IgA+细胞(精选五篇)
IgA+细胞 篇1
1 资料与方法
1.1 对象
IgA肾病患儿21例,男童12例,女童9例,年龄3~15岁,平均年龄7.8岁。所有患儿均行肾活检术,肾组织病理报告符合IgA肾病诊断标准。根据肾组织病理改变的程度分为轻、中、重3组。每组7例。
1.2 免疫组织化学染色
所有肾活检组织行VEGF和flk21染色,步骤如下:将组织蜡块切为厚度2μm的切片,脱蜡后用3%的过氧化氢阻断过氧化物酶5min。经抗原修复10min后血清封闭20min。再加入兔抗人VEGF多抗和小鼠抗人flk21单抗,在4℃下孵育过夜。然后经PBS漂洗完成后加入由生物素标记的山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG抗体,室温孵育20min。PBS漂洗后,加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素,室温孵育20min。再经PBS漂洗后DAB2H2O2显色,苏木素复染,最后脱水、透明、中性树胶封片。空白对照组不加入一抗,其他步骤同上。
1.3 观察指标
每个切片在400倍视野下随机选取10个肾小球,计算VEGF和flk21阳性面积所占肾小球面积百分比,取其均值为结果指标。然后计算每个肾小球内flk21阳性血管袢数,也取其均值为衡量肾小球微血管密度的结果指标。
1.4 统计学处理
应用SPSS13.0软件对数据进行处理,采用单因素方差分析和直线相关分析方法,数值以均数±标准差表示。
2 结果
2.1 小儿IgA肾病VEGF、flk21的表达分布及相关分析
中度病变组肾小球内VEGF和flk21在表达最多,在重度病变组表达最少,两组比较有统计学意义(P<0.05)。重度病变组肾小球微血管密度最少(P<0.05),肾小球内VEGF表达随肾小球微血管密度减少而降低(P<0.05),见表1。
2.2 免疫组织化学结果与临床指标的相关分析
轻、中度病变组VEGF、flk21的表达与患者24h尿蛋白定量呈正相关(r=0.431,P<0.05);重度病变组与患儿24h尿蛋白定量无相关性。3组VEGF、flk21的表达与患儿的血压、血肌酐水平无相关性。
3 讨论
注:*与其他两组相比P<0.05
IgA肾病的特征是免疫球蛋白A沉积在肾小球内。其病理表现多样,几乎表现所有原发性肾小球肾病的病理变化[3]。研究显示,VEG可减少肾小球基底膜阴离子数,并诱导肾小球内皮细胞小窗形成,其通过受体flk21发挥作用[4]。本研究结果显示,中度病变组肾小球内VEGF和flk21在表达最多,在重度病变组表达最少,两组比较有统计学意义(P<0.05)。FOSTER等[5]发现,正常情况下,VEGF通过自分泌方式调节足细胞内钙离子平衡,提高肾小球足细胞的存活率。病理情况下,VEGF介导单核吞噬细胞活化,大量毒性物质造成足细胞的损伤和死亡[6]。本研究结果显示,在轻、中度病变,Ig A肾病患儿24h尿蛋白定量与肾小球VEGF和flk21的表达呈正相关(r=0.497,P<0.05),表明VEGF增加肾小球基底膜对血浆蛋白通透性,促使蛋白尿的形成。而在重度病变,24h尿蛋白定量与VEGF和flk21的表达无明显相关性,分析其原因可能是随着病情发展,膜屏障被破坏。本研究结果表明重度病变时肾小球内VEGF表达最少并且微血管密度也最少,提示VEGF减少导致的肾小球内皮细胞增殖修复能力降低。综上所述,本研究表明VEGF在小儿Ig A肾病的发病进展过程中起关键作用,其作用机制可能包括内皮细胞通透性增强、血管生成障碍、细胞外基质合成增多等。
摘要:目的 探讨IgA肾病患儿肾组织中血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其受体VEGF2R2(flk21)表达,并将其表达水平与临床病理改变进行相关性分析。方法 免疫组织化学SP法。结果 肾小球内VEGF和flk21在中度病变组肾小球内表达最多,重度病变组表达最少,两组相比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。轻、中度病变组肾小球内VEGF表达与尿蛋白含量呈正相关(P<0.05)。肾小球VEGF表达与肾小球微血管密度呈正相关(P<0.05),重度病变组肾小球微血管密度明显减少(P<0.05)。结论 本研究表明VEGF在小儿IgA肾病的发病进展过程中起着重要作用,其作用机制有细胞外基质合成增多、内皮细胞通透性增强、血管生成障碍等。
关键词:血管内皮细胞生长因子,IgA肾病,小儿
参考文献
[1]关凤军,董晨,贺敏敏,等.罗格列酮对IgA肾病小鼠肾小球核转录因子-κB和活化蛋白-1表达的影响[J].徐州医学院学报,2010,30(12):834-839.
[2]赵慧娟,孙东立,张林霞,等.药物干预对IgA肾病患者尿液中结缔组织生长因子水平的影响及临床意义[J].中国全科医学,2010,13(33):3754-3756.
