细胞应激（精选八篇）
细胞应激 篇1
1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级雄性BALB/c小鼠,6~8周龄,体重20~25 g,均由巴黎第五大学医学院附属COCHIN医院免疫实验室提供,微型动脉夹由法国Moria公司生产。
1.2 肾IRI模型
小鼠术前8~12 h禁食,应用三溴乙醇溶液(200 mg/kg)腹腔内注射麻醉。肾缺血组:沿腹正中线做1.5~2.0 cm的切口,逐层分离皮肤、腹膜,进入腹腔,将肠道推向一侧,找到肾蒂后用无损伤微型动脉夹迅速阻断左、右肾蒂,可见肾脏由鲜红变紫黑色,表示夹闭成功。双侧肾蒂阻断45 min后,去除动脉夹,恢复血流灌注,可见肾脏迅速由紫黑色变为鲜红,恢复原来颜色,术毕分层缝合关闭腹腔。术后小鼠于24℃~29℃的环境保暖,补充水与饲料。术中应用生理盐水使小鼠保持充分的水化。对照组(假手术组):同法打开腹腔并找到肾蒂,但不夹闭肾蒂。
1.3 血清生化指标检测和收集肾脏标本
肾脏灌注后24 h,经眼眶内眦静脉丛取血0.3~0.5 m L,4 500 r/min、10 min离心后吸取血清,检测血清肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)。采血后引颈法处死小鼠,取出肾脏。其中1个肾脏置于10%中性甲醛溶液中固定做病理组织学检测,另1个肾脏用液氮迅速冷冻,置于-80℃冰箱保存以备后续相关检测。
1.4 肾脏病理组织学检测
肾脏行纵轴冠状面切开,置于10%中性甲醛溶液中固定,石蜡包埋,制作4μm切片,常规HE染色,光学显微镜下观察肾小管坏死情况。每只小鼠肾脏切片随机选取皮髓交界处20个视野观察,根据肾小管坏死程度,采用RABB等[1]的半定量病理评估法评分:评分越高说明肾小管坏死越严重(最高4分),0分:正常肾脏,1分:最少坏死(<5%的肾小管坏死),2分:轻度坏死(5%~25%的肾小管坏死),3分:中度坏死(25%~75%的肾小管坏死),4分:重度坏死(>75%的肾小管坏死)。
1.5 TUNEL法检测肾细胞凋亡
上述石蜡包埋后的肾脏制作4~6μm切片,采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的末端标记法(TUNEL法)检测缺血组和对照组肾细胞的凋亡情况,具体步骤按TUNEL检测试剂盒说明书操作(美国R&D公司,产品目录#TA4627)。在荧光显微镜下连续观察每张切片的10个皮髓交界处视野(×200),计算阳性细胞数。
1.6 免疫印迹法检测肾脏中凋亡相关蛋白表达
将置于-80℃冰箱保存的肾脏取出,裂解后制作成细胞裂解液,考马斯亮兰法(Bradford法)行蛋白定量,每个样本取含200μg总蛋白的细胞裂解液,采用常规Western blot法检测caspase-3、caspase-8、bcl-2和bax蛋白的表达,应用Western blot冷光影像分析仪(LAS-3000,日本Fujifilm公司)显像,以Fujifilm Multi-Gauge软体定量分析蛋白条带,并使用β-肌动蛋白(β-actin)作为内参照。所用抗体均购自美国Santa Cruz公司。
1.7 肾脏抗氧化酶活性和总抗氧化能力检测
将置于-80℃冰箱保存的肾脏取出裂解后制作成蛋白悬液,考马斯亮兰法(Bradford法)行蛋白定量。采用化学比色法检测肾脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶(GSH)及过氧化氢酶(CAT)的变化,采用终点比色法检测肾脏中总抗氧化能力(TAC)。试剂盒均购自美国Sigma公司。
1.8 统计学处理
应用Graph Pad Prism5.0统计软件进行统计分析,统计数据用均数±标准差表示,计量资料组间差异采用t检验或Mann-Whitney U非参数检验方法,计数资料组间差异采用χ2检验。P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 血清生化指标变化
小鼠经历45 min双侧肾脏缺血,再灌注后24 h血清肌酐和尿素氮如图1所示。缺血组的血清肌酐和尿素氮均明显升高,与对照组相比,差异有显著性(P<0.01)。
2.2 肾脏病理组织学评估
对照组(假手术组)肾脏形态、大小及色泽正常;缺血组肾脏稍肿大,剖面见皮质苍白,髓质淤血暗红。HE染色光镜检查显示:对照组肾脏组织结构基本正常,仅见局部肾小管上皮细胞变性;缺血组肾组织见大量小管上皮细胞肿胀、空泡变性,部分小管上皮细胞刷状缘扁平、皱缩、核深染及裸露。严重者可见上皮细胞坏死、崩解脱落以及细胞核浓缩、碎裂及核溶解。部分肾小管管腔扩张,坏死,崩解的上皮细胞可脱落入肾小管管腔内,呈模糊的颗粒样结构。病变往往呈片状或灶状。肾间质见炎性细胞浸润。再灌注后24 h代表性HE染色图如图2A和B所示。肾小管病理损伤评分结果如图3C所示。缺血组病理评分均显著高于对照组,差异有显著性(P<0.01)。
2.3 TUNEL法检测肾细胞凋亡
缺血组肾细胞凋亡明显增加,TUNEL法显示肾缺血再灌注后24 h,缺血组肾组织中TUNEL阳性细胞数(绿色荧光)明显增多,而对照组未见明显TUNEL阳性细胞。代表性的TUNEL图片和TUNEL阳性细胞计数如图2D、E及F所示。
2.4 肾脏中Caspase-3和Caspase-8蛋白的表达
缺血组和对照组肾脏中未活化的procaspase-3、procaspase-8蛋白表达无明显变化,而缺血组中活化的蛋白剪切片段Caspase-3(P11)、Caspase-8(P20)表达明显增加,与对照组相比,两组之间的差异有显著性(P<0.05)(图3)。
2.5 肾脏中Bcl-2和Bax蛋白的表达
缺血组肾脏Bcl-2蛋白的表达明显降低,Bax蛋白表达明显升高,与对照组相比,两组之间的差异有显著性(P<0.05)(图4)。
2.6 肾脏中抗氧化活性
与对照组相比,缺血组肾脏中SOD、GSH和CAT的变化无显著性(P>0.05)(图5A、B、C)。相反,总抗氧化能力(TAC)明显降低,与对照组相比,两组之间的差异有显著性(P<0.01)(图5D)。
A、B为Bcl-2、Bax及其各自内参照β-actin的Western blotting检测代表性蛋白条带图片。C、D分别为Bcl-2和Bax的条带经Fujifilm Multi-Gauge软体定量分析的条带密度与其内参照β-Actin的条带密度的比值的统计分析图。1)与对照组相比,P<0.05;2)与对照组相比,P<0.01
3 讨论
肾脏为高灌注器官,对缺血及缺血再灌注均敏感。肾IRI是缺血性急性肾功能衰竭的重要损伤环节,也是肾移植中影响移植肾早期功能恢复及长期存活的主要因素。肾IRI的病理生理机制非常复杂,至今尚未彻底阐明。大量研究表明,细胞凋亡增加和自由基生成增多是肾IRI的重要机制。
本研究中,肾缺血组再灌注24 h血清Cr和BUN水平明显升高,提示肾功能严重受损。另外,肾组织病理形态学显示肾小管明显坏死,TUNEL阳性细胞计数明显增多,均说明肾IRI模型成功建立。
近年来,Caspase蛋白酶家族是细胞凋亡研究的热点,Caspase家族被认为是细胞凋亡的中心环节和执行者。未活化的procaspases可分为启动因子(如caspase-8和caspase-9)和效应分子(如caspase-3和caspase-7),启动caspase的激活能导致效应caspase的激活[2]。Caspase-3是最主要的效应caspase,通过两种机制激活:死亡受体通路或线粒体通路[3]。死亡受体通路是通过细胞表面的死亡受体与其相应的配体(如Fas L和TNF-α)结合导致caspase-8激活而发生;线粒体通路是通过细胞应激反应(如DNA损伤,氧化应激)导致caspase-9激活而发生。当通过caspase-8或-9途径使caspase-3激活时,活化的caspase-3将被剪切成多个片段[4],这些剪切片段可以导致DNA的断裂和细胞凋亡的一系列特征的形成。ZHENG等[5]在小鼠肾IRI模型中发现,缺血组肾脏中caspase-8和caspase-3的表达明显升高,经RNA干扰后抑制caspase-8和caspase-3的表达,可以较好地保护肾IRI。本研究结果表明,缺血组和对照组的肾脏procaspase-3和-8的表达差异无显著性(P>0.05),但剪切的caspase-8片段P20和caspase-3片段P11在缺血组肾脏中表达明显上调,与对照组相比,差异有显著性(P<0.05)。因此,可认为caspase-8剪切片段P20和caspase-3剪切片段P11在促进缺血组肾细胞凋亡中起着重要的作用。
