精液冷冻

精液冷冻（精选八篇）

精液冷冻 篇1

1 材料

1.1 试验动物

试验选取榆林市榆阳区绒山羊繁育中心体格健康、性欲旺盛的年龄为2周岁的陕北绒山羊种公羊作为试验动物。

1.2 试验设计

离心去精清组:连续采集2次公羊精液, 混合, 进行精子活率检查 (精子活率≥0.72) 。用消毒鲜羊奶进行1∶2稀释后, 在32 ℃条件下, 以1 250 r/min离心6 min, 重复2次, 洗涤去除精清。随后立即用冷冻稀释液按1∶3的比例进行等温稀释, 并迅速分装于0.25 mL 细管中, 用棉花包裹于0～4 ℃冰箱中缓慢降温至4 ℃, 平衡, 冷冻, 保存。解冻后对精液品质进行检查和人工授精。

全份精液组:连续采集2次公羊精液, 混合, 进行精子活率检查 (精子活率≥0.72) 。用冷冻稀释液按1∶3的比例进行等温稀释并迅速分装于0.25 mL细管中, 用棉花包裹于0～4 ℃冰箱中缓慢降温至4 ℃, 平衡, 冷冻, 保存。解冻后对精液品质进行检查和人工授精。

离心去精清组和全份精液组稀释所用冷冻稀释液相同。 冷冻稀释液的配制:基础液 (乳糖4.6 g、葡萄糖3.5 g、柠檬酸钠1.5 g、双蒸水100 mL灭菌) 80 mL +卵黄20 mL+甘油5 mL+青霉素、链霉素各10万IU。稀释液甘油含量为4.76%, 稀释后最终甘油含量为3.57%。

1.3 采精

利用假阴道法采精, 间隔30 min, 连续采集2个射精量。

1.4 精液品质检查

1.4.1 精液品质检查项目

精子活率、精子畸形率、顶体完整率、精子存活时间、精子有效存活时间。

1.4.2 精液品质检查

每个试验组冷冻精液解冻3次, 每次解冻重复检查2次。以每个指标的6次检查平均数代表该指标的结果。

精子活率:观察统计显微镜视野中直线运动精子数占视野中精子总数的百分数。利用显微镜和精子质量分析仪进行检查。

精子畸形率:采用精子染色法观察精子形态, 计算畸形精子数占观察精子数的百分比。

顶体完整率:用吉姆萨染液对精液抹片进行染色, 精子顶体被染成紫色, 在显微镜油镜下观察, 计算顶体完整的精子数占所观察精子数的百分比。

精子存活时间:解冻后, 在室温 (25 ℃) 条件下, 精子全部死亡的时间。

精子的有效存活时间:在室温 (25 ℃) 条件下, 精子活率保持在0.3的时间。

1.5 情期受胎率测定

采用去精清和全份冷冻精液, 为同期发情的陕北绒山羊人工授精, 人工授精技术及方法相同。

1) 发情鉴定。

用公羊试情, 选择愿意接受公羊爬跨的母羊, 结合母羊阴道黏液状况及子宫颈口的开张情况, 确定适宜的输精时间。如果母羊外阴黏液量多、黏稠, 子宫颈口开张较好, 适宜立即输精。

2) 输精。

采用倒提后腿法进行输精。

3) 不返情观察。

对配种后17～25 d的母羊连续试情观察。不返情的视为妊娠, 做好记录。

计算配种后第1情期受胎率。第1情期受胎率=配种后第1情期不返情数/配种数×100%。

以各组情期受胎率的平均数代表各组冷冻精液的受胎率。

1.6 冷冻精液制作

1.6.1 陕北绒山羊离心去精清冷冻精液制作

1) 离心去精清:

迅速检查所采集的精液中精子活率, 按1∶2的比例用消毒鲜羊奶进行等温稀释;稀释后以1 250 r/min离心8 min, 用移液器移去与加入鲜羊奶等量的上清液, 弃上清液;再加入等量的鲜羊奶稀释, 混匀;再以相同方法弃上清液, 剩余为去精清精液。

2) 稀释、分装:

去精清后的精液, 经精子活率检查符合冷冻精液制作标准后, 立即与冷冻稀释液按1∶3的体积比稀释, 并分装于0.25 mL精液细管中, 封口后用棉套包裹, 于冰箱中降温2 h, 至细管温度为0～4 ℃。

3) 平衡:

在0～4 ℃的条件下平衡2 h。

4) 冷冻:

将平衡好的细管精液, 迅速采用CL-8800i冷冻程序控温仪进行冷冻。

5) 保存、解冻:

将冷冻好的细管冷冻精液迅速转入液氮罐中保存, 备用。解冻时, 将保存于液氮罐中的细管冷冻精液迅速投入到38 ℃温水中10 s, 取出即可进行有关精液的品质检查和人工授精。

1.6.2 陕北绒山羊全份冷冻精液制作

将采集的陕北绒山羊精液迅速进行精子活率检查, 符合冷冻精液制作标准后迅速进行稀释。无除去精清的操作步骤, 其他均与制作去精清冷冻精液步骤相同。

1.7 统计分析

采用SPSS 11.5软件对试验数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 离心去精清与全份冷冻精液解冻后精液品质比较

