基因转移（精选九篇）
基因转移 篇1
军事医学科学院院长贺福初院士表示, 这项科学发现, 不仅是细菌耐药性研究领域的原创性新认识, 也是纳米材料生物安全研究领域的最新突破。
纳米材料是指三维空间尺度至少有一维处于纳米量级 (1～100纳米) 的材料。而氧化铝纳米材料因能吸附水中的有机物、重金属等有害物质, 而被不断应用于水源的净化处理。该院卫生学环境医学研究所李君文研究员带领课题组长年从事医学微生物安全评价与检测研究, 并一直关注着纳米材料对环境中微生物的影响。经过5年潜心研究, 通过大量实验发现, 水中的纳米氧化铝可以使耐药基因从大肠杆菌转入沙门氏菌的效率提高200倍, 而大肠杆菌到粪肠球菌的效率能提高50多倍。他们还发现, 即使以往很难发生耐药基因转移的不同种类细菌, 在氧化铝纳米粒子的作用下耐药基因也发生了转移。氧化铝纳米粒子大大加快了细菌获取耐药基因的速度。
基因转移 篇2
目的 应用变性高效液相色谱技术(DHPLC)分析巯嘌呤甲基转移酶(TPMT)基因多态性位点.方法 用以PCR为基础的DHPLC,检测健康成人和脐血以及急性白血病病人,TPMT基因第5外显子G238C、第7外显子G460A和第10外显子A719G的3个多态性位点.结果 健康成人、脐血和急性白血病病人全部DNA样本,TPMT基因外显子区的3个位点的`多态性频率为3.49%,远低于白种人和非洲人.变异的位点仅为第10外显子A719G,且均为杂合变异.TPMT第5外显子630例标本的色谱峰均为单峰.第7外显子有316例为单峰,214(34%)为杂合峰.将单峰标本进行1:1混合后重新进样也有杂合峰出现.经DNA测序分析,证实此区无序列变异;杂合峰标本在54和60℃为单峰,55～59℃均为杂合峰.而单峰标本峰形未随温度发生变化.说明DHPLC的检测误差并不是柱箱温度不合适引起的.第10外显子有608例为单峰,杂合峰为22例,其中10/22例标本进行DNA直接测序,证实为杂合变异.结论 DHPLC技术能快速筛选出TPMT第5和第10外显子区的多态性位点,但不能检测出第7外显子的多态性位点.因此,DHPLC不能作为单一方法进行TPMT基因多态性位点的检测.
作 者：马晓莉 朱平胡亚美 吴敏媛 李志刚 卜定方 MA Xiao-li ZHU Ping HU Ya-mei WU Min-yuan LI Zhi-gang BU Ding-fang 作者单位：马晓莉,胡亚美,吴敏媛,李志刚,MA Xiao-li,HU Ya-mei,WU Min-yuan,LI Zhi-gang(首都医科大学附属北京儿童医院血液中心,北京,100045)
朱平,卜定方,ZHU Ping,BU Ding-fang(北京大学第一医院血液科,北京,100034)
动物基因是如何转移的？ 篇3
外源性基因导入受体动物有不同的方法，同时，由于有不同的受体动物，因此要根据实际情况采用不同的方法对动物进行转基因。大致而言，动物转基因的方法有：逆转录病毒法、显微注射法、胚胎干细胞介导法、精子载体法和体细胞核移植法（体细胞克隆介导法）等。
通过逆转录病毒转移基因
研究人员早就发现，逆转录病毒常常能侵入宿主细胞并整合于细胞中的DNA，因此逆转录病毒被用来当成载体以进行外源性基因的转移。一般做法是，把外源性基因插入到逆转录病毒，再由逆转录病毒感染受体动物的胚胎。此后将感染的桑椹期胚胎导入动物子宫，就可发育成携带外源性基因的子代动物。
具体的原理是，逆转录病毒的核酸在逆转录酶作用下会反转录为双链DNA，然后整合到受体细胞核基因组中。由于逆转录病毒DNA的长末端重复序列（LTR）区域具有转录启动子活性，如果把外源基因连接到LTR下部进行重组后，包装成高滴度病毒颗粒，加入到动物早期胚胎的培养液中，或与胚胎共同培养，或注入囊胚腔中，携带外源性基因的逆转录病毒DNA就可以整合到宿主染色体上，达到外源性基因转移到受体动物胚胎的目的。
2001年，美国哥伦比亚大学的帕克等人利用逆转录病毒将绿色荧光蛋白（EGFP）基因转入猪的成纤维细胞和耳上皮细胞，然后用这些细胞的细胞核进行核移植，获得了能发出绿色荧光的转基因猪。与此同时，其他研究人员利用这种方法培育出转基因猴。
但是，逆转录病毒作为载体具有潜在的致癌性，而且载体的构建较为复杂，容纳外源性基因的大小也有限，因此这项技术的应用受到一定限制。
显微注射法转移基因
动物转基因的显微注射法又称受精卵原核显微注射法，是用直径约0.5～1微米的玻璃微管吸入外源性基因，直接插入到受体动物的受精卵的细胞内，将外源性基因注入细胞中，然后通过受体动物基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等，使外源性基因嵌入受体动物的染色体内，最后这样的胚胎移植到代孕母体子宫内并发育成子代个体。
1980年美国的戈登等人首先用显微注射法创造了转基因小鼠。他们把小鼠的受精卵取出来，在显微镜下将胸苷激酶基因用玻璃微管送入受精卵的细胞中，然后将受精卵输入代孕母鼠的子宫内，最终发育成转基因小鼠。此后研究人员相继把人的珠蛋白基因和胰岛素基因转入小鼠体内。
显微注射法的优点是，动物的任何外源性基因都可转入受体动物体内，而且用这种方法已经获得转基因小鼠、鱼、大鼠、兔子以及转基因牛、羊、猪等。但是，这种方法转移外源性基因到受体动物的染色体时是随机整合的，因而难以控制其整合率。另外对外源性基因能否稳定整合于受体基因组的检测必须等到子代个体出生后才能进行和确认，不利于在生育期长、产仔少的大家畜中应用。
胚胎干细胞介导法
胚胎干细胞（ES）是从哺乳动物囊胚期内的细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，具有发育的多能性，能够分化出各种组织。20世纪80年代中期研究人员就开始利用胚胎干细胞进行动物转基因。方法是，将外源性基因直接导入胚胎干细胞，经体外培养筛选后再注入到受体胚胎，与其中的胚胎细胞聚集在一起，成为受体胚胎的一部分，参与其分化。
此后，这种胚胎可发育成嵌合体的转基因动物，这种动物体内有一部分组织来源于整合有外源性基因的供体胚胎干细胞。在嵌合过程中，从胚胎干细胞分化而成的生殖细胞可通过杂交将转入的外源性基因传递到子代。
研究证明，胚胎干细胞介导法可使受体动物细胞中外源性基因整合率达50%，其中生殖细胞中外源性基因整合率可达30%。但是，建立胚胎干细胞系比较困难，现在只建立了小动物的胚胎干细胞系，猪、羊、牛等大型动物的胚胎干细胞系尚未建立。
精子载体法
早在1971年，研究人员就发现，外源性基因可以进入动物精子。后来，研究人员将精子反复冷冻或经化学物质处理后与外源性基因共同孵育，使外源性基因与精子结合，通过人工授精获得转基因个体。
1989年，意大利研究人员拉维特拉诺将小鼠附睾精子与线粒体或环状pSV2CAT质粒一起在37℃下孵育30分钟，再用这种精子对成熟卵子进行体外授精，这样得到胚胎移植入受体鼠的子宫孕育，通过受体鼠孕育产出250只小鼠，以CAT基因为标记进行检测，发现有30%的小鼠成为转基因鼠。
目前研究人员通过精子载体法已获得了12种转基因动物，如转基因牛、猪、家兔和小鼠等。但是，这种方法进行动物转基因的成功率不高，效果也不稳定，还有待进一步研究和发展。其中，必须弄清楚精子和外源性基因结合的分子机制，外源性基因在精子和受精卵内的复制机理，以及促进精子结合外源性基因的方法和途径。
体细胞核移植法
体细胞核移植法又称体细胞克隆介导法，原理是，将外源性基因导入动物体细胞染色体中，然后通过显微操作技术将转入了外源性基因的细胞核移植到去核的卵母细胞中构成一个重建卵子，然后用人工方法让这个卵子发育，形成胚胎，再把胚胎移植到受体动物中，经妊娠、分娩后获得转基因克隆动物。
利用体细胞核移植法是目前动物转基因中的高级技术，1997年世界上第一个转基因绵羊（克隆羊）多利就是用这种方法产生的，是英国PPL公司与罗斯林研究所率先应用体细胞核移植法获得的成果。
多利诞生的过程和原理可以详细解释体细胞核移植法进行的动物转基因。
研究人员先从一只6岁的芬兰多塞特雌性白面绵羊（简称A）的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的培养液中，细胞逐渐停止分裂，这个细胞称为供体细胞。此后，研究人员从一头苏格兰黑面雌性绵羊（简称B）的卵巢中取出未受精的卵子，并将细胞核去除，使这个卵子成为一个无细胞核的卵细胞，也称为受体细胞。
然后，研究人员利用电脉冲方法让供体细胞和受体细胞融合，在这个过程中A细胞的细胞核融入B细胞中并像受精卵一样产生细胞分裂、分化，从而形成胚胎。最后将这个胚胎移植到另一只苏格兰黑面雌性绵羊（简称C）的子宫内，胚胎正常发育，足月孕育后绵羊C娩出小绵羊多利。
从这个过程可以看出，多利的主要遗传物（细胞核DNA）来自多塞特雌性白面绵羊（A），当然，多利身上还有来自苏格兰黑面雌性绵羊（B）的线粒体DNA，因为B细胞尽管去除了细胞核，在其细胞质中还有多种细胞器，其中就含有线粒体，线粒体也是一种遗传物质。所以，多利有3位母亲，一是基因母亲多塞特白面母绵羊（A）；第二个是借卵母亲，也称线粒体母亲，即剔除了细胞核的苏格兰黑面绵羊（B），胚胎是在B的卵子中借壳融合、分裂、发育而成的；第三个是代孕母亲，即另一头苏格兰黑面雌性绵羊（C），多利是在绵羊C的子宫中孕育并分娩的。
