骨髓源性心肌干细胞

骨髓源性心肌干细胞（精选六篇）

骨髓源性心肌干细胞 篇1

1 材料与方法

1.1 主要材料

SD大鼠由复旦大学实验动物中心提供;DMEM培养基、胰酶、多聚赖氨酸、荧光活性染料DiI、纤维蛋白酶和凝血酶均购自美国Sigma 公司;胎牛血清购自美国Hyclone公司;吖啶橙(acridine orange,AO)和溴乙啶(ethidium brimide,EB)购自华美生物工程公司;无糖DMEM购自美国Gibco公司;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购自日本Diagnostic Chemicals公司。

1.2 方法

1.2.1 MCSC的培养

参考成熟的实验方法[8]。将成年雄性SD大鼠拉颈处死,在无菌条件下剔出双侧股骨和胫骨。切除骨两端的干骺端,暴露骨髓腔,用含有肝素的PBS冲洗骨髓腔,收集冲洗液后离心。用DMEM培养液混悬沉淀细胞,均匀接种到培养瓶中。当细胞达到70%～80%汇合时,经胰酶消化后收集细胞。用添加15% FBS的DMEM充分混悬沉淀细胞,使细胞分散成单细胞悬液。显微镜下计数细胞后,将单细胞悬液用培养液稀释,以10倍等阶式稀释的方式将单细胞悬液稀释至细胞密度为103个/mL。取0.1 mL稀释后的细胞悬液加入10 mL培养液,使最终细胞密度为10个/mL。将稀释好的细胞悬液加入96孔细胞培养板,每孔150 μL,进行单细胞克隆培养。通过多能干细胞标志物c-kit的免疫荧光标记和早期心肌形成转录因子Nkx 2.5的RT-PCR 检测,筛选具有特异心肌分化潜能的MCSC。

1.2.2 FG-MCSC的制备

取第8代MCSC,用PBS浸洗后,在37 ℃下用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合消化液消化1 min,收集细胞,离心(1 000 r/min,8 min)。弃去上清液,加入纤维蛋白原重新悬浮。然后将50 μL细胞悬液缓慢滴加至96孔培养板中,随即在含有细胞的纤维蛋白原液体上面滴加50 μL浓度为5 U/mL的凝血酶,轻轻回荡和倾斜培养板,使两者混匀,放入培养箱20 min使其完全胶化,形成FG-MCSC混合物。加入含15% FBS的 DMEM进行培养。

1.2.3 细胞在不同浓度FG中的生长

FG-MCSC的制备同1.2.2。实验分两组:高浓度FG组和低浓度FG组。高浓度FG组为20 mg/mL纤维蛋白原形成的FG;低浓度FG组为5 mg/mL纤维蛋白原形成的FG。通过AO/EB染色观察MCSC在不同浓度FG中的生长。取各组培养后7 d细胞,加入AO/EB染色液。在Olympus荧光显微镜下观察细胞形态和着色。选择合适浓度的FG用于后续实验。

1.2.4 细胞增殖实验

取第8代MCSC,在37 ℃下用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合消化液消化1 min,收集细胞,离心(1 000 r/min,8 min)。吸取0.5 mL密度为2×105个/mL的细胞悬液,加入1.5 mL PBS,再加入4 μL DiI染料,在4 ℃条件下静置10 min。清洗未结合的DiI染料后,用5 mg/mL的纤维蛋白原悬浮细胞,在96孔培养板中制备FG-MCSC。加入15% DMEM进行培养。实验重复3次,每孔随机选取5个视野,在培养后2 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d分别在荧光显微镜下计数红色荧光细胞数目。

1.2.5 细胞迁移实验

在损伤实验,制备FG-MCSC,放入培养箱中放置 20 min,使其完全胶化,用刀片切除胶的一部分,加入15% DMEM进行培养。在培养后1 d、2 d和3 d分别在相差显微镜下观察从切除边缘向外迁移的细胞。

在迁移实验,制备FG-MCSC,放入培养箱中放置 20 min,使其完全胶化,不对FG-MCSC进行损伤处理,加入15% DMEM进行培养,在培养后1 d、2 d和3 d分别在相差显微镜下观察细胞从FG自然边缘向外迁移的细胞。

1.2.6 体外缺血缺氧模型的建立

参照Hori等[10]的方法自制缺氧装置,并加以改进,建立体外缺氧缺糖(OGD)模型在密封的有机塑料盒的两端各建立一个通气孔,分别为进气孔和排气孔。进气孔连接含有95% N2和5% CO2的混合气体源,排气孔用以抽空氧气和连接测氧仪。实验分FG-MCSC OGD组、MCSC组、MCSC OGD组。MCSC组为正常培养组。在MCSC OGD组和FG-MCSC OGD组,吸去培养液,用0.01 mol/L PBS清洗3次,更换无糖无血清的DMEM。将培养皿放入缺氧盒中,关闭通气孔后,经排气孔将缺氧盒中的气体抽空。然后,关闭排气孔,经通气孔通入体积分数为5% CO2和95% N2的混合气体,并用测氧仪检测盒中的氧气含量。当氧浓度小于1%时封闭两孔。将缺氧盒放入37 ℃培养箱内进行缺血缺氧处理。

将FG-MCSC OGD组和MCSC OGD组的细胞缺血缺氧处理12 h后,加入AO/EB染色液,在荧光显微镜下观察细胞核的形态和着色。每孔随机选取5个视野,分别计数存活、凋亡、坏死细胞。实验重复3次,计算存活、凋亡和坏死细胞所占细胞总数的比例。

1.2.7 LDH的检测

细胞凋亡或坏死可以造成细胞膜结构的损害或完全裂解,从而导致细胞内的LDH释放外泄进入培养液。LDH泄漏法的测定是基于在乳酸脱氢酶的作用下使四唑盐染料碘硝基氯化四氮唑还原为红色甲臜,通过比色法定量测定酶含量,以评价细胞损伤程度。将FG-MCSC OGD组和MCSC OGD组细胞缺血缺氧处理12 h后,取出培养板,分别从培养板各孔吸取上清100 μL,加到反应板孔中,37 ℃放置10 min。配制乳酸脱氢酶底物溶液:氧化型辅酶I 10 mg,PMS 2 mg,NBT 5 mg,用蒸馏水2 mL溶解,混匀,静置5 min。取上部溶液 1.5 mL,加入0.4 mL 1 mol/L乳酸钠溶液。用0.1 mol/L pH7.4的磷酸缓冲液定容到10 mL。每孔加入新鲜配制的底物溶液 100 μL,室温避光反应15 min,然后每孔加入25 μL柠檬酸液终止酶促反应。在酶标仪570 nm波长下读取各孔OD值,计算各个样本的平均值。