2.1.1 解冻后精子活率、精子畸形率和顶体完整率比较 结果见表1。

注: 同列数据肩标小写字母相同表示差异不显著 (P>0.05) , 小写字母不同表示差异显著 (P<0.05) , 大写字母不同表示差异极显著 (P<0.01) 。

由表1可知:解冻后去精清山羊冷冻精液精子活率为 (0.458±0.063) %, 全份精液为 (0.386±0.037) %, 去精清组精子活率显著高于全份精液组 (P<0.05) ;去精清组的精子畸形率为 (16.482±1.816) %, 全份精液组为 (16.539±2.014) %, 差异不显著 (P>0.05) ;去精清组顶体完整率为 (67.837±2.172) %, 全份精液组为 (63.173±1.947) %, 差异极显著 (P<0.01) 。

2.1.2 解冻后精子存活时间及有效存活时间比较 结果见表2。

由表2可知:解冻后去精清组精子存活时间为 (8.50±2.41) h, 全份精液组为 (11.00±3.28) h, 差异不显著 (P>0.05) ;在温度为25 ℃条件下去精清组有效存活时间为 (5.43±0.82) h, 极显著低于全份精液组[ (7.39±0.64) h] (P<0.01) 。

注: 同列数据肩标小写字母相同表示差异不显著 (P>0.05) , 大写字母不同表示差异极显著 (P<0.01) 。

2.2 情期受胎率比较

分别用去精清和全份冷冻精液对发情母羊进行人工授精, 去精清冷冻精液配种发情母羊236只, 全份冷冻精液配种发情母羊233只, 配种后第2情期末发情母羊分别为168只、164只, 情期受胎率分别为71.2%、70.4%, 差异不显著 (P>0.05) , 见表3。

注: 同列数据肩标小写字母相同表示差异不显著 (P>0.05) 。

3 讨论

3.1 去精清对陕北绒山羊冷冻精液品质的影响

去精清的陕北绒山羊冷冻精液与全份冷冻精液相比, 解冻后精子活率、顶体完整率均有显著或极显著提高, 这与张建军等[5]的报道一致。山羊精清中含有的不利于解冻后精子活率和顶体完整率的成分, 通过去精清可以有效地降低或去除, 进而减轻冷冻和解冻过程对精子造成的损伤, 提高解冻后的精子活率和顶体完整率。同时, 离心去精清的过程可以降低解冻后精子的谷草转氨酶 (GOT) 释放量。Roychudhury等人发现, 解冻后精子活率与GOT释放量之间存在明显的负相关, 解冻后精子的GOT 释放量低, 精子活率必然高[4]。离心去精清处理对精子的超微结构有轻微影响, 这种轻微影响可使稀释液中的抗冷冻物质 (如甘油、葡萄糖等) 较快地穿过精子膜, 使精细胞内部和外部环境之间的物质达到平衡, 并在冷冻过程中对精子有保护作用[7]。

解冻后去精清组与全份精液组精子畸形率相比差异不显著 (P>0.05) , 这与杨凌等[4]的报道一致, 但与姬云涛等[8]的报道不一致。离心去精清是否会对精子造成形态学损伤及其损伤程度还有待于进一步研究。 解冻后去精清组精子存活时间与全份精液组相比有所减少, 但差异不显著 (P>0.05) 。这与张建军等[5]的报道一致。说明虽然除精清同时除去了部分精子代谢所需要的成分, 但稀释液中的成分足以满足解冻后精子代谢需要, 不会显著影响精子的存活时间。 解冻后去精清组的精子有效存活时间极显著小于全份精液组 (P<0.01) 。可能是由于去精清组冷冻精液解冻后精子活率较高, 精子代谢强度增加, 使得在室温条件下精液中代谢基质消耗较快、代谢产物积聚迅速, 从而导致精子活率下降较快, 使精子有效存活时间减少。

3.2 去精清对陕北绒山羊冷冻精液人工授精受胎率的影响

将离心去精清冷冻精液和全份冷冻精液解冻后, 分别对236只、233只发情陕北绒山羊进行人工授精, 第1情期受胎率分别为71.2%、70.4%, 且差异不显著 (P>0.05) 。说明虽然除去精清可以提高冷冻后精液品质, 但精清中同时也存在许多精子正常生理所必需的物质, 这些物质很可能有益于提高精子受精能力, 从而抵消了除去对精子有不利影响物质的作用, 使解冻后情期受胎率没有明显改善。可能由于配种母羊数量较少, 不足以表现出去精清冷冻精液与全份冷冻精液情期受胎率的实际差异, 仍需要扩大配种规模进行进一步研究。

4 小结

离心去精清后制作的陕北绒山羊冷冻精液, 解冻后精液品质主要指标均有显著提高, 改善了精液品质, 解冻后配种的情期受胎率没有明显变化。鉴于离心去精清冷冻精液制作过程与全份冷冻精液制作过程相比较为复杂, 且在情期受胎率上没有明显改善, 因此建议现阶段陕北绒山羊冷冻精液制作仍采用全份精液。

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精液冷冻 篇2

关键词：兴国红鲤；精液；超低温保存

中图分类号：S965.116 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0277-02

收稿日期：2015-03-16

基金项目：江苏省科研院所社会公益研究与服务专项（编号：BM2006703）；江苏省水产三项工程项目（编号：K2006-3）。

作者简介：丁淑燕（1978—），女，山东烟台人，硕士，助理研究员，主要从事水产种质资源与遗传育种研究。Tel：（025）86581571；E-mail：dshy7869@sina.com。