从这个意义上看，这样的转基因实际上转移了多塞特雌性白面绵羊（A）的全部细胞核的基因组。由于多利没有父亲，是通过无性繁殖即克隆而来，因此这样的转基因方法也称为体细胞克隆介导法。
基因转移 篇4
关键词：胃癌,原发病灶,转移病灶,侵袭转移,nm23
1材料与方法
1.1材料
检测的胃癌组织, 来源于齐齐市哈尔铁路医院病理科标本及哈尔滨医科大学病理教研室2001至2004年积累的胃癌标本。45例胃癌组织, 以及相对应的胃癌已伴随转移的淋巴结组织。男30例, 女15例, 男∶女为2∶1。最大年龄84岁, 最小年龄37岁, 平均年龄56.8岁。45例胃癌组织, 均为浸润性胃癌, 组织学的分化程度:高、中分化腺癌18例;低分化腺癌20例;黏液腺癌3例;印戒细胞癌4例。所有45例胃癌组织, 均伴有不同程度的淋巴结转移。
1.1.1主要试剂
(1) 0.01mol/L PBS缓冲液 (pH=7.4) ; (2) 0.01mol/L柠檬酸盐抗原修复液~p H=6.0) ; (3) 小鼠抗人nm23单克隆抗体 (武汉博士德生物技术有限公司) ; (4) 即用型第二代免疫组织化学Elivision TM plus试剂盒~迈新生物技术有限公司) ; (5) 辣根过氧化物酶显色剂DAB (福建迈新生物技术有限公司) ; (6) 1%伊红染液; (7) 苏木素染液。
1.1.2主要仪器
(1) 滑动切片机, 德国; (2) 万能显微镜, 日本; (3) 生物显微镜, 日本; (4) 电子天平, 中国; (5) 微波炉, 中国; (6) 微量加样器, 日本。
1.2方法
1.2.1 HE染色 (苏木素-伊红染色)
以上所检肝组织均是由10%甲醛固定、按常规制备HE切片, 具体步骤如下: (1) 脱腊:二甲苯~Ⅰ) 15min→二甲苯~Ⅱ) 15min→二甲苯 (Ⅲ) 15min→二甲苯 (Ⅳ) →100%乙醇5min→95%乙醇5min→80%乙醇5min→70%乙醇5min→自来水洗。 (2) 染色:苏木素液8min→自来水洗片刻→1%盐酸酒精分化1~2min→自来水洗片刻→0.5%伊红1min→自来水洗。 (3) 脱水、透明、封固:90%乙醇片刻→95%乙醇片刻→100%乙醇5min→100%乙醇5min→二甲苯10min→二甲苯10min→树脂胶封固。
1.2.2免疫组织化学
本实验按胃癌的原发部位和转移部位分为两组, 各45例。免疫组织化学采用s ABC~streptomycin avidin biotin-peroxidase complex) 法, 分别检测两部位nm23的表达情况。
具体步骤如下: (1) 常规组织切片后, 置于65℃烤箱中烘烤4~8h。 (2) 二甲苯脱蜡至水, 后用PBS冲洗。 (3) 3%H2O2阻断内源性过氧化物酶10min, PBS冲洗 (5min×3) 。 (4) 采用微波抗原修复法。 (5) 自然冷却至室温, PBS冲洗 (5min×3) 。 (6) 用正常血清封闭15min。 (7) 加一抗, 4℃过夜。 (8) 用PBS冲洗 (5min×3) 后, 加二抗生物素, 室温30min。 (9) 用PBS冲洗 (5min×3) 后, 加辣根过氧化物酶, 室温15min。 (10) 用PBS冲洗 (5min×4) 后, DAB显色。流水去DAB, 苏木素复染, 流水冲洗10min。二甲苯透明, 封片。
1.2.3阳性结果的判定
nm23的表达以细胞胞质呈明显棕黄或棕褐色着色为阳性细胞, 每张切片均在癌细胞区着色细胞数占癌细胞总数比≥25%判定阳性。
1.2.4数据处理
用χ2检验和spearman统计分析, 当P<0.05时, 有显著性差别。
2 结果
2.1 45例胃癌病理组织学
45例胃癌原发部位组织, 高、中分化腺癌18例, 低分化腺癌20例, 黏液腺癌3例, 印戒细胞癌4例。45例胃癌组织, 每一例都有不同程度的淋巴管侵入和淋巴结转移, 即2/5、4/7、1/4、5/6 (分母为所获取的淋巴结数目, 分子为转移的淋巴结数目) 等。转移致胃小弯的淋巴结有6例;转移致胃大弯的淋巴结有10例;转移致胃小弯淋巴结和胃大弯的淋巴结有15例;转移致胃全周的淋巴结有14例。
2.2 45例胃癌组织nm23在原发部位与转移淋巴结中免疫组织化学检测
在胃癌的原发部位, nm23的阳性表达有26例 (26/45, 57.8%) , 在胃癌的侵入淋巴管图和转移致相应的淋巴结中, nm23的阳性表达有27例 (27/45, 60.0%) , 见表1。
3 讨论
肿瘤细胞具有侵袭和转移的能力, 这是恶性肿瘤最基本的生物学特性, 而侵袭和转移又是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的主要原因[1,2]。因此, 研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制, 对恶性肿瘤的防治有重要意义。
肿瘤侵袭 (tumor invasion) 是指恶性肿瘤细胞从其起源部位沿组织间隙向周围组织浸润的过程, 其标记是肿瘤细胞突破基底膜, 这是肿瘤扩散的第一步。肿瘤转移 (tumor metastasis) 是恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔, 至靶组织或靶器官, 长出与原发瘤不相连续而组织学类型相同的肿瘤。肿瘤侵袭和转移是两个既有联系而又是不同特点的过程。侵袭性生长是转移的前提和基础, 转移则是侵袭的继续和发展。
肿瘤侵袭和转移的机制, 特别是分子机制虽尚未彻底阐明, 但已获得相当丰富的研究材料, 取得较大的进展。如瘤体内的压力作用;瘤细胞黏着性降低;癌细胞的迁移;细胞黏附分子与肿瘤侵袭和转移;细胞外基质的降解;机体的免疫状态与肿瘤的侵袭和转移等。
到目前为止, 胃癌仍是我国发病率最高的恶性肿瘤, 也是导致人类由于肿瘤死亡的头号杀手[3]。近30年来, 对胃癌的诊断、治疗有了长足的进步, 但侵袭转移和复发仍是影响预后的一个重要因素, 且其过程非常复杂。近年来, 随着细胞生物学和分子生物学的发展, 对此已有了较深刻的认识, 尤其是肿瘤的侵袭和转移。
胃癌的侵袭转移与其他许多恶性肿瘤一样, 是一个多因素、多阶段、多种基因变异积累形成的综合病变过程, 在此, 多种因素参与其中。胃癌细胞脱离原发部位, 其黏附力下降, 也是多因素、多阶段、多种基因变化的结果[4,5,6], 如肿瘤抑癌基因的激活;某些癌基因的活化;一些基因的异常表达等。但是, 胃癌侵袭转移的具体分子机制尚不清楚, 多数专家研究曾提出与胃癌侵袭转移呈正、负相关的一些因素, 如正相关因素有:在各期胃癌中均可出现的抑癌基因p53基因突变;参与信号传导系统的原癌基因c-erb B2;降解局部基质, 促进癌细胞的迁移的基质金属蛋白酶2;介导癌细胞与基质间的异质黏附作用, 也能与细胞内骨架蛋白结合, 调节细胞移动和增殖, 影响肿瘤侵袭和转移的CD44v6;在癌细胞周围的细胞间质和基底膜的破坏过程中起重要作用的尿激酶型纤容酶原激活物 (u-PA) ;在ECM降解及血管生成调节中起重要作用的u-PA的抑制剂 (PAI-1) 。负相关的因素的:上皮钙黏附素 (E-cadherin, E-cad) 的黏附力下降;基质金属蛋白酶组织抑制剂2的异常表达;整合素 (integrin) 蛋白的过度表达等。而nm23RNA基因表达水平与肿瘤转移能力呈负相关。nm23等位基因缺失及突变与肿瘤转移能力呈正相关。
经SPSS软件分析, P=0.459
本实验研究结果发现, nm23蛋白与胃癌肿瘤的大小、发生部位、淋巴结转移均无关, 而且在已发生远处转移的胃癌组织中nm23蛋白与原发部位的表达非常相近 (分别是57.8%和60.0%) , nm23在胃癌的原发部位表达率到转移到远处部位的表达率无差异, 认为nm23蛋白在胃癌转移发生过程中可能没有起到抑制作用。这一实验结果与少部分学者的研究结果相一致。关于nm23在肿瘤中的作用机制, 有必要同时检测原发和转移部位的癌组织的蛋白表达和基因表达情况, nm23在不同癌细胞中的表达情况, 如胃肠道系统的恶性肿瘤;肺癌、肝癌、肾癌等, 进一步证实nm23在肿瘤转移过程中的作用机制。
总之, 肿瘤侵袭和转移是肿瘤病人的主要死因, 它是一个癌细胞与宿主细胞之间相互作用的过程, 是多因素、多基因综合作用的结果, 其机制十分复杂。认识与胃癌预后相关的生物学特征, 将为揭示胃癌侵袭转移本质奠定基础, 同时为肿瘤的根治治疗提供科学的理论依据。
4 结论
(1) 45例胃癌组织, 均为浸润性胃癌, 都伴有不同程度的淋巴结转移。 (2) 在45例原发部位的胃癌组织中, nm23阳性表达率为57.8% (26/45) 。在45例转移至淋巴结内的胃癌组织中, nm23阳性表达率为60.0% (27/45) 。 (3) nm23在胃癌转移发生过程中是否起到起到抑制作用, 有待于进一步研究。
参考文献
[1]刘复生, 刘彤华.肿瘤病理学[M].北京:北京医科大学、中国协和医科大学出版社, 1997.
