, 并且她们都是溶脂性维生素, 能够很好的被牲畜消化吸收。
2 常见动物性蛋白饲料特征分析
根据动物性蛋白质原料来源的不同, 主要可以将动物性蛋白饲料分为鱼粉、血粉、羽毛粉、骨肉粉等几大类。
2.1 鱼粉蛋白饲料
在过去的发展历程中, 包括我国畜牧行业在内的世界范围内的畜牧行业, 几乎都是将鱼粉作为动物性蛋白饲料的最主要来源, 鱼粉是将整条鱼加工而成, 蛋白质保存良好, 氨基酸组成也相对平衡, 牲畜的食用消化比例也相对较高, 所以一直以来鱼粉都被当作非常理想的动物性蛋白质饲料加以使用。
2.2 血粉蛋白饲料
血粉成分中的粗蛋白含量非常高, 一般能够达到80%以上至90%, 大大高于鱼粉和肉粉等类别。而且血粉中的氨基酸成分含量大种类也非常丰富, 如组氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等等, 而且血粉中的赖氨酸含量还高居所有天然性饲料的榜首, 高达8%左右。血粉中虽然含有大量的氨基酸和微量元素, 但是对于钙、磷的含量测试确实相对很低, 而且核黄素等维生素成分也相对较低, 并且可能会因为加工方式的不同而产生差异性较大的适口性问题。
2.3 羽毛粉蛋白饲料
羽毛粉蛋白饲料是利用家禽的羽毛回收处理之后制成的蛋白质饲料原料, 这种方法不仅能够为我国蛋白质饲料研发提供新的选择空间, 而且能够极大的缓解我国每年大量禽类羽毛难以合理消耗的问题。羽毛粉蛋白质中含有高达5%的胱氨酸以及B12、铁、锌、硒在内的大量微量元素, 是一种营养价值较高的蛋白质饲料原料, 但是由于羽毛蛋白属于角蛋白, 一般不溶于水, 需要经过特殊的水解工艺进行加工, 并且在使用过程中应该适当添加补充添加剂, 以保证羽毛粉的营养功效得到彻底发挥。
2.4 肉骨粉蛋白饲料
我国目前所用于肉骨粉生产的原料主要来自人类所不能使用的过期肉类, 以及各类肉类加工厂生产剩余下来的肉类骨头下脚料, 然后通过高温灭菌脱脂等工艺生产出来的一种肉骨混合的蛋白质粉末。肉骨粉原料虽然在我国储量丰富, 但是由于加工工艺粗陋、品质难以实现稳定持续, 甚至难以与豆饼饲料相比, 所以肉骨粉限制使用的比例较低, 一般不宜超过6%。而且不宜用于幼崽、雏禽的饲养当中。
3 影响动物性蛋白质饲料加工质量的因素
3.1 工艺与方法的因素
各种蛋白质饲料的质量都受加工方法的限制, 其加工方法与工艺技术不同, 产品的质量就不一样。如:鱼粉的质量因原料的品质和加工方法的不同而存在较大的差异。鱼粉干燥过程中温度过高会导致鱼粉品质下降, 不合要求的干燥方法会导致鱼粉发生不同程度的变质等。
3.2 原料产地质量的因素
原料的种类不同, 产品的质量各异。如:鱼类不同生产的鱼粉蛋白质就不一样。同一种物质也会因产地的不同而含量各异;同一产地也会因每年季节气候变化的不同, 所获得的产品质量也不同。
3.3 人员素质的因素
由于受市场经济的影响, 掺杂现象十分严重。其中掺假最严重的是鱼粉。从而使蛋白质饲料原料的产品质量很难保持一直, 其营养价值差异很大, 对动物生产带来很大影响。
4 动物蛋白饲料的市场应用前景
动物性蛋白饲料氨基酸蛋白质的含量非常高, 营养价值非常丰富, 而且动物性蛋白质更有利于动物牲畜的消化吸收, 并且能够起到极大的刺激牲畜生长和繁衍的作用, 所以动物性蛋白质饲料是其他种类饲料或营养都难以替代的。而且随着我国的生物技术不断进步与发展, 我国的动物性蛋白饲料的研发也取得了非常重大的进步, 各种动物性蛋白饲料逐渐投入市场, 获得了消费者的一致好评, 而且随着我国电子商务的不断发展, 许多生产厂家和用户开始通过互联网进行饲料的购买或销售, 从而形成了具有现代气息的动物蛋白饲料销售氛围, 销售前景非常广阔。
5 结论
开发动物性蛋白饲料资源技术探析 篇5
1 动物性蛋白饲料资源的分类和特征
根据动物性蛋白饲料资源来源不同, 可分为鱼粉、血粉、血浆蛋白粉、羽毛粉、肉骨粉、皮革粉和昆虫蛋白饲料。
1.1 鱼粉
鱼粉是动物性蛋白质饲料的主要来源, 它是将全鱼经过加工制成的。鱼粉的蛋白质含量一般在50%以上。鱼粉的氨基酸组成是接近平衡的, 因而利用率很高, 是理想的蛋白质饲料。优质鱼粉的蛋白质含量在65%以上, 赖氨酸含量在3.5%～6.5%, 蛋氨酸含量在1.6%以上, 矿物质钙、磷含量较高, 所有的磷都是可利用磷 (有效磷) 。在猪日粮中添加5%～8%的鱼粉, 能明显促进生长, 提高饲料转化率。
1.2 血粉
血粉是以畜、禽血液为原料, 经脱水加工而成的粉状动物性蛋白质补充料。猪血液占活体重的4.6%～5.0%, 牛羊血液占活体重的3.5%, 禽血液占活体重的3.9%。血粉的粗蛋白含量可达80%～90%, 高于鱼粉和肉粉。血粉中赖氨酸和亮氨酸, 以及缬氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸的含量都很丰富, 其中赖氨酸的含量居所有天然饲料之首, 达到7%～8%, 比常用鱼粉的含量还高。精氨酸、蛋氨酸、胱氨酸的含量很低, 异亮氨酸的含量很少, 几乎为零。另外, 血粉中还含有多种微量元素, 如钠、钴、锰、铜、磷、铁、钙、锌、硒等, 其中含铁量是所有饲料中最丰富的。血粉还含有可帮助消化的多种酶类和维生素A、维生素B2、维生素B6、维生素C等。血粉是蛋白质含量很高的饲料, 但氨基酸组成平衡性差, 并因加工方法的不同其营养成分、适口性和可消化性都有较大的差异。用2.5%喷雾干燥血粉替代仔猪日粮中的豆粕后, 仔猪日增重和采食量分别提高14.4%和12.5%, 饲料转化率略有改善。
1.3 羽毛粉
羽毛粉是将家禽的羽毛净化消毒, 再经过蒸煮、酶水解、粉碎或膨化而制成的粉状动物性蛋白质补充饲料。每只成年鸡可得风干羽毛80～150g, 是体重的4%～5%, 是一种潜力很大的蛋白质饲料原料。粗蛋白质含量在85%～89%, 胱氨酸含量高达4.65%, 也含有维生素B12, 铁、锌、硒含量高, 缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的含量均较高。但羽毛蛋白质中大部分是角蛋白, 结构坚固, 不易被一般工艺水解, 不易被动物消化。由于加工工艺及生产条件对羽毛蛋白质的质量影响较大, 使其质量不稳定。所以在动物饲料中添加量不宜过多, 必要时可补充羽毛粉缺乏的氨基酸, 经加工处理的羽毛粉可以代替鱼粉, 是一种优质的蛋白质资源, 在畜牧生产中具有广泛的应用前景。
1.4 肉骨粉
肉骨粉多利用肉联厂不能食用的超期肉类, 以及屠宰厂、制革厂、骨胶厂的各种畜禽下脚料制成。以上原料经分离杂质, 按一定的比例配合, 经高压蒸煮、灭菌脱脂等工艺生产出的一种褐黄色粉状肉骨混合物。该类产品因原材料不同, 形成的理化指标也不相同。通常情况下, 肉骨粉的蛋白质含量在30%～50%、磷2.5%～7.5%、钙6%～18%、粗脂肪6%～12%、粗纤维2.5%～3.5%、蛋氨酸0.6%～0.8%、赖氨酸1.5%～2.6%。肉骨粉可作为猪、禽饲料的蛋白质及钙、磷来源, 但其品质稳定性差, 饲养价值比不上鱼粉与豆饼, 用量限制在5%以下, 并需补充所缺乏的氨基酸。还应注意钙、磷平衡。一般多用于肉猪、种猪、肉禽, 不宜用于仔猪、雏鸡。在反刍动物中利用效果不佳, 用量应控制在3%以下。