通信作者：葛家春，博士，研究员，主要从事种质资源保藏与利用。Tel：（025）86581570；E-mail：gjc09@sina.com。兴国红鲤（Cyprinus carpio var.singuonesis）别称金狮红鲤，隶属鲤形目鲤科鲤属，是江西省兴国县特有的淡水养殖品种。在渔业生产上具有较广泛的实际应用价值。据史料记载，该鱼已有1 300年的养殖历史，具有体色全红、个体长大、背宽肉厚、肉质鲜嫩、繁殖力强等特点，深受广大渔业工作者欢迎。由于受到长期、密集的人工选育影响以及缺乏科学的选育指导，在形态和生长性状等方面出现了不同程度的衰退[1]。水产生物种质资源的保护关系到水产业的可持续发展。研究兴国红鲤精液的超低温保存，无论从良种的保存还是水产上的实际生产来讲都是很有意义的。本研究通过筛选D-20、Kurokura-1、Ringer液3种稀释液和二甲基亚砜（DMSO）、甘油（Gly）、甲醇（Meth）3种抗冻剂，并对冷冻保存的精子进行活力测定，旨在探索一套有效的兴国红鲤精子超低温冷冻保存方法。

1材料与方法

1.1试验材料

试验所用的兴国红鲤取自江苏洪泽水产良种场，充气运回后于笔者所在研究所水池内暂养。

1.2试验方法

1.2.1精液的采集根據鱼体质量，分别注射催产激素HRH-A2 5 μg/kg、HCG 250 IU/kg、DOM 1.5 mg/kg、脑垂体 5 mg/kg；12 h后，挤压腹部，若有精液流出，即可取精。方法为用干毛巾擦干其生殖孔，轻轻挤压雄鱼腹部，有精液流出，采集至干燥容器中。所采集的精液要求乳白色，无血液、粪便污染。

1.2.2精子的形态观察取1滴精液于干净载玻片上，通过自来水流水冲洗调节密度至适中，置于空气中干燥后，加苏木精染色液，后再次置于空气中干燥，再加入曙红染色液，空气中干燥后重新置于显微镜下观察，并进行显微摄影。

1.2.3精液质量的测定先用细口吸管吸1滴激活液于载玻片上，对准视野后，用解剖针针尖挑取培养皿中的精液，取出后立即在载玻片上的激活液中搅匀观察，激活液激活后测活力，大于90%用于保存。将精液稀释10 000倍，采用血球计数板计数，统计精子密度。

1.2.4稀释液的配制将精液经过不同稀释液适当稀释后，分别与含有16%DMSO、25%甘油、20%甲醇的同种稀释液等体积混合，使其终浓度为5×108 精子/mL，每管400 μL。以不含有任何保护剂的稀释液为对照组。每组试验均重复3次（n=3）。

1.2.5冷冻保存方法将配好的精液稀释液迅速按照下列程序进行冷冻保存：（1）两步冷冻：-80 ℃平衡15 min，后投入液氮中保存；（2）多步冷冻：4 ℃平衡30 min，-20 ℃平衡15 min，-80 ℃平衡15 min，后投入液氮中保存。

1.2.6解冻方法与精子激活经过一定时间的冻存，将冷冻管从液氮罐中取出，于37 ℃水浴90 s，用SM试剂（NaCl 2.6 g/L、KCl 0.4g/L、Tris-HCl 2.4 g/L，pH值为8.0）激活，具体激活方法为每900 μL SM试剂加入6 μL解冻后的精液，立即放入显微镜视野下观察精子运动力和寿命。

1.2.7精子活力的测定精子活力分别以精子寿命及精子运动力来评价，精子寿命是指精子被激活至绝大部分停止摇摆运动所需的时间。精子运动力指运动精子占全部精子的百分数。

2结果与分析

2.1兴国红鲤精子的形态观察

在400倍光学显微镜下，兴国红鲤精子头部为卵圆形，尾长而弯曲，形如蝌蚪（图1）。

2.2兴国红鲤新鲜精子的质量鉴定

该精子是一类分化程度很高的细胞，在精巢中不活动，与其生存水环境接触后，99%的精子被激活开始做快速直线运动，经稀释液一定程度的稀释，血球计数板计数，其精子浓度为3.2×1010精子/mL。

2.3兴国红鲤冷冻保存精子的活力测定

2.3.1稀释液对精子冷冻保存的影响应用上述含有16% DMSO的3种冷冻稀释液对兴国红鲤精子按照两步冷冻法进行冷冻保存，其冷冻保存效果见图2。在3种稀释液中，Ringer液的冻后成活率最高，达（83±9.6）%；寿命最长，达 （86.25±24.7） s。Kurokura-1、D-20液的冻后成活率和寿命分别为（33±20.6）%、（75±5.8）%和（54.5±28.2） s、（56.25±13.6） s。因此兴国红鲤精子冷冻保存的最适稀释液为Ringer液。

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2.3.2保护剂对精子冷冻保存的影响用Ringer液作稀释液，按照两步冷冻法进行冷冻保存，比较了3种抗冻剂（DMSO、Gly、Meth）的冷冻保存效果，结果见图3。DMSO冻存兴国红鲤精子效果最好。8%的DMSO冻后精子成活率为（83±9.6）%，寿命为（86.25±24.7） s。12.5% 甘油、10%甲醇冻后精子成活率较差，分别为（7.5±9.6）%、（33±34）%；寿命较短，分别为（10.5±14.2）s、（40±36.9）s。