1.3 统计学处理

采用SPSS 15统计软件处理数据,数据用均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示,各组间的差别采用单因素方差分析进行比较,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度FG对MCSC黏附和存活的影响(见表1)

高浓度FG几乎不透明,有一定的弹性和机械强度,经牵拉不易变形。而低浓度FG为一种透明的凝胶,弹性较高,但机械强度较差,机械牵拉极易导致凝胶变形。将MCSC接种到高浓度FG内,细胞伸展受限。MCSC在低浓度FG内培养2 h,相差显微镜下可见MCSC在FG内均匀散在分布,少数细胞已开始伸展。培养24 h后,大部分MCSC铺展,呈现成纤维细胞样形态。在FG中培养7 d后,高浓度FG组MCSC的数目较少,细胞增殖不明显,且细胞伸展欠佳;在低浓度FG组,培养7 d后MCSC的数量明显增多,细胞呈成纤维细胞样,伸展良好,未出现明显的凋亡或坏死。

2.2 MCSC在FG中的增殖(见表2)

接种后2 h,MCSC在FG内均匀散在分布,少数细胞已开始伸展。接种后1 d～7 d,FG组大部分MCSC细胞保持正常的形态,具有较好的活力。而在单独MCSC组,接种后5 d～7 d,可见上清液中出现部分漂浮细胞。通过比较DiI标记的细胞数目发现,MCSC在FG内能够保持较好的增殖能力,在接种后5 d和7 d,与MCSC组相比,细胞数目显著增加。

2.3 MCSC在FG中的迁移(见表3)

损伤实验结果发现,接种后1 d和2 d,仅有少量细胞从FG的刮除线边缘迁出。在接种后3 d,有大量细胞从FG中迁出。在迁移实验中,接种后1 d,有许多细胞从FG自然形成的边缘迁出。接种后2 d和3 d,有更多的细胞自FG的自然边缘迁移到FG外。

2.4 FG对MCSC的保护作用(见表4)

正常培养的MCSC很少发生凋亡或坏死,而经缺氧缺糖处理12 h后,在MCSC OGD组,大部分MCSC细胞核表现出明显的凋亡或坏死形态变化。与MCSC OGD组相比,FG-MCSC OGD组MCSC的存活数目较高,凋亡和坏死细胞数目较低。MCSC经缺氧缺糖处理后可释放大量LDH,上清液中LDH的水平显著升高,虽然FG-MCSC OGD组LDH的水平仍高于MCSC组,但明显低于MCSC OGD组。

3 讨 论

生物材料是一类具有特殊功能的,用于机体组织修复和再生的材料[11]。生物材料能够促进细胞黏附、存活和分化,对优化干细胞移植微环境和提高干细胞移植治疗心肌梗死的效果具有重要的临床指导意义。在多种生物材料中,FG具有较大的优势,它可以从病人自身血液制备,能够避免免疫反应,并且可重复性好,已广泛用于外科领域的止血和创伤修复[3]。本研究发现,在接种后7 d内,MCSC在FG中能够保持较高的活力。通过比较DiI标记的细胞数目,发现MCSC在FG内能够很好地增殖。以上结果表明,FG具有很好的生物相容性,FG可以为MCSC提供一个良好的生长微环境,并且5 mg/mL纤维蛋白原形成的低浓度FG比高浓度的FG更适合细胞的生长与增殖。

我们首次通过体外建立缺血缺氧模型,研究FG对MCSC抗缺血缺氧的保护作用。经缺血缺氧处理12 h后,MCSC OGD组大部分MCSC细胞核表现出明显的凋亡或坏死形态变化。而FG-MCSC OGD组大部分细胞仍保持较好的形态,凋亡或坏死的细胞数目明显较少。LDH泄漏法可以定量反映细胞膜的损伤程度。缺血缺氧处理可以导致MCSC中LDH的大量释放。在MCSC组,上清液中LDH的水平显著升高,而FG-MCSC OGD组LDH的水平比MCSC OGD组明显较低。以上结果提示,缺血缺氧可以导致MCSC发生明显的凋亡和坏死,而FG有助于细胞抵抗缺血缺氧微环境,提高其存活能力。FG提供的三维微环境可以直接促进MCSC的存活。FG也可通某些特异性配体,与MCSC表面受体结合,进而激活下游信号传导通路,发挥保护细胞抵抗缺血缺氧的作用。另外,FG也可能通过影响MCSC的旁分泌间接促进MCSC的存活。最近的研究表明,生物材料可以与干细胞发生相互作用,提高干细胞胰岛素样生长因子-1和肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)等细胞因子的释放[12]。由于生物材料的缓释的作用,这些细胞因子能较长时间的停留在生物材料中,对于细胞的存活可能发挥间接的调控作用[13]。然而,FG促进MCSC存活的具体作用机制尚需进一步研究。

骨髓源性心肌干细胞 篇2

1干细胞治疗的基本原理

干细胞具有十分重要的特性:自我再生和分化。因此, 干细胞是破环的心肌组织再生的理想来源[1]。通过经皮冠脉介入治疗, 冠脉灌注可以恢复正常。但是, 心肌功能却不能完全恢复, 心肌重塑和心脏衰竭不可避免。而干细胞移植可重建心肌, 也许可以阻止心室重塑, 修复甚或使损害的心功能正常化。另外, 干细胞也可分化为血管内皮细胞 (Condorelli et al. 2001) , 参与新生血管形成。目前研究应用最多的是自体骨髓干细胞。

2临床试验疗效及安全性观察

几个临床前和临床试验已证实, 自体骨髓干细胞或前体细胞移植可改善心肌梗死和慢性心脏病后的心功能。干细胞移植已经在治疗缺血性心肌病中取得满意疗效。Seth等人首先进行了冠脉内干细胞移植治疗非缺血性扩张型心肌病的研究[3]。首次人体试验调查了44个患者, 24个随机分配进行干细胞治疗, 其余20个作为对照。每一位患者都没有冠状动脉性疾病和心肌炎。最终结果显示, 干细胞治疗组患者心功能 (按纽约心脏病学会心功能分级) 有明显提高。心脏射血分数提高了5.4%。而且, 患者心律失常的发生率降低。心脏收缩末期容量减小, 舒张末期容量没有明显改变。而在对照组, 患者各项功能指标无明显改善。整个自体干细胞移植治疗过程中, 患者没有出现副反应, 没有心率不齐、心悸、心功能不全和呼吸困难等不适。这说明, 冠脉内自体骨髓干细胞移植是扩张型心肌病的一种新型而有效的治疗方式。