[2]谭郁彬, 张乃鑫.外科诊断病理学[M].天津:天津科学技术出版社, 2000.
[3]Sarris M, Scolyer RA, Konopka M, et al.Cytoplasmic expression of nm23predicts the potential for cerebral metastasis in patients with primary cutaneous melanoma[J].Melanoma Res, 2004, 14 (1) :23-27.
[4]Park DS, Lee YT, Lee JM.Prediction of lymph node metastasis based on p53and nm23-H1expression in muscle invasive grade III transitional cell carcinoma of bladder[J].Adv Exp Med Biol, 2003, 539 (Pt A) :67-85.
[5]Kanat O, Adim S, Evrensel T, et al.Prognostic value of nm23in gastrointestinal stromal tumors[J].Med Oncol, 2004, 21 (1) :53-58.
基因转移 篇5
Twist被认为是一种在胚胎发育中起关键调控作用的转录因子,能在转录水平上调控很多基因的表达,进而发挥其在调控细胞增殖分化、器官生长发育等过程中的作用。Twist基因最初在果蝇中被发现,随后陆续在多个物种体内被发现。在不同的种属之间,其核苷酸序列和其蛋白产物的氨基酸序列高度保守,其中小鼠和人类的氨基酸序列具有96%的同源性。不同种属的Twist基因均能编码碱性的螺旋-环-螺旋(basic Helix-loop-Helix,bHLH)的转录因子,都属于bHLH转录因子家族成员,并且在不同的种属中其与DNA结合区域具有100%的序列保守,Twist蛋白通过它们的bHLH膜序识别E-box反应元件(CANNTG),并且履行它们作为转录抑制或激活因子的作用。
正常情况下,Twist在胎盘和中胚层来源的细胞和组织中高表达。Twist对果蝇的原肠胚正常发育及神经嵴细胞生成是必须的,若敲除Twist则会致死于原肠胚期,在这些胚胎中由于胚层缺乏衍生组织而导致腹部扭转。在鼠类,Twist对头间质、体节以及四肢的发生是必需的。鼠杂合子表现出四肢和颅面畸形,若缺失Twist在胚胎第10d死亡并表现出神经管闭合失败、异常肢芽等多种缺陷。在个体出生以后,Twist 表达下降并且只存在于成熟组织的前体细胞。在成体动物,Twist主要表达于骨、软骨母细胞等,保持他们的未分化状态。人的Twist基因突变会导致尖头-并指畸形(Saethre-Chotzen)综合征。最近的研究还发现,Twist作为一个适应性发热的关键性调控因子表达于棕色脂肪组织[1],另外,Twist 对淋巴细胞的成熟和功能发挥及自身免疫性疾病发生也有重要作用[2]。
随着Twist基因在小鼠乳腺癌转移模型中的重要作用被发现,更多的研究发现Twist在许多肿瘤,如乳腺癌、肺癌、肾癌、肝癌等的发生和发展过程中起到重要的作用,还经常表达于黑色素瘤和肉瘤等肿瘤中,并且Twist总是和侵袭、转移、高龄、预后差等相联系。Twist对肿瘤发生发展的作用也是多方面的。对肿瘤血管发生而言,在高表达Twist的MCF7乳腺癌细胞(MCF7/Twist)鼠种植实验动物模型中,肿瘤组织血管流量和血管渗透性有着显著升高[3]。Twist过量表达还可以促进细胞表型的恶性转化、抵抗衰老、抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤恶化等。
2 Twist与E-cadherin及EMT
上皮-间质转化(Epithelial-mesenehymal transition,EMT)是指上皮细胞表型向成纤维细胞或间充质细胞表型转变并获得迁移能力的过程。它使特殊部位产生的上皮细胞分离并迁移到其他位置,是个体正常发育、伤口愈合以及转移性肿瘤发生的基础。EMT的具体表现是上皮细胞间的紧密连接,黏附连接以及桥粒消失,细胞骨架重构,细胞极性变乱,基底部完整性破坏,细胞可塑性增强,细胞运动能力增加,上皮细胞的标记表达减少,间质细胞的标记表达增加。EMT过程中的一个重要标志性变化是E-cadherin的表达降低或丢失。若敲除E-cadherin能促进EMT。人E-cadherin基因(CDH1)定位于16q22.1,该区在晚期乳腺癌患者的癌细胞中常有功能丢失,并提示着癌细胞转移和预后不良。和正常乳腺导管上皮细胞相比,在30%导管原位癌及60%转移性导管癌标本中,CDH1启动子区CpG岛甲基化水平升高,提示肿瘤的侵袭能力及恶性程度和E-cadherin的表达水平有相关性。在大多数恶性肿瘤中都发现存在由E-cadherin介导的细胞间黏附功能的减弱或丢失,这使恶性肿瘤细胞容易脱离原发灶向周围组织侵袭及向远处器官转移[4,5]。体外实验也发现,抑制E-cadherin表达能使细胞侵袭性增强,而将E-cadherin cDNA转染入高侵袭性上皮肿瘤细胞并使其表达能明显降低细胞侵袭能力。
由于Twist在胚胎发育过程中能赋予细胞运动迁移能力及调节组织重建。有人研究了Twist能否使人体正常乳腺上皮细胞具有迁移能力。结果表明,表达Twist的细胞为梭形,呈现出E-cadherin等细胞间连接蛋白表达下降、细胞和细胞间黏附作用明显减弱等EMT的特征,这些变化使正常乳腺上皮细胞具有运动迁移能力。Twist使E-cadherin表达下降揭示Twist能直接或间接影响E-cadherin启动子。Twist调节EMT的机制是与靶基因启动子上的E-BOX序列结合,进而调控靶基因的表达。如Twist作用于E-cadherin基因的转录启动序列,抑制该基因的转录,使E-cadherin表达下降,细胞与细胞间的黏附作用降低,从而有利于癌细胞的分离进而在肿瘤侵袭和转移中发挥作用[6,7,8]。应用si RNA技术抑制Twist在转移性癌细胞系的表达,结果发现对Twist基因的抑制不影响原发癌的形成,但明显抑制新的转移灶形成。
3 Twist与乳腺癌的发生和转移
Yang等[9,10]首先证实Twist是一种肿瘤转移因子。随后在人乳腺癌中也发现Twist能通过抑制E-cadherin的表达来促进EMT来促进肿瘤的迁移和侵袭。Sahlin等[11]对多个尖头-并指畸形综合征家族中的数位女性患者展开研究,发现该综合征家族中女性患乳腺癌机率升高且发病年龄提前,进而推断Twist可能是一种乳腺癌易感基因。Hennessy[12]等发现,永生化人乳腺上皮细胞(HMLE)经EMT诱导后可表达干细胞标记物,且更易转化为乳腺癌干细胞,而包括Twist和Snail2在内的各种EMT的诱导因素使乳腺癌干细胞表现出最具进展性的乳腺癌细胞的特性,揭示了Twist及EMT在乳腺癌的发生和发展过程中起着重要的作用。Signoretti等[13]培养了能稳定过表达人Twist的乳腺癌细胞系(MCF-7/Twist)。Twist的过量表达引起了细胞类上皮间质转化(EMLT),并导致了此细胞系运动和侵袭能力增强,且有显著数量的染色体发生异常和畸变,这也可能是肿瘤恶性程度增加,转移性增强的原因之一。Yang等[14]发现Twist在小鼠乳腺组织中能促进类EMT表型改变,此外,Twist基因在转移的小鼠乳腺癌细胞中呈现高表达,在原发癌细胞中表达为阴性。如在高度转移性的小鼠乳腺癌细胞中抑制Twist表达,则可以特异性阻止癌细胞血管内渗以及从乳腺转移到肺部。说明Twist在乳腺癌细胞的血管内渗过程中起重要作用。杨静等[15]使用siRNA沉默小鼠乳腺癌细胞株4T1中Twist表达,能使4T1细胞的肺转移能力得到明显抑制。说明Twist能直接或间接影响癌细胞的转移。
而在临床上,Spaderna等[16]发现Twist在侵袭性较强的乳腺小叶癌中表达明显升高,E-cadherin基因的表达受到了抑制,进而确定由E-cadherin所介导的细胞与细胞间黏附的减少是决定乳腺小叶癌病理表型的重要机制。有人也观察到乳腺小叶癌细胞表现出EMT的很多特点,瘤体中E-cadherin表达水平明显降低。Twist和小叶癌侵袭性之间的联系说明了这类转录因子能抑制E-cadherin的启动并在肿瘤发病机制中扮演重要的角色,也表明Twist表达量高低和肿瘤的良恶性及转移侵袭能力强弱存在相关性。Cheng等[17,18]观察到Twist在早期乳腺癌患者体内表达不明显,而在晚期乳腺癌患者癌组织中表达升高,进而推断Twist的表达水平与乳腺癌的进展有关。对富黏附骨髓细胞的分析揭示Twist在正常志愿者的骨髓细胞中并不表达,相反,Twist的持续表达则反映出化疗后乳腺癌骨微转移。在最近的研究中,付俊江等[19]纯化和鉴定了Twist相关蛋白并确定Twist与Mi2/NuRD的数个组成部分包括MTA2、RbAp46、Mi2和HDAC2相互作用,并共同作用于E-cadherin的启动子近端,发挥转录抑制的作用。在体外及小鼠试验中,若敲除乳腺癌细胞系中Twist/Mi2/NuRD/MTA2,均能有效抑制癌细胞的侵袭和转移。