2.3.3冷冻程序对精子冷冻保存的影响用Ringer液作稀释液，8% DMSO作保护剂，比较了2种冷冻方法对兴国红鲤精子的冷冻保护效果，结果见图4。采用两步冷冻法保存的精子成活率为（83±9.6）%，寿命为（86.25±24.7）s，而三步冷冻法保存的精子成活率为（85±5.8）%，与两步冷冻法无显著差异，寿命为（68±6.7）s，与两步冷冻法差异显著（P<0.05）。

3讨论

目前，精液超低温冷冻保存的方法一般遵循的原则是慢

冻速融，本次试验的结果符合该原则。关于鱼类精液保存稀释液的配制至今没有一个统一的理论依据，而且由于试验用鱼种类的不同，稀释液可能也有所差异。目前用于鱼类精液超低温冷冻保存的稀释液配方多数都是借鉴家畜的精液超低温保存配方或者凭经验配制。一般来说弱酸性稀释液的保存效果高于弱碱性的稀释液。本研究采用以往文献中较为成功的几种稀释液配方[2-4]，通过试验，筛选出最适合用于兴国红鲤精液超低温保存的冷冻稀释液—Ringer液。

不同的冷冻保护剂被成功用于不同鱼类精子的超低温冷冻保存。DMSO常被用于大菱鲆[5-6]、海鲈鱼[7]、黑石斑鱼[8]、美洲黄盖鲽[9]等精子的冷冻保存，本试验比较了DMSO、甘油、甲醇对兴国红鲤精子的冷冻保护效果，结果显示，DMSO比甘油、甲醇更适合兴国红鲤精子的冷冻保存。DMSO对精子有毒性但又有较好防冻效果的双重特性，在本研究中8% DMSO既能起到良好的抗冻作用，且不会导致精子损伤。

鱼类精液经过冷冻保存及解冻后的激活方式对于获得高的精子活力具有重要意义。陈松林等研究表明，在冷冻过程中，在DMSO的作用下，鱼类精子的渗透压升高，先前用于鲜精的激活方式已经不再适合冻精。如果用水直接激活，会导致冻精内外渗透压过大，精子吸水膨胀、活力降低、寿命缩短。而用有一定渗透压的溶液去激活冻精，效果要好得多[10]。本研究激活冻精所用的SM试剂即能获得较好的激活效果。

鱼类精液经过超低温冷冻后，活力都有一定降低。本次试验用曙红染色冻精，在显微镜40倍物镜下观察发现经过冷冻/解冻后的精子中有部分精子的形态结构发生变化，主要表现在：（1）精子的细胞膜变得疏松、膨胀甚至破裂、脱落；（2）精子尾部的鞭毛断裂，有基部断裂和中部断裂2种；（3）精子鞭毛非正常缠绕、扭曲。精子在冷冻/解冻过程中发生冻存损伤是难免的[11-12]。在冻存过程中，一方面由于温度的不断下降，精子不耐低温可能导致结构及功能发生变化，另一方面由于加入的抗冻剂本身对精子有毒性，以及精细胞中水分不断渗出导致精子内外渗透压变化也会导致精子的冻存损伤。

虽然目前在冷冻稀释液、抗冻剂、降温速率以及激动方法等方面还没有统一标准，但随着精液超低温保存技术的不断发展，使得精子冻存后的损伤大大减小，这项技术会更加完善。

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藏獒精液冷冻技术研究 篇3

近年来, 由于原产区生态环境和藏族牧民生活方式改变, 逐渐忽视了对藏獒的选择和培育, 导致大部分个体因品种混杂而失去了原有的遗传特色, 加之大量藏獒外销, 纯种藏獒的种群数量减少, 品种基因流失, 种质资源受到严重破坏[4,5]。因此, 试验通过对藏獒精液冷冻稀释液进行筛选, 制作冷冻精液, 建立藏獒精液冷冻技术体系, 为藏獒人工授精、扩繁及优良品种资源保护提供依据。

1 材料

1.1 试验动物

公藏獒5只, 年龄为2.5~5.5岁, 藏獒单舍饲养, 有正常的配种史, 无生殖系统疾病史。

1.2 试验仪器及试剂

生物显微镜、高压灭菌器、移液器、电子天平、酸度计、液氮罐、恒温水浴箱、冰箱、温度计、0.25 m L冻精管、0.5 m L冻精管、自制假阴道、集精杯、载玻片、盖玻片等, 均由青海省畜牧兽医科学院提供;试剂, 均为Sigma公司产品。

2 方法

2.1 试验时间、地点

试验于2012年9月份—2013年12月份, 在西宁市绿杰特种养殖有限公司和青海省畜牧兽医科学院高原动物遗传育种与繁殖实验室进行。

2.2 精液的采集

采用自制假阴道采精, 首先用温生理盐水清洗公犬的阴茎并擦拭干净。调节好假阴道内胎压和温度后, 操作时戴上乳胶手套, 人工按摩公犬阴茎待勃起后导入假阴道内刺激阴茎让其排精, 收集精液。