1.5 蝇蛆粉
蝇蛆粉是将蝇蛆卵接种到培养基上, 经过培养以后分离蝇蛆, 干燥后粉碎制成。蝇蛆也可以鲜喂, 活蝇蛆蛋白质含量为15.6%, 可直接用来喂鸡、鸭。加工成蝇蛆粉, 其粗蛋白质含量高达59.4%～63.0%, 与进口鱼粉蛋白质相似, 粗脂肪含量为10.6%～20.0%, 赖氨酸含量为4.1%, 蛋氨酸为1.9%, 色氨酸含量为0.7%, 氨基酸总含量占干物质的52.2%, 还含有铁、铜、锌、锰等微量元素。在其他条件完全相同的情况下, 用10%蝇蛆粉喂养蛋鸡, 其产蛋率比饲喂同等数量的国产鱼粉的蛋鸡提高19.5%, 饲料转化率提高15.8%, 成本降低40%, 而且可提高鸡蛋及鸡肉的品质。在基础日粮相同的条件下, 每头猪加喂100g秘鲁鱼粉, 结果喂蝇蛆粉的仔猪比喂鱼粉的仔猪增重提高了7.18%, 而且每天增重0.5kg, 成本下降13.2%。用蝇蛆粉喂养的猪瘦肉中蛋白质含量比喂鱼粉的高3.5%。雏鸡阶段每天加喂少量蝇蛆, 每千克鲜蛆可使雏鸡多增重0.75 kg, 开产日龄比对照组提前28d, 产蛋量和平均蛋重明显高于对照组。
1.6 蚯蚓粉
蚯蚓体内的营养丰富, 粗蛋白含量平均为56.5%, 最高达70%, 且富含11种氨基酸。其中精氨酸的含量比鱼粉高2～3倍, 色氨酸的含量是牛肝的7倍, 赖氨酸的含量也高达4.3%, 还含有丰富的维生素A、B、E及多种微量元素、激素、酶类、糖类物质。蚯蚓粉由鲜蚯蚓风干或烘干后粉碎而成。在产蛋鸡的日粮中加入4%的蚯蚓粉, 产蛋量增加20%以上, 奶牛和奶山羊辅以蚯蚓饲料, 泌乳量增加10%～40%。用蚯蚓粉代替鱼粉饲喂育肥猪日增重可提高13.1%。在粗饲料中添加5%～8%的蚯蚓粉喂养家禽, 可使其生长速度提高15%。在猪粗饲料中添加5%～8%蚯蚓粉, 其生长速度可提高15%。
1.7 蚕蛹粉
蚕蛹是蚕茧抽丝后剩下的副产品, 经过除臭、烘干、脱脂, 再烘干和粉碎后, 即为蚕蛹粉。蚕蛹粉蛋白含量高达68.3%, 可消化蛋白占56.5%, 粗脂肪占28.8%, 磷为0.9%, 钙为1.2%, 灰分为2.8%, 并含有维生素B1、维生素B2、维生素E。蚕蛹含有17种氨基酸, 其中必需氨基酸7种, 占总量的14.59%。在猪饲料中添加蚕蛹粉, 其氨基酸消化率达到88%, 明显高于啤酒糟、豌豆等饲料蛋白辅料。用蚕蛹粉喂猪, 日平均增重比不加蚕蛹粉的提高23.6%;在蛋鸡日粮中加入5%～10%的蚕蛹粉, 产蛋率可提高18%。
2 影响动物性蛋白饲料资源应用的因素
动物性蛋白质的特点是蛋白质含量高, 氨基酸组成好, 尤其是鱼粉的适口性好, 氨基酸组成接近动物体组织氨基酸组成模式, 是一种动物较平衡的蛋白质饲料资源。但蛋白饲料价格都比较昂贵, 而且容易受细菌感染, 饲喂受感染日粮将会影响动物的健康生长, 而且对人类的健康和环境造成一定的威胁。各种蛋白质饲料的质量都受加工方法的限制, 其加工方法与工艺技术不同, 产品的质量就不一样。如鱼粉的质量因原料的品质和加工方法的不同而存在较大的差异。鱼粉干燥过程中温度过高会导致鱼粉品质下降, 不合要求的干燥方法会导致鱼粉发生不同程度的变质等。由于受市场的影响, 掺杂现象十分严重, 其中掺假最严重的是鱼粉。从而使蛋白质饲料原料的产品质量很难保持一直, 其营养价值差异很大, 给动物生产效益带来很大影响。
3 结语
从动物皮中提取胶原蛋白的方法 篇6
胶原是生皮中最主要的纤维蛋白,是动物皮肤的主要成分。除此之外,动物的骨、齿、肌腱、韧带、软骨、血管等组织中都存在胶原。胶原是哺乳动物体内含量最多的蛋白质,占体内蛋白质总量的25%~30%,在真皮蛋白质中,胶原占85%~90%[1]。胶原蛋白被广泛地应用于食品、营养保健、美容以及生物医学材料等诸多领域,胶原蛋白的提取一直是研究的热点。迄今为止,胶原的提取方法主要有酸法、碱法、酶法和结合法。随着高科技的不断发展,市场对胶原蛋白质的品质和档次提出了更高的要求,高产率生态化提取胶原已经成为必然的发展趋势。
本文综述了胶原蛋白的不同提取方法,综合分析了不同提取条件对胶原蛋白结构的影响,在此基础上,初步揭示了提取工艺方法、胶原蛋白分子结构与胶原蛋白性质三者之间的关系,提出了胶原蛋白高产率、生态提取的新的理念和技术思路。
2 胶原蛋白的分子结构
胶原蛋白的分子结构单元是原胶原。原胶原为细长的棒状分子,由三条肽链构成[1]。每条肽链由1000个以上的氨基酸残基构成,不含色氨酸,其中脯氨酸是胶原特有的氨基酸。胶原蛋白中甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸含量高,不能形成α螺旋或β折叠片结构,而是形成以三条称为α肽链或α链的多肽链(亚基)缠绕成特有的三股螺旋[2]。虽然各种类型的胶原蛋白都具有相似的螺旋结构特征,但组成胶原蛋白的各α多肽链的结构有很大的差别[3]。以I型胶原为例,其一级结构,胶原中含有较为伸展的左手螺旋区段以及非螺旋区段,在螺旋区段中则呈现出了(Gly-X-Y)n(其中X,Y代表非甘氨酸)的周期性排列。二级结构则由三条呈左手螺旋的肽链形成的右手大螺旋(如图1所示)。三股螺旋分子间以一定间距、呈纵向对称交错排列形成原纤维,再聚集成纤维,然后形成更大的纤维束。对于其他类型胶原的分子结构本文不作探讨。
A—电镜下胶原纤维呈明暗交替的条纹图案;B—胶原纤维中原胶原分子的排列;C—原胶原分子是一种右手三股螺旋;D—三股螺旋中的每股链是左手螺旋;E—三股螺旋的原胶原分子水平模型
3 胶原蛋白的提取方法
提取胶原蛋白工艺过程大致为:除杂、溶出、纯化三个阶段,具体操作方式和控制条件因皮源的不同而有所差异[4]。在几种胶原蛋白的提取方法中,酸法提取迅速而彻底,但色氨酸全部被破坏,丝氨酸和酪氨酸部分被破坏,且产品得率低;碱法提取迅速且彻底,但含羟基和巯基的氨基酸全部被破坏,且产生消旋作用(结构变异);酶法提取对胶原蛋白破坏性小,能更好、更完全地得到活性蛋白,但水解不够彻底[5]。酸、酶结合法相对于酸法溶解量提高。此外,还有酸碱结合法,酸碱与热水结合法等。
3.1 酸法提取