[3]张丽萍,谭会斌,邢玲玲,等.IgA肾病足细胞损伤中的血管内皮生长因子表达及临床意义[J].中国现代医学杂志,2010,20(14):2162-2165.
[4]潘利敏,王月华,边东,等.肾炎宁对IgA肾病血管内皮生长因子的影响[J].中国中医基础医学杂志,2010,16(2):135-137.
[5]袁曙光,孙永超,刘映红,等.IgA肾病肾活检组织中血管内皮生长因子的测定及意义[J].广东医学,2008,29(10):1688-1690.
IgA+细胞 篇2
1 材料与方法
1.1 实验材料
人脐带间充质干细胞 (北京和泽生物科技有限公司) , 牛血清白蛋白 (北京宏捷成生物科技有限公司) , 四氯化碳 (天津市化学试剂三厂) , 脂多糖 (北京生物试剂耗材) , VEGF (北京博奥森)
1.2 实验分组
SPF级正常昆明小鼠60只, 体重25~40g, 由辽宁医学院实验动物中心提供。按随机数字表法分为正常组、阴性对照组和人脐带间充质干细胞治疗组。
1.3 造模方法
根据大量文献提供资料, 采取改良法造模, 运用脂多糖牛血清白蛋白+脂多糖+四氯化碳方法建立IgA肾病小鼠模型2~4。具体方案如下:牛血清白蛋白400mg/kg隔天灌胃, 持续6周;CCl4皮下注射用诱导肝硬化剂量的1/3, 浓度为豆油与CCl4体积比5:1, 0.3mL/100g, 持续9周;联合应用LPS, 分别于第6、8周LPS0.05mg尾静脉注射。正常对照组正常饮食和生活, 不予干预。
经过实验室检查及肾组织病理观察确认造模成功后, 分别对空白对照组、造模组和人脐带间充质干细胞组尾静脉注射生理盐水和人脐带间充质干细胞 (含5×105个细胞) , 与注射后第7、21、56天处死实验小鼠取材观察。
1.4 临床结果检测
生化指标检测 分别于实验开始第1天、造模后10周末从模型组小鼠的静脉取血, 用全自动生化分析仪检测血清白蛋白 (serum-album in, ALB) 、24h尿蛋白定量、尿素氮 (urea nitrogen, BUN) 及血肌酐 (serum creatinine, SCr) 正常对照组在同一时间点取血进行对照。应用间充质干细胞治疗后, 在第7、21、56天进行血肌酐、尿素氮的检测, 以确定肾功能变化。
1.5 肾组织病理和免疫组化
造模成功后, 取模型小鼠, 用乙醚麻醉, 沿腹中线切开取肾脏, 沿冠状线将肾脏分为两半, 再沿冠状面将肾脏继续切分, 做常规光镜检查, 用100mL/L的中性甲醛固定, 石蜡包埋切片, 作HE染色, 观察肾小球结构及系膜区有无增生和增宽。
利用同上方法, 在应用间充质干细胞治疗后, 于第7、21、56天每组各随机抽取6只动物处死, 光镜下观察肾小球系膜区的增生和增宽有无减退。
用上述做好的石蜡切片作VEGF免疫组化研究, 应用Image-Pro Plus ( IPP ) 图像分析系统对免疫组化图像做半定量分析, 探讨应用间充质干细胞治疗IgA肾病的可能机制。
1.6 统计学处理
所有数据均采用统计软件包SPSS13.0处理。计量资料用均数±标准差undefined表示, 采用单因素方差分析, SNK法多重比较, 统计结果以P<0.05为差异有统计学意义, P<0.01为有显著性差异, P>0.05为尚不能认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 实验室检查 间充质干细胞治疗前后血清白蛋白、24h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮变化如表1。
2.2 光镜观察HE染色下肾组织结构变化, 见图1-3。
2.3 免疫组化观察 利用Image-Pro Plus ( IPP ) 图像分析系统分析人脐带间充质干细胞组VEGF表达较阴性对照组明显增强, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表2。
注: (1) “1*”提示正常组与造模组相比, t=19.659, P=0.000; (2) “2*”提示治疗第21天时与造模组相比, t=-26.059, P=0.000; (3) “∕”代表无比较性。
注:图1为正常组肾组织结构, 图2为造模组肾组织结构, 图3为治疗组肾组织结构, 从图中可以看出在光镜下造模组肾小球结构破坏较严重。
3 讨论