2.3 精液的常规检查

采用平板压片法测定精子活力, 在普通光学显微镜下观察, 按照0~1.0十级评分判断精子活力。取少许精液滴在载玻片上, 分散均匀后盖上盖玻片, 自然风干后用中性甲醛溶液固定15 min, 冲去固定液, 风干后用姬姆萨染液染色90 min后, 用细水冲去多余染液, 风干后检测精子畸形率和顶体完整率。

2.4 稀释液的配制

试验采用三羟甲基氨基甲烷 (Tris) -果糖-柠檬酸稀释液配方进行改进, 分别称取Tris 2.42 g, 果糖0.9 g, 柠檬酸1.26 g于100 m L容量瓶中, 用前添加卵黄20 m L, 5万IU青霉素, 链霉素0.1 g, 加双蒸水至100 m L刻度。在稀释液基础上添加不同浓度甘油 (0、2%、4%、6%、8%、10%、12%) , 用稀盐酸对配好的稀释液进行滴定, 用酸度计进行测定, 配成5个p H值梯度, 即5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5。

2.5 精液稀释和平衡

将采集到的精液镜检后, 用不同p H值的稀释液按照1∶1的比例进行稀释。稀释后的精液用纱布包裹后放入4℃冰箱中, 待精液温度下降至4℃时添加含有不同浓度的甘油冷冻液进行平衡 (最终稀释比为1∶2) 。

2.6 冷冻及解冻

平衡后的精液采用颗粒形式, 0.25 m L和0.5 m L细管, 封口后冷冻。将细管置于距离液氮面3~5 cm处熏蒸5 min, 然后投入液氮中保存。将细管冻精直接投入42℃水中, 晃动30 s待其完全溶解后取出, 显微镜下检测其活力。

2.7 数据的统计分析

检测结果以平均值±标准差表示, 采用OneWay ANOVA (SPSS 15.0) 统计软件进行方差分析和显著性检验, 每组试验重复3次。

3 结果与分析

3.1 试验藏獒精液品质评定 (结果见表1)

由表1可知, 试验藏獒5只, 体况良好, 年龄为2.5~5.5岁, 藏獒单舍饲养, 有正常的配种史, 无生殖系统疾病史。精液颜色为淡乳白色或乳白色, 采精量为 (2.57±0.60) ~ (16.17±3.01) m L, 个体射精量差异较大, p H值在6.77~6.97之间, 精子活力在 (0.62±0.13) ~ (0.92±0.03) 之间, 精子密度为 (3.10~17.67) ×107/m L, 畸形率和死精子率分别为6.20%~9.33%和5.27%~9.17%。

3.2 稀释液p H值对藏獒精液的影响 (结果见图1)

由图1可知:用p H值为5.5~7.5的稀释液对藏獒精液进行稀释, 随着时间的延长精子活力均下降, 其中以p H5.5、p H6.0和p H7.5的稀释液中精子活力下降最快, 48 h时p H7.0稀释液精子活力为 (0.21±0.03) 高于p H6.5的稀释液中精子活力 (0.17±0.03) , 二者差异不显著 (P>0.05) ;而p H7.0和p H6.5稀释液中精子活力显著高于p H5.5、p H6.0和p H7.5稀释液中精子活力 (P<0.05) , 说明藏獒精液稀释液p H值在6.5~7.0之间精子活力较好。

3.3 不同甘油浓度对藏獒精液冷冻的影响 (结果见表2)

由表2可知, 添加冷冻液之前所有藏獒的活力为 (0.81±0.09) ~ (0.84±0.06) , 各组间差异不显著。解冻后甘油浓度为4%、5%、6%的冷冻液藏獒精子活力分别为 (0.36±0.05) 、 (0.36±0.06) 、 (0.37±0.06) , 差异不显著 (P>0.05) ;但均显著高于甘油浓度为1%、2%、3%冷冻液藏獒精子活力 (P<0.05) , 而不添加甘油的冷冻液解冻后精子的活力为0。同时随着甘油浓度的升高, 冷冻精液解冻后精子的畸形率显著升高 (P<0.05) , 而顶体完整率随着甘油浓度的升高显著降低 (P<0.05) 。依据解冻后精子活力、精子畸形率和顶体完整率进行综合评价, 4%的甘油冷冻液对藏獒精液冷冻效果最佳。

注:同列数据肩标小写字母不同表示差异显著 (P<0.05) , 小写字母相同或无肩标表示差异不显著 (P>0.05) 。

3.4 甘油平衡时间对藏獒精液冷冻的影响 (结果见表3)

注:同列数据肩标小写字母完全不同表示差异显著 (P<0.05) , 含相同小写字母表示差异不显著 (P>0.05) 。

由表3可知, 添加甘油冷冻液后直接冷冻藏獒精液, 其解冻后精子活力为 (0.13±0.06) 显著低于平衡时间为20 min、40 min、60 min、80 min和100 min的精子活力 (P<0.05) , 随着平衡时间的延长, 冷冻精液解冻后精子活力增加, 以平衡60 min时 (0.37±0.04) 为最高。顶体完整率在没有平衡冷冻的精液中显著低于各平衡组, 在平衡20 min后, 随着平衡时间的延长精子顶体完整率呈下降趋势。

3.5 不同冷冻形态对藏獒精液冷冻的影响 (结果见表4)