酸法提取是用酸浸泡预处理后的材料,再经离心等操作提纯的提取方法。常用的酸有:乙酸、盐酸、草酸、柠檬酸、醋酸以及乳酸等。酸法提取时,根据皮源的不同,所采取的工艺不同,其影响条件也不同。叶易春等通过对酸法提取猪皮胶原分析得出:酸法提取时,提取时间不同,其相对分子量及分布基本相同;pH对相对分子量的分布也没有太大的影响;温度较高,相对分子量分布宽且呈弥散分布。因此在酸法提取胶原时,应严格控制温度。户业丽等[6]以酸法提取鲟鱼皮胶原蛋白,通过正交试验得出:乳酸较乙酸、柠檬酸提取率高;随着乳酸浓度的增加,胶原蛋白的提取率也随之增加,但当浓度超过1 mol/L后,由于胶原蛋白变性导致提取率下降;在一定范围内浸提时间越长,胶原提取率增加越快,而后趋于平稳,最后还有可能会降低。同样地,在一定范围内,温度提高胶原提取率增加,但一旦超过某一温度时胶原易发生变性导致降低;固液比小,胶原提取率低,固液比高,提取率增加不大。其实验得出对胶原提取率的影响程度:酸浓度>提取时间>温度>固液比。酸法提取主要是利用在低离子浓度酸性条件下,破坏分子间盐键和Schiff碱,从而引起纤维膨胀、溶解,但是其溶解量很少[7]。研究发现,膨胀能力是胶原提取中的一个很重要的因素,因为它降低了胶原内部分子结构间的连接作用,打断非共价键连接使胶原打开[8]。因此,在酸法提取时,酸引起纤维的膨胀能力也是影响胶原提取难易的重要因素。另外,其他研究者就不同的动物皮进行了研究,发现影响酸法提取胶原的因素以及影响程度也不同。由此可见,在影响酸法提取的诸多因素中,p H的影响不大,但p H值过小胶原大分子带正电荷,因电荷之间的排斥作用使胶原不能形成稳定的凝胶;动物皮的种类以及对皮的预处理也是重要影响因素之一;酸的种类和浓度、以及提取温度和时间影响都较大。一般情况下,提取率随温度升高、时间延长而提高,但时间过长或温度过高导会导致胶原变性从而使提取率降低。
3.2 碱法提取
碱法提取是用碱溶解预处理后的材料,从而达到提取胶原蛋白的目的。预处理时除去皮中的脂肪、污渍、杂质等越好,就越有利于胶原蛋白的提取。
已经有人以碱法提取皮革废弃物中的胶原蛋白,其中最关键的是脱铬。碱处理法操作简便,脱铬率比酸法高,但采用该法只能得到相对分子量较小的胶原蛋白水解产物,应用价值并不太高[9]。与其他提取法相似,提取时间的延长在一定范围内可以使提取率增加。有研究者将鱼鳞长时间浸泡在强碱溶液中,发现容易造成肽键水解,会使大量的胶原蛋白降解,部分氨基酸解离,导致提取率很低[10]。
影响碱法提取的因素主要有碱浓度、提取温度、预处理、p H以及时间。一定范围内提高碱浓度有利于提高胶原蛋白提取率。一定范围内提高温度,有利于水解得到相对分子量较小的胶原产物,但超过范围会导致胶原的生物活性丧失。在温度升高时,碱对胶原蛋白的作用加强,肽键水解加快,胶原蛋白结构发生改变的可能性增大,温度过高将会破坏其三股螺旋结构。随时间的延长,提取率曲线也会出现先升高后降低的趋势。
3.3 酶法提取
酶法提取是在预处理后的材料中加入酶制剂,溶解材料,再经过其他操作提取胶原蛋白。
酶法提取常用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶以及胰蛋白酶等。酶水解产物的分子集中分布在某些相对分子量范围,该特点有利于将皮水解产物开发成高附加值产品[11]。
预处理一般是除去皮源中的不同杂物,如钙物质、脂肪等,以便后续操作,得到更多更纯的胶原。李国英等在通过优化预处理来提取胶原的研究中指出:对比而言,预处理主要集中在去钙上,因为那些无机物质中最主要的成分是钙,钙会降低胃蛋白酶活性从而影响胶原提取率[12]。可见预处理对于胶原提取率的影响较大。
目前国内采用酶法提取胶原时的水解温度基本在50℃以上或4℃以下,而胶原在37~38℃以上就会变性,生成明胶,故较高温度下的提取物为变性胶原,其进一步应用受到限制[13]。低温下虽然有助于胶原结构的完整,但酶解时间长。提高酶解温度,有利于提高酶解速率,缩短酶解时间。所得胶原纯度降低、热稳定性减弱、三股螺旋结构有一定程度的破坏,可能是因为温度升高后,胃蛋白酶中的少量胶原酶活性增加,开始作用于胶原螺旋区,从而导致相关特性的减弱[14]。当胶原蛋白在高于某一临界温度(变性温度)时,胶原的生物活性丧失、溶解度降低、不对称性增高,其它一些物理常数也会发生改变,即产生了变性作用[7]。此变性作用是因为当温度升高到胶原蛋白的热变性温度以上的时候,胶原蛋白吸收的能量超过了分子间作用力,从而导致胶原蛋白三股螺旋链被破坏,三股螺旋链从伸展的纤维状态转变成无规卷曲状态。三股螺旋结构对于胶原蛋白在医学方面的应用有很大的影响,因此应根据其应用特点选择相对合适的提取方法。酶法提取的猪皮胶原就保持了完整的三股螺旋结构,这是胶原作为特种生物材料应用于生物医学领域的基础[15]。
在特定的pH值、温度等条件下,酶促反应的反应速率随着时间延长呈逐步变小的趋势。在胃蛋白酶水解猪皮的过程中,酶作用底物的浓度随作用时间的延长逐渐降低,而胶原产物的浓度逐渐升高并趋于稳定[16]。因此在酶法提取胶原蛋白时,应适当控制时间,不宜太长。
酶法水解提取胶原的影响因素主要有酶的用量、水解p H、水解时间、以及水解温度[17]。酶法提取胶原的一般提取工艺为:预处理→酶解→盐析→透析→冷冻干燥[14]。用酶解法提取胶原蛋白是目前比较理想的手段,它具有反应快、时间短、对环境友好,提取胶原蛋白纯度高、水溶性好、理化性质稳定等特点[18]。
3.4 结合法提取
结合法是指将酸法、碱法、酶法及热水法等互相结合运用在提取胶原蛋白上。结合法是现在很多研究者正在做的工作,以期通过此法克服各种单一方法的不足,得到高提取率的胶原蛋白。Keiji Yoshimura等以酸碱结合法提取胶原蛋白,先以碱预处理,再以酸提取。当碱预处理时间缩短,酸浸提的胶原量就会减少。与此相反,碱预处理时间越长,在预处理中胶原的损失就会增加[19]。酸碱结合法提取的胶原产物稳定性较高,质量也较好。潘杨等以酸碱法与热水浸提结合法提取鱼鳞胶,得到的胶原纯度高,品质良好。其中料液比对其影响最小,而酸碱的浓度影响较大,呈现出先增大后减小的趋势;随浸酸时间延长,提取率先稍有下降后升高,再趋于平稳,最后降低[20]。
4 胶原蛋白提取的影响因素分析
胶原的来源不同,热稳定性也会有差异,这在一定程度上反映出胶原中亚氨基酸(脯氨酸和羟基脯氨酸)含量的高低。一般亚氨基酸的含量越高,螺旋越稳定[21]。因此,皮源不同,羟脯氨酸与脯氨酸含量不同,胶原稳定性不同。含量越高,胶原越稳定,越难提取出。