国内对干细胞移植治疗扩张型心肌病也陆续进行了临床研究。王建安等[4]发现, 细胞移植术后3个月和6个月血浆脑钠肽 (BNP) 水平较对照组低, 差异有统计学意义;延长6 min步行路程, 在一定程度上增加运动耐量, 而没有明显的致心律失常、栓塞和免疫炎症反应。宋延彬等[5]也发现细胞移植组6 min步行路程增加, 与对照组有显著差异 (P<0.05) ;围手术期及术后6个月随访中未见任何严重心律失常等不良反应发生, 证实经冠状动脉自体骨髓干细胞移植治疗扩张型心肌病安全、有效。

3讨论

自体骨髓干细胞移植治疗扩张型心肌病心力衰竭的机制尚未完全清楚, 目前认为主要有[6]:①骨髓干细胞在心脏增殖、分化衍生为心肌样细胞, 通过同步收缩参与整体心功能的改善;②骨髓干细胞通过衍生为血管内皮细胞和分泌血管内皮细胞生长因子, 促进新生血管和血管网的形成;③骨髓干细胞通过增殖、分化参与维护心脏室壁的厚度及弹性, 阻止心室重构。

虽然上述几个研究都认为自体骨髓干细胞移植安全有效, 但观察期尚短, 治疗的远期效果还需进一步证实。并且扩张型心肌病中约35%为家族型, 患者基因本身存在缺陷, 把干细胞移植到有缺陷的心肌中能否正常分化、长期稳定的发挥作用, 也需要进一步的研究。

参考文献

[1]Goodell MA, Jackson KA, etal.Stemcell plasticityin muscle and bone marrow.Ann.NY Acad.Sci, 2001, 938, 208-218.

[2]Condorelli G, Borello U, et al.Cardiomyocytes induce endothelial cells to trans-differentiate into cardiac muscle:implications for my-ocardium regeneration.Proc.Natl.Acad.Sci.USA98, 10733-10738.

[3]Seth S, Narang R, et al.AIIMS Cardiovascular Stem Cell Study Group.Percutaneous intracoronary cellular cardiomyoplasty fornonischemic cardiomyopathy:clinical and histopathological results:the first-in-man ABCD (Autologous Bone Marrow Cells in Dilated Cardiomyopathy) trial.J.Am.Coll.Cardiol, 2006, 48, 2350-2351.

[4]王建安, 谢小洁, 等.骨髓间质干细胞移植治疗原发性扩张型心肌病的疗效与安全性.中华心血管病杂志, 2006, 34:107-110.

[5]宋延彬, 高峰.经冠脉移植自体骨髓干细胞治疗扩张型心肌病的安全性及疗效.心血管病康复医学杂志, 2008, 17:348-350.

骨髓源性心肌干细胞 篇3

1 自体骨髓干细胞移植的基础与临床研究

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞, 其中骨髓干细胞来源丰富, 易于采集, 是最容易获得的成体干细胞。骨髓干细胞的主要作用是分化为造血干细胞, 以补充和维持造血系统的稳态。但是在某些特殊情况下, 骨髓干细胞也可以增生为其他细胞, 如心肌细胞。Verfaillie[4]报道, 从人的骨髓中分离得到的成年祖母细胞可分化为多种组织细胞。Alvarez[5]和Gojo[6]等研究证明骨髓干细胞能够分化为心肌细胞。李连达[7]等对心肌梗死的小型猪模型进行自体骨髓干细胞移植后观察到移植细胞在心脏分化为心肌细胞及血管内皮细胞, 心肌梗死面积减小, 心脏功能明显改善, 为临床应用奠定了基础。

2 自体骨髓干细胞应用于扩张性心肌病的研究

扩张性心肌病光镜下的主要病理变化是心肌细胞有不同程度的肥大与萎缩, 肌细胞间纤维组织增多, 心肌纤维仍为规则性排列, 个别可看到轻度心肌细胞排列紊乱。心肌细胞常发生空泡变性, 在内层心肌、乳头肌内可见到小灶状液化性肌溶解, 散在性微小坏死灶。间质胶原纤维增多, 心室内膜下及血管周围有广泛的大小不等的纤维化病灶。即心肌坏死与心肌细胞凋亡是扩张性心肌病心肌细胞减少的主要原因。理论上, 心肌细胞是终末细胞, 不具备增生能力, 因此病情进展最后出现心力衰竭, 死亡。但是最近有研究发现心肌梗死后有丝分裂状态的心肌细胞分裂增加38.2倍, 提示心肌细胞有可能再生。Beltrami等[8]对心肌梗死后死亡病例进行尸解及病理检测发现, 心梗区周边有提示细胞增殖的Ki-67阳性心肌细胞, 但是这种心肌细胞是来源于心脏原位的干细胞还是来源于循环中的骨髓干细胞目前尚不明确。有研究[9]表明, 在心肌梗死病理状态时外周循环中的骨髓干细胞较正常人明显增加, 另有研究证实[10]骨髓干细胞能分化成心肌细胞并可向血管内皮细胞分化, 增加心肌的新生血管, 并修复受损的心肌, 减少肥大心肌细胞凋亡。吴朝晖[11]等证实应用自体外周血干细胞移植治疗扩张性心肌病是安全有效的可显著改善左室收缩功能。胡春松[12]等应用自体骨髓细胞移植治疗扩张性心肌病证实该方法是一种安全、有效的细胞治疗, 它能通过加强心肌收缩力改善患者心功能, 尤其是对年轻且病程短的患者。陈容[13]等对17例扩张性心肌病进行了骨髓单个核细胞移植, 术后患者随访3个月~2年, 16例患者胸闷、气喘、水肿等临床症状均有不同程度的改善, 运动耐力增加, 生活质量提高。说明经冠状动脉自体骨髓干细胞移植治疗扩张型心肌病是安全的且有一定的疗效。张瑶[14]等利用阿霉素复制了扩张型心肌病动物模型, 然后进行自体骨髓间质干细胞移植, 证实可以改善扩张型心肌病的心脏功能, 而且移植后在心肌组织内发生了心肌源性的转化。