肾IRI过程中,肾组织细胞凋亡与调控基因bcl-2和bax的表达密切相关[6,7]。Bcl-2可通过抑制自由基的产生及细胞内钙超载、抑制线粒体膜的通透性、阻止细胞色素C的释放及caspase的激活等机制,发挥抑制凋亡的作用。有研究发现,bcl-2蛋白能通过降低氧自由基活性和抑制氧自由基生成发挥抗氧化作用,还能维持线粒体的氧化功能[8]。Bax是促凋亡基因,能促进细胞因子缺失而诱导细胞凋亡,bcl-2与bax可形成二聚体,两者的比例决定细胞向存活还是凋亡方向发展。CHIEN等[6]研究表明,大鼠肾IRI后bcl-2/bax比值下降,通过腺病毒转染bcl-2后,提高bcl-2/bax比值,可以很好地保护肾IRI和抑制肾小管细胞的凋亡。HOCHMAN等[9]发现,Bcl-2基因敲除小鼠对各种氧应激特别敏感、细胞氧化损伤增加和抗氧化能力下降。本研究证明肾IRI时肾脏bcl-2蛋白表达下调,而bax蛋白表达上调,bcl-2/bax比值明显下降,从而使肾细胞凋亡增加和抗氧化能力下降。
有研究表明,caspase-3能够裂解bcl-2蛋白。在体外从过表达caspase-3的细胞中发现,Fas配体诱导细胞凋亡时,caspase能在bcl-2蛋白的环状区域Asp34处裂解bcl-2蛋白,bcl-2 C末端产物能触发细胞凋亡,裂解产物可进一步激活下游的caspase,并导致caspase级联反应放大[10,11]。
肾脏IRI与活性氧(ROS)的产生密切相关[12]。缺血再灌注时机体大量产生ROS,ROS的大量产生,超过了机体的清除能力,使体内抗氧化活性被消耗,即可直接损伤组织和诱导细胞凋亡[13]。本实验结果表明,与对照组相比,肾IRI时虽然肾脏中SOD、GSH和CAT等抗氧化酶的变化无显著性,但总抗氧化能力(TAC)明显降低,其差异有显著性(P<0.05)。BAYRAK等[14]在大鼠肾IRI模型中也发现,缺血组和假手术组肾脏SOD、GSH和CAT等抗氧化酶的变化无显著性,而血清中TAC的变化缺血组比假手术组明显降低,差异有显著性(P<0.01)。
机体总抗氧化能力除了包括SOD、GSH和CAT等抗氧化酶外,还包括一些具有抗氧化活性的非酶类大分子和小分子物质(如维生素C、维生素E、胡萝卜素、辅酶Q10、白蛋白、转铁蛋白、血浆铜蓝蛋白、尿酸和胆红素等)[15]。本研究虽然缺血组与对照组抗氧化酶(SOD、GSH和CAT)无明显变化,但可能缺血组的其他具有抗氧化活性的非酶类物质消耗降低,而使总抗氧化能力(TAC)明显降低。
细胞应激 篇2
目的:观察创伤应激及电针对大鼠胸腺细胞增殖功能及细胞凋亡的`影响.方法:Sprague-Dawley大鼠随机分为正常对照组、创伤应激组、创伤应激加电针组.建立创伤应激大鼠模型.电针选用的穴位为“足三里”和“阑尾”两穴.用MTT法检测胸腺细胞增殖功能,用TdT介导的脱氧尿嘧啶末端缺口标记法(TUNEL)检测胸腺细胞凋亡情况.结果:创伤应激能导致大鼠胸腺细胞发生凋亡,同时伴有胸腺细胞增殖能力的降低;电针能减少由于创伤应激诱导的胸腺细胞凋亡并改善胸腺增殖能力.结论:电针可通过抑制创伤应激诱导的胸腺细胞凋亡,起到改善应激后细胞免疫功能紊乱的作用.
作 者：汪军 孙静 王彦青 俞瑾 曹小定 吴根诚 WANG Jun SUN Jing WANG Yan-qing YU Jin CAO Xiao-ding WU Gen-cheng 作者单位：汪军,王彦青,俞瑾,曹小定,吴根诚,WANG Jun,WANG Yan-qing,YU Jin,CAO Xiao-ding,WU Gen-cheng(复旦大学上海医学院中西医结合系,针刺原理研究所,上海,32)
孙静,SUN Jing(上海第二军医大学附属长征医院病理科,上海,200003)
细胞应激 篇3
1 氧化应激和抗氧化系统
氧化应激是指机体内ROS产生过多, 超出其清除能力,导致氧化/抗氧化失衡,造成组织细胞损伤的一种状态[8]。 ROS是一类由O2-衍生出来的氧自由基的总称,主要包括超氧阴离子(·O2-)、羟自由基(·OH)、氢化氧基(·HO2)、过氧基(RO2)和烷氧基(RO)以及由O2-衍生出来的非自由基成分如过氧化氢(H2O2)等。 线粒体是细胞内ROS的主要来源[5],此外,生物体内酶促反应过程中也伴有ROS的产生。 线粒体来源的超氧阴离子通过锰超氧化物歧化酶催化形成H2O2,在金属离子存在的情况下,产生高反应性的羟自由基能通过Fenton和/或Haber-Weiss反应造成细胞内蛋白质、脂质和DNA损伤[9]。生理情况下,ROS的产生量很少,不引起机体病理改变,而过量的ROS则会导致氧化应激,引起一系列疾病和毒理作用[8]。 机体存在由多种“抗氧化剂”组成的抗氧化系统,主要通过酶类和非酶类两大抗氧化系统来抵御氧化剂的毒性作用,使ROS的产生和清除处于动态平衡状态[10]。 酶类抗氧化系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、细胞色素氧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等,微量元素铜、铁、锌、硒、锰、镁参与构成这些酶的活性中心。 非酶抗氧化系统主要有维生素C、维生素E、褪黑素、α-硫辛酸、类胡萝卜素等[8]。 其中,GSH氧化还原系统、SOD和CAT在防御氧化应激损伤中起着重要作用。
2 ECM及其代谢相关因子
ECM是存在于细胞之间的动态网状结构, 由胶原、蛋白聚糖及糖蛋白等大分子物质组成。 这些大分子物质可与细胞表面的特异性受体结合,通过受体与细胞骨架结构直接发生联系或触发细胞内的一系列信号传导而引起不同的基因表达,从而导致细胞的粘附、迁移、增殖和分化[11,12]。 不同的组织ECM组成成分的种类和含量不同。 在ECM各组分中,胶原蛋白主要为组织提供基本骨架及强度,蛋白聚糖和透明质酸主要维持水和状态、力学特性以及建立与维持信号分子的浓度梯度以确保组织的发育、形式和功能[12,13]。 若改变ECM中蛋白、 透明质酸和蛋白聚糖等成分可能会使组织的性质和生物学功能发生变化,参与一系列疾病的病理过程。 ECM的合成与降解受机体内多种酶和细胞因子的调节, 以维持正常生理条件下ECM的动态平衡。 调控ECM降解的酶主要有丝氨酸蛋白酶类、半胱氨酸蛋白酶类、天冬氨酸蛋白酶类和基质金属蛋白酶类(MMPs)四大类,其中,MMPs被认为是最重要的一类。 ECM中胶原的代谢主要取决于MMPs及其抑制剂TIMPs的动态平衡[8]。 而细胞因子主要包括转化生长因子-β(TGF-β)、基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)、血小板衍生因子(PDGF)和结缔组织生长因子(CTGF)等。
3 氧化应激与ECM代谢异常相关疾病
3.1 骨关节ECM代谢异常疾病
多聚蛋白聚糖和胶原是构成软骨细胞ECM的主要生物大分子[14]。 研究[1]显示关节退行性疾病患者体内抗氧化酶表达减少,ROS水平升高且胰岛素样生长因子(IGF-1)及其受体和MMPs表达上调,表明氧化应激是退行性骨关节炎和风湿性骨关节炎等骨关节退行性疾病发生发展的重要因素。 致病因素所导致的氧化应激可通过调节PI3K/Akt信号通路使多聚蛋白聚糖生成减少、降解增加,关节软骨胶原过度降解和表型表达改变,使关节软骨含水量减少、弹性丢失,最终导致关节软骨的损毁和关节功能的丧失[14,15]。
3.2 心血管ECM代谢异常疾病
研究证实,动脉粥样硬化(AS)、高血压病、缺血性心脏病等多种心血管疾病与氧自由基引起的氧化应激有关[12,13]。 Zarkovic等[2]认为,氧化应激所致的脂质过氧化及其产物4-羟基壬烯醛(4-HNE)可使弹性蛋白合成与降解失衡,参与衰老和动脉粥样硬化所致的血管壁重构。Essick等[16]研究表明,采用血管紧张素Ⅱ (AngⅡ) 处理小鼠, 使ROS水平上升,MMP-2、MMP-9 表达减少,TIMP1、TIMP-2 表达增加, 促进心机肥大与心室重塑。
3.3 肾脏ECM代谢异常疾病
肾脏ECM主要为透明质酸、层黏连蛋白和IV型胶原,ROS能破坏ECM合成和降解的平衡,引起肾小球基底膜增厚、系膜区增宽和间质纤维化[17]。 在糖尿病高糖状态下,过量的ROS可以使胶原蛋白、纤连蛋白等合成增加[18,19]。 同时,高糖可以ROS为第二信使,上调系膜细胞内纤溶酶激活物抑制剂-1(PAI-1)的表达,而PA的表达却得以下调从而使得系膜细胞降解ECM的能力降低,从而参与糖尿病肾病的发生发展[3]。
3.4 肺ECM代谢异常疾病
氧化应激反应能加剧气道炎性反应,其中的氧自由基及活性氧可减弱黏膜功能, 增强内皮渗通性,减弱内皮细胞的黏附性, 影响细胞外基质的重建。 Yao等[4]证实,SOD3 可以通过抗氧化作用减少弹性蛋白酶的表达,抑制氧化损伤所致的弹性蛋白降解,缓解吸烟所致的慢性阻塞性肺疾病(COPD)和肺气肿。 且MMP-9 在COPD患者的支气管肺泡灌洗液、 痰液和血清中的含量增多,血清MMP-9 浓度高于正常组,与FEV1、FEV1/FVC呈负相关[20]。 此外,在肺纤维化患者组织研究中也发现,ROS生成增加, 抗氧化物酶(GSH、SOD、CAT) 表达水平明显减少,MMP-2、3、7、8、9 的表达水平增加[13,21]。