性质依赖于结构,胶原的稳定性就是其特殊结构的外在表现[21],胶原的结构及氨基酸组成决定了胶原蛋白结构的稳定性。在各种氨基酸组成中,脯氨酸的羟基化程度有种属差异,生活在低温环境中的动物,其胶原蛋白上的脯氨酸羟基化程度较低,脯氨酸的羟基化对于原胶原单体之间形成氢键是必需的,因而对于原胶原三螺旋结构域的热稳定性具有相当大的作用[22]。影响胶原提取的因素有皮源、预处理情况、提取液浓度、p H、提取温度、提取时间、有的还有提取液固液比、提取工艺等。这些因素都是相辅相成的,其中皮源是一个重要因素,皮源不同直接关系到胶原提取的难易程度,一般是根据不同皮源制定不同提取方案。预处理是一个很重要的步骤,去杂、去钙以及去脂等都对后续操作有较大的影响,很好地除去材料中的杂质有利于提高胶原蛋白的产率。应适当控制提取液中酶、酸、碱的浓度,浓度过高的酸或碱,或者预处理时间过长都会导致胶体强度降低[23]。一定范围内提高提取温度提取率增加,但超过一定的范围反而降低,也容易导致胶原变性,因此应注意了解胶原的变性温度;p H的影响会因皮源的不同而不同,当p H高于或低于p I时,蛋白质分子净电荷残余物较多,由于链间斥力溶解性增大(Vojdani 1966),与之相对,若蛋白质分子间总净电荷为零,疏水基之间作用增强,从而导致在p I处聚集沉淀[24]。因此在溶解时,注意控制p H值。适当延长提取时间也有利于胶原的提取,但过长,反而会使提取率降低。因此,要得到高产率胶原蛋白,应该了解各种提取方法的影响因素,选择最优方案。
5 结束语
近年来,随着科学的不断发展,皮胶原因其良好的生物活性,很多其他材料无法与之媲美,尤其在医学方面。Eileen Gentleman等研究胶原在组织工程中的应用时指出,胶原在组织工程中的应用是一个很好的选择,它是具有很好生物降解性的天然材料,可以重建组织,最终在体内形成新的胶原,代替原来的胶原[25]。在提取胶原蛋白时,提取方法应与胶原产品的最终用途相结合,有选择性地最大程度保留胶原蛋白某些方面的生物学性能。总之,今后的胶原蛋白提取应该是继续朝着高产率、清洁化的生态提取的方向发展,在了解各种不同的胶原蛋白提取方法的基础上,考虑其对环境的影响,将提取过程中所产生的对环境的影响因素降到最低。此外,通过对高纯度的、具有生物活性的胶原蛋白进行改性,获得高性能的生物医学材料,也将成为研究的热点和重点。
摘要：综述了胶原蛋白的提取方法,阐述了提取条件对胶原蛋白结构的影响,探讨了不同胶原蛋白的结构与性质之间的关系。
乳与乳制品中动物水解蛋白的检测 篇7
水解动物蛋白是一种优质蛋白质, 其蛋白含量竟高达90%之上, 其是明胶、干酪粉、鱼粉等原料的水解最终产物, 主要成分是低分子的多肽, 可以起到则增加口感的作用。它含有18类氨基酸, 有7种是人体必需的;还含有人体需要的多种微量元素。除此之外它也是良好的天然生理性物质, 水溶性好, 营养价值高, 不含有胆固醇, 极利于人体消化和吸收。就是这样的营养价值让一些不法分子有机可乘趁机牟取暴利, 昧着良心挣黑心钱, 他们利用废弃的皮革、毛发、动物骨骼制备。例如, 2012年毒胶囊事件, 把皮革的下脚料通过药用胶囊进入人类胃肠, 造成人类重金属中毒。还有的不法分子为了获取更高利益, 在酸奶和果冻中添加, 祸国殃民。铬是毒性很大的重金属, 聚集体内不易排出, 具有致癌性并可能诱发基因突变。因此需求一种合适准确快捷的方法迫在眉睫, 通过自己多年的实验室经验, 在前辈们的操作基础上进行改进, 得出一套简单方面快捷, 投资少的方法, 便于一些小的实验室、学校、企业开展。下面就工作中实际开展应用展开讲解。
试剂
所用试剂均为分析纯, 水为蒸馏水 (同等纯度的水) 。
0.75%溶液氯化亚锡。
准确称取7.5 g氯化亚锡溶解于500 m L蒸馏水中, 然后再加入浓盐酸500 ml, 摇匀备用。
6 mol/L盐酸溶液, 准确量取540ml盐酸注入1 000 ml水中, 摇匀备用。
1 mol/L氢氧化钠溶液:精确称取40克氢氧化钠溶于1 000 ml水中, 摇匀备用。
10 mol/L氢氧化钠溶液:精确称取400克氢氧化钠溶于1 000 ml水中, 摇匀备用。
缓冲液:精确称取柠檬酸10g, 氢氧化钠5.26g, 结晶乙酸钠29.22g共同溶于240蒸馏水中, 再加入正丙醇60m L, 摇匀备用。
氯胺T溶液 (现用现配) :精确称取氯胺T1.41g, 溶解在10m L蒸馏水中, 再加入正丙醇10m L混匀, 最后加缓冲液80m L, 摇匀备用。
显色剂:精确称取对二甲氨基苯甲醛10g, 溶解在高氯酸35m L中, 在加异丙醇65m L, 摇匀备用, 存放在冰箱内。
羟脯氨酸储备液:精确称取50.0mg L-羟脯氨酸置于100 m L容量瓶中用水溶解, 定容至刻度 (加几滴6mol/L盐酸溶液助溶) 摇匀存放冰箱作为储备液。
标准液5μg/m L:准确吸取羟脯氨酸储备液1.00m L于100m L容量瓶中, 加水至刻度, 摇匀备用。
仪器和设备
PH酸度计
载玻片
250m L磨口三角瓶
恒温水浴锅, 可控温于60℃
紫外可见分光光度计
滤液的制备
精确称取10 g样品 (精确至0.001g) 置于250 m L磨口三角瓶内 (不要使样品粘在壁上) , 加入100 m L0.75%氯化亚锡溶液, 放在60℃水浴锅上, 盖上载玻片加热反应16 h (此操作受酸影响即时水解为黑色也不影响结果) 。取出趁热过滤于容量瓶中, 用热的 (40℃) 6 mo L/L盐酸10 m L分三次 (3+3+4) 反复冲洗磨口三角瓶及滤纸, 冷却至室温后, 加水定容至刻度 (200 m L) , 摇匀。准确吸取25 m L滤液放在100 m L烧杯中, 使用PH酸度计调节p H为8±0.2 (10 mol/L、1mol/L氢氧化钠溶液) , 然后过滤, 用30 m L水分三次反复冲洗烧杯和滤纸, 用水定容至250 m L容量瓶, 摇匀备用。
测定
标准曲线的绘制
依次吸取标准液 (5ug/m L) 0.00, 10.00, 20.00, 30.00, 40.00m L, 分别置于100m L容量瓶里, 加水定容摇匀。浓度分别为0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0μg/m L。依次取上述不同浓度溶液4.00m L, 分别放入20m L具塞试管内, 加2m L氯胺T溶液, 摇匀, 室温条件下静置20 min后。再加入2m L显色剂, 摇匀, 加塞子放在60℃水浴锅中恒温保持20min后取出, 及时降温, 在波长558±2nm处及时进行比色测定吸光值 (见表1、图1) 。
样品测定
准确吸取制备好的待检液4.00m L放入20m L具塞试管中, 以下按4.1步骤进行, 同时作空白试验。
计算
5C公式:X=───m V1式中:X——样品中应含有的L-羟脯氨酸含量, %;C——通过标准曲线查到的相应L-羟脯氨酸量, μg;m——称取样品质量, g;V1——吸取滤液的体积数, m L。
结论
动物蛋白质 篇8