人脐带间充质干细胞 (Human umbilical mesenchymal stem cells, HUMSCs) 是具有自我更新和多系分化潜能的一类干细胞成分。该细胞起源于胚胎时期的胚外中胚层间充质, 可在骨髓、肌肉、脐带血、胎盘、外周血、脂肪、血管等组织器官中发育成熟5。该种系细胞具有多向分化潜能以及高度增殖能力, 归巢能力在创伤恢复和组织再生中也已经被证实6, 同时, 人脐带间充质干细胞还具有取材方便, 来源广泛等经济社会效益, 在应用于治疗肾脏方面疾病时可以很大程度的降低成本, 在未来的应用中将会有广阔的前景[1,2]。
VEGF是血管内皮细胞特异性有丝分裂原, 具有促进血管内皮细胞增殖、新生血管生成等作用[3,4]。在IgA肾病小鼠的肾脏组织中, 肾小球、系膜细胞及基底膜均受到不同程度的破坏, 而且有很严重的纤维化现象, 致使肾脏的功能受到严重损害。我们的研究中, 在应用人间充质干细胞治疗后, 模型小鼠的VEGF表达增强, 临床症状得到明显改善, 我们推测VEGF是间充质干细胞肾脏保护作用中的重要因子7, 8。
但是, 其中存在的问题在于: (1) VEGF的表达增强是否是由于间充质干细胞本身的直接作用; (2) VEGF的表达是否有赖于间充质干细胞使VEGF mRNA表达增强, 即是否是间接调控VEGF的表达; (3) 在很多研究中显示, 组织中存在一定数量的祖/母干细胞, 在人脐带间充质干细胞归巢到受损组织后, 营造出适合的微环境后该族群的细胞即被激活, 从而达到修复目的, 那么我们是否可以进一步研究VEGF的表达是由我们注入的人间充质干细胞调控还是由诱导出的组织本身的祖/母干细胞调控。
上述结论以及由此而衍生出的问题将会为我们以后的研究作为很有意义的参考, 相信人间充质干细胞的应用将会有广阔的前景。
参考文献
[1]袁莉, 梅长林, 刘厚奇, 等.VEGF基因转染促进人早胚间充质干细胞修复急性肾损伤的作用研究[J].第二军医大学博士学位论文, 2010, 03:78.
[2]汤颖, 娄探奇, 成彩联, 等.实验性IgA肾病模型的改进[J].中山大学学报, 2006, 27 (2) :184-187.
[3]WOODROFFE A J, GORMLY A A, CLARK A R.Experimental cirrhosis and deposition of glom erular IgA immune complexes[J].Contrid Nephrol, 1984, 40:51-54.
IgA+细胞 篇3
1 材料和方法
1.1 足细胞培养 小鼠肾足细胞株:由英国伦敦大学皇家医学院Steve教授赠送。培养基为RPMI1640培养液加100U/ml小鼠γ-干扰素(上海普飞),33℃、5%CO2培养箱中传代增生,细胞成鹅卵石状,之后转入37℃,5%CO2培养箱中,无γ-干扰素条件下继续培养,待其分化为树枝状细胞时,接种于25cm2的培养瓶中进行刺激干预。
1.2 含药血清的制备 按随机分组的原则,将40只SD大鼠(浙江中医药大学实验动物中心)分为4组,分别为正常组、复方积雪草2号组(主要成份为积雪草、黄芪、当归、桃仁、大黄、雷公藤等,简称中药组)、缬沙坦组、强的松龙组。正常组每日1次灌胃蒸馏水2ml。复方积雪草2号组每日1次灌胃中药2ml(每ml含生药积雪草0.375g),缬沙坦组每日1次灌胃缬沙坦2ml(每ml含缬沙坦0.9mg),强的松龙组每日1次灌胃强的松龙2ml(每ml含强的松龙0.6mg)。连续灌胃3天,于末次灌胃1小时后股动脉取血,离心取血清,56℃水浴30分钟灭活补体,0.22μm无菌滤器过滤除菌,分装冻存备用。
1.3 实验分组 参照文献[3]剂量用不含血清的RPMI1640培养液将IgA1刺激终浓度调至100μg/ml。实验分为7组:分别为正常组、模型组、中药高浓度组(原血清)、中药中浓度组(50%原血清)、中药低浓度组(25%原血清)、强的松龙组和缬沙坦组。
1.4 细胞活力测定 采用胎盼蓝法。各组细胞干预24小时后收集细胞,混匀后各取900μl,加入100μl的0.4%胎盼蓝染色,混匀后静置3分钟,取10μl用细胞计数板显微镜下分别计活细胞与死亡细胞数量。
1.5 VEGF、Col-IV蛋白含量测定 ELISA法检测。按照VEGF、Col-IV检测试剂盒操作说明操作,以OD值为纵坐标,以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线,并根据标准曲线分别计算出VEGF、Col-IV蛋白浓度。