3.5 肝脏ECM代谢异常疾病
在慢性肝损伤时,TGF-β 和PDGF表达增加,导致ECM合成大于降解,Ⅰ、Ⅲ型胶原表达增加,晚期出现降解障碍,而损伤后的ECM又能调节基质金属蛋白酶的活性,进一步影响ECM代谢。Li等[5]研究表明,黄芪甲苷Ⅳ可通过清除ROS、上调GSH表达,抑制HSC活化及Ⅰ型胶原和纤连蛋白的表达,从而缓解肝纤维化。 此外,氧化应激可增加TIMP1、TNF-α 和TGF-β1表达,减少MMP-2 的表达,使HA、LN及Ⅲ、Ⅳ型胶原表达增加,促进肝脏胶原沉积,导致纤维化[22,23]。
3.6 盆底支持组织ECM代谢异常
盆底支持组织ECM的组成成分有胶原蛋白(Collagen)、 弹性蛋白(Elastin)、 蛋白聚糖、层粘连蛋白和纤连蛋白等。Chen等[24]研究发现子宫脱垂患者子宫骶韧带氧化应激相关线粒体融合蛋白Mfn2 与Ⅰ、 Ⅲ型前胶原蛋白呈负相关,提示氧化应激可通过影响胶原代谢参与子宫脱垂发生。Li等[7]的研究表明,耻骨宫颈筋膜中GPx1 表达与CTGF和TGF-β1呈负相关,提示盆底支持组织抗氧化能力下降可下调胶原代谢调节通路TGF-β1-CTGF、 抑制胶原代谢进而损伤盆底支持结构。 有研究证实氧化应激能影响MMPs的表达[25],但在子宫脱垂中尚无相关文献。 因此,氧化应激可能通过影响胶原、 弹性蛋白等代谢导致ECM重构导致盆底支持结构生物力学完整性丧失。
4 氧化应激调控ECM代谢的机制
相关文献提示多条细胞信号通路参与氧化应激调控ECM代谢和重构过程, 其中TGF-β1/Smad3、丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节蛋白激酶(MAPK/ERK)、 磷脂酰肌醇-3 - 激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、酪氨酸蛋白酶/信号转导子和转录激活子(JAK/STAT)、Nrf2/ARE、Wnt/β-catenin等经典信号通路以及其相关效应因子发挥着重要作用。
4.1 TGF-β1/Smad3 信号通路
TGF-β1/Smad3 信号转导通路是调控机体组织纤维化的最重要机制之一。Hagler等[26]研究发现,ROS可通过激活TGF -β1/Smad3 通路, 增加CTGF和MMP-2 的表达,促进ECM重构和纤维化,参与二尖瓣黏液瘤的发生发展。 此外,ROS可通过启动TGF-β1/Smad3 信号通路, 激活下游的PAI-1,PAI-1 可抑制纤维酶原向纤维蛋白酶转化,从而影响组织纤维化的过程[27]。
4.2 JAK/STAT信号通路
JAK/STAT信号通路参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等很多重要的生物学过程, 主要通过JAK2/STAT3 通路实现[28,29]。 有研究证实,ROS可激活JAK2/STAT3 信号转导通路, 上调TGF-β1和纤维结合素的表达,影响ECM代谢,与糖尿病肾病有极其密切的联系[19]。 Huang等[30]研究显示,N-乙酰半胱氨酸(NAC)可通过减少ROS生成,抑制JAK2/STAT3 信号通路减少Ⅳ型胶原及纤连蛋白的表达缓解肾小管上皮细胞肥大性增长。
4.3 PI3K/Akt信号通路
PI3K/Akt信号通路在ECM产生和降解过程中起到重要作用。 ROS可通过激活PI3K/Akt信号通路促进MMP-2 的表达,从而激活HSC合成ECM[31]。 Qin等[32]研究表明,ROS可通过激活PI3K/Akt信号通路,促进Ⅰ型胶原的表达,从而参与肾间质纤维化的病理过程。 Yu等[33]研究显示,通过醉茄素A处理兔软骨细胞使ROS水平升高,激活PI3K/Akt通过,导致Ⅱ型胶原表达减少,而加用PI3K/Akt抑制剂LY294002 处理后,胶原表达上升。 同时,Zhang等[34]证实,氧化应激可通过调节PI3K/Akt信号通路抑制IGF-1 的表达,减少软骨细胞ECM蛋白聚糖的生成。 提示氧化应激可通过PI3K/Akt通路影响ECM代谢,参与退行性骨关节炎的发生发展。
4.4 MAPK/ERK信号通路
Ras和MAPK/ERK激酶(MEK)等都可激活ERK,活化的ERK移位入胞核,参与调控一些转录因子和细胞周期蛋白D、E表达, 导致HSCs增殖和表型改变,一些细胞因子和刺激活化MAPK后,把信号传入细胞核,包括磷酸化和激活多个转录因子,引起一系列细胞应答, 如增殖分化和对特定代谢途径的调节。 Yin等[15]研究表明,氧化应激可通过激活MAPK/ERK信号通路抑制IGF-1 的表达, 减少软骨细胞ECM蛋白聚糖的生成。 此外,ROS可通过激活MAPK/ERK信号通路上调TGF-β1, 刺激血管平滑肌细胞表达与分泌MMP-9,调节ECM代谢[34]。
4.5 Nrf2/ARE信号通路
Nrf2/ARE信号通路是近年来被公认的机体抗氧化系统的核心机制。 Oh等[35]研究表明,氧化应激状态时,Nrf2/ARE通路活化, 可抑制TGF-β/Smad信号通路,减少Ⅰ型胶原、纤连蛋白以及TIMPs和PAI-1 的表达。 此外,去乙酰化酶1(Sirt1)可通过激活Nrf2/ARE通路减少ROS生成,进而下调纤连蛋白和TGF-β1 的表达,参与糖尿病肾病的发生[36]。 而Nrf2 敲除小鼠在紫外照射诱导氧化应激状态下,MMP-9 表达较野生型明显增加[37]。
4.6 Wnt/β-catenin信号通路
Wnt是一种细胞间分泌的糖蛋白,与细胞表面受体结合将信号传至细胞内, 减少 β-catenin的降解并将之转位到核内,与转录因子T细胞因子/淋巴增强因子相结合,改变目的基因的表达(如MMPs、c-MYC、cyclin Dl和CD44 等),调节细胞的增殖和分化[38]。 Hsu等[39]通过动物实验发现,一氧化氮供体处理糖尿病模型小鼠,可通过下调内皮一氧化氮合酶,缓解糖尿病介导的氧化应激和氮化应激, 抑制Wnt/β-catenin信号通路,减少纤连蛋白和TGF-β1的表达,进而减轻小鼠肾脏ECM聚积,缓解糖尿病肾病的发生。
5 小结与展望
外科应激与Th1/Th2细胞因子 篇4
1 Th1/Th2与外科应激
Th1型细胞因子IFN-γ是Th1细胞的标志性细胞因子, 促进THO分化成Th1, 并曾强Th1的活性, 同时IFN-γ能有效抑制THO向Th2分化和Th2细胞增殖[2]。IL-2降低会损伤机体的免疫防御功能及增加感染易感性, 导致创伤后脓毒血症发生率显着上升。经研究发现, 大手术后与小手术相比, 血中IL-2水平降低幅度要更大, 并且需要更长的恢复时间[3]。因此, 可以断定术后IL-2降低幅度及持续时间由手术创伤大小来决定的。且有临床试验发现, 手术期间低温可导致术后24h IL-2分泌降低抑制术后IL-2体外诱生浓度。巨噬细胞和单核细胞通过自分泌、旁分泌与内分泌的形式产生的TNF-α, 可见其是一种来源极为广泛且较为重要的细胞因子, 具有广泛的生物学活性, 它不仅是有效的肿瘤杀伤因子, 而且参与了机体炎症与免疫应答反应, 在免疫性疾病的发病机制中具有重要意义。在组织修复、炎性反应和免疫应答中对人体起到较为有利作用的就是低水平的TNF-α。在外伤、炎症等应激条件下TNF-α产生增加。研究认为TNF-α导致术后免疫损伤, 其原因是该细胞因子是与疼痛加速作用最为密切的炎性细胞因子。
Th2型细胞因子IL-4是Th2细胞的标志性细胞因子, 主要生物学特性是刺激B细胞生长、调节造血功能、增强正常休止期T细胞的活性和生长能力。促进IgG和IgE的生成, 能下调CD14的表达, 并抑制TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达[4]。IL-6是一种典型的具有多种生物活性的细胞因子, 机体内多种有核细胞都可产生IL-6, 如单核-吞噬细胞、B细胞、T细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞等[5], 它属于促炎性细胞因子, 能诱导急性期炎性反应的产生, 是介导应激病理生理过程最重要的炎性介质之一。Jeong-Won等发现IL-6在围手术期能显着升高, 在术后6h达到最高。IL-10主要由Th2细胞产生, 也可来源于Th0细胞、单核-吞噬细胞、B细胞、肥大细胞及角质细胞等。是分子量为18KD的小分子多肽。
2 Th1/Th2的平衡与外科应激
手术应激造成的机体免疫功能受损免疫抑制越来越受到人们的重视, 可导致术后机体易受病原菌感染。正常情况下体内Th1/Th2系统是维持平衡状态, 各种细胞因子形成复杂的细胞因子网络, 对免疫反应进行调节。任何一方的过度增强或减弱均可导致疾病发生。