近年来, 由于农村经济发展及城乡结构发生变化, 养猪散户数量下降, 规模化养猪场大量涌现, 我国养猪业结构和规模发生了新的变化, 养猪业正由粗放经营逐渐向现代化生产转变。随着养殖规模的不断加大, 养殖生产管理过程中各种疫情发生的风险也在不断增加, 许多养殖场不得不使用大量的抗生素来预防疫情的产生。然而, 随着科学认识的深入, 人们在获得经济效益的同时, 对抗生素所带来的副作用有了更深刻的认识。抗生素的长期或超量使用会使病原菌产生耐药性, 并在畜禽产品中残留而给人体健康带来危害, 为此, 国内外动物营养专家从仔猪营养供应体系出发做了大量的研究工作。随着动物营养科学研究的深入、生物工程人技术的发展, 微生态制剂、酶制剂、寡糖制剂、草药制剂等相继出现, 并成为饲用抗生素替代品研究的热点, 也为无抗饲料开发提供了技术可能[3]。本文重点介绍一种由新型寡糖制剂、4种微生态制剂和以大米为原料的酵母蛋白组成的新型无抗、无动物蛋白的仔猪日粮。
1 壳寡糖
壳寡糖 (COS) , 广义上是指分子量一万以下、水溶性好的低分子壳聚糖;狭义上, 是指聚合度 (DP) 为2~10的氨基葡萄糖低聚物。华中农业大学生命科学技术学院发酵工程实验室通过酶解法制得的COS是具有安全性可靠、水溶性较好、功能作用大、生物活性高等特点的低分子量产品, 具有壳聚糖所没有的较高溶解度、容易被生物体吸收等诸多独特的优点, 也具有更独特、优越的生理特性。
1.1 抗菌作用
Liu等[4]测定了分子量从5 000到1.08×106的7种壳聚糖抑制大肠杆菌的能力, 认为当分子量为5 000~9.16×104时, 其抑菌能力随分子量增加而增加;当分子量在9.16×104~1.08×106时, 其抑菌能力随分子量增加而下降。郑连英等[5]考察了不同分子量壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌性能, 初步找出了壳聚糖分子量和浓度对抗菌、抑菌作用影响的规律, 发现分子量在30万以下时, 壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抗菌作用随分子量减小而逐渐减弱;壳聚糖的抑菌效果是受其分子量影响的, 而且因为其针对的菌种不同影响效果也不同。壳寡糖结构中最主要的特征基团是氨基, 这些氨基被证明在抑菌作用中起了重要作用。最被广泛接受的一种作用机理是认为壳寡糖能改变细胞膜的渗透性, 从而阻止营养物质进入细胞或引起细胞组分的流失, 最终导致细菌死亡。壳寡糖富含阳离子的特性使其能与含负电荷基团的真菌发生反应, 从而对霉菌和酵母菌表现出抑制特性。
1.2 降低胆固醇的作用
低聚壳聚糖具有吸收胆汁酸和促使胆汁酸排出体外的作用, 小肠内胆汁酸的减少促使肝内胆固醇向胆汁酸转化从而降低肝脏中胆固醇的含量。也可与脂肪、脂肪酸、胆固醇等脂类物质结合成络合物, 产物具有很强的疏水性, 不被胃酸水解, 不被消化系统吸收, 而随粪便排出。Sugano等[6]报告壳聚糖分子量在2 000以上有降血脂作用, 分子量为5 000时降胆固醇能力很强。
1.3 抗肿瘤免疫促进作用
低聚壳聚糖保持有壳聚糖增强免疫力、抗肿瘤的活性, 并且活性更高, 特别是聚合度6~8的壳聚糖。1986年, Suzuki等[7]就曾发现聚合度为4~7的低聚壳聚糖具有直接抑制肿瘤的作用。据推测, 其作用机理是通过活化人体的淋巴细胞、抑制癌细胞毒素的释放以及在正电荷的驱动下吸附到肿瘤细胞表面, 从而表现出较强的抑制肿瘤细胞生长和转移的功能。动物体的非特异性免疫系统启动迅速并能对侵入的微生物作出普遍广泛的响应。免疫增强剂通常被认为是能通过增强吞噬细胞 (巨噬细胞和中性粒细胞) 的防卫能力来增强非特异性免疫系统的功能。大多数免疫增强剂可以特定结合巨噬细胞或淋巴细胞上的受体蛋白, 然后产生响应物质 (如干扰素、白介素、补体蛋白等) , 这些免疫因子能刺激免疫系统。除此之外, 一些免疫增强剂可以和被感染机体中目的细胞上特定的受体分子竞争。
2 粪肠球菌
粪肠球菌也称为粪链球菌, 是乳酸菌中的一种, 该菌是一种兼性厌氧菌, 能产生多种酶和维生素 (主要是B族维生素) , 在动物体内可产生大量乳酸、分解酶和多种促生长因子。具有以下作用。
1) 可调节畜禽肠道菌群平衡, 改善肠道内有益菌的生存环境, 切断病原菌侵袭途径, 抑制有害菌的生长, 激活巨噬细胞, 促进机体免疫应答, 全面提高动物的抗病能力。
2) 在动物体内代谢可产生大量的消化酶, 优化肠道内多酶消化体系, 还可产生较多的B族维生素、有机酸、促生长因子等, 可有效改善粗饲料营养不足, 促进消化吸收。
3) 分泌的乳酸可使肠道的p H值降低, 促进维生素D及钙、磷、铁等矿物质的吸收, 进而可促进肉鸡、猪等肉用动物的生长。
4) 可降低料蛋比, 提高产蛋率, 延长产蛋高峰期, 预防性添加可以延长种鸡、蛋鸡的产蛋高峰期。
5) 可提高断奶仔猪的消化能力, 加速仔猪免疫器官的发育, 促进其尽早尽快成熟;可改善饲养环境, 将氨气浓度降低70%以上, 减少呼吸道疾病和眼病的发生。
3 枯草芽孢杆菌
枯草芽孢杆菌属好氧益生菌, 不仅在饲料中应用比较广泛, 在污水处理及生物肥发酵或发酵床制作中应用也相当广泛, 是一种多功能微生物。
3.1 生物夺氧
枯草芽孢杆菌为需氧菌, 在生长过程中需要大量的氧气, 进入动物肠道内后, 可消耗大量的游离氧, 降低肠道内氧浓度和氧化还原电势, 改善乳酸杆菌、双歧杆菌等厌氧菌的生长环境, 保持肠道微生态系统的平衡, 提高动物机体抗病能力, 减少胃肠道疾病发生几率。
3.2 抗菌作用
动物饲喂枯草芽孢杆菌后, 能显著降低肠道大肠杆菌、产气荚膜梭菌及沙门氏菌的数量, 使机体内的有益菌增加而潜在的致病菌减少, 因而排泄物、分泌物中的有益菌数量增多, 致病性微生物减少, 从而净化体内外环境, 减少疾病的发生。
3.3 提高免疫力
枯草芽孢杆菌能促进动物肠道相关淋巴组织处于高度的免疫准备状态, 同时使免疫器官发育加快, 免疫系统成熟快而早, T、B淋巴细胞数量增多, 动物体液和细胞免疫水平提高。
3.4 促生长和促消化
枯草芽孢杆菌在动物肠道内生长繁殖, 能产生多种营养物质如维生素、氨基酸、有机酸、促生长因子等, 参与动物机体新陈代谢。同时枯草芽孢杆菌能提高动物生产性能是其产生多种消化酶的一个重要体现。研究表明, 枯草芽孢杆菌能产生多种消化酶, 帮助动物对营养物质的消化吸收。枯草芽孢杆菌具有较强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性, 同时还具有降解饲料中复杂碳水化合物的酶, 如果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等, 这些酶能够破坏植物饲料细胞的细胞壁, 促使细胞的营养物质释放出来, 并能消除饲料中的抗营养因子, 减少抗营养因子对动物消化利用的障碍。
4 凝结芽孢杆菌
凝结芽孢杆菌, 革兰氏阳性菌, 属于肠道乳酸菌, 又称为有孢子性乳酸菌, 可以产生芽孢, 对环境有很强的抗性。凝结芽孢杆菌是益生菌领域中的后起之秀, 不仅具有乳酸菌和双歧杆菌的保健特性, 还具有较强的耐高温、耐酸、耐胆盐的抗逆性。除此之外, 还对肠道内的致病菌有较强的抑制作用;能分解糖类生成L-乳酸, 为同型乳酸发酵菌。