4 Twist与乳腺癌耐药
Twist除了影响肿瘤的发生和转移外,与肿瘤耐药也有密切的联系[20,21]。Cheng等[22]在乳腺癌细胞系MCF-7中发现,当Twist表达上调时,细胞凋亡比例减小,侵袭能力增加并获得对紫杉醇的耐药性,所以确定Twist与人乳腺癌耐药性相关。李清泉等采用si RNA干扰Twist,在阻断细胞的间充质转变的同时能够部分改善乳腺癌多药耐药性。Wang等[23]研究发现, Twist在侵袭性乳腺癌细胞株中的表达量与癌细胞株的耐药性相关。张飞等[24]比较了乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/ADR与MCF-7中Twist和E-cadherin的表达差异,发现MCF-7/ADR中Twist的表达升高,E-cadherin表达下降,这些变化可能跟细胞转移和耐药相关,也说明多药耐可能和癌细胞转移能力相关。另外,癌细胞的侵袭能力与多药耐药性之间也存在相关性,但具体机制还不清楚。临床观察化疗可能会增加肿瘤的侵袭转移,而转移性肿瘤也具有更强的耐药性。体外实验也表明,多药耐药的乳腺癌细胞株侵袭,转移能力与亲本细胞相比明显增强[25],与临床上所观察到的结果一致。因此,在肿瘤的进展过程中耐药和转移现象可能是相互促进的。这也为进一步研究肿瘤细胞耐药提供了依据。
5 结语
目前治疗乳腺癌提倡早发现、早诊断、早治疗。因此,抑制癌细胞转移以及对抗化疗过程中耐药性获得是以后探索的主要途径之一。目前发现Twist在乳腺癌发生、发展,特别是其在促进肿瘤转移及耐药性获得过程中的作用,对其深入研究可以使其为研究治疗乳腺癌提供更多的依据。在现有的研究基础上,未来进一步的工作可能会建立Twist作为乳腺癌重要的诊断标记和潜在的药物治疗靶点以及临床治疗后预测患者预后的新指标。
摘要：乳腺癌是来源于乳腺终末导管小叶单元上皮的恶性肿瘤,多发生于中老年女性,是目前威胁女性健康常见的疾病之一。其发病率在过去的几十年中逐年增高,已跃居女性恶性肿瘤的首位。近年来的研究发现,Twist作为一种肿瘤相关基因,其在乳腺癌的发生、发展以及诊断、治疗和预后中起着重要作用。
基因转移 篇6
植物的非特异性脂转移蛋白 (Non-specific lipid transfer protein, ns LTP) 是一类含量丰富的小分子碱性蛋白。最近有研究表明, 植物体内ns LTPs可能与运输、抗逆、抗病以及生殖发育等生理过程有关[1,2]。此外, 一些植物中的ns LTP具有抗细菌、抗病毒和抗肿瘤的活性[3,4,5,6,7,8], 表明这种蛋白具有临床应用的潜能。
前期研究中, 笔者课题组联用浸提、硫酸铵沉淀、阳离子交换层析等方法从骆驼蓬种子中分离纯化得到具有抑制肿瘤细胞增殖和抗病毒活性的天然活性蛋白质[9]。在该研究基础上, 分离纯化得到的骆驼蓬脂转移蛋白具有抗菌、抗肿瘤和抗病毒的活性[8,10]。与以往的小分子药物相比, 蛋白质类药物具有特异性强、安全可靠、低毒性等优点, 但天然的脂转移蛋白在植物中的含量不是很高, 并且提取纯化的工艺复杂, 限制了对脂转移蛋白功能的进一步研究[11]。利用基因重组的方法批量的表达、纯化蛋白已被证明是一个有效手段。为了探讨重组骆驼蓬脂转移蛋白是否具有抗肿瘤活性, 本研究通过基因工程技术从骆驼蓬 (Peganum harmala) 叶片中克隆出具有ns LTP特征结构的骆驼蓬脂转移蛋白 (Ph LTP) 基因序列, 经转化、原核表达、亲和纯化获得重组蛋白, 并检测其体外抗肿瘤活性, 为进一步研究脂转移蛋白的性质和功能提供了基础资料。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
骆驼蓬叶采于乌鲁木齐市红雁池水库。E.coli DH5α和BL21菌株, 以及人宫颈癌He La细胞株、人食管癌Eca-109细胞株、鼠黑色素瘤B16细胞株、非洲绿猴肾细胞Vero和p ET-30a质粒为新疆大学生物资源基因工程重点实验室保存。
1.1.2 试剂
Trizol试剂、p CR2.1载体购自Invitrogen;DNA Marker、Taq DNA聚合酶购自天根生化科技;T4DNA连接酶、限制性内切酶购Ta KaRa (Dalian) ;DNA片段回收试剂盒购自上海生工。
1.1.3 仪器
PCR仪 (TECHNE公司) ;凝胶成像仪 (Alpha公司) ;倒置显微镜 (Leica公司) ;3423型的CO2培养箱 (Themo公司) 。
1.1.4 培养基
含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基 (Gibco公司) 。
1.2 方法
1.2.1 引物的设计与合成
根据Gen Bank中脂转移蛋白序列设计合成脂转移蛋白基因的简并引物:P1:5’-ATGGCWRSCMTSAAGSTTGYWT-3’和P2:5’-TCACYTSACSKTRGMGCAGTTGGTG-3’送Ta KaRa (Dalian) 公司合成。
1.2.2 骆驼蓬总RNA的提取和cDNA的合成。
按Trizol法提取骆驼蓬叶片总RNA, 按照全式金Trans S-cript First-Strand c DNA Synthesis Super Mix说明书进行第一链c DNA的合成。再以c DNA为模板, 用前述引物扩增骆驼蓬脂转移蛋白基因 (Ph LTP) , PCR反应条件:94℃的预变性5 min, 94℃变性45 s后59℃退火45 s, 72℃延伸45 s, 35个循环后72℃延伸10 min。产物经回收纯化后克隆入p CR2.1载体, 重组质粒经PCR和酶切鉴定后, 选取阳性克隆 (p CR2.1-Ph LTP) 送Ta KaRa (Dalian) 公司测序。
1.2.3 序列分析
测序结果通过美国国立生物技术中心 (NCBI) 进行序列比对, 将DNA序列翻译成蛋白质序列, 用网站上的Blastp程序和DNAMAN软件进行同源性分析。通过分析工具Singnal P3.0分析Ph LTP的信号肽分析, 用Ex PASy网站 (http://www.expasy.org/) 提供的SWISS-MODEL软件进行蛋白质结构预测分析。
1.2.4 原核表达质粒pET30a-Ph LTP的构建
为了获得Ph LTP基因ORF编码的成熟肽片段, 根据测定的Ph LTP基因序列设计合成亚克隆引物P3、P4。P3:5 ′-GGAATTCGCCATAGCATGCGGTACGGTG-3 ′, P4:5 ′-CCGCTCGAGTCACTTCACCGTAGAGCAGTT-3 ′, 产物Ph LTP不包含信号肽序列。以p CR2.1-Ph LTP为模板以前述PCR反应条件扩增目的基因, 回收PCR产物构建至表达载体p ET30a上后转化E.coli DH5α, 酶切鉴定后, 电泳结果与预期的350 bp的基因片段大小相符, 送Ta KaRa (Dalian) 公司测序。获得的正确重组子命名为p ET30a-Ph LTP。
1.2.5 重组质粒p ET30a-Ph LTP在大肠杆菌中的表达及纯化
将鉴定正确的含有重组质粒的培养物分别按1:100转接到含卡那霉素 (50 mg/L) 的LB液体培养基中, 菌液培养至OD600=0.6~0.8。在不同的IPTG浓度与温度条件下进行诱导表达, 然后收集3 m L菌体SDS-PAGE检测。
将p ET30a-Ph LTP转化E.coli BL21 (DE3) 获得重组菌。挑取含单菌落, 接种于新鲜的LB (含Amp+50 mg/L) 培养基中, 37℃培养过夜。次日, 按1%的接种量转种于新鲜的LB (含Amp+50 mg/L) 培养基中。当OD600达到0.6~0.8时, 在0.4 mmol/L IPTG的诱导下, 于28℃表达4 h。离心收集菌体, 进行SDS-PAGE检测。
诱导表达后, 4℃、8 000 g离心10 min, 收集菌体, 用预冷的PBS重悬菌体, 进行超声破碎处理, 于12 000 g离心20min, 收集上清。上清为可溶性的重组Ph LTP (带有His标签) , 经金属螯合柱Ni-NTA亲和纯化, 透析除去咪唑, Bradford法测浓度后, 过滤除菌。将纯化的重组蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定正确, 冷冻干燥后于-20℃保存备用。
1.2.6 Western blot分析
纯化的重组蛋白Ph LTP (r Ph LTP) 经SDS-PAGE后电转至硝酸纤维素膜上, 以5 g/L脱脂奶粉封闭2 h。依次滴加鼠抗His-tag抗血清 (室温2 h、PBS洗3次) 及山羊抗鼠Ig G-HRP (室温反应1 h、PBS洗涤3次) , 最后加底物DAB显色并拍照。