O’Sullivan发现, 严重创伤及烧伤可导致Th1和Th2的平衡向Th2免疫应答偏移, 表现为IFN-γ产生降低及IL-4升高。有研究发现对胆结石患者分别进行腹腔镜胆囊切除术 (LCE) 和传统胆囊切除手术 (CCE) , 并对术后两组患者IFN-γ/IL-4比值进行比较, 发现CCE术后比值明显低于LCE术后。说明外科手术创伤大小会影响Th1/Th2平衡偏移, 手术创伤越大Th1/Th2平衡越向Th2偏移。
手术创伤是对患者强烈的刺激, 手术创伤大小、术中出血量、手术时间长短、麻醉方法等是影响术后机体内免疫功能改变的重要因素。
Th1/Th2细胞因子相互构成一个网络, 其平衡对机体的内稳态至关重要[6]。麻醉和手术可以造成患者术后非特异性免疫应答和监视功能下降, 术后机体免疫功能状态的变化也与细胞因子的异常释放有关。主要表现为细胞免疫功能受抑制, 抑制Th1细胞因子, Th细胞向Th2方向极化, 这可能是术后易发感染, 以及肿瘤复发、转移的重要因素之一。对手术应激全面合理地理解, 掌握生理病理变化规律从而减轻有害应激提高临床治愈率。
摘要：全身应激反应是由手术创伤和术后疼痛引起, 虽然适度的应激对机体有利, 但是, 如果应激反应过度, 就会在一定程度上对机体造成损害, 甚至会削弱生理储备。近年来医学研究的热点就是, Th1/Th2型淋巴细胞。目前, 已有研究显示, 它与多种疾病有关, 当外科应激时Th1/Th2的平衡会向Th2漂移, Th2细胞因子会因过度激活和对有害物质的免疫呈现耐受状态, 文章重点讨论外科手术对Th1, Th2细胞因子的影响。
关键词：外科手术,Th1,Th2,细胞因子
参考文献
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细胞应激 篇5
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料:
含人PRKCD基因的质粒由第三军医大学段炼惠赠;大肠杆菌E. coli DH5α、真核表达载体pDC316-LacZα购自北京本元正阳基因技术有限公司, 骨架质粒pBHGlox△E1, 3Cre购自加拿大Microbix公司, 人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 由重庆医科大学生命科学研究保存并提供。
1.1.2 试剂:
限制性内切酶 (AgeⅠ, NheⅠ) 、T4 DNA连接酶购自美国New England Biolabs公司;rTaq酶为日本TaKaRa公司产品;高保真酶platnum为Invitrogen公司产品;DNA Marker为日本TaKaRa公司产品;小量质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒均为Vigorous公司产品;胰蛋白胨 (Tryptone) 及酵母提取液 (Yeast Extract) 为OXOID公司产品;琼脂糖 (Agarose) 为BIOWEST公司产品;无糖RPMI 1640培养基及普通RPMI 1640培养基、新生胎牛血清购于美国Gibco公司, D-葡萄糖购于加拿大Bio Basic公司, L-葡萄糖购于美国Sigma公司;兔抗人PKCδ多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司, FITC标记山羊抗兔IgG (美国进口分装) 为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。
1.1.3 仪器:
高速低温离心机 (德国Eppendorf公司) ;PCR仪 (TECHNE 公司) ;紫外分光光度计 (Bio PhotometerTM Eppendorf公司) ;电泳成套设备 (Bio-RAD公司) ;凝胶成像系统 (Alpha Imager 2200TM) ;激光共聚焦仪、倒置荧光显微镜 (德国Leica公司) ;灭菌型CO2培养箱 (美国Thermo Forma公司) 。
1.1.4 培养基:
无糖RPMI 1640培养基及普通RPMI 1640培养基、新生胎牛血清购于美国Gibco公司。
1.2 方法
1.2.1 重组穿梭质粒:
pDC316-PRKCD的构建用Vector NTI 10.0软件对人PRKCD基因序列 (GenBank) 进行分析, 设计出上游带有AgeⅠ位点和下游带有NheⅠ位点的两条引物:上游引物5′ GATGCGCAGGAACGGCGCCACTGGCCAGGG 3′;下游引物5′ CGATCGTCAATCTTCCAGGAGGTGCTC 3′。以含PRKCD基因的质粒为模板进行PCR扩增。反应体系为50μl, 其中模板质粒0.5μl, 上下游引物各0.5μl, dNTP (2.5mmol/L) 4μl, Platinum Taq 0.2 μl, 10×PCR Buffer5μl, 水37.8μl。PCR反应参数:预变性95℃ 5min, 变性95℃ 30s, 退火60℃ 40s, 延伸72℃ 2min, 25个循环后, 72℃再延伸5min。AgeⅠ和NheⅠ分别酶切pDC316-lacZα质粒和PRKCD的PCR产物, 行1%琼脂糖凝胶电泳, 切取目的片段及线性质粒胶, 回收纯化, 得到pDC316和PRKCD的线性片段。将目的片段及线性质粒按3:1比例建立连接反应体系, 用T4 DNA连接酶16℃反应2h, 取5μl连接产物转化至感受态大肠杆菌DH5α中, 冰浴30min, 42℃热激90s, 冰浴5min后加入300μl LB, 37℃、150r/min振摇40min, 全部涂布于含有氨苄青霉素 (Amp) 的LB琼脂平板培养基上, 37℃培养12h, 形成单菌落。挑取单个菌落, 接种于5ml含100μg/ml Amp的液体LB培养基中, 37℃、250r/min振荡过夜培养, 按小量质粒抽提试剂盒提取质粒, 获得重组穿梭质粒pDC316-PRKCD。
1.2.2 重组pDC316-PRKCD质粒鉴定:
取1μl重组pDC316-PRKCD菌液为模板进行PCR鉴定。上下游引物同前。反应体系共20μl, 其中模板质粒1μl, 上下游引物各0.2μl, dNTP1.6μl, rTaq酶0.3μl, 10×PCR Buffer 2μl, 水14.7μl。热循环程序:预变性95℃ 5min, 变性95℃ 30s, 退火60℃ 40s, 延伸72℃ 2min, 30个循环后, 72再延伸5min, 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。酶切鉴定:重组pDC316-PRKCD质粒用AgeⅠ+NheⅠ双酶切后, 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。将PCR和酶切鉴定正确的质粒送国家人类基因组北方研究中心测序。将测序正确的重组穿梭质粒定量后用于细胞转染。
1.2.3 双质粒共转染293细胞重组腺病毒:
293细胞 (<30代) 培养至亚隔合状态, 按Lipofectamine 2000说明书操作, 将等摩尔比的pDC316-PRKCD及pBHGloxAE1.3Cre共转染293细胞。光学显微镜下观察到细胞出现典型病变效应 (cytopathic effect, CPE) 并从底部脱落, 将出毒的细胞培养瓶先后置于-70℃和37℃水浴锅中反复冻融3次, 4℃、3 000r/min离心5 min, 收集含毒上清, 获得重组腺病Ad5-PRCKD (初毒) 。
1.2.4 重组腺病毒的PCR鉴定:
按DNA-QIAamp Blood Mini Kit试剂盒操作说明提取病毒DNA, 引物序列同前。设立阴性对照组 (ddH2O) , 阳性对照组 (原始质粒) , 反应条件:预变性95℃ 5min, 变性95℃ 30s, 退火60℃ 40s, 延伸72℃ 2min, 30个循环后, 72℃再延伸5min, 所得片段用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.5 重组腺病毒的扩增和滴度测定:
将已获初毒大量感染293细胞, 待50%细胞出现CPE时, 收集细胞, 按前述方法进行反复冻融, 离心, 收集上清。TCID50法测定病毒感染滴度 (IU/ml) , 保存于-70℃。
1.2.6 共聚焦检测高糖负荷下人脐静脉内皮细胞中PRKCD蛋白表达
1.2.6.1 腺病毒感染细胞及分组培养:
HUVECs培养于普通1640培养基 (含10%胎牛血清, 100U/mL青霉素, 100U/mL链霉素) , 置5%CO2培养箱中于37℃孵育, 隔日换液。按MOI (mutiplicity of infection, 病毒感染单位数/细胞数) 50∶1感染部分细胞。设正常葡萄糖对照组 (NC, 5.6mmol/L D-葡萄糖) 、高糖组 (HG, 25mmol/L D-葡萄糖) 、空载体对照组 (EH, 转染Ad5-Null后于高糖培养) 、过表达PRKCD组 (OP, 转染Ad5-PRCKD后于高糖培养) 及渗透压对照组 (OS, 5.6mmol/L D-葡萄糖+19.4mmol/L L-葡萄糖) 。共培养6d。