4.1 调节动物消化道的微生态平衡
凝结芽孢杆菌为兼性厌氧菌, 当其进入肠道后会消耗游离氧, 并在肠道内定植, 降低氧化还原电势, 有利于肠道内厌氧微生物 (如乳酸菌和双歧杆菌) 的生长, 从而达到肠道内微生物的菌群平衡, 提高机体的免疫力和抗病力, 减少肠道疾病的发生, 促进动物生长。凝结芽孢杆菌以活菌状态进入动物肠道比以死菌 (细胞组成部分和代谢产物) 状态进入肠道内的功效要好得多, 其主要原因是死菌不能在肠道内消耗游离氧, 也不能定植, 不能促进肠道内厌氧菌的生长, 只能从死菌的细胞和代谢产物的营养成分中供给肠道一部分养分。
4.2 促进动物机体的消化作用
动物摄取的营养物质进入机体后, 需要经过一系列的理化作用才能被吸收利用。凝结芽孢杆菌以2种方式影响机体的消化作用:一是通过促进多种消化酶的分泌来提高对营养物质的消化和吸收;二是通过凝结芽孢杆菌在动物消化道内生长、繁殖和定植, 直接产生多种营养物质 (如维生素、氨基酸、短链脂肪酸等) 来增加小肠蠕动的速度, 改善肠道消化功能, 进而促进机体对饲料中各种营养成分的消化和吸收。
4.3 改善动物机体的免疫功能
周映华等[8]研究凝结芽孢杆菌对断奶仔猪生长性能影响的试验结果表明, 在断奶仔猪日粮中添加0.05%的凝结芽孢杆菌能明显提高日增重、饲料转化率和粪便中乳酸菌和双歧杆菌的数量, 显著降低腹泻率和粪便中大肠杆菌的数量。对断奶仔猪表现出较好的促生长和防治腹泻的作用, 从而改善其肠道菌群平衡, 提高断奶仔猪的生产性能和养殖效益。李国建[9]在生长育肥猪中用凝结芽孢杆菌替代抗生素, 研究凝结芽孢杆菌对生长育肥猪的影响, 研究结果表明, 在生长育肥猪饲料中添加凝结芽孢杆菌制剂可显著提高猪的平均日增重, 降低饲料成本, 饲养效果与抗菌药没有显著差异。
5 丁酸梭菌
丁酸梭菌, 又名酪酸菌, 是梭状芽孢菌属中的一个种, 是1993年由日本千叶医科大学宫入近治博士首先发现并报告的, 因此又叫宫入菌。1935年, Kingimiyairi博士从人的粪便和土壤中分离出丁酸梭菌, 随后发现其厌氧培养的过滤物中含有较少的脂肪酸, 具有极强的整肠作用, 可抑制肠道中的致病菌, 促进肠道中有益菌 (如双歧杆菌和乳酸杆菌) 的生长。
5.1 维持肠道菌群平衡
肠道菌群失衡会导致许多消化道疾病的发生。丁酸梭菌作为一种有益菌, 对人体和动物没有毒害, 可以抑制葡萄球菌、念珠菌、克雷伯菌、弯曲杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒沙门氏菌以及腐败菌的生长, 从而减少了胺类、硫化氢等有害物质。丁酸梭菌还可促进肠道有益菌的繁殖, 王松丽等[10]在37℃条件下, 对丁酸梭菌与鼠李糖乳杆菌进行了混合培养, 结果显示两者在混合培养体系中表现出良好的互惠共生关系, 混合培养生物量较纯培养生物量分别增加80.0%和51.7%;朱晓慧等[11]研究了丁酸梭菌对双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪链球菌的增殖作用和共生关系, 表明3种菌在共培养条件下, 活菌数分别增长了约24%、43%和7%;张雪平等[12]研究得出丁酸梭菌与婴儿型双歧杆菌混合培养后对几株肠道致病菌有更强的抑制作用
5.2 增强免疫功能, 预防肿瘤发生
试验证明口服丁酸梭菌能增加人和动物体内血清中免疫球蛋白的含量。丁酸梭菌的细胞壁成分及其产生的胞外多糖半乳糖葡萄糖能抑制肿瘤细胞的生长。用加热灭活丁酸梭菌制成的疫苗有激活细胞和巨噬细胞的作用。有人用小鼠肝癌H22株建立移植肝癌小鼠模型, 1株丁酸梭菌作抑瘤试验, 得出这株丁酸梭菌对小鼠移植肝癌的抑制作用是强的, 且与环磷酞胺联合治疗时抑癌作用更强, 有望成为临床上的抗肿瘤药[13]。
5.3 产生益生产物
在肠道内丁酸梭菌能产生B族维生素、维生素K等物质, 从而能够促进人体健康。对维生素K缺乏具有高度敏感性的家禽进行试验证明, 丁酸梭菌能在肠道内产生动物体必需的维生素K[14]。丁酸梭菌在肠道内还能产生淀粉酶、蛋白酶、糖普酶、纤维素酶等。特别是, 日本学者发现肠道中丁酸-拜仁梭菌组中的菌产生内切和外切果胶的裂解酶和果胶甲基化酶, 能把肠道内的果胶降解为中间产物, 最终分解为挥发性短链脂肪酸—乙酸和少量丁酸及甲酸。丁酸梭菌的主要代谢产物为丁酸, 而丁酸是肠道上皮组织细胞的再生和修复的主要营养物质, 因此, 丁酸梭菌对肠道上皮组织的再生和修复有很重要的意义。
5.4 稳定性好
丁酸梭菌属于芽孢菌, 能产生内生芽孢, 所以生存能力较强, 能耐热、耐酸、耐胆汁、耐抗生素。在人体内不受胃酸、胆汁酸等影响, 因此在体内外都能长期生存不失活。丁酸梭菌对青霉素、氨苄西林、链霉素等抗生素有一定的抗性, 因此可和抗生素合用, 提高疗效, 被广泛用于医药、功能性保健食品和动物饲料的添加剂中。
6 大米蛋白
长期以来大豆蛋白是猪饲料中的主要蛋白源, 其蛋白质含量丰富, 氨基酸组成适宜, 赖氨酸、苏氨酸、色氨酸和异亮氨酸含量较高, 但大豆中含有多种抗营养因子 (如抗胰蛋白酶因子、植物凝集素等) , 会引起仔猪肠道的暂时过敏性反应, 使肠绒毛大量脱落、隐窝加深, 降低消化面积, 导致肠道营养物质吸收不良、绒毛萎缩和腹泻。
许多研究表明, 大米蛋白是优质蛋白, 具有氨基酸组成合理、低过敏性等特点, 是蛋白质中的佼佼者。以大米渣为基础, 培养生产酵母, 可使原料中蛋白质成分提高5%~15% (即蛋白质含量达60%以上) , 酵母蛋白可利用比率高达80%, 氨基酸组分齐全, 富含VB族, 营养价值和鱼粉相近, 可替代鱼粉利用, 具有可消化性, 适口性好, 是一种优良的饲料添加剂, 尤其对幼畜和消化不良动物有更好的饲养效果。大米蛋白氨基酸组成平衡合理, 与动物的营养需求非常接近。大米蛋白低抗原性是其有别于其他植物蛋白食物的另一个特点。很多植物性蛋白中含有抗营养因子, 如大豆和花生是常用的植物蛋白质来源, 但大豆和花生含有对人体有害的胰蛋白酶抑制素和凝血素, 大豆中还含有胀气因子棉子糖、水苏糖等;而大米蛋白不含类似致敏因子, 安全可靠。
随着人们生活水平的提高, 对于肉制品的需求量与日俱增, 同时也造成了养殖业对饲料蛋白的需求量日益增加。但是据联合国粮农组织统计, 目前全球蛋白质短缺量是比较严重的。鱼粉是高质量动物蛋白质饲料, 为当今动物平衡日粮的重要组成部分, 富含蛋白质、脂肪酸、维生素、矿物质等营养成分, 氨基酸组成较为平衡, 各种必需氨基酸含量丰富且含有未知的促生长因子。但是由于对鱼粉的需求量增大, 使得近几年鱼粉价格飙升, 养殖业的成本不断提高。例如以秘鲁普通级别鱼粉为例, 2012年鱼粉价格从1月份的约7 500元/t上升至13 500元/t, 最终年末成交价是13 000/t。2013年7月份统计的数据显示全国的鱼粉价格也是13 000/t。鱼粉的成本价格高昂已经成为制约养殖业发展的重要因素。