1.6 VEGFmRNA、Col-IV α 2链表达的测定 RT-PCR检测。收集刺激后的细胞培养上清液,用Trizol(美国Promega)按标准程序提取细胞总RNA。紫外分光光度计测定样品的总RNA含量。用M-MLV(美国Promega)逆转录为cDNA,在PCR仪扩增(美国Bio-Rad公司)。引物由上海生工公司合成。VEGF上、下游引物序列分别为5′-CCT GGT GGA CAT CTT CCA GGA GTA CC-3′、5′-GAA GCT CAT CTC TCC TAT GTG CTG GC-3′,产物为196bp;IV胶原α2链上、下游引物序列分别为5′-CTG GGT GGC GGA GTT TGT-3′、5′-GAT GTG CGT GCG GAT GAG-3′,产物为266bp;内参照为GAPDH,上、下游引物序列分别为5′-TAC TAG ACA AGA TGG TGA AG-3′、5′-TGA CGG GAT CTC GTC CCT GGA AGA T-3′,产物为255bp。退火温度60℃,反应循环数为35个。PCR产物行琼脂糖凝胶电泳,用810-RAD凝胶成像系统图象采集,Quantity-one软件半定量分析。
1.7 统计学处理 采用SPSS 11.5医学统计软件,对实验数据进行单因素方差分析,实验数据以均数±标准差undefined表示。
2 结果
2.1 各组细胞活力测定
正常组活细胞率为98.5%、模型组活细胞率为96.8%、中药高浓度组活细胞率为97.4%、中药中浓度组活细胞率为98.1%、中药低浓度组活细胞率为97.9%、强的松龙组活细胞率为97.3%、缬沙坦组活细胞率为98.1%。各组细胞活力测定均在95%以上,提示本实验所用干预用药未对细胞产生毒性作用。
2.2 各组足细胞VEGF、Col-IV表达的变化 见表1~2。
与正常组比较△P<0.05,△△P<0.01;与模型组比较▲P<0.05,▲▲P<0.01
与正常组比较△P<0.05,△△P<0.01;与模型组比较▲P<0.05,▲▲P<0.01;与低浓度组比较#P<0.05
3 讨论
血管内皮细胞生长因子(VEGF)是一种二聚体糖蛋白,在肾脏主要由足细胞产生,有增加血管通透性、促进内皮细胞增生和血管形成作用。肾小球内皮细胞表面有相应的VEGF受体,是内皮细胞生长的有效刺激因子。足细胞和内皮细胞是构成肾小球滤过膜的重要成分,VEGF能减少肾小球基底膜阴离子数而影响电荷屏障,并通过影响肾小球内皮细胞而调节滤过膜机械屏障,因而被认为是调节肾小球通透性的重要因子。大量证据表明,VEGF与蛋白尿的形成有密切的关系[4,5,6]。Bailey[5]等发现微小病变肾病综合征患者肾组织中VEGF明显上调;Wasada[6]等也发现糖尿病肾病患者的尿蛋白与VEGF水平呈正相关,Cooper[7]等人观察经STZ诱导的糖尿病大鼠VEGF及VEGF受体的表达情况,发现3周及32周糖尿病大鼠VEGF表达明显增加,而VEGF受体仅在3周时表达增加,提示VEGF介导了早期糖尿病肾病的蛋白尿排泄;以上研究提示VEGF的异常分泌增加将导致肾小球滤过膜通透性增加,促进蛋白尿形成。足细胞上有VEGF受体,这些受体通过酪氨酸激酶信号途径使足细胞产生VEGF,而进行自我调节,形成自分泌环。Chen S[8]研究证实,转化生长因子(TGF)可以通过刺激足细胞分泌VEGF增加,而最终使足细胞分泌的Col-IV α3增加,即足细胞分泌VEGF可以通过自身受体作用的信号使足细胞分泌的Col-IVα3增加,其为构成基底膜的主要成分,其结果是使基底膜增厚的同时使基底膜的通透性增加,提示VEGF分泌增加不仅增加蛋白尿的产生,还有助于肾小球的硬化。Iglesias-de la[9]研究也表明,足细胞在使基底膜增厚和蛋白尿的产生中起关键作用,当足细胞产生的IV胶原(Col-IV)增多时,基底膜增厚,分泌VEGF增多时蛋白尿增加。Col-IV则是哺乳动物基膜的最基本成分,在肾小球基底膜(GBM)中含量最丰富,Col-IV由上皮细胞分泌至细胞外后,自我结合形成多边形Col-IV网,再与层黏连蛋白、巢蛋白、蛋白聚糖和其他糖蛋白一起形成基膜。基膜是细胞附着的支架,有利于维持细胞的正常形态和功能,同时影响细胞的增殖、分化、分泌及物质水分等滤过[10]。Col-IV分泌的异常将直接导致肾脏病的发生。
IgA肾病是以IgA或IgA为主的免疫复合物沉积在肾小球系膜区或血管襻为病理特征的一组肾小球疾病,其发病机制目前仍末完全明了。既往研究认为IgA肾病是由于黏膜免疫引起的免疫复合物肾炎,但这个假说仍有许多不能解释的现象,如:(1)约30%~50%IgA肾病患者血清IgA升高,且升高的IgA主要是骨髓产生的IgA1,并非黏膜分泌的IgA2;(2)沉积在肾小球中的IgA认为是聚合IgA1;(3)血清中很少检测到含IgA2的循环免疫复合物[11];等等。研究[12]已发现IgA1与肾小球细膜细胞结合具有特异性和相当的亲和力,可以激活信号传导通路,引发细胞增生和分泌炎症因子等,沉积在肾小球系膜区的IgA1与肾小球系膜直接的相互作用越来越受到人们的重视,认为IgA肾病的发生与进展与IgA1存在密切关系。