1.2.7 MTT法检测r Ph LTP抑制细胞增殖活性
RPMI-1640完全培养基 (10%FBS) , 5%CO2, 37℃湿化孵箱中培养的He La、B16、Eca-109和Vero细胞以5×103/孔接种于96孔板内, 细胞贴壁24h后, 分别添加含有不同r Ph LTP浓度 (1.25, 2.5, 12.5, 25, 50, 62.5, 125, 250μg/m L) 的培养基, 分别培养12 h、24h、48h后, 用MTT (5 mg/ml) 法检测r Ph LTP对肿瘤细胞增殖的影响, 酶标仪测定A值 (570/655nm) 后按公式计算出生长抑制率。生长抑制率 (%) = (1-实验组A570/655nm/对照组A570/655nm) ×100%。
1.2.8 统计方法
均为3次重复, 结果以平均数±标准差 (mean±SD) 表示, 使用Graph Pad Prism 5.0统计学软件进行单因素方差分析 (one-way ANOVA) , P<0.05表示有显著性差异。
2 结果与分析
2.1 骆驼蓬脂转移蛋白基因的扩增及p ET30a-Ph LTP原核表达质粒构建
PCR扩增获得成熟肽基因Ph LTP, 电泳结果显示在约350bp处有一条清晰的DNA条带与预期分子量大小一致, 而阴性对照泳道无相应条带 (图1.A) 。PCR产物回收纯化后, 构建的重组质粒p ET30a-Ph LTP经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切, 琼脂糖电泳显示产生2个条带, 目的条带与预期相符 (图1.B) 。
2.2 序列分析
序列分析表明, Ph LTP基因完整的开放阅读框 (ORF) 片段大小为348 bp, 编码1条长为115个氨基酸肽链, 前23个氨基酸是信号肽, 将Ph LTP c DNA序列提交Gen Bank (AFI61838.1) 。通过比较基因片段推导的氨基酸序列, 发现Ph LTP基因与柑桔、欧洲栗和中国板栗脂转移蛋白氨基酸序列之间相似性分别可达到66.1%、64.4%和63.6%, 说明Ph LTP基因与其他植物的LTP基因进化关系较近。通过与12种植物的LTP氨基酸聚类分析, 发现它们可分为2个分支。其中甜橙、柑桔、杏树、甜樱桃、甜扁桃、大山樱、桃、板栗、欧洲栗、橡胶树同属于一个分支, 而骆驼蓬脂转移蛋白与欧洲栗、板栗的脂转移蛋白的相关性最大, 说明它们可能是由一个原始祖先分化进而产生的多重分支 (图2) 。
A:Ph LTP基因PCR扩增, M:DNA Marker 2000;1:阴性对照;2:Ph LTP基因。B:p ET30a-Ph LTP的质粒酶切鉴定, M:DNA Marker;1:重组质粒酶切结果。A:PCR amplification of Ph LTP gene.M:DNA Marker 2000;1:Negative control;2:Ph LTP gene.B:Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid p ET30aPh LTP.M:DNA marker 2000;1:p ET30a-Ph LTP/EcoRⅠ+XhoⅠ.
二级结构结果预测Ph LTP含有α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲。通过Ex PASy网站的SWISS-MODEL模拟的氨基酸序列的三维 (3D) 结构的分子模型显示Ph LTP蛋白类似球形 (图3) , 与已知的玉米ns LTP (PDB Code:1FK5) 的三级结构[12]相似, 且具有一个柔性的能够结合脂样分子和容纳各种配位体的疏水腔[13]。
2.3 r Ph LTP在大肠杆菌中的诱导表达和纯化
将Ph LTP基因成熟肽序列构建到表达载体p ET30a后, 经IPTG诱导SDS-PAGE电泳显示, 在分子量约为18 kDa处有与预期分子量相符的新生蛋白条带出现。通过分析比较诱导温度、诱导时间、IPTG浓度对r Ph LTP蛋白表达的影响, 最终确定该目的蛋白表达的最优条件:温度28℃, 初始菌OD600=0.6, IPTG终浓度0.3 mmol/L, 时间4 h。菌体超声破碎后经SDS-PAGE电泳显示, 目的蛋白在上清中的含量明显多于沉淀, 表明重组蛋白主要以可溶形式表达。选择低于100 mmol/L的咪唑浓度将亲和胶非特异性结合的杂蛋白洗脱下来, 最后选用咪唑浓度为200 mmol/L (Elution-buffer) , 就可将靶蛋白洗脱下来, 从而得到纯度较高的产物。采用超声波破碎法和金属镍螯合柱层析相结合的方法, 获得了纯度为97%以上的重组骆驼蓬脂转移蛋白 (图4) 。
2.4 表达产物的Western blot分析
欧洲栗 (ADK60918) ;板栗 (ACL010930) ;骆驼蓬 (AFI61838.1) ;橡胶树 (AAL25839) ;柑桔 (BAH03575) ;甜橙 (AF369931_1) ;杏树 (ADR66947) ;甜樱桃 (ADR66943) ;光烟草 (AAT68262) ;棉花 (AAY43801) ;向日葵 (CBW38497) ;非洲草棉 (ADY68820) 。Castanea sativa (ADK60918) , Castanea mollissima (ACL01093) , Peganum harmala L. (AFI61838.1) , Hevea brasiliensis (AAL25839) , Citrus jambhir (BAH03575) , Citrus sinensis (AF369931_1) , Prunus armeniaca (ADR66947) , Prunus avium (ADR66943) , Nicotiana glauca (AAT68262) , Gossypium hirsutum (AAY43801) , Helianthus annuus (CBW38497) , Gossypium herbaceum var.africanum (ADY68820) .
A:Ph LTP;B:大麦的ns LTP。A:Ph LTP;B:The ns LTP of the barley.
将纯化得到的表达产物r Ph LTP与抗His-tag单克隆抗体反应, 在分子量约18 k Da处出现特异表达的蛋白条带, 与预期大小一致 (图5) 。
2.5 r Ph LTP对He La、B16、Eca-109和Vero细胞生长的抑制作用
MTT结果显示, 随着蛋白浓度的增加, r Ph LTP对3种肿瘤细胞的抑制作用也在增强, 并呈明显剂量依赖性。不同浓度 (1.25, 2.5, 12.5, 25, 50, 62.5, 125, 250μg/m L) 的r Ph LTP分别处理He La、Eca-109、B16细胞12 h、24 h、48 h后, 抑制率在处理48 h后最高, 故该蛋白对三种肿瘤细胞的作用效果最佳时间为48 h (表1) 。此时, 该蛋白对He La、B16和Eca-109的IC50值分别为16.76±1.23、38.92±2.16和9.011±1.01μg/m L。
1:蛋白Marker;2:未诱导;3:IPTG诱导后BL21/p ET30a-Ph LTP超声裂菌后上清;4:IPTG诱导后BL21/p ET30a-Ph LTP超声裂菌后沉淀;5:100 mmol/L咪唑洗脱r Ph LTP;6:200 mmol/L咪唑洗脱纯化后的r Ph LTP。1:Protein Marker;2:uninduced bacteria;3:BL21/p ET30a-Ph LTP ultrasound bifida bacteria supernatant after inducted by IPTG;4:BL21/p ET30a-Ph LTP ultrasound bifida bacteria precipitation after inducted by IPTG;5:100 mmol/L imidazole wash;6:wash and purification by 200mmol/L imidazole.
为了验证该蛋白是否对正常细胞有抑制作用, r Ph LTP对Vero细胞也做了相同处理。结果显示处理Vero细胞48 h后, 高浓度的r Ph LTP蛋白会抑制Vero细胞的生长, 但抑制作用明显低于肿瘤细胞 (图6) 。
*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs.r Ph LTP处理相应细胞系12 h。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs.The corresponding cell line was treated with r Ph LTP for 12 h.