自20世纪末, 世界各国开始研究把农副产品废料直接转化为养殖业急需的微生物饲料蛋白。而我国现阶段的畜牧业发展过程中蛋白质资源缺乏是很严重的。国内以大米为原料的味精厂、葡萄糖厂、酒厂、麦芽糊精厂等在利用完大米淀粉之后产生了大量的副产物米渣, 其潜在的发展前景是非常广阔的。针对目前畜牧业蛋白类资源短缺的现状, 能有效和合理的利用米渣, 是对工业及农产品废渣的资源优化利用。面对当今发展趋势, 国家提出了以畜牧养殖业带动农村经济的发展战略, 这就对我国饲料资源开发与饲料添加剂的开发提出了更高的要求, 同时也对糟渣发酵蛋白饲料产业带来了发展的商机。因此, 加快我国糟渣酵母蛋白饲料产业化生产、推广及应用步伐, 不仅能提高我国蛋白质生产能力, 占领可观的市场份额, 而且可以降低农产品的生产成本。
7 小结
动物蛋白质 篇9
1 分类、结构特点及分布
PRPs是一类生物活性多肽, 由大概有80多个多肽分子所构成, 通过高效液相色谱, 可以将PRPs大致分成四大家族:PRP1 (分子量2 500~5 000) , PRP2 (分子量1 000~2 500) 和PRP3 (分子量500~1 000) , SPRR4, 每个家族又包含小的亚型。SPRR2一共有11个亚型 (2A-2K) [1], 其余家族有1个或几个亚型, 如SPRR1只有1A与1B两个亚型。
SPRRs在结构上具有同源性, 但又存在各自的特点。SPRR3具有富含赖氨酸和谷胱酰胺的N端与C端, 其间被含有23个保守的8残基重复序列的中央域所隔开;SPRR1具有与SPRR3同源的赖氨酸和谷胱酰胺末端, 不同的是中央域有13或14个8残基重复序列;SPRR2同样具有赖氨酸和谷胱酰胺的末端, 且与其它家族的SPRR同源, 但其中央域包含9个脯氨酸残基重复序列;赖氨酸和谷胱酰胺残基位于末端的交联体内, 在体内起到与其它蛋白交联的作用[2]。
SPRRs主要存在于机体不同组织的上皮及屏障系统中。RANSOM等利用正负筛选的方法在成年绵羊瘤胃上皮中鉴定出两种编码SPRR蛋白的克隆, 且这两种SPRR参与上皮发育过程中颗粒层的形成, 具有形成角化被膜的功能[3]。在一些实验中发现, PRP1在免疫应答中并不活跃, 发挥生理作用的主要是分子量较小、肽链较短的PRP2和PRR3。由于人体的咽喉是呼吸道和食道的第一道守卫, 是各种感染的“多发地”, 所以也有机构通过专利技术, 将PRPs制作成液体的喷雾包装, 通过往咽部直接洒喷, 促进吸收, 使增强免疫的功效在第一时间得到发挥[4]。
2 不同因素对SPRRs表达的影响
2.1 紫外线
在转谷氨酰胺酶抑制剂存在或不存在的情况下, 检测了十二种蛋白基因的表达。通过免疫荧光染色、Western blot与半定量PCR检测分析发现, SPRR 1和SPRR 2分布在角膜以及周围角膜缘上皮中;SPRR 2在HCECS细胞质中表达。在紫外线作用后, SPRR2A与2B表达量下降。GIBBS等[5]采用紫外照射, TPA诱导及融合质粒与脂质体转染的方法在分子水平上研究SPRR2基因的调控。结果表明, SPRR2的启动序列包含全部紫外线诱导因子, SPRR2的表达受紫外线的调控。
2.2 激素、体内因子及环境因素
在雌性小鼠生殖系统中, SPRR2基因的表达随生理周期变化而变化, 当雌性小鼠处在发情期时, 雌激素水平升高, SPRR2的表达量升高[6]。SEOK HO HONG等利用雌二醇作用于去势的成年雌性大鼠, 运用激光捕获显微解剖 (Laser capture microdissection, LCM) 和定量PCR技术检测特定的子宫细胞、腔上皮细胞、间质细胞与肌肉细胞中SPRR2分别在发情前期, 妊娠早期表达的变化。实验结果表明, 雌激素能使SPRR2A、2B、2D、2E、2F与2G表达上调。而且SPRR2基因在小鼠子宫中的表达对雌激素与EDs存在剂量依赖关系, EDs与雌激素受体拮抗剂可抑制SPRR2的表达。SPRR2基因表达的同时也受到雌激素信号因子的调控[7]。
除了雌激素, SPRRs基因在例如睾酮、转录因子增强子结合蛋白等因子的调节下表达下调[8,9]。
白细胞介素 (IL-6) 在体内也影响SPRRs的表达。NOZAKI等[10]利用高密度寡核苷酸微阵列技术、SYBR绿色荧光实时定量PCR技术、免疫组化、Western blot与原位杂交等方法研究发现, 在胆管损伤与屏障机制受损后, IL-6开始产生, IL-6 gp/130信号传导首先受STAT3的调节, 导致胆管上皮细胞中SPRR2非协调表达;在胆管结扎后给予IL-6的实验鼠中, SPRR2高表达。结果表明, 在胆管上皮中, IL-6/gp130/STAT3信号可上调SPRR2的表达以促进胆管屏障系统功能。
GIBBS等[11]在研究表皮在真皮上重建的过程中发现, 培养温度与生长因子对SPRR的表达存在影响。在33℃或37℃时, 培养基中有或无生长因子时, 表皮形态均相似, SPRR2在颗粒层有表达而SPRR3并没有;在33℃并含有EGF的培养基中, 表皮重建出现杂乱的基底层而无颗粒层, SPRR2与SPRR3的表达延伸至刺状层。PELEGRINO等[12]发现, 在低湿度环境下引起的小鼠角膜屏障损伤模型中, SPRR2的表达升高。
另外, 郑亮等[13]在研究中还发现, 一氧化碳 (CO) 诱导SPRR1A表达上调, 同时抑制组织的纤维化过程。
2.3 肿瘤、病毒因素
在一些病理条件下, 例如肿瘤、病毒感染等可导致SPRRs基因表达的变化。LEHR等[14]研究了人乳头瘤病毒 (Hunan Papiloma Virus, HPV) 对SPRR2与SPRR3表达的影响。结果显示, HPV病毒不会导致被感染的角质细胞溶解, 其准确的机制还不清楚, 但角质细胞的分化、角质化细胞被膜的发育为宿主细胞提供了保护屏障。采用RT-PCR检测发现, 感染或者未感染HPV11 (低风险) 或HPV59 (高风险) 病毒后, 上皮组织中有SPRRs基因的表达, 免疫组化与免疫印迹分析发现, SPRR2B的转录在感染HPV11或HPV59的组织中有所提高;SPRR3的转录在HPV11感染的组织中显著提高而在HPV59感染的组织中略微提高;SPRR2B的转录与SPRR2A相比略微提高;SPRR3蛋白未在未感染的上皮组织中发现。DALIBORKA等[15]利用微阵列方法绘制了皮肤细胞全基因表达谱, 并利用q RT-PCR和免疫组织化学分析了在转基因小鼠中与HPV8致癌基因相关的反常细胞基因的表达。研究结果显示, 在HPV8转基因小鼠中, 乳头状瘤的形成提高了SPRR2的表达。