3 应用干细胞移植治疗扩张型心肌病的可能机制

自体骨髓干细胞移植治疗扩张性心肌病的可能机制[15,16,17]: (1) 生成心肌细胞:循环中的自体骨髓干细胞到达受损的心肌细胞周边时在其特殊的理化因素影响下发生转化, 生成有功能的心肌细胞, 参与心脏的同步收缩和舒张, 改善心功能。 (2) 改善心肌供血:到达受损心肌细胞周围的骨髓干细胞转化成为血管内皮细胞, 促进新生血管形成, 改善缺血心肌的血液供应, 从而减少心肌进一步坏死和凋亡。 (3) 改善心肌基质成分:骨髓干细胞可改善心肌基质成分, 增加弹力纤维, 限制心脏瘢痕形成及扩展, 减少心室扩大, 从而改善心功能。

4 自体骨髓干细胞的常用移植方法[16,17]

4.1 直接移植法:

将通过骨髓穿刺或外周血分离采集到的骨髓干细胞经心肌内注射或冠脉内注射直接移植于心脏病变部位。此方法优点:取材容易、创伤小、收集骨髓干细胞数量丰富, 体外培养、传代及扩增容易, 安全性高没有异体排斥反应, 避免了干细胞研究的伦理学争论, 直接移植到病变部位。但此方法也有其缺陷及不足:不论是直接心内注射还是经冠脉注射均为有创性, 要求有较高的技术与条件, 且扩张性心肌病为全部心肌的弥散性病变没有明显注射靶点使临床应用有一定困难。

4.2 细胞因子骨髓干细胞迁移、归巢心脏移植法:

采用细胞因子刺激骨髓干细胞迁移至外周循环血中再诱导其在心脏病变部位附着及分化。此方法简易、无创伤, 且理论上可到达心脏任何病变部位, 易于临床推广与应用。但是临床上扩张性心肌病患者常没有明显的发病时间, 何时开始注射细胞因子?注射细胞因子的数量是多少?而注射后多长时间能定位于心脏病变部位?定位的干细胞数量有多少?多长时间后能分化成有功能的心肌细胞?这些细胞因子会不会刺激其他静止细胞的分化, 比如肿瘤细胞等。这些都关系到临床疗效及副作用。

5 问题与展望

骨髓源性心肌干细胞 篇4

1 研究背景

随着人们生活节奏的加快, 生活方式的改变, 心血管系统方面的疾病呈逐年增长的趋势。但心肌细胞是不可再生细胞, 现有的医学手段也只能从营养心肌细胞, 降低心肌氧耗来改善心脏功能。因此寻找一种能替代坏死心肌细胞的新的种子细胞成为我们的迫切需求。骨髓间充质干细胞 (BMSCs) 最原始的命名为骨髓基质成纤维细胞, 它属于成体干细胞, 主要来源于中胚层, 可在体内外分化为成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞, 心肌样细胞等。1995年, Wakitani等[2]首先证实骨髓间充质干细胞在体外经5-氮杂胞苷诱导后分化成心肌样细胞, 分化率约为30%。引起了对骨髓间充质干细胞的研究热潮。屈佳等[3]体外模拟心肌环境用心肌细胞冻融液诱导MSCs向心肌细胞分化发现:在心肌细胞冻融液的环境中培养的MSCs, 细胞生长旺盛, 有大量子代形成。同时还发现心肌细胞冻融液可将具有多能分化潜能的MSCs诱导为包括心肌细胞、血管内皮细胞在内的一个细胞群体, 与5-Aza单一的心肌细胞诱导作用相比, 更能提供一个适合心肌再生所需的自然条件。Kadner[4]等以成人BMSCs为种子细胞, 进行体外扩增, 然后进行基因修饰借助于生物材料载体将其回植入体内, 可用于心血管组织工程。Krupnick等[5]将鼠BMSCs种植在三维支架上, 并将细胞-支架复合物移植在同系基因型鼠的左心室, 研究结果表明, BMSCs种植在三维细胞支架上有向心肌分化的潜力。

2 BMSCs的分离方法

2.1 全骨髓贴壁法:这是骨髓间充质干细胞最早的分离方法, 将抽取的骨髓直接加入培养液制成细胞悬液, 以合适的细胞浓度进行接种培养, 它是利用BMSCs对塑料底的贴附性, 定期换液去除悬浮生长的造血系细胞, 进行分选纯化而得。这种方法得到的BMSCs形态多呈梭形、呈集落生长, 而且成分复杂, 均一性差, 抗原特异性差异也较大。

2.2 密度梯度离心法:根据骨髓中细胞成分的比重不同, 能有效地将红细胞、白细胞和间充质干细胞分离开来, 然后将分离出来的骨髓间充质干细胞进行贴壁培养。这类细胞同源性更强, 且有更强的自我更新能力和多向分化潜能, 同时操作简便、快速, 对细胞的活性影响较小。

2.3 流式细胞仪分离法:不同种类细胞都有其自身特殊的细胞标志并且其体积大小也不同, 将分理出的细胞与有荧光标记的特异性抗体相结合, 制做成特定浓度的细胞悬液, 放入流式细胞仪机器中, 然后经激光照射, 发出的荧光信号将被转化成电信号, 再由计算机对其进行处理, 这样就把阳性表达的细胞与阴性表达的细胞分离开了。

2.4 免疫磁珠分离法:将BMSCs的表面特异性抗原与连接有磁珠的特异性抗体相结合, 形成带有磁珠的, 抗原-抗体免疫复合物, 在外加磁场磁力作用下带有磁珠的细胞将停留在磁场中, 未带磁珠的细胞则离开了磁场, 从而使细胞分离。

后两种方法分离的细胞纯度较高, 但价格昂贵, 对细胞的活性影响也较大, 甚至导致细胞完全失去活性, 目前较少应用。

3 BMSCs体外扩增的微环境

3.1 胎牛血清培养法:胎牛血清是目前干细胞培养中常规应用的添加剂, 但其有感染病毒或细菌的潜在风险, 此外胎牛血清培养后的细胞含有异体蛋白, 并且扩增后也难以清除, Spees等[6]证实应用胎牛血清扩增获得的108个骨髓间充质干细胞含7~30 mg胎牛血清蛋白, 可引起免疫反应。

3.2 自体血清培养法:Mizuno等[7]使用人自体血清代替胎牛血清, 实验也证明自体血清微环境更适合体外培养骨髓间充质干细胞, 它能促进BMSCs增殖, 缩短传代时间, 维持细胞的稳定, 减少细胞自发分化等优点。