足细胞及相关蛋白分子在维持正常肾小球选择性滤过屏障方面具有至关重要的作用,足细胞损伤可直接导致蛋白尿的发生[13],同时还可通过产生某些细胞外基质(ECM)生成因子,造成ECM积聚,最终导致肾组织硬化。我们的体外研究结果显示:经100μg/ml浓度的IgA1刺激后,无论足细胞培养液中的VEGF和Col-IV含量,还是足细胞内的VEGF和Col-IV的mRNA的表达,与不加IgA1刺激的正常组比较均明显增加(P<0.05),说明IgA1可以诱导体外培养肾小球足细胞VEGF和Col-IV的分泌增加以及mRNA表达上调,提示IgA肾病患者血清IgA1与肾小球足细胞直接相互作用可能是IgA肾病足细胞损伤的发病机制之一。
本研究用复方积雪草2号、强的松龙以及缬沙坦作为实验干预用药进行观察,结果显示:复方积雪草2号高、中、低浓度组,强的松龙组,缬沙坦组均可抑制IgA1刺激下足细胞VEGF的异常表达,复方积雪草2号高浓度组及强的松龙组均可抑制IgA1刺激下足细胞Col-IV的异常表达。提示中药复方积雪草2号、强的松龙及缬沙坦可以通过抑制IgA1诱导下足细胞VEGF、Col-IV的分泌,保护足细胞、减少蛋白尿的产生、减轻肾小球的硬化。复方积雪草2号通过何种信号通路影响VEGF、Col-TV的表达,还有待继续研究。
摘要:目的:探讨复方积雪草2号对IgA1诱导的小鼠肾足细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)、IV型胶原(Col-IV)的影响。方法:用体外实验的方法,将小鼠肾足细胞经培养及传代,分成正常组、模型组、复方积雪草2号高、中、低剂量组、泼尼松龙组及缬沙坦7组,用IgA1诱导并分别予以上述各药进行干预24小时,用RT-PCR及ELISA法分别检测VEGF、Col-IV的mRNA及其蛋白质的表达。结果:IgA1刺激可以使小鼠足细胞VEGF与Col-IV表达明显升高(P<0.05),泼尼松龙、缬沙坦和复方积雪草2号的干预均能明显降低小鼠足细胞VEGF的高表达,与模型组相比,P均<0.05;而且泼尼松龙和复方积雪草2号还能明显降低足细胞Col-IV的高表达,与模型组相比,P均<0.05。结论:复方积雪草2号可抑制肾足细胞由IgA1诱导造成的VEGF、Col-IV的高表达。
IgA+细胞 篇4
1 材料
1.1 动物
Wistar健康大鼠, 清洁级, 体重250~300g, 雄性, 由中国药品生物制品检定所实验中心供给, 许可证号为:京动许字 (2000) 第017号。
1.2 试剂与仪器
0.5%羧甲基纤维素 (CMC) :中国医药上海化学试剂站供给;内毒素 (LPS) :Sigma公司;血清IL-2、IFN-γ、IgA、IgG检测试剂盒:尚柏生物医学技术有限公司提供。MK-3全自动多功能型酶标仪:美国Rayto公司产品。大前门烟:上海烟草公司出品。
1.3 药物
氨茶碱:北京紫竹药业有限公司, 批号:20050111;安肺益肾方:由冬虫夏草菌丝粉、生黄芪、红景天、银杏、瓜蒌、海蛤壳、麻黄等8味中药组成, 为颗粒剂, 由北京师范大学教育部资源药物工程研究中心所提供, 规格为每剂生药89.5g, 制成22.15g颗粒, 每克颗粒相当于生药3.56g。
2 方法
2.1 COPD大鼠模型的制备
本实验采用熏香烟加气管注入内毒素法复制COPD模型[4]。除正常对照组呼吸正常空气外, 其余各组大鼠每天在染毒箱内被动吸烟12支×1次, 每次30分钟。在实验开始第1天和第14天时, 各组大鼠均用10%水合氯醛4ml/kg作腹腔注射麻醉, 除正常对照组气道内缓慢滴入200μl生理盐水外, 其它各组大鼠均气道内缓慢注入200μl内毒素水溶液 (1mg/ml) , 当日不予被动吸烟。连续熏烟4周。
2.2 分组与给药
大鼠按体重采用半随机单盲法分为6组, 即安肺益肾方大、中、小剂量组 (简称大、中、小剂量组) , 造模对照组 (简称模型组) , 阳性药氨茶碱对照组 (简称氨茶碱组) 和正常对照组 (简称正常组) 。安肺益肾方大、中、小剂量组的给药剂量分别为2.4、1.2、0.6g/kg, 分别为临床用药剂量的2、1、0.5倍, 各实验药物均用0.5%CMC配制。氨茶碱组的给药剂量为15mg/kg, 为临床用药剂量的1倍, 氨茶碱组用药用生理盐水配制。模型组和对照组分别灌胃0.5%羧甲基纤维素钠 (CMC) 。各实验组给药体积均为1ml/100g体重, 每天给药1次, 连续给药4周。