注:同列数据肩标小写字母不同表示差异显著 (P<0.05) , 小写字母相同表示差异不显著 (P>0.05) 。

由表4可知, 利用液氮熏蒸方法通过颗粒冻精、0.25 m L细管和0.5 m L细管对藏獒精液进行冷冻, 0.25 m L细管解冻后精子活力为 (0.39±0.05) 显著高于颗粒冻精活力 (0.35±0.05) 和0.5 m L细管冻精活力 (0.33±0.07) (P<0.05) 。颗粒冻精、0.25 m L细管冻精和0.5 m L细管冻精解冻后精子畸形率和顶体完整率差异不显著 (P>0.05) 。

4 讨论

采用自制假阴道采精, 藏獒鲜精液颜色为淡乳白色或乳白色, 采精量为 (2.57±0.60) ~ (16.17±3.01) m L, 个体射精量差异较大, p H值在6.77~6.97之间, 精子活力在 (0.62±0.13) ~ (0.92±0.03) 之间, 精子密度为 (3.10~17.67) ×107/m L, 畸形率和死精子率分别为6.20%~9.33%和5.27%~9.17%。精液中酶活性的变化受精液p H值的影响, 而酶活性直接影响精子的受精能力[6,7], 当精液p H值降低时, 精子的代谢与活动减弱;反之因p H值上升, 代谢与活动增强, 能量迅速耗竭, 存活时间减少, 为维持正常代谢活动, 精子需要一个适宜的p H值范围。研究认为, 藏獒精液的p H值范围以6.5~7.0为宜, 而C.Yildiz等[8]认为, 犬精液的最佳p H值为6.6, 研究结果一致。精液冷冻保存中, 甘油为一种渗透性保护剂, 是目前家畜精液冷冻中最常用的冷冻保护剂之一。甘油渗入细胞内结合胞内水分防止细胞脱水或结合细胞水, 阻止细胞内形成冰晶, 同时甘油也有稀释作用, 能降低溶液中盐的浓度和冷冻液的渗透压, 从而发挥其低温条件下对精子的保护作用[9,10], 甘油作为冷冻保护剂对精子的冷冻保存既有保护作用又有毒性作用, 而且在不同动物精液中不同浓度的甘油对精子毒性作用不同, 研究认为, 4%的甘油浓度冷冻藏獒精液其解冻后活力为 (0.36±0.05) , 同时精子畸形率和顶体完整率适宜。添加甘油后随着平衡时间的延长, 冷冻精液解冻后精子活力增加, 而精子顶体完整率下降, 以平衡60 min时精子活力 (0.37±0.04) 为最高, 这与辛国省等[11]的研究结果平衡20 min精子活力最高存在差异, 还需要进一步验证。许多学者分别用安瓿瓶法、颗粒和细管对藏獒精液进行冷冻保存, 不同剂型各有优缺点, 不同研究者观点差异较大。T.T.Olar等[12]认为, 细管精液易于标记、贮存和解冻, 因此比颗粒和安瓿瓶精液更实用, 研究利用液氮熏蒸法通过颗粒冻精、0.25 m L细管和0.5 m L细管对藏獒精液进行冷冻, 0.25 m L细管解冻后精子活力为 (0.39±0.05) , 显著高于颗粒冻精活力 (0.35±0.05) 和0.5 m L细管冻精活力 (0.33±0.07) (P<0.05) ;颗粒冻精、0.25 m L细管冻精和0.5 m L细管冻精解冻后精子畸形率和顶体完整率差异不显著 (P>0.05) , 说明细管冻精适合藏獒精液的冷冻保存。

参考文献

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冷冻精液贮运、保管及使用 篇4

1. 液氮罐质量量与保管

液氮罐是保存冻精的必需品, 新买来的或长期没有使用过的旧罐, 在使用前必须严格检查, 查看外部有无破损 (特别是真空抽气嘴) 。第1次充满液氮罐要观察24小时, 正常情况下罐体上下的温度一致, 罐盖外部不挂霜, 取下罐盖后罐内雾气不外溢而下沉。用手触摸罐体外壁上下温度均衡, 24小时重量消耗不大于100克。

液氮罐应由配种员亲自保管, 在使用中要经常查看液氮的消耗情况, 注意轻拿轻放, 在给牛配种时要把液氮罐放在安全的地方。在驾车带罐上门配种服务时, 由于路途颠簸, 会造成液氮消耗过快, 应注意及时补充。平时液氮罐要放置在清洁、干燥、阴凉、安全的地方, 周围不应有化学品。

冻精贮存容器每年至少要清洗1次。清理时应将冻精用完或转移到其他液氮罐内, 将液氮全部倒空, 待罐内温度上升到0℃以上时, 用40～50℃温水或中性除垢剂洗涤, 洗涤需用细软布擦洗干净, 放在阴凉处, 凉干后再用。

2. 冷冻精液的贮运与使用

冷冻精液必须放置在盛有足够量液氮的液氮罐内存放。在长途运输过程中要经常观察外部温度变化。罐内要有足够的液氮, 以淹没冻精为最低限。不足1/3时应及时补充。一般10升液氮罐重约5.5～6公斤, 1升液氮重0.808公斤, 每两天定时称重一次, 做好消耗记录。如果发现液氮消耗显著增加, 要查明原因。尽量减少开启盖塞次数, 开盖时防止湿气 (水滴) 、异物进入罐内, 动作要迅速, 以减少液氮的消耗。

在提取冻精时, 将盛有冻精的提筒或纱布袋提到液氮罐颈部 (10厘米以下) , 不得提到容器外操作, 如经过10秒尚未操作完毕时, 应放回液氮中浸泡一下后继续操作。