3.3 脐血血清培养法:脐血血清含有多种细胞因子, 可促进BMSCs的增殖、分化;并且具有采集方便, 来源广泛, 对母亲及胎儿无影响, 巨细胞病毒、EB病毒污染率低, 无伦理限制等优势。Lam等[8]使用自体脐血血清扩增自体脐血干细胞, 旷文勇等[9]使用脐带血血清替代胎牛血清的DMEM/F12培养法, 雷晓宇等[10]发现骨髓间充质干细胞在较低体积分数脐血血清中增殖能力良好。这些实验也都足以说明脐血血清培养法可做为一种安全有效的培养法应用于临床。

4 BMSCs诱导分化为心肌样细胞的研究

4.1 诱导分化的方法及相关诱导因素

4.1.1 化学诱导剂:①5-氮胞苷:尽管胞嘧啶类似物5-Aza的诱导作用已获得肯定, 但5-Aza具有细胞毒性则限制了其应用, 因此寻找更加安全有效的诱导剂成为当前备受关注的课题之一。②血管紧张素Ⅱ:AngⅡ是一种肽类激素, 它可诱导BMSCs向心肌样细胞分化, 其诱导作用可能与浓度, 细胞信号转导通路有关。它同时具有调节代谢, 刺激血管平滑肌增殖, 调节血管张力的作用。Li等[11]研究证实, AngⅡ刺激BMSCs增殖的作用是通过与受体结合, 引发多条信号通路激活使细胞活化, 其中最重要的是其激活有丝分裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 通路并发生酪氨酸磷酸化而活化细胞外信号调节激酶 (EPK) 而产生的。③骨形态发生蛋白-2:BMP-2是转化生长因子β超家族中的一员, 它可调节多种细胞生长、分化和凋亡。王新艳等[12]研究发现, BMP-2介导Smad通路的磷酸化及向细胞核转位过程, 从而在BMSCs向心肌细胞的分化过程中发挥诱导效应。④丁酸钠:董亮等[13]研究发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠能够有效诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化, 其机制可能与抑制组蛋白去乙酰化酶活性, 增强组蛋白的乙酰化, 进而激活相关沉默基因, 促使其表达有关, 因组蛋白乙酰化是诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的机制之一。

4.1.2 心肌微环境:①心肌组织裂解液:李琴等[14]用心肌组织裂解液人工模拟心肌生长的微环境, 对BMSCs定向诱导。得到的结果证明诱导后的细胞呈明暗交替排列整齐的肌丝样结构, 同时也发现了具有自律性搏动的多核肌管结构。②心肌细胞共培养:Pijnappels等[15]将心肌细胞混合乳鼠BMSCs进行共培养诱导, 获得的细胞有心肌细胞的功能活性, 但大龄鼠BMSCs无法得到具有功能活性的心肌细胞。因此可以得出在诱导干细胞分化的过程中不但外部的诱导环境非常重要, 同时实验对象的年龄, 细胞的活力和其自身的形态都有关系。

4.2 分化为心肌样细胞的鉴定方法

4.2.1 形态学鉴定:①在高倍显微镜下观察细胞的形态:如细胞外形是否向心肌样衍变, 细胞是否形成肌管, 细胞是否跳动等。②在电子显微镜下观察细胞的超微结构:如定向诱导后的骨髓间充质干细胞是否具有心肌样细胞的超微结构, 如呈梭形样的细胞, 其细胞核位于细胞的中央, 胞质内可见糖原颗粒和线粒体结构等。

4.2.2 免疫组化鉴定:①表达心肌细胞的特异性标志:a.结蛋白、α肌动蛋白:作为心肌细胞分化的早期标志物, 结蛋白与和α肌动蛋白得到了广泛的认可。目前用来检测心肌细胞使用次数最多的特异性指标。b.肌钙蛋白:具有较高特异性的c Tn I, 作为心肌损伤的检测和心肌源性细胞鉴定的特异性生化标志物, 其阳性表达说明BMSCs发生心肌转化白。c.间隙连接蛋白43:Cx43在细胞间电冲动的传导, 维持细胞间电活动和收缩、舒张功能的同步性, 心肌功能的保持和细胞间化学信号的交流, 都很重要, 是心肌闰盘检测的常用指标。贾敏等[16]在研究BMSCs提取扩增及向心肌细胞诱导的过程中, c Tn T和Cx43表达阳性, 表明诱导分化的细胞有心肌细胞的特性。d.肌细胞增强子2C:肌细胞增强子2C (MEF2C) 作为心脏特异性的因子在心脏发育的过程中均参与、调解心脏特异性基因的表达, MEF2C有显著的组织特异性。e.超极化激活的核酸环:超极化激活的环核苷酸门控的离子通道 (HCN) 是编码起搏电流的离子通道, 同时由于HCN和心脏起搏的产生和调节密切相关, 因此又被称作起搏基因。HCN编码的起搏电流具有超极化激活, 对钠钾离子均具有通透性, 可被细胞内的c AMP调节, 具有微弱的单通道电导等独特特征[17]。HCN的表达在窦房结中依次为HCN4>HCN2>HCN1。因此, 可以通过检测HCN4、HCN2和起搏电流判定BMSCs是否分化为心肌细胞。f.肌球蛋白重链:已知哺乳动物的心脏表达两种肌球蛋白重链 (MHC) , 即α-MHC和β-MHC。β-MHC蛋白水平能够在一定程度上反映BMSCs向心肌细胞的分化情况, 其基因表达水平是观察BMSCs向成熟心肌样细胞分化的重要指标之一。②β半乳糖酐酶基因转染细胞标记技术:将β半乳糖酐酶基因通过复制缺陷重组胰病毒为载体转染至待移植培养的骨髓干细胞。通过检测宿主心脏中的β半乳糖酐酶的活性, 即可定性和定位移植干细胞是否分化增殖为心肌细胞。③Y染色体荧光原位杂交技术:运用该技术鉴定移植干细胞的前提是选用雌性动物为受体, 同时移植的骨髓干细胞来源于雄性动物, 如果雌性受体动物心肌检测到Y染色体, 则可以证明骨髓干细胞已分化增殖为心肌细胞。

4.2.3 电生理学鉴定:目前遇到分化出来的心肌样细胞的电生理特性的研究尚不多见, 虽然一些对细胞的动作电位的特点进行了描述, 但对细胞膜上的钠、钾、钙、氯等离子通道的特异性研究在国内外的文献报道较少。