1.2.6.2 共聚焦检测PRKCD蛋白表达:
制备细胞爬片, PBS洗涤爬片5min×3次, 细胞贴附面向上, 于4%多聚甲醛中室温下固定15min, 0.2%Triton X-100于4℃透化处理10min后, 将爬片细胞面朝上转移至载玻片上, 滴加1∶100兔抗人PKCδ多抗20μl使完全覆盖, 于湿盒中4℃孵育过夜。PBS洗涤5min×3次, 滴加按1:100稀释后的FITC标记山羊抗兔IgG 20μl使完全覆盖爬片上, 湿盒中避光, 37℃孵箱孵育2h, PBS清洗5min×3次, 50%甘油封片后送激光共聚焦检测。选用40×物镜, 以488nm波长的激发光激发, 确定最佳扫描参数, 观察荧光在细胞内的分布、定位, 并以选定的扫描参数对各样本进行扫描。采用Image-Pro Plus 6.0软件对所获图像进行荧光强度分析, 取其平均荧光值作为定量参数。
2 结果与分析
2.1 重组腺病毒Ad5-PRKCD构建
2.1.1 重组pDC316-PRKCD质粒鉴定:
以重组质粒pDC316-PRKCD为模板, 用合成的上下游引物扩增, 经琼脂糖电泳发现, 2 000bp附近均出现明亮的特异性扩增条带, 与预期一致。见图1。
注:M为DNA marker (100bp～2000bp) ;1为阴性对照;2为重组pDC316-PRKCD质粒;3为重组腺病毒Ad5-PRKCD;4为原始质粒为模板的阳性对照。
2.1.2 重组pDC316-PRKCD质粒酶切鉴定:
酶切产物经电泳鉴定得到分别为3.9kb和2.0kb左右的两条带 (图2) , 与预期结果一致, 初步表明插入正确。见图2。
注:M1、M2为范围不同的DNA标准;1、2为AgeⅠ+NheⅠ双酶切重组质粒pDC316-PRKCD。
2.1.3 重组pDC316-PRKCD质粒基因测序鉴定:
对PCR和酶切鉴定正确的质粒送国家人类基因组北方研究中心测序, 采用pDC316-cexu-f测序引物, 将所得序列与原始序列比对, 结果吻合, 说明pDC316-PRKCD质粒构建正确, 部分结果见图3。
2.1.4 重组腺病毒PCR鉴定:
与阳性对照、重组质粒组相比较, 均得到约2 000bp的目的基因片段。见图1。
2.1.5 重组腺病毒的滴度:
测得病毒感染滴度为1.0×1010IU/ml。
2.2 重组腺病毒Ad5-PRKCD蛋白表达鉴定及高糖负荷下的差异表达分析
共聚焦显示, 正常葡萄糖培养下, HUVECs胞浆内均匀分布PRKCD, 胞核内无表达或弱表达;高糖负荷下, 胞内PRKCD荧光表达强度明显增强, 为正常对照组的1.5倍 (P<0.05) , 并呈现出向核周聚焦的趋势, 核内表达增加;过表达PRKCD后 (OP) , 胞内表达进一步上调, 核内荧光强度增加明显, 浆/核荧光强度比值较高糖组 (HG) 进一步降低了35% (p<0.05) , 提示核转位明显;同为高糖培养条件下, 空载体对照组 (EH) 与高糖组无明显差异, 排除了空载体效应。正常对照组 (NG) 与渗透压对照组 (OS) 相比, PRKCD表达与正糖组无明显差异 (P>0.05) , 提示上述表达变化并非渗透压增加效应。见图4。
3 讨论
人类PRKCD基因 (GenBank) 位于染色体3p21.31, 包含18个外显子, 其开放读码框长约2 031bp, 编码含676个氨基酸的PKCδ蛋白。PKCδN端为调节区, 可与二酰基甘油 (DAG) 结合, 使空间构型变化从而引起PKCδ移位活化。大量研究已证实糖尿病环境应激原诱导的PKCδ移位激活, 可介导细胞稳态失调;活化核转位信号[4,5];调节氧化应激和炎症反应[6,7];促进细胞外基质集聚等细胞学事件[8], PKCδ抑制剂或δ/β2双重抑制剂可能成为DVC防治的潜在药物。因此, 构建高效的PKCδ腺病毒载体, 高通量筛选PKCδ信号蛋白复合体, 建立以PKCδ为靶点的药物筛选模型具有重要意义。
PKCδ过表达的生物学效应的研究目的决定了需要一种高效、低毒、低致病且高装载量的载体工具, 本研究选用的5型复制缺陷型腺病毒 (Ad5) , E1、E3双缺失, 同时具备了以上优点。其中, 切除的E1区中置入了核定位信号、强启动子, 并可插入外源基因, 同时腺病毒也失去了自我复制能力, 其同源重组和繁殖均需在互补细胞株293的辅助下进行, 而E3区为复制非必须区, 其缺失则可大大扩大外源基因的插入容量。
在采用AdMax包装系统重组腺病毒时, 我们选用了穿梭质粒pDC316, 与之前使用的pDC315相比[9], 仅仅是多克隆位点不同, 并不影响其效能。腺病毒基因组质粒pBHGlox△E1, 3Cr (骨架质粒) 含缺失E1和E3区编码序列的人类5型腺病毒基因组, 其与克隆了PKCδ基因的腺病毒穿梭质粒共转染293细胞, 利用Cre/loxP系统实现重组, 产生重组腺病毒。293细胞是整合有Ad5 E1基因的人胚肾细胞系, 共转染过程中, 缺失的E1区表达蛋白由 293细胞提供, 从而包装产生腺病毒颗粒。该病毒的蛋白质外壳与野生型腺病毒相似, 具有同样的感染能力, 但是基因组DNA的E1区被外源的目的基因取代, 故进入靶细胞后病毒不能复制, 但可以表达目的蛋白。这就为我们提供了目的蛋白过表达的工具。
注:NG为正常糖组;HG为高糖组;EH为空载体对照组 (Ad5-null转染后高糖培养组) ;OP为PKCδ过表达组 (Ad5-PKCδ转染后高糖培养) ;OS为渗透压对照组。箭头所示为核内荧光。
DAG是人体内最主要的内源性PKCδ激活剂[10,11]。为了建立激活状态下PKCδ细胞模型, 本实验采用高糖刺激使细胞内DAG从头合成增多。鉴于PKCδ的活性表达依赖于胞内DAG水平, 避免了因大量PKCδ激活所致的细胞死亡, 从而保证了后续信号蛋白组学实验的细胞及蛋白用量。本实验将构建的PKCδ腺病毒载体转染内皮细胞, 结果显示导入外源PKCδ基因后, 目的蛋白表达进一步增加, 说明了过表达PKCδ的人脐静脉内皮细胞模型建立。同时激光共聚焦显微镜下观察到, 正糖负荷HUVEC, 胞浆内PKCδ荧光均匀分布, 胞核内无表达或弱表达, 而高糖培养PKCδ核内荧光表达显著上调, 直观显示了PKCδ从胞浆至胞核的转位激活构象。此与Jovana Kapor-Drezgic[12]等研究结果相类似。Nathalie Gaudreault[2]等在人冠状微血管内皮细胞中亦发现PKCδ向核周转位现象, 但国外多数学者却发现PKCδ在高糖、化学药物、激动剂等外来刺激因子的作用下, 从胞浆至胞膜转位活化[13,14], 提示PKCδ可因不同的细胞系、刺激原及暴露时间而有不同的转位特征。有趣的是, PKCδ不同的亚细胞定位, 产生不同的生物学效应, 国外研究认为[15], 内质网及胞膜上的PKCδ可能具有抗凋亡的保护作用, 而线粒体及核中的PKCδ参与诱导凋亡, 但其具体机制尚不清楚, 故在以后的研究中, 我们将着重研究PKCδ亚细胞蛋白复合体, 揭示其对细胞生物学功能的影响。
细胞应激 篇6
1 海马的解剖与功能
海马是大脑边缘系统的重要组成部分, 在进化上是大脑的古皮质, 位于大脑内侧面颞叶的内侧深部, 左右对称, 结构比较复杂。在功能和纤维联系上, 不仅与嗅觉有关, 还与内脏活动、情绪反应和性活动密切相关。海马也是大脑具有可塑性和极易受损的一个脑区, 对缺血缺氧极为敏感。
海马被认为是参与学习与记忆的重要结构, 同时也能调控机体内分泌和自主神经活动, 并协调、控制应激反应的发生和发展。因此, PTSD引起一系列神经生化、神经内分泌和免疫功能的异常改变与海马功能紊乱互为因果, 最终导致海马形态结构改变, 造成海马损伤。因此, PTSD患者的海马易受到创伤性刺激的影响, 出现不同程度的损伤。
2 海马细胞凋亡的钙通路与PTSD发病机制的相关性
最近研究发现, 在PTSD患者的磁共振成像中, 海马体积相对减小, 这可能是由海马神经元凋亡引起[2]。在光镜下, 凋亡的神经元体积变小、变形, 细胞膜完整, 可见凋亡小体。有研究报道, PTSD患者海马神经细胞[Ca2+]浓度于12h明显升高, 24h达高峰[3,4]。由此表明, 在PTSD患者脑神经细胞内, Ca2+及钙调控紊乱作为一种重要的通路引起海马细胞凋亡并引起海马的多种功能障碍。
2.1 内质网途径
内质网是调节蛋白质合成及合成后折叠、聚集的场所, 是调节细胞的应激反应及细胞钙水平的场所。而通过内质网引起细胞凋亡的主要有以下几个途径: (1) 内质网应激引起的细胞凋亡; (2) 内质网钙引起的细胞凋亡; (3) 内质网上Bcl-2家族参与细胞凋亡; (4) 内质网上存在重要凋亡分子底物。下面主要介绍Ca2+及钙调控紊乱作用于内质网而引起的细胞凋亡途径。