2.3 观察指标及测定
给药4周后, 各组随机取8只大鼠, 用25%乌拉坦 (4ml/kg) 腹腔注射麻醉后, 腹主动脉取血, 制备血清, 用ELISA法进行IL-2、IFN-γ、IgA、IgG含量检测;取大鼠脾脏, 用MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖功能。
2.4 统计学方法
实验数据以undefined表示, 用SPSS 13.0进行统计分析。治疗前后比较采用配对t检验, 两样本均数比较采用两个独立样本的t检验;多个样本均数比较用方差分析, 多重比较用LSD检验;重复测量数据采用重复测量数据的方差分析。
3 结果
3.1 各组大鼠血清IL-2、IFN-γ含量的测定
结果见表1。
与正常组比较△P<0.05, △△P<0.01;与模型组比较*P<0.05, **P<0.01
3.2 各组大鼠血清IgA、IgG含量的测定
结果见表2。
与正常组比较△P<0.05, △△P<0.01;与模型组比较*P<0.05, **P<0.01
3.3 各组大鼠脾淋巴细胞增殖的测定
结果见表3。
与正常组比较△P<0.05, △△P<0.01;与模型组比较*P<0.05, **P<0.01
4 讨论
安肺益肾方是导师姜良铎教授多年治疗COPD的经验方, 由冬虫夏草菌丝粉、生黄芪、红景天、银杏、瓜蒌、海蛤壳、麻黄等8味中药组成, 具有安肺益肾、益气活血、化痰通络的作用, 在临床治疗COPD中有较好疗效。因其既可宣肺, 敛肺, 又可补益肺气, 以复肺之宣肃, 非独宣肺、敛肺或补肺一端, 故名之“安肺”[3]。
研究表明, 肺内免疫动态失衡在慢性阻塞性肺疾病的发生中起到重要的作用[5]。IL-2、IFN-γ是具有广泛的免疫调节作用的细胞因子。IL-2 (又称T细胞生长因子, TCGF) 主要由T细胞产生, 以自分泌和旁分泌方式发挥效应, 能活化T细胞, 促进细胞因子产生, 刺激NK细胞增殖, 增强NK杀伤活性及产生细胞因子, 诱导LAK细胞产生, 促进B细胞增殖和分泌抗体, 激活巨噬细胞。IFN-γ产生于CD+4Th1和CD+8Th1, 是一种调节细胞功能的小分子多肽, 为Ⅱ型IFN, 可通过促进抗原呈递过程而增强免疫功能, 但在大剂量时常抑制淋巴细胞尤其是B细胞的增殖反应。它可通过刺激巨噬细胞、激活PMN、血管内皮细胞等在COPD的发病机制中起作用。本文结果显示在COPD模型大鼠血清中IFN-γ表达增加, IL-2表达降低, 这与有关文献报道的相似[6]。予安肺益肾方灌胃后, IFN-γ不同程度下降, IL-2不同程度增加, 提示该方可通过干预COPD T淋巴细胞亚群相关的细胞因子的表达而起到治疗作用。
IgA分血清型和分泌型两种, 血清型IgA可介导吞噬ADCC作用;分泌型IgA (SIgA) 能抑制微生物在呼吸道上皮附着[7], 减缓病毒繁殖, 保护黏膜表面, 防止感染[8], 对某些病毒、细菌和一般抗原具有抗体活性, 是防止病原体入侵机体的第一道防线。IgG是初级免疫应答中最持久、最重要的抗体, 它仅以单体形式存在。大多数抗菌性、抗毒性和抗病毒抗体属于IgG, 它在抗感染中起重要作用, 能够促进单核巨噬细胞的吞噬作用, 中和细菌毒素的毒性和病毒抗原结合使病毒失去感染宿主细胞的能力。它是唯一能通过胎盘的免疫球蛋白, 在自然被动免疫中起重要作用。此外, IgG还具有调理吞噬和结合SPA等作用。研究表明, 在COPD患者中, 血清IgG水平高的患者急性发作次数较血清IgG水平低的患者急性发作次数少[9]。本研究表明, COPD模型大鼠血清中IgA、IgG含量明显下降, 表明COPD模型大鼠存在免疫功能的降低;予安肺益肾方灌服后, IgA、IgG不同程度上升, 提示体液免疫参与了COPD的发生发展, 该方可通过提高COPD血清免疫球蛋白水平而起到治疗作用。
T细胞是淋巴细胞的主要组分, 它具有多种生物学功能, 如直接杀伤靶细胞, 辅助或抑制B细胞产生抗体, 对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等。T细胞产生的免疫应答是细胞免疫, 细胞免疫的效应形式主要有两种:与靶细胞特异性结合, 破坏靶细胞膜, 直接杀伤靶细胞;另一种是释放淋巴因子, 最终使免疫效应扩大和增强。研究表明, T淋巴细胞及其分泌的细胞因子在COPD的发生发展中起着重要的作用[10]。T细胞与COPD、哮喘的气道炎症和肺部疾病密切相关, 这一现象在老年人中尤其突出[11]。本研究表明, 在熏香烟加气管注入内毒素法制造COPD模型大鼠脾脏T淋巴细胞增殖功能明显下降, 表明COPD模型大鼠存在免疫功能的降低。予安肺益肾方灌服后, 脾脏T淋巴细胞增殖功能不同程度上升, 提示T淋巴细胞参与了COPD的发生发展, 该方可通过对COPD免疫增强和免疫调节作用而起到防治作用。