5 存在的问题及展望

近年来骨髓间充质干细胞因具有易获得, 易增殖, 易被诱导分化, 不存在道德伦理问题, 移植后无免疫排斥反应等优点。它已被作为种子细胞广泛的应用于骨, 软骨, 心肌等组织工程的研究中, 并且已经取得了一定的发展。但在一些领域的研究尚处于探索阶段, 还有如下一些问题需要解决。

5.1 BMSCs的鉴定问题:虽然BMSCs分化为心肌样细胞的心肌特异性鉴定指标的研究取得一定成果, 但仍有许多问题需要解决。如BMSCs表面的多个细胞表面标志物大多缺乏特异性, 因此在BMSCs的鉴定方面的仍需进一步的研究。

5.2 BMSCs的诱导问题:BMSCs增殖, 分化的控制需要合适的条件, 如何既能控制增殖, 又可以避免肿瘤细胞形成, 同时又能在合适的条件下取得所需的分化途径, 还有待进一步的研究。

5.3 对BMSCs离子通道的研究:从结构蛋白的表达到功能蛋白的表达之间存在着复杂的调控机制, 可能与细胞分化的方向和程度密切相关。BMSCs仅表达外向钾电流, 未表达内向的快钠电流, 说明其尚不足以完成心肌细胞的兴奋与传导功能。

摘要：骨髓间充质干细胞因其具有高度增殖能力, 多向分化潜能等优点已经引起了人们对骨髓间充质干细胞的研究热潮, 尤其是做为组织工程及心血管疾病细胞移植治疗的理想种子细胞方面。常规用于房间隔或室间隔缺损修补手术的补片为涤纶补片, 它具有质量轻、质地薄、生物相容性较好等优点, 但近几年发现, 用其修补后, 如若发生术后残余漏, 较易引起溶血、真菌或细菌感染。因此利用骨髓间充质干细胞的多向分化潜能在体外构建一种含有类心肌样细胞具有生物活性的补片是目前亟待解决的问题。但骨髓中的间充质干细胞含量极低, 需经体外分离, 纯化, 扩增并吸附于一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料上形成复合物, 然后将其复合物植入机体组织或器官病损部位, 才能达到修复缺损心肌和梗死后心肌组织的目的。

骨髓源性心肌干细胞 篇5

1 资料与方法

1.1 一般资料

丝裂霉素C (Sigma公司) ;马血清 (Invitrogen公司) ;FCS (Invitrogen公司) ;MEF-2抗体 (Santa Cruz) ;FITC Santa Cruz) ;DAPI (Sigma) ;Dil-ac LDL (Santa Cruz) ;HLA-DR抗体 (Caltag) 。没有冠心病史以及任何心肌梗死临床症状和体征的健康成人志愿者, 采血前所有患者签署知情同意书, 研究方案通过广东医学院附属医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 人外周血来源的内皮祖细胞以及大鼠心肌细胞的分离、培养

取1~2日龄SD大鼠分离得到新生心室肌细胞, 差速贴壁法分离出心肌细胞, 此过程中加入2μg/ml丝裂霉素C。按1.2×105/cm2密度接种于明胶包被的培养皿中。将一部分细胞接种于玻片上便于免疫细胞化学检查。从人外周血中分离出EPCs, 培养3 d后, 然后用荧光示踪剂Dil-ac LDL标记。将心肌细胞与EPCs按4∶1的比例混合于加有10%马血清, 5%FCS的培养基中进行共培养, 培养2 d后, 培养基换为5%马血清培养基, 以后每隔2 d换液1次。

1.2.2 细胞大小的测量以及转分化情况检测

一种与MEF-2家族 (包括MEF-2c、钙黏素、α-肌动蛋白、心房钠尿肽) 广泛相关的抗体作为一抗作用于细胞心肌肌钙蛋白Ⅰ细胞增强因子2 (MEF-2) 。然后加入FITC标记的二抗。用藻红蛋白标记的抗人HLA-DR抗体鉴定人类细胞。细胞核用DAPI染色标记。倒置相差显微镜下观察细胞, 100倍镜下测量细胞最大长度和表面积。用Axio Cam以及Axio Vision软件进行计算。共培养6 d后, 人EPCs和大鼠心肌细胞均被标记上了藻红蛋白标记的具有人类特征的抗人HLA-DR抗体, 用Cytofix/Cytoperm试剂盒进行透化, 然后用FITC标记的抗α肌动蛋白抗体进行染色。用流式细胞分选仪对细胞 (2×104个) 进行分析。

1.2.3 转分化的EPCs的钙瞬变检测

心肌细胞和EPCs在盖玻片上共培养, 6 d后用无磷台式溶解液清洗细胞, 然后置于37℃, 5%CO2浓度, 5μmol/L Fluo 4-AM条件下培养。30 min后将细胞移入用HEPES校正过的台式溶解液清洗过的显微镜室中。钙瞬变通过每一帧时间匹配的叠加进行均分。Fluo 4图像采集系统来获得图片。用Fluo 4荧光素 (绿色荧光) 检测Dil-ac LDL标记 (红色荧光) 的人EPCs活细胞的钙瞬变。

1.3 统计学处理

所有数据用均数±标准差 (±s) 表示, 连续变量之间用未配对的双尾t检验, 用ANOVA进行多重比较。用Mann-Whitney检验进行名义变量的比较。

2 结果

2.1 人外周血来源的内皮祖细胞可以转分化为心肌细胞

从人外周血中分离出的EPCs, 培养3 d后, 超过95%的贴壁EPCs表达内皮标志。将内皮祖细胞与大鼠心肌细胞按1∶4比例进行共培养, 12 h即可见Dil-ac LDL标记的EPCs黏附于心肌细胞 (图1A) 。6 d后可见一些人EPCs与大鼠心肌细胞相整合 (图1B) 。

2.2 细胞大小以及转分化情况

共培养6 d后, 一些人EPCs与大鼠心肌细胞相整合 (图1B) 。与未整合的人EPCs相比, 整合的人EPCs的细胞长度和表面积显著增加, 这与其相邻的心肌细胞类似 (图2) 。与此同时, 人EPCs和大鼠心肌细胞均被标记上了藻红蛋白标记的具有人类特征的抗人HLA-DR抗体, 用Cytofix/Cytoperm试剂盒进行透化, 然后用FITC标记的抗α肌动蛋白抗体进行染色。用流式细胞分选仪对细胞 (2×104个) 进行分析。最初并没有检测到双阳性细胞 (图3) 。相反, 共培养6 d后, (8.23±1.56) %的人EPCs表达α-肌动蛋白 (图4) 。一些Dil-ac LDL阳性以及人HLA阳性的EPCs表达心脏标志蛋白如肌钙蛋白Ⅰ, 心房利钠肽以及一些心肌特异蛋白如α-肌动蛋白和MEF-2 (图5) 。此外在一些人EPCs中还观察到了肌组织 (图5) 。相反, 在基础培养条件下, EPCs不表达肌源性标志蛋白 (图3和图4) 。