3 讨论
研究发现, 植物脂转移蛋白能够抑制癌细胞增殖并诱导癌细胞凋亡。2007年Peng Lin等研究结果表明, 芸苔属的脂转移蛋白 (ns LTPs) 能抑制肝癌细胞 (Hep G2) 和乳腺癌 (MCF7) 细胞的增殖, 并涉及了肿瘤细胞的程序性死亡[14]。目前蛋白质类药物已成为医药产品中的重要组成部分[11]。但天然植物脂转移蛋白由于来源有限, 产率低和提取成本较高等因素制约其生物学功能的研究和应用。而原核表达系统具有表达量高、生产周期短、方法简单、价格低廉等优点, 已成为获得重组脂转移蛋白的选择之一[9]。前期研究中, 分离纯化得到的骆驼蓬脂转移蛋白具有抗菌、抗病毒与抗肿瘤的活性[8,10]。但关于重组骆驼蓬脂转移蛋白的大量获得以及其在体外是否具有抗肿瘤活性至今未见报道。
此研究中我们通过RT-PCR法从骆驼蓬 (P.harmala) 叶片中克隆了一段c DNA序列, 经Blast检索和3D模型分析表明该序列翻译的氨基酸具有显著的ns LTP特征结构, 故将其命名为骆驼蓬脂转移蛋白。由于真核生物的信号肽会影响重组蛋白原核表达的产量[15], 本研究将去除信号肽的骆驼蓬脂转移蛋白基因的成熟肽片段经原核质粒构建、诱导优化表达等方法获得了纯度较高的r Ph LTP。表明通过基因工程方法可以简便并大量获得骆驼蓬脂转移蛋白产物, 为深入研究该蛋白的生物学特性和将来的应用提供了物质条件。
先前的研究证实骆驼蓬种子中分离纯化的脂转移蛋白能显著抑制肿瘤细胞的增殖[8], 故本研究也对r Ph LTP的抗肿瘤活性进行了验证。MTT结果表明r Ph LTP对He La、Eca-109和B16细胞均具有抑制作用, 且有明显剂量效应, 而对正常细胞Vero抑制作用较弱。这些数据表明, 与正常细胞相比r Ph LTP对癌细胞有更高的细胞毒性。在研究r Ph LTP的体内抗肿瘤作用时, 我们发现r Ph LTP能有效地抑制实体瘤的生长, 并在治疗期间对小鼠毒副作用低[16]。这些结果预示了该蛋白具有治疗肿瘤的潜在的应用价值, 但其具体作用机制还不清楚, 因此, 需进一步研究其凋亡途径, 为抗肿瘤药物的筛选和应用奠定基础。
基因转移 篇7
必特螺旋霉素(结构见图1)是利用基因重组技术获得的基因工程菌的发酵产物,属于一种新型大环内酯类抗生素,目前已按一类新药标准完成Ⅲ期临床研究,具有很大的应用价值和前景[1]。然而目前国内生产的必特螺旋霉素的药效还有待提高,为了提高产量,作者实验室构建了一个4″-异戊酰基转移酶基因(ist)和其正调控基因(acyB2)共表达的载体pSET152-ia以期提高ist基因的表达,从而提高必特螺旋霉素的产量,然而经过一系列的研究表明该新重组质粒在导入S.lividans TK24之后不能产生必特螺旋霉素,在对该新重组质粒进行基因测序之后发现4″-异戊酰基转移酶基因(ist)和其正调控的调节基因(acyB2)的启动区包含一个点突变。本文首次报道利用引物设计、PCR、基因测序等基因工程技术回复此突变,并构建了两个新的ist-acyB2的重组质粒pKC1139-ia new和pSET152-ia new,检测ist基因在异源宿主中的表达情况,为必特螺旋霉素进一步研究提供一定的参考。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌种、基因和载体
螺旋霉素产生菌(S.spiramyceticus1941),中国医学科学院医药生物技术研究所代谢工程室保存。E.coli DH5α:大肠杆菌质粒转化用受体菌,中国医学科学院医药生物技术研究所代谢工程室保存。E.coli DH5α感受态细胞,中国医学科学院医药生物技术研究所代谢工程室保存。4″-异戊酰基转移酶基因(ist),从中国医学科学院医药生物技术研究所代谢工程室克隆的含ist基因的质粒pSW4中获得;pUC18(AmpR),克隆测序用载体,由中国医学科学院医药生物技术研究所代谢工程室保存。pKC1139,温敏型链霉菌/大肠杆菌穿梭载体,含阿普霉素抗性基因,用于构建重组质粒,作者实验室保存。pSET152,温敏型链霉菌/大肠杆菌穿梭载体,含阿普霉素抗性基因,用于构建重组质粒,作者实验室保存。
1.1.2 试剂
琼脂粉购于青岛水产品加工厂,琼脂糖购于Biowest 。溶菌酶为Sigma公司产品。
阿普霉素(Apramycin,Am)、氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)、RNase A均购于华美公司。限制性内切酶、去磷酸化酶(CIAP)连接酶、LA-Taq酶、T4聚合酶,均购于TakaRa公司。DNA快速纯化/ 回收试剂盒(北京鼎国生物技术有限公司)回收、提取DNA或质粒。
1.1.3 仪器
PCR扩增仪(2720Thermal Cycler)由Applied Biosystems制造;台式离心机(4214)购于ALC公司;电泳仪(DYY-6C)购于TaKaRa公司;低温离心机(ZK365)由HERMLE制造;凝胶成像仪(alpha 2200),购自安莱生命科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 质粒提取:
按试剂盒说明书进行。
1.2.2 DNA回收与提取:
按试剂盒说明书进行。
1.2.3 分子克隆[3,4]
PCR主要技术参数为:反应体积25μL;退火温度62℃;延伸时间1min;28个循环;72℃延伸7min,结束反应。
2 结果与分析
2.1 pKC1139-ia new与pSET152-ia new重组质粒的构建
重组质粒pSET152-ia 导入S.lividans TK24中之后发现其不能表达产生bitespiramycin,经基因测序发现重组质粒pSET152-ia 上的ist启动区发生了一个碱基突变,该碱基突变可能导致ist基因无法表达,因此,通过PCR引物设计来回复该碱基突变。我们将新扩增出来的两段引物ia-1和ia-2根据需要在上游引物5’端分别加上PstⅠ酶切位点序列和3个保护碱基;下游引物5’端分别加上BamHⅠ酶切位点序列和3个保护碱基,分别对该上下游引物进行琼脂糖凝胶电泳检测其条带大小,并纯化回收。然后将上下游引物用PCR反应组合,获得组合的ia-1+2 扩增片段(约0.7kb),然后把扩增出来的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳检测并纯化回收,克隆到pUC18载体,测序验证无误,再采用BamHⅠ和PstⅠ将ia-1+2序列切下,利用限制酶PstⅠ和XbaⅠ从作者实验室构建好的载体pBlue-ia上把ist基因切下,用限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ切下acyB2基因片段,将三个片段按顺序连接到载体pKC1139上得到新的重组质粒pKC1139-ia new(在宿主中以质粒形式存在,见图2)。
同时,我们利用EcoRⅠ和XbaⅠ将pKC1139-ia new中的外源片段切下克隆到整合型载体pSET152上构建出重组质粒pSET152-ia new(整合到宿主细胞基因组中,见图3)。
2.2 启动区点回复突变
2.2 启动区点回复突变
本实验室得到的ist-acyB2重组载体在变铅青链霉菌TK24中中不表达。经多次测序证实此载体中ist-acyB2的启动区序列中存在一个点突变,位于序列的1 272bp处G 突变成了A。此位点位于ist基因和其RBS之间的序列中,很可能对ist基因转录有影响。拟将其突变位点进行回复。采用PCR的方法将突变的点回复过来[5],为此我们设计出两段引物将突变的碱基回复过来,将新扩增出来的两段DNA序列命名为ia-1和ia-2(ia-1上游引物和ia-1下游引物扩增ia-1,ia-2上游引物和ia-2下游引物扩增ia-2)。对两段DNA进行电泳检测,回收。对回收回来的两段DNA,以及对回收的两段DNA片段进行PCR连接,接着进行电泳检测。
设计用于扩增两段序列的引物如下:
引物的设计是通过5’ 端的改造进行设计。将突变位点A改成G。突变回复点后面还必须延长一段,这样才能使得在ia-1和ia-2 PCR连接时连接成功。
在对ia-1和ia-2进行PCR连接时,起初是不用引物,直接将两者加聚合酶进行PCR连接,经过多次实验发现ia-1与ia-2不能够连接起来,经过分析得知如果直接对这两段基因进行PCR连接,两段基因各自解链后连接是这两段基因还是各自进行了连接,并没有发生两段基因重组连接。为此我们改变方法加入ia-1的下游引物和ia-2的上游引物对扩增出两段带有点突变回复的单链[6],以此方法对ia-1和ia-2进行连接,结果显示连接成功。
2.3 基因表达鉴定
通过回收前后的PCR得到ia-1、ia-2电泳(和图5),电泳图上有明显的条带,经测定对比碱基长度分别为500bp和200bp,两者非常吻合。 我们将ia-1和ia-2 整合到PUC18载体上进行测序检测,图6即为测序图谱。通过对比发现770bp到780bp之间有一碱基,由原来的A回复成了G,说明突变回复成功。
1:Marker 3;2:ia-1;3:ia-2.
1:marker 3 ;2:ia-1;3:ia-2;4:ia-1+2.
3 讨论
随着基因工程技术的兴起和快速发展,抗生素生物合成的分子遗传学研究不断深入,越来越多的抗生素生物合成途径及相关基因的功能已被逐渐揭示[7],人们已经可以有目的地对其生物合成基因进行分子遗传学操作,来改造抗生素的结构,以期得到具有更高抗菌活性的结构衍生物。抗生素的生物合成属于次级代谢范畴,与初级代谢相比,具有生物合成途径复杂、生物合成酶对基质特异性不高等特点[8],导致抗生素产生菌可以产生多组分抗生素,往往各组分的化学结构非常相似,而生物活性有时却相差很大[9]。本实验通过构建ist-acyB2重组载体,发现启动区存在一个点突变,并使该突变回复过来,并构建出两个新的重组质粒,从而提高4″-异戊酰基转移酶基因在宿主中的表达水平。在下一步的研究中,可把构建的新重组质粒导入宿主细胞中进行生物转化获得转化子,然后检测获得的转化子螺旋霉素生物转化产物,看是否含有必特螺旋霉素或者其产量比之现有必特霉素生产方法有提高,这方面正在进一步研究。
参考文献
[1]李瑞芬,王以光.基因重组技术对必特螺旋霉素基因工程菌种的改造和培养基的优化研究[D].北京:中国医学科学院,2009.
[2]杨永红,赫卫清,李瑞芬,等.利用强启动子PermE*提高4″-异戊酰基转移酶基因在变铅青链霉菌TK24中对螺旋霉素的4″-异戊酰化水平[J].中国抗生素杂志,2010,35(11):826-830.
[3]Epp J K,Huber M L,Turner J R,et al.Production of a hybrid macrolideantibiotic in Streptomyces ambofaciens and Streptomyces lividans by introduc-tion of a cloned carbomycin biosynthetic gene from Streptomyces thermotoler-ans[J].Gene,1989,85(2):293-301.
[4]Bentley S D,Chater K F,Cerdeno-Tarraga A M,et al.Completegenome sequence of the model actinomycete A3(2)[J].Nature,2002,417(6885):141-147.
[5]赫卫清,周红霞,王红远,等.格尔德霉素基因工程高产菌株的构建和培养[J].生物工程学报,2008,24(1):15-16.