内质网Ca2+释放主要经两条通道:三磷酸肌醇受体 (IP3R) 通道和阿理诺碱受体 (RyR) 家族通道[5]。IP3R.RyR.依赖的Ca2+增加可通过以下几种机制影响细胞凋亡: (1) 钙依赖钙激活蛋白酶的活化而激活caspases; (2) 钙激活蛋白酶裂解Bax而增加其促凋亡的活性; (3) 钙激活蛋白酶还可通过caspases而执行凋亡。
内质网是钙的储存场所。当细胞内钙离子紊乱时, 内质网通过自身的调节来平衡钙离子的浓度, 使之在一定浓度范围内保持平衡。当胞内钙离子浓度进一步失衡, 内质网不能通过自身的调节来维持稳态时, 内质网将启动内质网应激程序来拮抗胞内钙离子的过度失衡。因此, 胞内钙离子过高, 促发内质网应激反应, 严重时可引起细胞凋亡。
在各种原因引起的内质网应激过程中, Ca2+从内质网中释放激活caspase-12的前体, 进而激活m-calpain, 而m-calpain从胞浆转位到内质网中来切割caspase-12前体的CARD域, 进而激活caspase级联反应, 引起细胞凋亡[6]。
内质网通过其表面的IP3R或RyR受体释放Ca2+进入胞质的同时, 线粒体内的[Ca2+]升高, 当线粒体内Ca2+升高直至出现Ca2+超载时, 线粒体肿胀、结构裂解, 引起细胞凋亡[7]。Michalak实验室也发现内质网和线粒体联系紧密:从内质网释放的Ca2+最后积累在线粒体中[8]。因此, 内质网和线粒体可以同时作用而引起海马细胞凋亡。
2.2 线粒体途径
线粒体是真核细胞中重要的细胞器, 参与各种能量代谢, 也是细胞凋亡的重要途径。相关研究显示, 线粒体是细胞内死亡信号的重要感受器与放大器。在海马的SPS大鼠模型中, 神经元显著凋亡, 并且伴随着细胞色素C从线粒体释放入胞浆, Caspase-9和Caspase-3的表达增加, Bcl-2/Bax的比率降低。这些实验结果表明SPS模型诱导的海马凋亡的PTSD大鼠, 线粒体途径参与其中并发挥中重要的作用[9]。
钙失衡等细胞应激反应或凋亡信号能引起线粒体细胞色素c释放。作为凋亡诱导因子, 细胞色素c能与Apaf-1、caspase-9前体、ATP/dATP形成凋亡小体, 然后召集并激活caspase-3, 进而促发caspase级联反应, 导致细胞凋亡。同时, 在PTSD大鼠海马神经元中, Bax的上调也能促进细胞色素c的释放[10]。
Ca2+依赖的活化转录因子MEF2能导致Nur77.TR3上调, 而Nur77TR3能与线粒体结合并导致细胞色素c的释放。Ca2+在内质网与线粒体之间的优势转运可使线粒体对促凋亡Bcl-2家族成员的敏感性增加, 进而Bcl.2家族促进海马细胞凋亡, 这可能是由于Ca2+能诱导线粒体膜渗透转运孔的开放。
因此, 线粒体途径在PTSD患者海马细胞凋亡的钙通路中起重要作用。
2.3 死亡受体途径
Fas是典型的死亡受体。在大多数细胞中都有基础表达, 尤其在活化的淋巴细胞, 而在肝、心、肾、肺、皮肤等组织中也有较高水平的Fas表达, 特别是成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞。Fas和FasL介导的细胞凋亡依赖细胞膜表面表达的功能的Fas蛋白, 通过Fas-FasL的结合作用而诱导激活后续的凋亡相关蛋白, 特别是Caspase3蛋白酶, 最终导致凋亡。
已有研究发现, 在T淋巴细胞中, FasL的表达主要是受NFAT调控, 其过程主要涉及到在Ca2+或及钙调蛋白 (CaM) 的参与下, 经钙调神经磷酸酶 (Ca N) 激活的一系列步骤, 即:Ca2+/Ca N依赖的信号通路 (Ca2+/CaM→激活Ca N→NFAT去磷酸化→NFAT移至核内, 与FasL启动子结合→调控FasL表达) 。
2.4 其他相关途径
Ca2+-CaM-CaMKIIa信号途径在学习记忆、精神行为等多种认知活动中起非常重要的作用。因此, 海马的Ca2+-CaM-CaMKIIa信号途径调控的紊乱可能是PTSD大鼠情感行为异常的重要病理生理基础之一[11]。胞内Ca2+超载导致钙调蛋白依赖性蛋白激酶 (CaM-CaMK) 信号途径调控紊乱, 引发神经细胞长时程基因表达、调控异常, 促使CNS神经可塑性改变。
Furuya等[12]研究发现:thapsigargin (TG) 抑制内质网膜的活性, 使胞质Ca2+不易进入内质网腔, 同时, 细胞外Ca2+内流, 进而是胞内Ca2+浓度持续性升高, 激活了Ca2+/Mg2+-ENase, 而发生细胞调亡。
钙浓度升高还会改变转录因子Fos、Jun、Nru77或Cerb的活性, 从而导致基因表达发生变化, 而启动细胞凋亡程序[13], 进而在基因的水平上直接调节细胞凋亡。细胞核Ca2+信号和钙结合蛋白S100β共同调节p53途径依赖的细胞凋亡的发生[14]。
各种应激刺激可以引起海马神经元Ca2+过度内流, CA3区神经元受损, 导致细胞凋亡。凋亡细胞的产生诱发邻近细胞的溶酶体释放大量ACP酶摄取并消化凋亡的细胞, 从而引起凋亡的细胞减少[15], 海马体积减小进而影响海马的学习记忆等功能。
3 讨论
以上研究表明, 钙及钙相关蛋白通过内质网途径、线粒体途径、死亡受体途径和其他相关途径, 作用于PTSD患者海马神经元并引起海马神经元的凋亡, 进一步引起海马体积的减小, 造成PTSD患者海马的学习记忆相关功能障碍。然而, 内质网作为细胞内钙离子的储存库, 在钙及钙相关蛋白引发的海马神经元凋亡中的作用尤为重要。
4 展望
随着近年来, 战争、暴力事件、地震海啸等重大自然灾害的频繁发生, 以发病率高、患病率高、病程缓慢、疗效差为特点的PTSD越来越受到人们的重视。PTSD患者海马神经元凋亡引起海马体积减小, 不同程度的影响海马结构的生理功能, 造成一系列PTSD症状的出现。在PTSD患者脑神经细胞内, Ca2+及钙调控紊乱作为一种重要的通路引起海马细胞凋亡并引起海马的多种功能障碍。研究海马神经元凋亡的途径, 通过干扰神经元凋亡有利于对PTSD患者的靶向治疗。
细胞应激 篇7
1 对象与方法
1.1 对象
本研究时间为2010年8—10月,随机选取的核潜艇艇员35名,均为健康男性,平均年龄为(27.5±1.9)岁,艇员出航时间为8月17日,返航时间为9月22日,共出航36 d。
1.2 方法
1.2.1 长航前后白细胞总数和淋巴细胞总数的检测
于出航前1天上午7:00和返航后次日上午7:00坐位抽取肘静脉血2 ml,注入含7.5%EDTA二钠20 μl的试管中。采用日本Sysmex XT-1800i全自动五分类血液分析仪检测WBC总数和淋巴细胞数。
1.2.2 长航前后TL-CFU形成数的检测
主要试剂和仪器:淋巴细胞分离液(军事医学科学院提供),T克隆体系(军事医学科学院提供),96孔细胞培养板(丹麦NUNC公司),超净工作台(北京冠鹏锦华设备有限公司),倒置相差显微镜(日本Olympus公司)。
于出航前1天上午上午7:00和返航后次日上午7:00坐位抽取肘静脉血5 ml,注入含7.5%EDTA二钠50 μl的试管中,加3 ml 1640培养液混匀后沿试管壁缓慢加到淋巴细胞分离液上,4 ℃ 1 700 r/min离心15 min,收集中间呈絮状的淋巴细胞,加入1640培养液8 ml洗涤;1 500 r/min离心15 min,去上清,再加入1 640培养液8 ml洗涤;1 000 r/min离心10 min,去上清,加入1640培养液,调整细胞的浓度至2.0×106/ml;将细胞悬液0.1 ml加入到0.9 ml的T克隆体系中,充分吹打混匀后取0.4 ml平均分配到细胞培养板的4个孔中(此时每孔中的细胞数为2.0×104),置于37 ℃,5%的CO2孵箱中培养7 d。倒置显微镜下进行原位计数,以大于40个细胞以上的细胞团计数集落。
1.3 统计学处理
用SPSS 11.0对数据进行统计学处理,检测结果以undefined表示,组间比较用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 长航前后艇员外周血WBC和淋巴细胞数的变化
长航后,核潜艇艇员外周血WBC总数较长航前减少,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05);外周血淋巴细胞数则较长航前增多,两者比较,差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。
2.2 长航前后艇员外周血T淋巴细胞集落形成率的变化
长航后,核潜艇艇员外周血TL-CFU形成率为(68.95±16.80)个/2×104 MNC,较长航前的(39.99±14.30)个/2×104 MNC显著升高,两者差异有统计学意义(t=6.935,P<0.01)。
3 讨论