3. 注意事项

在实际工作中, 提取冻精操作要快捷, 要在有液氮的容器内操作。如在转移冻精或解冻提取时, 冻精离开液氮不得超过5秒, 否则降低精子活力。因此在操作前准备工作要充分, 动作要熟练、准确。

充满的液氮罐在使用过程中, 随着时间的延长, 越到后期液氮消耗越快, 注意及时补充。人工授精人员在驾车带罐时, 用软布或毛巾将罐盖包起扎紧, 防止路途颠簸罐盖冲出罐体。用客车带运精氮罐应由本人亲自或派专人看管。最好不离开视线, 以免在人多拥挤或车辆颠簸时翻倒, 液氮流出, 冻伤他人。

黄牛精液冷冻技术探讨 篇5

1 黄牛冷冻精液的意义

用黄牛冷冻精液进行品种改良,可以最大限度的发挥种公牛的种用价值,冷冻精液可以长期保存,这样1头良种公牛的精液就可以用于1万头以上的母牛配种;缩短品种改良的时间;冷冻精液不受时间、地域的限制,可以大范围的利用良种种公牛,同时种公牛的饲养数量可以减少,饲养成本降低了。

2 精液冷冻保存的原理

精液的冷冻就是就是将精液经过特殊处理,能够达到长期保存的目的。生产中常用液氮(-196℃)、干冰(-79℃)为冷源,在超低温下保存经过处理的精液,此时精子的生理代谢活动受到抑制,升温后精子的活力又可以恢复,这样就达到了长期保存利用的目的。

3 精液冷冻保护剂

生产中最常用的冷冻精液保护剂就是甘油,甘油可以保护精子,提高精子的存活力和活动力,但是也会对精子有一定的损伤,新型的保护剂的开发一直是研究的重要课题。冷冻稀释液是精子的载体,要为精子提供代谢物质,调节精子的受精能力,其成份对精子有很大的影响。例如,牛冷冻精液稀释液中添加VB12可以显著提高精子活力、顶体完整率和质膜完整率;添加某些氨基酸如添加半胱氨酸和谷胱甘肽可以降低在冷冻过程对精子的DNA产生损害。

4 冷冻保存技术

4.1 采精及精液品质检查

精液的品质直接关系着精液冷冻效果,做好采精的准备工作并规范采精操作技术,才可以获得高质量的精液。采集精液以后,要对精液的品质进行鉴定,不合格的产品要废弃。牛精液的精子活率要不低于0.7,并保存在30℃的水浴中。

4.2 精液稀释

选择合适的稀释液,按照科学的稀释方法,规范操作程序来对精液进行稀释。稀释以后取样,在38~40℃的条件下进行镜检,稀释后的精液活率要不低于原精液的活率。

4.3 降温和平衡

降温就是在精液稀释以后,用12~16层的纱布包裹,放到0~5℃的冰箱内经过1~2h的时间将精液缓慢降温的过程。平衡就是将降温后的精液放在冰壶内,放入0~5℃的冰箱内平衡2~4h,以便精液的保护剂充分的进入精子的内部,发挥保护精子的质量的作用。在操作过程中要注意降温、平衡过程中要避光操作,已经降温、平衡后的精液温度不能在回升了。

4.4 精液的分装

目前常用的分装设备为细管精液分装一体机,这是一套灌装、封口、喷墨印字的一条龙式作业的一体化设备,这种设备的自动化程度高,可以确保精液不被外界污染。如果单独使用细管分装机操作,要在分装前做好细管上的标记,如种公牛的详细信息,自己要清楚,信息要准确、全面。

4.5 冷冻

(1)冷冻温度冷冻温度是影响牛精液品质的关键因素,精液冷冻刚开始的温度一般为-120~-140℃之间,尽量在8min内达到和维持这个温度区域后,继续降温倒入液氮。生产中由于冷冻精液的数量不同,有时温度稍有回升,同时由于采精的季节、稀释液的成分、甘油的浓度、冷冻剂型的不同,降温的速度和时间也会稍有差异。

(2)冷冻方法目前我国对牛精液的冷冻方法根据设备的不同可以分为两种:精液自动冷冻仪法和简易细管精液冷冻箱法。精液自动冷冻仪法是一种科技含量比较高的方法,冷冻仪是由计算机控制的全自动冷冻容器,人工做好各种准备工作,设定好参数,启动程序,有计算机控制来完成精液的冷冻过程。简易细管精液冷冻箱法是生产中常用的方法,投资少,操作简单。首先要有一个隔热性能较好的、深度在50cm以上的冷冻箱,使用前先加入液氮制冷,根据冷冻细管精液量的多少确定液氮的使用量。然后把冷冻细管精液放在冷冻架上,迅速放入冷冻箱中进行冷冻,整个的冷冻过程一般为8min以内。

4.6 牛冷冻精液保存

我国家畜精液冷冻专利技术分析 篇6

但由于不同公畜精子的生物学特性不同, 其冷冻保存效果也存在很大的差别。多年来我国科研工作者在家畜的精液冷冻技术领域的研究取得了一定成果, 获得了一系列具有自主知识产权的专利。我们利用中国专利数据库, 对我国家畜精液冷冻领域相关的专利文献进行了检索。通过检索获得家畜猪、牛、羊、马4个物种42项专利/专利申请。