注:A为共培养1 d时;B为共培养6 d时

注:A为刚刚共培养时;B为共培养6 d后

2.3 转分化的EPCs的钙瞬变

用Fluo 4荧光素 (绿色荧光) 检测Dil-ac LDL标记 (红色荧光) 的人EPCs活细胞的钙瞬变。转分化的EPCs显示出与其相邻的心肌细胞同步的周期性振荡 (图6) 。单个钙信号的时间匹配均值显示, 人EPCs和大鼠心肌细胞拥有相似的钙瞬变幅度和持续时间 (图6C和图6D) 。仅仅是转分化的EPCs显示出与大鼠心肌细胞相似的钙瞬变, 而非转分化EPCs则没有 (图6B和图6C) 。

注:A:共培养6 d后EPCs与心肌细胞被Fluo 4标记呈绿色, 而EPCs被Dil-ac LDL单独标记为红色;B:0 ms时Fluo 4荧光成像情况;C:为高峰期120 ms时图片。*表示为转分化EPCs, 小箭头为大鼠心肌细胞, 大箭头为转分化EPCs。心肌细胞和转分化的EPCs的钙瞬变被记录, 而未转分化的EPCs未被记录;D:EPCs (蓝色) 与心肌细胞 (紫色) 钙瞬变情况;E:为EPCs (蓝色) 与心肌细胞 (紫色) 的单个钙信号的时间匹配情况

3 讨论

最近一项研究证明, 小鼠胚胎内皮细胞能够分化为心肌细胞[5]。小鼠以及人类胚胎干细胞或者骨髓间充质干细胞同样也能够分化为心肌细胞, 并且显示出结构以及功能活性[6,7,8]。动物体内试验表明体内注射EPCs能够促进心脏新生血管的形成并改善心脏功能[9]。因此, EPCs可能被用于细胞疗法, 从而促进缺血性心脏病患者的血管再生, 并且改善其心脏功能。但是究竟EPCs的转分化能力怎样还不为人所知。

本试验结果表明, 当与大鼠心肌细胞共培养后, 来自健康志愿者外周血的EPCs均有转分化为心肌细胞的能力。共培养6 d后, EPCs显示出心肌细胞的特征表型以及功能特性。这与小鼠胚胎内皮细胞或者人半胚胎脐静脉内皮细胞相似[5]。心肌细胞的一个关键性能是它的兴奋-收缩耦联。通过Fluo 4成像仪, 在转分化人EPCs与大鼠心肌细胞间检测到相似振幅以及持续时间的钙瞬变。将转分化的人EPCs的钙瞬变与由人胚胎干细胞分化成的心肌细胞的钙瞬变进行比较也得到类似结果。总之, 这些数据表明, 人EPC具有获得心肌细胞表型以及功能特征的能力。

总之, 在体外培养过程中, 来源于健康成人外周血的EPCs在与大鼠心肌细胞共培养过程中能够转分化为心肌细胞。最后, 这些细胞可能用于潜在的细胞疗法, 进一步促进缺血性心脏病患者心脏组织再生。

摘要：目的:探讨成人血源性内皮祖细胞转分化为心肌细胞的潜能。方法:从健康成人外周血中分离出单个核细胞, 用内皮细胞培养基以及生长因子诱导培养得到内皮祖细胞。乙酰化低密度脂蛋白进行标记, 并与大鼠心肌细胞共培养。流式细胞仪检测EPCsα-肌动蛋白表达情况。免疫细胞化学法检测人EPCs表达α-肌动蛋白、肌钙蛋白Ⅰ、心房钠尿肽以及心肌细胞增强因子2情况。Fluo 4成像仪检测转分化EPCs钙瞬化情况。结果:培养3 d后95%以上的贴壁细胞在功能和表型上属于内皮祖细胞。共培养6 d后EPCs表现出心肌细胞样形态, 并且表达α-肌动蛋白、肌钙蛋白Ⅰ、心房钠尿肽以及心肌细胞增强因子2。α-肌动蛋白表达为 (8.23±1.56) %, 转分化的EPCs的钙瞬变与邻近心肌细胞是同步的。结论:来源于健康成人外周血的EPCs在与大鼠心肌细胞共培养过程中能够转分化为有功能活性的心肌细胞, 调节EPCs转分化的不是细胞功能的损伤而是细胞与细胞间的接触, 自体内皮祖细胞细胞疗法的应用可能促进缺血性心脏病患者心肌细胞的再生。

关键词：内皮祖细胞,心肌细胞,转分化

参考文献

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骨髓源性心肌干细胞 篇6

MSCs是自我复制和更新能力较强的一类细胞,在相应的诱导培养条件下,可向骨、软骨、脂肪和心肌等多种细胞谱系分化,且能较长时间保持多向分化潜能[1]。由于MSCs取材方便,对机体损伤小,并具有高增殖和良好的分化潜能,而且易于基因操作导入外源基因,使其成为组织和基因工程理想的种子细胞,应用价值较高[2]。

NKX2.5是NK型同源盒基因家族NK2型的成员,它与果蝇心脏发育决定基因tinman基因具有同源类似性。研究表明,NKX2.5在心肌细胞分化、心脏器官形态的形成有重要作用,另外也与房室分隔、传导系统及成熟心脏正常功能的维持密切相关[3],是公认的心脏发育过程中最重要的转录因子。

本研究联合应用基因工程和细胞治疗的方法,观察心脏发育中重要的转录因子NKX2.5基因修饰后MSCs对心肌梗死的治疗作用,为临床心肌梗死的治疗提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

低糖DMEM;干细胞血清;TRIzol R总RNA提取试剂盒(美国Gibco);Percoll(美国Pharmacia);逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(德国Qiangen);质粒提取试剂盒(德国TianGen);限制性内切酶BamH I、Sal I(Takara公司);引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成;质粒pEGFP-N3(吉林大学疫苗研究中心惠赠);SD大鼠购自吉林大学动物实验中心。