核潜艇长航对机体免疫系统是一种复杂的应激刺激,且具有因素混杂性、刺激持续性、无法回避性等特点。潜艇舱室内的电磁、温湿、放射及有害气体等环境因素构成了对机体的环境应激;长期的社交缺失、孤独感和时空隔绝焦虑等社会因素构成了对机体的心理应激[2]。这些因素的共同作用可使机体出现生理心理的多方面变化,本研究拟通过对外周血WBC及淋巴细胞长航前后变化的研究,探讨核潜艇长航应激因素对免疫系统的影响。
内分泌系统是应激作用时反应最为迅速的调控体系,糖皮质激素、肾上腺激素、甲状腺激素、胰高血糖素等一系列应激相关性激素快速释放入血,调动机体的防御机制[3]。免疫系统也是其调节靶系统之一,长时间持续应激刺激可以使机体应激水平整体上调,免疫系统呈现高敏、高反应性的特点。曾有针对水面舰艇艇员的研究显示,长航后艇员的免疫反应增强,淋巴细胞活性增高[4],本研究亦获得类似的结果,长航后艇员外周血的淋巴细胞数量较长航前增多,同时TL-CFU形成能力亦显著升高。由此可见,长航应激因素作用可加速淋巴细胞的成熟及促进其释放,而能形成集落的T淋巴细胞主要是外周血中少量CD4+ T淋巴细胞,故长航后外周血淋巴细胞除数量增多外,其中活化的CD4+T细胞数量也增多,CD4+T辅助细胞活化是细胞免疫应答启动的重要环节,其分泌的IL-2是最重要的淋巴细胞刺激因子,能加快淋巴器官内的淋巴细胞成熟分化,促进其功能[5],这可能是长航后外周血淋巴细胞数量增加的重要原因。CD4+T辅助细胞可分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子,这些细胞因子可介导炎症反应、辅助B淋巴细胞产生与吞噬作用有关的免疫球蛋白,并激活巨噬细胞、中性粒细胞等一系列复杂免疫反应,增强机体免疫反应强度[6],CD4+T辅助细胞增多提示机体对外免疫应答能力在长航后出现了上调。而应激刺激引起淋巴细胞免疫活性增高的机制尚不完全清楚,可能的途径包括糖皮质激素相关性免疫协同作用、炎症刺激因子诱导的过度免疫反应及甲状腺激素等应激相关激素对淋巴器官的直接激活作用等原因[7]。
本研究中外周血中淋巴细胞数呈现升高的改变,但核潜艇长航后艇员外周血中白细胞总数显著下降,故粒系细胞数量的显著下降是造成白细胞数量的下降的原因。研究显示,应激状态下体内氧自由基的含量可显著升高[8],对机体细胞产生氧毒性,中性粒细胞是其中最为敏感的细胞之一,氧自由基可使粒细胞膜脂质过度氧化,膜体稳定性变差,易破裂变形,细胞出现中毒性改变,分裂延迟,体积增大,胞质内碱性磷酸酶活力的下降,内质网肿胀,核浓缩,并可诱发细胞的凋亡;同时骨髓内粒细胞也出现原位破坏,骨髓内早期出现凋亡细胞,导致释放到外周血中的粒细胞减少。此外氧自由基还能损害粒细胞功能,表现为寿命缩短及黏附、分泌、吞噬等功能减弱[9]。与此同时,长航后外周血辅助性CD4+T淋巴细胞活性上调,机体表现出对外来抗原的高反应性表现,免疫反应强度升高,大量粒细胞在细胞因子等因素作用下,趋化并参与炎症反应[10],这一过程亦造成外周血中粒细胞的过度消耗。此外,研究显示,粒细胞胞质内存在糖皮质激素、肾上腺激素等激素的受体,体内应激相关性激素的高水平,亦可直接通过与粒细胞包膜、胞质及胞内细胞器上相关受体的相互作用,影响粒细胞的数量和功能,短期内可激活粒细胞的功能,增强粒细胞吞噬、黏附等作用,但长期的应激刺激和激素作用,则会造成细胞器和DNA损伤,加速粒细胞的过度消耗,促进凋亡程序启动,造成外周血中粒细胞数的下降[11]。
长航后,艇员外周血中淋巴细胞总数及CD4+T辅助淋巴细胞数虽明显上调,但由于免疫效应细胞如粒细胞、巨噬细胞等数量和功能受慢性持续应激因素作用的影响而下降,其免疫效应受影响,艇员整体免疫力仍然呈现一个下降的趋势[12],易罹患各种疾病。
核潜艇舱室环境复杂,多种复杂因素的联合作用造成的持续应激效应可使艇员免疫功能受损,导致艇员对于感染性疾病的罹患风险增加。采取各种有效措施预防慢性应激刺激对艇员免疫功能损害,改善官兵的健康状况,对于保证潜艇官兵战斗力非常重要 。
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细胞应激 篇8
1材料与方法
1.1材料
细胞培养用DMEM、IMEM和OPTI-MEM培养基购自Sigma及Gibco公司,10%的胎牛血清(FBS)、 青霉素购自Gemini公司,L- 谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠购自Sigma公司,MTS试剂盒、逆转录酶、逆转录酶抑制剂、d NTP混合物购自Promega公司,随机引物购自AB公司,Annexin V-FITC及PI购自Sigma公司,CHOP和GRP78抗体购自Santa Cruz生物公司 ,β-actin抗体购自Sigma公司 , SYBR green(ROX)及Tripure试剂(总RNA提取试剂)购自Roche公司,CHOP、GRP78、XBP-1s基因购自Invitrogen公司。
1.2细胞培养
DU145细胞由美国康奈尔大学医学院提供。细胞培养选用含有10%胎牛血清及酚红的DMEM,置于37℃、5%二氧化碳CO2的孵育箱培养,待长到70~ 80%,予以传代,取传3代内细胞用于实验。处理前更换为不含酚红的DMEM培养基。
1.3细胞增殖实验
将DU145细胞均匀接种于96孔板,培养浓度5×103个 / 孔,24 h后用不同浓度EPO处理细胞。 按照MTS分析试剂盒说明书操作,分别于24、48和72 h检测活细胞数目。
1.4流式细胞术
分别用0、10和20 nmol浓度的EPO处理24 h DU145细胞(1×106个 / 孔),PBS洗涤后加100μl结合缓冲液重悬细胞,然后加入5μl Annexin VFITC和2μl PI,4℃避光30 min,1 h内进行流式细胞仪分析。
1.5实时定量聚合酶链反应
检测DU145细胞的m RNA表达水平。将DU145细胞按照7.6×104个 / 孔种植到12孔板,24 h后用不同浓度的EPO处理DU145细胞,Tripure收集细胞并提取总RNA,逆转录试剂盒获得c DNA,按照Roche公司SYBR Green(ROX)试剂盒说明书检测CHOP、XBP-1s、XBP-1、GRP78 m RNA的表达,选用 β-actin为内参照。见附表。
1.6Westernblot检测蛋白含量
将DU145细胞按照浓度7.25×105个 / 板种植于100 mm的培养板,加入无酚红培养基24 h后,予以不同剂量的EPO处理24、48和72 h后收集细胞。按照Thermo公司的说明书用RIPR缓冲液(加入Cocktail和PMSF) 冰上裂解细胞30 min,14 000 g/min离心15 min,取上清液,用BCA检测蛋白浓度。25μg蛋白量与样本缓冲液作用,95℃加热变性5 min,用SDS-PAGE胶(BIO-RAD公司)电泳分离,转印于0.45μm PVDF膜(BIO-RAD公司)。予以5%脱脂牛奶TBST室温封闭2 h,CHOP、GRP78、β-actin多克隆抗体4℃孵育过夜,TBST洗涤3次,10 min/ 次。辣根过氧化物酶标记的多克隆抗兔、抗山羊及抗小鼠Ig G抗体,室温孵育1 h,重复洗涤,ECL显色,Bio-rad公司Image Lab 4.1版本进行拍照,分析吸光光度值。 β-actin为内参照。
F:上游引物;R:下游引物
1.7统计学方法
采用Sigmaplot 12.5统计软件进行数据处理, 计量资料用均数±标准差(±s)表示,组间比较用单因素方差分析,P <0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1EPO对DU145细胞的影响
正常组DU145细胞随时间增长成线性增殖,说明DU145细胞按照5×103个 / 孔浓度接种,其生长曲线成线性增殖(见图1)。用不同浓度的EPO处理该浓度的DU145细胞,发现细胞生长呈浓度时间依赖性。0.8 nmol EPO处理组与正常组的对应时间比较差异均无统计学意义(P >0.05);4 nmol EPO处理组与正常组比较,第1天差异无统计学意义(P >0.05), 第2和3天活性细胞数量下降约26.35%和28.08% (P <0.05);20和100 nmol EPO组与正常组第1、2和3天相比活性细胞数量明显下降,差异有统计学意义 (P <0.05)。
2.2EPO对DU145细胞凋亡的影响
分别用0、10和20 nmol EPO处理DU145细胞, 24 h后流式细胞仪检测细胞凋亡率(见图2)。低剂量组和高剂量组分别为(25.04±3.67)%和(38.88± 5.52)%,与正常组(1.45±0.29)%相比差异均有统计学意义(P <0.05);高剂量组凋亡率高于低剂量组 (P <0.05)。
1)与正常组比较,P <0.05;2)与 10 nmol EPO组比较,P <0.05
2.3实时定量聚合酶链反应结果