本研究同时用MTT法对安肺益肾方对熏香烟加气管注内毒素法制造COPD模型大鼠脾脏B淋巴细胞增殖功能进行了研究, 发现各组脾脏B淋巴细胞增殖功能均较低, 特别是模型组, 而安肺益肾方大、中、小剂量组与对照组比较有统计学意义。但由于模型组脾脏B淋巴细胞增殖功能较低, 未进行安肺益肾方大、中、小剂量组、对照组与模型组的脾脏B淋巴细胞增殖功能比较。模型组脾脏B淋巴细胞增殖功能较低可能与以下因素有关: (1) 实验方法选择存在错误, 可换用3H-胸腺嘧啶掺入法、荧光标记流式细胞仪分析法等进行检测。 (2) 培养中未严格无菌操作。 (3) 模型组大鼠免疫功能较低, 脾脏B淋巴细胞增殖功能低下。有待于在未来的实验中进一步探讨。
摘要:目的:探讨安肺益肾方对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠血清IL-2、IFN-γ、IgA、IgG及脾淋巴细胞增殖的作用。方法:健康Wistar大鼠72只, 采用半随机单盲法分为安肺益肾方大、中、小剂量组、氨茶碱组、模型组、正常对照组, 每组12只, 除正常对照组外, 其余各组大鼠采用熏香烟加气管注入内毒素法建立慢性阻塞性肺疾病模型。安肺益肾方大、中、小剂量组分别给予生药2.4、1.2、0.6g/kg, 氨茶碱组予氨茶碱15mg/kg。模型组和正常组灌胃0.5%羧甲基纤维素溶液, 连续给药4周。用ELISA法检测血清IL-2、IFN-γ、IgA、IgG含量;取大鼠脾脏, 用MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖情况。结果:安肺益肾方能降低慢性阻塞性肺疾病模型大鼠血清IFN-γ表达 (P<0.01) ;提高血清IL-2、IgA、IgG水平 (P<0.05) ;增强脾T淋巴细胞增殖 (P<0.001) 。结论:安肺益肾方可调节慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的免疫功能。
关键词:慢性阻塞性肺疾病/中医药疗法,安肺益肾方/治疗应用,大鼠
参考文献
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IGA肾病治验 篇5
患者男性, 13岁, 因感冒、咽痛而出现排尿不适来我院就诊。查血常规白细胞16.3×109/L, 中性分叶76%, 单核3%, 淋巴21%, 尿十项潜血++++ (≥200Cells/μL) 蛋白质+, 进一步查尿沉渣红细胞23个/μL (0~4个/μL) , 异性细胞占83%, 呈椭圆形, 棘形及头盔形, 白细胞6个/Hp, 肾功能:BUN8.4mmol/L (2.5~6.4 mmol/L) , 肌酐168μmol/L (53~133) , 二氧化碳结合力21 mmol/L (22~28mmol/L) , 尿酸164.3μmol/L (156~428μmol/L) , β2微球蛋白3.4mg/L (0.80~2.80 mg/L) , C3187mg/dL (82~180) , 抗“O”100 iu/mL (145iu/mL) , RF13 U/mL (2~140U/mL) , IGA529mg/dL (70.0~400 mg/dL) 其余生化指标均正常, 疑诊“IgA肾病”因条件限制未作肾活检。门诊给予雷公藤多甙, 卡托普利, 阿莫西林, 潘生丁口服, 一周后感冒症状消失, 查血常规白细胞7.3×109/L, 分类正常, 尿十项, 白细胞0, 红细胞12~15个/Hp, 潜血++++, 蛋白+/-遂自行在诊所用龟板、鳖甲等煎服迁延不愈无奈停药。半年后再次来院, 查尿红细胞4~5个/Hp, 潜血++++, 蛋白+/-, BUN8.9mmol/L, 肌酐183μmol/L, β2微球蛋白4.4mg/L, 二氧化碳结合力22 mmol/L, 尿酸142.7μmol/L, IGA540mg/dL, 抗“O”103 IU/mL, RF13 U/mL) 就诊中医门诊。自诉小便色浓, 时有尿疼不适, 尤以午后为甚, 伴腰疼, 平时多汗易感冒, 且随之加重。查体:营养发育良好, 咽红肿, 舌红, 苔薄白, 脉滑数。处方:金银花30g、连翘30g、玄参12g、贯众10g、豆根10g、射干10g、仙鹤草15 g、白茅根15g、藕节10g、地榆10g、生地10g、生草6g十剂, 水煎, 一日一剂。