RUIDE等[16]采用Western blot、免疫组化及细胞HE染色的方法, 对63例支气管癌的样本进行分析, 结果显示, 在四种类型的肺癌细胞中, SPRR1 100%存在于鳞状支气管癌细胞中, 是鳞状支气管癌特征性标志。此外, 在食管鳞状细胞癌病变时, 食管鳞状上皮细胞中SPRR3表达下调, SPRR3可作为健康粘膜的生物标记[17]。
其他一些研究还显示出SPRRs基因在机体病理条件下发挥着作用。例如, SPRR2A的表达在胆管癌发生过程中, 能够促进局部肿瘤的攻击性但能阻止其转移[18];SPRR3在乳腺癌晚期或者无淋巴转移的阶段过表达, 通过信号传导增强P53因子的退化, 促进乳腺癌细胞的增殖[19];而对于结直肠癌而言, SPRR3表达上调, SPRR3过表达不仅促进结直肠癌细胞增殖, 而且还与结直肠癌中与淋巴浸润相关[20]。SPRR3过表达可失去线粒体膜电势和增加食管癌细胞系半胱天冬酶3的活性, 进而提高细胞对于DNA损伤诱导的凋亡反应的灵敏度[21]。
2.4 其他疾病因素
临床除肿瘤、病毒外, 其他一些疾病同样影响着SPRRs的表达。
在湿疹中, 表皮分化复合体蛋白的功能受20种基因多态性的影响, 其中的四种基因突变, 可能改变了CE的物理性质, 研究显示SPRR3基因的24个碱基对缺失突变的比例最高, 说明SPRR3与湿疹密切相关[22,23]。
ZIMMERMANN等[24]利用不同的过敏原制造哮喘模型, 发现SPRR家族中的两个成员SPRR2A、SPRR2B参与了病理过程;原位杂交实验表明, 在给与过敏原之后, SPRRs存在于支气管上皮细胞与炎症相关的单核细胞中;研究结果还显示SPRR2由过敏原诱导产生而在肺中积累, 且具有时间依赖性 (在10~96 h达到高峰) ;同时, 白细胞介素-13的过表达可诱导SPRR2表达上调, SPRR2的表达依赖于STAT6信号通路的作用。SPRR2在病理生理学方面有重要作用。
EPSTEIN等[25]同样发现SPRR2B单核苷酸多态性表现在白人儿童湿疹与哮喘疾病中, 推断SPRRs基因多态性可作为综合型湿疹和哮喘重要的标志。
GRZANKA等[26]制造了皮肤过敏性损伤模型, 研究匹美莫司 (PIM) 对皮肤屏障功能失调相关基因表达的影响, 与未损伤皮肤相比, SPRR2C在损伤皮肤中显著表达而在PIM作用后显著下降;SPRR1A表达也升高但在PIM作用后下降不是很明显;SPRR4在损伤皮肤中表达显著下降, 但在PIM作用后没有明显变化。JARZAB等[27]采用实时定量PCR分析了慢性异位过敏性皮炎中相关基因的表达情况, 发现SPRR1A与2C表达上调。
另外, PYLE等[28]在研究动脉粥样硬化疾病的过程中, 发现血管平滑肌中SPRR3高表达, 且与胶原蛋白和整合蛋白间的相互作用有关。
3 SPRRs在屏障系统损伤修复过程中的作用
有研究发现, SPRR2A可通过扰乱p53因子的乙酰化和其后续的转录活动而具有调节和修复角质化细胞的能力[29]。皮肤屏障受到损伤后, 引起机体短暂的屏障修复反应, 包括角质化相关蛋白的表达增加, 结构和脱皮相关蛋白的表达减少[30]。SPRRs在损伤修复与组织重建过程中起到关键作用[31], 它将活性氧解毒作用与细胞迁移作用联系起来, 在许多形式的损伤中表达上调。PELEGRINO等[32]通过组织学分析, 原位杂交手段, 在研究上皮细胞的渗透率和表皮细胞水分流失的过程中发现, 在末期细胞分化移动过程中, SPRR1受到诱导并参与屏障的形成。MATTHIAS等[33]研究发现, SPRR2D和2H是有效的氧化反应抑制剂, 其上调有助于Nrf2因子对皮肤的保护功能, 但同时也引起角质细胞脆性增加和脱皮。
4 具有富脯氨酸结构蛋白的抑菌作用
其他的一些研究表明, 某些具有富脯氨酸结构的蛋白存在抑菌活性, CD4+Th细胞功能亚群在体内构成复杂的细胞调节网络, 各亚群比例和功能平衡, 在维持内环境稳定中起着重要的作用。过度的Th1细胞应答, 会产生如接触性皮炎、不明原因的慢性炎症、移植排斥反应等反应, 而过度的Th2细胞应答, 则会削弱的对感染因子的保护性防御机制, 并在遗传易感人群的个体引发过敏性症状。病菌感染或其他诱因, 能改变微环境中细胞因子组成, 进而影响T细胞分化并使T细胞功能亚群失衡, 最终导致自身免疫疾病的发生。而PRPs, 就是通过对细胞因子的调节, 来最终实现“免疫平衡”的结果。
ROZGONYI等[34]研究发现, 富含脯氨酸的多肽A3-APO可通过裂解细菌细胞膜, 可与70KDa热激蛋白Dna K或其他小分子抗生素共同作用起到体内和体外的抗菌作用。由此猜测, 哺乳类动物SPRRs可能同样具有抑菌活性。
5 SPRRs的其他研究
其他一些研究还发现, SPRRs蛋白是角质化细胞被膜的主要组成部分, 鼠的SPRRs蛋白存在多元化, 因此全身不同部位的屏障系统组成形式略有不同, 且这些基因之间具有相互协调作用[35];SPRR1A还是一种重要的神经损伤后再生的标志基因[36];SPRR3在复层鳞状上皮中, 其N端与C端具有稳定有序的结构, 可作为转谷氨酰胺酶的底物, 从而作为一种灵活的交联蛋白为角质化细胞被膜提供一定的张力强度或硬度, 起到交联的作用[37,38]。
另外, 唾液中也含有富脯氨酸的蛋白。唾液中三种基本的富脯氨酸的蛋白包括IB5、II-1和II-1 ng。前两种蛋白可被糖基化, 在口腔中三种蛋白都可与单宁酸结合[39]。口腔中富脯氨酸蛋白PRP是刺激唾液产生的主要成分, 体外研究表明在含有丹宁茶多酚、表儿茶素没食子酸等糖基化蛋白的条件下, 富脯氨酸蛋白具有聚合作用[35,40]。
与有龋齿的成人相比, 没有龋齿的人的口腔中, 牙膜能更好的中和菌酸。唾液中包含酸性的富脯氨酸多肽 (PRP) , 能够吸附口腔链球菌;在没有龋齿的人中, 一些PRP的等位基因表型频率是有龋齿的3倍[41];PRP还具有调节表儿茶素-3-没食子酸 (Epicatechin-3-gallate, EGCG) 抑制乳糖酶活性的作用, 且唾液PRP有稳定EGCG的作用[42]。
6 结语
目前, 有关哺乳类动物SPRRs活性的相关研究较少。哺乳动物中SPRRs主要存在于体内组织的上皮及屏障系统中, 从以往的研究来看, 哺乳类动物SPRRs在一定因素的诱导下, 尤其是疾病反应中, 表达量发生变化。紫外线, 激素、体内因子及环境因素, 肿瘤、病毒因素以及其他疾病都会对其表达产生影响。SPRR2的表达受紫外线的调控。雌激素能使SPRR2A、2B、2D、2E、2F与2G表达上调, EDs与雌激素受体拮抗剂可抑制SPRR2的表达。白细胞介素 (IL-6) 在体内也影响SPRRs的表达。在HPV8转基因小鼠中, 乳头状瘤的形成使SPRR2表达上调。在食管鳞状细胞癌病变时, 食管鳞状上皮细胞中SPRR3表达下调。在湿疹、哮喘、皮肤损伤模型中, SPRRs的表达均有变化。SPRRs在损伤修复与组织重建过程中起到关键作用而某些具有富脯氨酸结构的蛋白存在抑菌活性。