1.2 实验方法

1.2.1 MSCs的原代培养与鉴定大鼠MSCs的分离培养与鉴定参考已发表的文章[4]。

1.2.2 pEGFP-N3-NKX2.5真核表达载体的构建NKX2.5与绿色荧光蛋白融合基因质粒构建按照《分子克隆实验指南》(第3版)和试剂盒操作说明完成。整个实验流程为:体外分离SD胎鼠心肌,组织匀浆后按照试剂盒步骤提取总RNA。RT-PCR方法扩增NKX2.5基因。并分别在上游引物的5′端引入Sal I酶切位点,下游引物5′端引入BamH I酶切位点,进行扩增。扩增后基因凝胶电泳,割胶回收靶片段。载体pEGFP-N3经BamH I、Sal I双酶切过夜胶回收4.7 Kb载体片段,将载体片段与先前获得的NKX2.5基因片段连接。上述连接产物转化并挑取单克隆,最终获得NKX2.5-pEGFP质粒。提取NKX2.5-pEGFP质粒,以用于转染MSCs。

1.2.3 MSCs细胞培养、转染和筛选10%干血清DMEM、37℃5%CO2条件下培养MSCs细胞。取传代后P3代细胞,按Lipo2000转染试剂操作步骤转染NKX2.5-pEGFP质粒。转染之后48 h加入400μl/ml的G418筛选2周。细胞长满后传代培养继续用G418加压筛选,通过荧光显微镜观察MSCs绿色荧光蛋白表达情况。

1.2.4心肌梗死模型建立及NKX2.5-pEGFP基因修饰后MSCs移植40只SD大鼠制备心肌梗死模型,在呼吸机支持下经左外侧开胸切口暴露心脏。于左前降支下置7号缝合线结扎,成功者见左室前壁心肌活动障碍并有颜色变化。术后10 d心脏超声检测心功能后,将模型随机分为MSCs组(20只)和DMEM组(20只),第2次开胸于心外膜瘢痕区边缘注射移植,MSCs组注射NKX2.5-pEGFP基因修饰后MSCs2×105/μl共计160μl,分4点注入梗死区与正常心室组织交界处。对照组给予等体积无血清DMEM注射。

1.2.5超声心功能检测参考文献[5]方法,分别于模型制备后10 d(移植前)和移植后4周用超声检测心功能。以HP小动物超声探头(15 MHz)在大鼠胸骨旁以二维超声和M型超声进行心脏功能检测。测量指标有室间隔厚度(IVS)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)等。左室射血分数(LVEF)、左室缩短分数(FS)通过M型超声按HP5500的Teich模式获得。LVEF=(左室舒张末期容积-左室收缩末期容积)/左室舒张末期容积×100%。FS=(LVEDD-LVESD)/LVEDD×100%。

1.3 统计学方法

统计分析均在SPSS 11.0软件系统完成,计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MSCs培养

体外分离MSCs,72 h后换液,见部分细胞贴壁生长呈梭形或条形,并有突起,细胞形态与成纤维细胞相似。原代培养第14天,细胞基本长至90%融合(图1),以1∶3传代。传代细胞24 h贴壁,增殖较快,一般5~7 d可再次传代。

2.2 NKX2.5基因修饰后MSCs

构建的含有绿色荧光蛋白基因和NKX2.5基因的质粒转染MSCs后,按照常规操作培养,细胞长至90%融合后传代,继续培养并在荧光显微镜下观察细胞生长情况。结果显示,绿色荧光蛋白在MSCs中呈现绿色,证实质粒转染并表达成功(图2,见封三)。

2.3 大鼠心功能测定

40只SD大鼠制备心肌梗死模型后10 d,测定模型鼠心功能。将模型随机分为MSCs组和DMEM组,第2次开胸于心外膜瘢痕区边缘注射移植,MSCs组注射NKX2.5-pEGFP基因修饰后MSCs。DMEM组给予等体积无血清DMEM注射。术后4周再次测定心功能。移植后4周,MSCs组与DMEM组比较,心功能有明显改善,两组间LVEF和FS结果比较差异均有高度统计学意义(均P<0.01),见表1。

注:与DMEM组同期比较,aP<0.01

3 讨论

心肌细胞属于永久性细胞,心肌细胞坏死后一般无法再生,需要通过新生肉芽组织并最终转化为纤维组织对坏死区心肌进行修复。多种细胞具有心肌修复功能,如心肌细胞[6]、骨骼肌卫星细胞[7]、平滑肌细胞[8]。但MSCs具有取材方便、增殖能力强,易于外源基因导入等优点,体外研究提示:MSCs能分化为心肌样细胞并可以与宿主心肌细胞形成缝隙连接,并可能产生同步收缩[9]。

NKX2.5基因心脏特异性表达特点显著,发育初期在脾、舌、胃和甲状腺等组织中有低度表达NKX2.5基因,但出生后心脏外器官中NKX2.5蛋白水平都显著下降。证明NKX2.5基因对多种器官发育都有着一定影响,尤其对心脏发育的影响作用更为明显[10]。

本研究利用基因工程和细胞治疗的方法,构建NKX2.5和绿色荧光蛋白融合基因质粒,并将该质粒转染入MSCs中,结果显示MSCs能够表达该融合基因。将基因转染后的MSCs在心肌梗死模型梗死区注射后,能够在一定程度上改善心肌梗死大鼠的心脏功能。该方法的建立及所获得的实验结果,为组织工程领域在心肌梗死方面的研究提供的新的参考,也具有较好的研究前景。但此过程中,所涉及的作用机制问题,有待于深入研究和进一步的探讨。

摘要：目的:以NKX2.5融合绿色荧光蛋白基因(NKX2.5-pEGFP)质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),将基因修饰后MSCs移植入大鼠心肌梗死模型中,评价其对心功能的影响。方法:体外分离培养大鼠MSCs,构建NKX2.5-pEGFP基因质粒,以lipo2000将质粒转染入MSCs。将基因修饰后MSCs植入心肌梗死后10 d的大鼠心肌梗死区(MSCs组,n=20),同时将注射等体积无血清改良依格尔(DMEM)培养液于心肌梗死区的大鼠作为DMEM组(n=20)。移植注射后4周,通过检测左心室射血分数(LEVF)、左室缩短分数(FS)等研究其对心功能的影响。结果:移植4周后,MSCs组大鼠LEVF[(79±4)%]较DMEM组[(47±3)%]显著提高(P<0.01),MSCs组大鼠FS[(48±9)%]较DMEM组[(25±6)%]显著提高(P<0.01)。结论:移植NKX2.5基因修饰后的MSCs能够改善心肌梗死大鼠心功能。

关键词：NKX2.5基因,骨髓间充质干细胞,心肌梗死,心功能

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