二诊:用药后咽部红肿明显减轻, 舌淡红, 苔白腻, 脉濡, 其他症状同前, 查尿十项红细胞0, 潜血++, 蛋白-, 尿沉渣红细胞16个/μL, 70%异常, 上方减银花、连翘为15g, 加木香6g, 白术10g、苍术10g, 十剂水煎服, 一日一剂。
三诊:小便仍有淋涩感, 腰疼咽部红肿消失, 舌淡红, 苔薄白, 脉缓, 查尿, 潜血+, 余阴性, BUN7.8mmol/L, 肌酐156μmol/L, β2微球蛋白3.0mg/L, 二氧化碳结合力23 mmol/L, 尿酸153μmol/L, IGA432mg/dL, 抗“O”65 iu/mL, RF13 U/mL就诊, 二次处方加木通10g, 扁蓄10g, 三七6g十剂水煎服, 一日一剂。
四诊:因不慎感冒再次出现咽疼, 腰部不适, 尿不舒, 尿十项, 红细胞3~4个/Hp, 潜血++, 较上次有所反弹, 三次处方加荆芥10、桂枝10十剂, 水煎一日一剂。
五诊:感冒及尿不适等症状消失, 查尿十项 (-) , 处方:藕节12g、仙鹤草15g, 丹参10g、三七6g、木通10g、扁蓄10g, 二花10g、连翘10g、寄生10g、贯众12g、甘草6g二十剂水煎, 一日一剂。
六诊:自觉无不适, 尿十项, 尿沉渣均阴性, 肾功能BUN3.5 mmol/L, Scr110μmol/L, β2微球蛋白1.09 mg/L, C393mg/dL, IGA342.2mg/dL, 做扁桃体摘除术, 术后尿潜血再次++, 红细胞 (-) 。用原方治疗一周, 尿潜血 (-) 。方用黄芪15g、白术g10、防风10g、玄参10g、山芋10g、熟地15g、山药10g、丹皮6g、泽泻6g、茯苓10g, 杜仲10g、寄生10g、三七6g三剂混合粉碎成末, 炼蜜成丸, 一次九克, 一日两次, 服药半年后, 停药, 随访一年无复发。
2 讨论
IGA肾病 (IgA.nephropathy, IgA) 又称Berger病, 是多种原因引起的具有相同病理, 指在肾小球系膜区以IGA或IGA沉积为主, 伴或不伴有其他免疫球蛋白在肾小球系膜区沉积的临床表现、病理改变、预后变异甚大的原发性肾小球病, 临床上一部分患者表现为发作性肉眼或显微镜下血尿, 有时伴有蛋白尿, 有的表现为肾病综合症和肾功能衰竭, 本例患儿以血尿为主, 腰痛, 尿痛轻微, 病程长达两年, 随上呼吸道感染而加重, 平时自汗多, 易感冒, 扁桃腺由于长期炎症Ⅰ度肿大, 发作时咽部弥漫性红肿, 尿潜血 (++++) , 尿沉渣红细胞呈多形性改变, 有时伴蛋白尿最多者 (+) , 发病早期肾功能异常, 尿素氮, 肌酐缓慢升高, IGA升高, 由于条件限制未做肾活检, 患儿营养发育良好虽未治疗半年, 除自觉腰痛, 尿痛外, 尿化验潜血 (++++) 再无其他不良表现, 可除外过敏性紫癜, 肝病, 狼疮肾等;病程较长, 而临床证侯以实热表现为主, 火热上扰咽痛咽肿, 下伤血络, 血溢于外故尿血, 上方清热解毒, 凉血止血, 热邪得清, 尿血自止, 尿化验好转后, 湿热下注膀胱气化不利腰痛尿涩不爽仍持续存在, 加入木通, 扁蓄, 三七, 清利湿热浊邪, 散瘀生新;据现代医学研究, 清热解毒中药具有显著的抗脂质过氧化损伤作用, 能保护细胞器的结构完整和功能正常[1], 清热解毒类中药抗感染作用的主要机制被认为与提高机体特异性和非特异性免疫功能有关, 临床症状消失尿化验正常后处方玉屏风散合六味地黄汤加玄参、杜仲、寄生、三七, 以清余热, 补气滋阴, 健脾补肾, 扶正固本;现代医学认为健脾补肾药均有调节人体免疫功能, 对于预防疾病复发有重要作用, 特别是方中加入了三七对损伤细胞的修复有很好的作用, 前医不加辨证屡用龟板, 鳖甲之属而招致疾病迁延, 是所谓闭门流寇[2,3]。所以治疗疾病掌握初诊是临床的重点, 凡初诊必须详审有无新感, 若有新感无论阳虚阴虚之体必先解表, 庶免遗患.不在某法之可不可用, 在于其法用之当于不当, 中医治病重在辨证, 临证依据病情立法选方, 随证施治, 这就是祖国医学的治疗原则。
摘要:目的 探讨IgA肾病应用中药治愈的实验室检测变化。方法 中药方用清热解毒, 凉血止血。实验室检测以潜血、尿蛋白、IgA、C3、β2微球蛋白变化为主。结果 IgA肾病用中药治疗后, 潜血、尿蛋白、IgA、C3、β2微球蛋白各项数据恢复正常。结论 IgA肾病正确辩证, 施治可取得满意的临床效果。
关键词:IgA肾病,中医治疗,实验检测
参考文献
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