[6]赫卫清,王以光.吸水链霉菌17997格尔德霉素部分生物合成基因簇的克隆和分析[J].生物工程学报,2006,22:6.
[7]Salas J A,Mendez C.Engineering the glycosylation of natural productsin actinomycetcs[J].Trends Microbiol.,2007,15(5):219.
[8]Chunyan Ma,Hongxia Zhou,Jingyan Li,et al.Construction of 4″-Isovalerylspiramycin-I-Producing Strain by In-Frame Partial Deletion of3-O-Acyltransferase Gene in Streptomyces spiramyceticus WSJ-1,theBitespiramycin Producer[J].Curr Microbiol.,2011,(62):16-20.
基因转移 篇8
1 MTA1基因
MTA1基因于1990年Pencil等在研究鼠乳腺癌时发现,后研究得出它与乳腺癌的转移有关。1994年,Toh等进一步研究该基因,命名该基因为MAT1,并测出了该基因的核苷酸序列和编码蛋白质的氨基酸序列。
2 MTA1基因与肿瘤
2.1 MTA1基因与胃癌
胃癌在我国发病率极高,临床治疗上常因为肿瘤转移而失败。吴穷等[2]在研究胃癌时应用半定量RT-PCR技术,首先确定了总RNA模板量和最适的RT-PCR循环数,然后分别测定了37例胃癌组织样本MTA1基因mRNA在癌变组织与癌变周围正常组织中mRNA的表达水平。37例胃癌组织样本中,MTA1基因mRNA过度表达样本有14例,占总样本的37.8%。这些病例淋巴结转移率高、胃癌浸润层次深,与剩余病例组比较差异有统计学意义。该研究显示,肿瘤的转移和浸侵袭能力与MTA1基因的过度表达相关。基因过度表达,肿瘤的转移概率大大增加。
2.2 MTA1基因与肝癌
肝癌组织中有转移潜能的细胞恶性增殖后会形成子灶,子灶具有极强的浸润和转移能力的细胞,具有很高的转移风险。林川等[3]用Northern杂交技术研究肝癌时,检测了肝脏癌变组织及癌变周围组织MTA1基因mRNA表达情况。
2.3 MTA1基因与膀胱癌
汪盛等[4]研究MTA1基因时,通过RT-PCR技术测定了34例膀胱癌标本中MTA1基因mRNA表达的相对水平。实验分为两组,一组检测膀胱癌癌变部位,另一组检测癌变周围组织基因表达情况。研究结果发现,MTA1基因mRNA在膀胱癌标本和癌旁正常黏膜标本中均呈现不同程度的表达,其中有38.3%的标本MTA1基因过度表达。研究时还发现,34例膀胱癌标本中有8例出现淋巴结转移,而其中5例MTA1基因过度表达(62.5%);而分析其余26例膀胱癌标本,发现只有7例过度表达,表达率大大降低。由此表明,膀胱癌的转移能力与MTA1基因mRNA的表达可能呈正相关。
2.4 MTA1基因与食管癌
王俊平等利用免疫组化SP法研究MTA1基因,他们测定的组织有48例食管癌组织及其癌旁正常组织。对比食管癌癌变组织和癌变周围正常组织,发现前者MTA1基因的表达率显著高于后者。部分食管癌组织还出现了淋巴结转移,且其MTA1表达率明显高于未转移组织。
Toh等人研究MTA1基因时用到RT-PCR技术,他们以47例外科切除的食管鳞状细胞癌组织为材料,检测了其中基因MTA1表达水平。结果显示,有16例食管癌患者的癌组织MTA1基因raRNA表达过度,占总标本的34.0%。过度表达MTA1基因mRNA的16例患者中,更有12例患者癌细胞已浸润至外膜甚至邻近组织;而无过度表达的其余31例食管癌患者只有13例发生了浸润,且在基层以内。所以,MTA1基因可能增加了食管癌肿瘤向外浸润和淋巴结转移的几率,大大增加癌变组织继续恶性增殖的可能性。
2.5 MTA1基因与乳腺癌
Pencil等最开始用Northern杂交技术研究MTA1基因,他们分别测定了该基因在人和鼠乳腺癌中的表达情况。他们发现,鼠乳腺癌中未转移株和转移细胞株中基因的表达率竟有着4倍差距;在人类组别中,这一数据同样达到惊人的4倍。在人非转移细胞株,浸润细胞株和转移细胞株中MTA1基因的表达水平之比为1:2:4。这表明鼠和人类肿瘤的浸润和转移与MTA1基因表达水平有关。
2.6 MTA1基因与前列腺癌
与其他癌变组织几乎一样,前列腺癌变组织中MTA1基因也会选择性地过表达。Hofer等利用300例前列腺样本,1940个组织块分析前列腺DNA微阵列,运用免疫组化法检测MTA1蛋白的表达水平。观察发现,转移癌MTA1基因的阳性表达率为83%,明显高于平均水平而良性组织和局限性前列腺癌的阳性率分别仅为25%和63%。
2.7 MTA1基因与喉癌
王会河[6]等通过半定量RT-PCR技术研究了肺癌中MTA1基因的表达。结果表明,喉癌原发灶中MTA1基因在的表达率高达43.2%,证实了文献所述。30例患者中有8例转移者无一例外都呈现出高表达(100%),而无转移者高表达率仅为22.7%(5/22),说明MTA1基因高表达对喉癌的转移可能有促进作用。
2.8 MTA1基因与骨肉瘤
李新志等[7]做了相关研究。他们的研究材料是高低转移的骨肉瘤细胞株,通过RT-PCR技术检测两组细胞株中基因表达存在的差异。结果表明,对比高低转移组,前者MTA1基因的表达率明显高于后者,初步证实了MTA1基因有一定的促进转移作用。制作能完全表达MTA1基因的质粒,将其转移、插入到低转移或未转移细胞株中培养,经多次分散培养后,筛选出了高转移的细胞株,进一步证明了MTA1基因的促转移作用。
2.9 MTA1基因与肺癌
A Saki H等人[8]研究了MTA1基因mRNA在非小细胞肺癌(NSCLC)标本中的表达情况,表明Ⅱ一Ⅳ期的NSCLC MTA1基因mRNA表达水平(3.464±3.673)明显高于I期NSCLC (1.613±2.432,P=0.015),T4 NSCLC(4.376±4.168)又明显高于T2 NSCLC(2.047±1.898,P=0.269)及T1 NSCLC(1.965±2.147,P=0.351),发生淋巴结转移的NSCLC (4.241±3.757)明显高于未转移的(P=0.0168)。因此,NSCLC的侵袭与转移和MTA1基因mRNA的表达密切相关。
2.1 0 MA1基因与口腔鳞癌
口腔中的恶性肿瘤以口腔鳞癌(OSCC)最为常见,多个基因的异常表达都可能导致OSCC的发生。王永霞等[9]探讨了MTA1mRNA的表达与口腔鳞癌发生与转移的潜在联系。他们采用了免疫组织化学法研究MTA1基因,检测了相关标本中基因的表达水平。他们用到的标本包括20例正常口腔黏膜标本、15例口腔黏膜白斑标本和45例口腔鳞癌组织标本。结果表明,口腔黏膜白斑比正常口腔黏膜中MTA1基因的表达率要高(P<0.01),而三者中表达率最高的当属口腔鳞癌标本,且比其余二者高出不少。
3结语
恶性肿瘤患者多死于肿瘤的转移,是威胁人类生命健康的一大杀手。肿瘤的侵袭与转移成为治愈肿瘤患者的最大障碍,研究肿瘤的转移具有至关重要的作用,也是当今医疗卫生事业的重大课题之一。肿瘤转移的研究越来越受到关注,随着分子生物学的广泛应用,其也不断有重大突破。MTA1基因是近年来发现的与肿瘤转移相关基因,虽然其确切作用机制目前还不完全清楚[10],但已有许多资料与研究表明MTA1基因的表达与多种肿瘤的发生、侵袭和转移密切相关。相信在不久的将来,随着研究进一步深入,我们将一步步揭开MTA1基因的完整作用机制。届时,MTA1基因有望成为肿瘤诊断与治疗重要参考指标,在临床上得到广泛应用。
参考文献
[1]谢海健.MTA1基因的研究概况[J].包头医学,2013(3):136-139.
[2]吴穷,陈昌杰,刘黎明,等.MTA1基因过度表达与胃癌浸润和转移的关系[J].蚌埠医学院学报,2002(4):289-291.
[3]邓蕾,姜润秋,殷爱红,等.肝细胞肝癌中MTA1基因的表达及其与术后患者生存率及肿瘤复发率相关性研究[J].南京医科大学学报:自然科学版,2011(12):1717-1721.
[4]汪盛,彭程,蒋先镇,等月肿瘤转移基因MTA1在膀胱癌中的表达及其临床意义[J].中国医学工程,2007(7):555-557,560.
[5]郑文凤,李颖霞,陈奎生,等.USP22、MTA1及Ki-67蛋白在食管鳞癌中的表达及相关性[J].世界华人消化杂志,2013(28):2915-2921.
[6]王会河,黄光武,莫立根,等.MTA1表达与鼻咽癌浸润转移的关系[J].广西医科大学学报,2006(4):546-548.
[7]李新志,陈安民,易成腊,等.MTA1基因表达与人骨肉瘤细胞浸润和转移的关系[J].中国癌症杂志,2006(2):81-84.
[8]A saki H,M oriyama S,N akashima Y,etal.Expression of the MTA1Mrna in advanced lnng cancer[J].Lung Cancer,2002,35(2):149-154.
[9]王永霞,裴华,刘珊,等.MTA1基因表达在口腔鳞癌发生、发展中作用的研究[J].重庆医学,2012(28):2905-2906,2910,2900.