EPO处理DU145细胞后 ,CHOP、XBP-1s、 GRP78 m RNA的表达在24、48和72 h呈逐渐增加的趋势(见图3)。 10和20 nmo L EPO组24 h CHOP m RNA的表达为正常组的15.41及15.48倍, 差异有统计学意义(P <0.05);48 h分别为正常组的32.46和60.61倍,差异有统计学意义(P <0.05);72 h分别为正常组的94.65和94.42倍,差异有统计学意义 (P <0.01)(见图3A)。 XBP-1s也有与CHOP m RNA表达相一致的趋势,在24、48和72 h与正常组比较差异有统计学意义(P <0.05)(见图3B)。不同剂量EPO组与正常组24 h GRP78 m RNA的表达比较差异无统计学意义(P >0.05);不同剂量EPO组与正常组48和72 h GRP78 m RNA的表达比较差异有统计学意义(P <0.05)(见图3C)。本研究发现低剂量组与高剂量组48 h CHOP和XBP-1s m RNA的表达比较差异有统计学意义(P <0.05),但是低剂量组与高剂量组24和72 h组间比较差异无统计学意义 (P >0.05)。低剂量组与高剂量组24 h GRP78 m RNA的表达差异无统计学意义 (P >0.05);48和72 h两组比较差异有统计学意义(P <0.01)。
A:CHOP m RNA 在 DU145 细胞中的表达;B:XBP-1s m RNA 在 DU145 细胞中的表达;C:GRP78 m RNA 在 DU145 细胞中的表达
2.4XBP-1和XBP-1s的变化
20 nmol EPO处理DU145细胞后,分别于6、12、 24和36 h用Real-time PCR检测XBP-1及XBP-1s m RNA的表达。XBP-1s随时间增长呈逐渐增加的趋势,6 h就已经明显高于正常组(P <0.05)(见图4)。 XBP-1与正常组比较,有增加的趋势,但是随着处理时间的增长,m RNA表达水平无明显增加。
2.5EPO对DU145细胞CHOP和GRP78表达的影响
EPO处理DU145细胞后,24和48 h CHOP与正常组比较差异均无统计学意义(P >0.05);72 h与正常组比较差异有统计学意义(P <0.01);72h高剂量组与低剂量组比较差异有统计学意义(P <0.01)(见图5B和图6)。EPO处理DU145细胞后GRP78明显增加,24 h低剂量组与高剂量组即为正常组的180和260倍,差异有统计学意义(P <0.01);48和72 h两组均高于正常组(P <0.01);24和48 h低剂量组与高剂量组比较差异无统计学意义(P >0.05),72 h两组比较差异有统计学意义(P <0.01)(见图5B和图6)。
覮,P <0.05
1:正常组 24 h;2:10 nmol EPO组 24 h;3:20 nmol EPO组 24 h;4: 正常组 48 h;5:10 nmol EPO组 48 h;6:20 nmol EPO组 48 h;7:正常组 72 h;8:10 nmol EPO组 72 h;9:20 nmol EPO组 72 h
3讨论
Er-stress是指内质网稳态受到破坏后的一系列分子、生化改变。Er-stress包括内质网未折叠蛋白质反应(unfolded protein response,UPR)[11,12]、内质网超负荷反应和固醇调节级联反应[13]。内质网是细胞内完成蛋白质折叠修饰的主要场所,如果细胞内蛋白质合成修饰失调,内质网内未拆叠蛋白质过量,即可导致UPR。UPR是真核细胞对各种原因引发的内质网未折叠蛋白质积累的生存适应性反应,可通过多种从内质网腔到细胞浆或胞核的信号传导实现[14]。 UPR的启动在早期起保护作用,使大部分蛋白质合成停滞,减轻内质网负荷;加速内质网伴侣基因的表达,如Bip/GRP78、钙联接蛋白(Calnexin)和GRP94等,协助蛋白质折叠;启动内质网相关蛋白降解通路, 清除不能正确折叠的蛋白质[15,16],积极重建细胞内稳态。内质网伴侣主要包括Calnexin、钙网蛋白、Bip/ GRP78、GRP94、CHOP、XBP-1等。当Er-stress过度, 稳态重建失败时,UPR可以引发内质网负荷过度的细胞凋亡。
EPO通过抑制蛋白酶体辅助的内质网降解而阻断内质网的稳定性,引起Er-stress[17]。因此,EPO治疗肿瘤细胞的特点就是特征性激活EIF2a,增加ATF4,上调UPR基因,如GRP78、CHOP、XBP-1s的表达[17,18,19,20]。有研究表明[21],蛋白酶体通过激活巨噬细胞抑制前列腺癌细胞。那么EPO对前列腺癌细胞的抑制作用是否与Er-stress有关呢?
本研究发现EPO处理DU145细胞后,DU145细胞数量明显减少,并且具有时间浓度依耐性。最低剂量组与正常组比较活性细胞数量的减少无明显变化,但是20和100 nmol EPO组处理细胞72 h,活性细胞数量减少分别达88.97%和93.07%。在后续的实验中选择10和20 nmol EPO处理DU145细胞, 通过流式细胞仪技术检测细胞的凋亡。研究发现细胞凋亡率随着剂量的增加而升高,处理组与正常组比较,细胞凋亡率明显升高,高剂量组细胞凋亡率高于低剂量组。那么笔者就猜想细胞的凋亡是否与Er-stress有关呢?
EPO处理DU145细胞后,分别于24、48和72 h收集细胞的RNA、蛋白质。通过Real-time PCR检测GRP78、CHOP、XBP-1s的m RNA水平在不同时间的变化。研究发现经过EPO处理的DU145细胞, GRP78、CHOP、XBP-1s m RNA的表达水平随时间增长逐渐升高,72 h m RNA表达水平达到最高。低剂量组与高剂量组48 h CHOP和XBP-1s m RNA的表达比较差异有统计学意义,但是72 h两组差异无统计学意义。低剂量组与高剂量组24 h GRP78 m RNA的表达比较差异无统计学意义,但是48和72 h比较差异有统计学意义。因为XBP-1s的产生可以刺激更多的GRP78基因的转录[13],笔者猜想本研究的变化趋势可能与此有关。Er-stress激活后启动IRE1途径,短时间内即可导致XBP-1丢失26个碱基对成为XBP-1s[13]。研究发现EPO处理DU145细胞后,6、 12、24和36 h XBP-1和XBP-1s的基因水平均增高,其中XBP-1s增高的幅度较大,说明经过EPO处理后XBP-1s基因水平明显增加。同样XBP-1激活后,被剪切26个碱基对成为XBP-1s。随着EPO处理时间增长,产生大量XBP-1s,所以XBP-1随着时间变化不明显。
通过Western blot检测EPO对DU145细胞GPR78和CHOP的表达变化,研究发现EPO处理后, GRP78和CHOP随着时间增长逐渐增加,72 h达到最高,72 h低剂量组与高剂量组比较差异有统计学意义,但是24和48 h两组蛋白质表达水平比较差异无统计学意义。同时发现CHOP和GRP78在正常组含量较低,并且随着时间增长无明显变化。
研究发现EPO可诱导CHOP、XBP-1s和GRP78的基因转录水平升高,导致GRP7和CHOP的表达水平明显升高。同时研究发现EPO处理后,XBP-1s随着时间增长所占的比例逐渐增多。因此,研究证实EPO处理前列腺癌DU145细胞后可诱发Er-stress产生,而Er-stress的产生可能就是EPO诱导前列腺癌活性细胞数量下降,导致细胞凋亡的原因。
摘要：目的 探讨蛋白酶体抑制剂(EPO)诱导前列腺癌DU145细胞凋亡机制是否与内质网应激(Er-stress)有关。方法 用不同浓度的EPO处理DU145细胞,MTS检测细胞生长情况;流式细胞仪检测细胞凋亡率;实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测Er-stress相关分子同源蛋白质(CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、X盒结合蛋白1(XBP-1)、剪接型X盒结合蛋白1信使核糖核酸(XBP-1s m RNA);Western blot检测CHOP和GRP78的表达。结果 EPO抑制DU145细胞生长,并且呈现浓度梯度依赖性,处理组细胞凋亡率高于未处理组,高剂量组凋亡率高于低剂量组。EPO处理后,CHOP、剪接型X盒结合蛋白1(XBP-1s)、GRP78 m RNA明显升高,72 h最明显。低剂量组与高剂量组48 h CHOP和XBP-1s的表达比较差异均有统计学意义,两组48和72 h GRP78比较差异均有统计学意义。EPO处理后,XBP-1和XBP-1s基因转录水平升高,而XBP-1s随处理时间增长基因转录水平变化不明显。EPO处理后,CHOP和GRP78不断增加,72 h两种蛋白质均达到最高值,并且低剂量组与高剂量组在72 h比较差异有统计学意义。结论 EPO能抑制DU145细胞生长,诱导凋亡,其机制可能与激活Er-stress,诱发内质网的相关分子CHOP、XBP-1s、XBP-1、GRP78的表达有关。