基因转移 篇9
关键词：乳腺癌,737.9
乳腺癌发病率逐年上升, 肿瘤的转移与复发是乳腺癌患者治疗的重大障碍。对乳腺癌侵袭、转移相关指标的研究在预测肿瘤预后和指导临床治疗方面具有重要的意义。MTSS1 (meastasis suppressor 1) 又称MIM (missing in metastasis) 是Lee等[1]研究5种膀胱癌细胞株时发现的一种新基因, MIM-B则是由Woodings[2]等发现的MIM的同源异构体。本研究运用real-time PCR技术检测MIM-B mRNA在60例乳腺癌中癌及癌旁组织中的表达, 分析其与临床病理特征的关系, 并探讨在乳腺癌发生及发展过程中的意义。
1 材料与方法
1.1 标本
60例乳腺癌标本取自福建省肿瘤医院2010年至2011年手术新鲜标本, 术后病理证实, 年龄22~84岁 (中位年龄47) 。所有病例均为女性, 术前均未接受放疗、化疗和免疫治疗, 在组织学分级中高分化6例, 中分化36例, 低分化18例;在TNM分期中I期有23例, II期有24例, III期为13例;所取乳腺癌组织于离体后均置入液氮中进行速冻, 并于-80℃冰箱保存。在病理类型方面包括有浸润性导管癌、浸润性小叶癌、小管癌和浸润性微乳头癌, 具体例数分别为55例、3例、1例、1例;其中淋巴结转移阳性的病例为26例, 阴性者为34例。癌旁正常乳腺组织取自对应的乳腺癌病例, 所取组织均距癌组织5 cm以上。
1.2 方法
1.2.1 提取总RNA并合成Cdna
采用TRizol (Invitrogen, 美国) 提取乳腺癌组织及癌旁组织的总RNA, 所获得的RNA用琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性, 并经紫外分光光度计验证RNA的纯度, 并计算其含量。将提取后的RNA用于逆转录成cDNA, 操作过程均按照试剂盒说明书进行。逆转录的总反应体系为20μL, 反应条件为42℃1h, 45℃30min, 90℃3 min。
1.2.2 PCR引物设计
引用文献[3,4]中的MIM-B基因作为PCR反应引物并以18S为内参照基因, 其中MIM-B上游引物5′-CGGAGGCCTCTTCCAGACCATCA TC-3′;下游引物5′-AATGTGAGCTGGGGGAATGCGAGTG-3′, PCR扩增片段长度为860bp, 退火温度63℃。18S上游引物、下游引物分别为5′-CTCTTAGCTGAGTGTCCCGC-3′, 5′-CTGATCGTCTT CGAACCTCC-3′, PCR扩增片段大小为294bp, 退火温度为63℃。以25μL为反应体系。反应条件:95℃预变性10 min, 95℃变性1min;63℃退火1 min;72℃延伸1 min共40个循环。72℃延伸5 min。由美国Invitrogen公司合成所有引物。严格按照SYBR ExScriptRT-PCR试剂盒说明书 (Ta KaRa公司, 中国大连) 操作进行real-time PCR反应。
1.2.3 数据分析及修正
PCR反应获得的数据用ABIPrism7500SDS软件进行分析。以18S为内参基因对各基因表达进行标准化, 以T36作为参照因子。采用2-△△CT法比较MIM-B的相对表达量。根据仪器测出的CT值, 通过运用公式△CT标本=CT目的基因–CT18S, △△CT=△CT目的基因–△CT内参 (即RQ值) , 计算得出代表相对表达量的RQ值, 为了便于统计及减小误差, 且m RNA的扩增是以指数倍增长的, 因此把RQ值取Log10进行分析。
1.3 统计学处理
采用统计学处理软件SPSS13.0进行统计分析, 不同组之间差异用t检验进行分析, P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 MIM-B mRNA在乳腺癌与癌旁正常乳腺组织中的表达水平
MIM-B mRNA在乳腺癌组织中的相对表达水平 (-0.05±0.58) 高于癌旁乳腺组织 (-0.29±0.45) , 具有统计学意义 (P=0.049, 见图1, 2) 。
横杆代表每组的均值。
2.2 乳腺癌中MIM-B mRNA表达水平与临床病理学特征的关系
MIM-B mRNA在淋巴结转移组中的表达水平高于未转移组, 其结果具有统计学意义 (P<0.05) , 且在乳腺癌的肿物大小、TNM分期方面, MIM-B mRNA表达均与其具有相关性 (P<0.05) , 然而在乳腺癌的病理特征中包括组织学分级、病理类型和各项免疫指标中, MIM-B mRNA的表达均与其无明显相关 (P>0.05) , 见表1。
3 讨论
MIM是Lee等在膀胱癌细胞株中发现的潜在转移抑制基因, 其位于染色体8q24.1, 编码5.3 kb的m RNA和多肽。MIM-B是Woodings等发现的MIM同源异构体, 结构上与MIM相似, MIM-B的C末端有WH2 (WASP homology 2) , N末端具有和胰岛素受体酪氨酸激酶底物P53 (IRSp53) 同源的结构域 (IRSp53/MIM homology domain, IMD) 。
目前MIM-B仍是一个有争论的基因, 有观点认为MIM-B表达下降与肿瘤的发生、发展和侵袭转移有关, 具有肿瘤转移抑制基因的功能, 在肿瘤的形成发展中发挥作用。Loberg[5]等用Western印迹法及RT-PCR检测到前列腺癌细胞株中MIM-B的表达下降。Nixdorf[3]等在膀胱癌细胞株中发现MIM-B mRNA有下调, 但在体内和体外实验中均未发现MIM-B的表达和侵袭能力有关, 其表达水平和和启动子的甲基化及P53的功能无关, 表明MIM-B的表达下调不是肿瘤侵袭过程中的重要因素。
但也有观点认为MIM-B不是转移抑制基因, 因为研究发现内源性MIM-B蛋白广泛表达且于多种转移性肿瘤细胞株中均有表达, 认为其参与了肿瘤的形成。Callahan[6]等发现MIM-B在皮肤毛囊的发育和基底细胞癌中表达升高, 且MIM-B的表达受SHH的调控, 促进肿瘤的增殖, 提示MIM-B的水平在不同组织的发育过程中受调控。Ma[4]等研究40例肝细胞癌及相应癌旁组织时发现在肝癌中MIM-B的mRNA和蛋白水平均显著高于正常肝和癌旁组织, 认为MIM-B的高表达是肝癌的早期事件, 不仅对肝癌的发展有影响, 还早期预警肝癌的发生, 可能是肝癌早期病变的强诱导者, 且MIM-B的过表达与肝癌TNM分期和包膜侵犯密切相关。Guillaume等[7]在实验中发现MIM-B在小鼠脑、肺、膀胱和脾等脏器有广泛表达, 但均未表达于肠、骨骼肌、肾和心脏中。同时在转移性前列腺癌、膀胱癌、和乳腺癌中均发现MIM-B广泛表达。本文部分结果与该研究结果一致。在国内的文献报道中, 已明确MIM-B可表达于不同的肿瘤。黄修燕等[8]发现抑制MIM-B mRNA和蛋白表达, 可抑制肝癌的侵袭、转移潜能, 认为MIM-B基因表达水平和肝癌转移潜能有相关性, 并且该课题组还发现MIM-B mRNA在肝残癌组织中的表达水平与肺转移结节呈正相关, 但与转移出现的时间具有负相关的关系, 另外MIM-B mRNA高表达于具有高转移潜能的肝癌细胞系[9]。
另有观点认为MIM-B是一种支架蛋白。骨架蛋白是细胞骨架结构的调节物, 与细胞的移动有关[10]。研究[11]表明对细胞骨架蛋白的协同调控是细胞运动、侵袭和转移的关键, 细胞骨架的改变在细胞转化和癌变过程中非常普遍, 很多原癌基因激活后都会引起细胞肌动蛋白丝的破坏。MIM-B具有细胞骨架蛋白结合位点, 通过WH-2结合G-actin, 通过IRSp53/MIM结构域 (IMD) 与F-actin结合, 通过与细胞骨架蛋白结合, 诱导下游Rac表达, 或与RPTPδ结合参与SHH信号介导的反应, 引起细胞骨架的改变, 从而参与肿瘤细胞的转移。骨架蛋白结合位点IMD可能与肿瘤分化相关[12], Bompard[13]等发现MIM-B通过IMD连接并激活Rac, 但不足以促进伪足形成, 仍需MIM-B的其他结构域或其他蛋白的相互作用, 所以推断MIM-B作为与Rac、肌动蛋白、肌动蛋白相关蛋白相作用的支架蛋白。Mattila[14]等也证实MIM-B的表达诱导了富含肌动蛋白的伪足样质膜突起形成, 通过激活Rac使肌动蛋白应力纤维丢失, MIM-B可能是作为一个支架蛋白募集Rac的效应分子来组织肌动蛋白的组装。
本实验采用real time PCR技术检测MIM-B mRNA在60例乳腺癌组织及癌旁正常乳腺组织中的表达, 发现MIM-B mRNA在乳腺癌组织中的表达高于癌旁正常乳腺组织, 综合国内外的文献, 笔者认为在各种正常组织及肿瘤组织中MIM-B的表达水平呈不一致性的改变, 与肿瘤异质性可能有相关性。进一步分析数据发现在淋巴结转移组中MIM-B的表达上调, 同样在中晚期的患者 (TNM分期II期和III期) 和肿物直径大于2cm的病例中MIM-B的表达具有同步性, 但MIM-B的表达上调与患者的年龄, 乳腺癌病理学特征 (包括组织学分级、病理类型等) 和各项免疫指标等均无相关性, 推测在乳腺癌的转移侵袭中MIM-B的表达发挥着重要作用, 并可能有效地预测乳腺癌中晚期的病情。