1 家畜精液冷冻专利申请概况

对获得的42项专利/专利申请按照发明创造类型分类, 发现其中发明34项, 实用新型8项, 发明占80.95%。从申请的时间分布来看, “十一·五”我国加大对畜牧业投入以来, 该领域的发明数量明显增加, 累计为18项, 占发明总量的52.94%, 高出“十·五” (9项) 整整一倍。从专利权人/申请人所在单位的性质来看, 大专院校最多, 为19项, 占发明总量的55.88%, 随后依次为企业5项, 事业单位4项, 科研院所3项, 个人3项, 这些数据表明大专院校在该领域的研发中具有明显的优势。从发明专利申请所涉及的物种来看, 涉及猪的有10项, 牛9项, 羊4项, 牛羊共用3项, 马2项, 不分物种6项。虽然目前猪精液冷冻保存效果与牛、羊相比还有较大差距, 但是在该领域有关猪精液冷冻技术的发明专利申请最多, 这些成果必将推动猪精液冷冻技术逐步走向完善。

2 家畜精液冷冻专利技术分析

对检索到的42项专利技术进行了初步分析, 我们发现这些专利申请的主要涉及精液冷冻配方、精液冷冻承载工具、精液制作新方法以及冷冻后精液的检测方法。

2.1 冷冻液配方以及冷冻保护剂

精液冷冻液主要包括基础液以及稀释液, 是精子的冷冻保护剂, 对精液冷冻的效果有着决定性的影响。精液冷冻保存稀释液, 一般由葡萄糖、蔗糖、果糖、柠檬酸钠、EDTA、脱脂奶、蛋黄、甘油等组成。发明人王丽霞等[1]研究发现在精子分离、冷冻的过程中添加抗氧化剂CAT和VE, 可以降低活性氧族对精子造成的过氧化损伤的作用, 从而提高解冻后精子活力并延长精子存活时间。发明人李青旺等[2]发明了一种含有10～18%的鸽子蛋黄的猪精液冷冻保存抗冻剂, 当新鲜鸽子蛋黄添加量为13～15ml时, 冷冻—解冻后猪精子活率达65%, 顶体完整率达58%, 质膜完整率达64%。李新红等[3]发明的猪精子冷冻防冻剂采用一种表面活性剂氨基—钠—十二烷基硫酸酯 (OEP) , 其可以有效地抑制冻融精子质膜和DNA的损伤率, 提高冻融精子的质量。采用该防冻剂进行猪精液稀释后制作细管冻精, 猪冻融后精子活力、质膜完整率、顶体完整率分别为62.4%、66.8%、69.5%, 人工输精母猪受孕率达到85.9%, 接近利用鲜精的母猪受孕率。发明人王争光等[4,5]研究发现在精液冷冻保存的稀释液中添加2～6mg/ml的谷胱甘肽, 可以有效地去除冷冻过程中产生的多余自由基, 从而可有效提高猪精液冷冻解冻后的存活率。

在牛的冷冻精液稀释液中, 发明人李青旺等[6]还发现添加7.5～9.5g的低密度脂蛋白可以使得冷冻—解冻后牛精子活率达50～68%以上, 精子直线运动速度达30～35μm/s, 精子直线性达55%, a级精子的百分率达到35%以上, 精子的顶体完整率达72%以上, 精子的质膜完整率达55%以上。发明人昝林森等[7]将VE、VC联合加入到了精液稀释液中, 能够明显提高牛精子冻后活率、顶体完整率及精浆中抗氧化物酶的活力, 从而提高精子冻融后的品质及受精率。发明人杨利国和桑雷[8]对奶牛性控精子的冷冻保存研究发现, 稀释液中添加5～20%的猪精清, 能够明显提高奶牛性控精液的精子顶体完整率和精子活率, 同时有助于降低精液的密度, 从而节约了精液制备成本, 冷冻—解冻后, 奶牛性控精液的精子活率为57.41%, 精子顶体完整率为51.90%。在布尔山羊细管精液冷冻方法中, 基础液还包括乙二胺四乙酸钠、5%的脱脂羊奶以及10%的乙二醇[9]。发明人丁建平等[10]在冻精稀释液中添加羟乙基哌嗪乙磺酸、二甲基甲酰胺和十二烷基硫酸钠, 经检测, 安徽白山羊颗粒冻精复苏活力达到65%。在牛羊冷冻精液稀释液中, 添加牛血清白蛋白 (BSA) 4.5～7.5ml, VB120.45～0.75ml, 解冻后精子活力≥45%, 顶体完整率≥68%, 质膜完整率≥50%, 精子畸形率≤15%[11]。发明人张世伟等[12]在辽宁绒山羊精液冷冻稀释液中添加丙酸睾丸酮, 其提高了冻精解冻后精子的活力、顶体完整率, 延长了冻精解冻后具有受精能力的时间, 使情期母羊受胎率得到提高, 从而可以使辽宁绒山羊优秀种公羊冷冻精液得到大力推广。

近年来, 很多研究者发现中草药在精液冷冻中发挥着重要作用。发明人李青旺等[13]发现1～1.5%的红景天多糖在猪精液冷冻中可使精子活率达到50%以上。李青旺等[14]还研究发现基础液中添加10～14%的从淫羊藿、巴戟天、菟丝子、甘草中提取的中草药提取液, 可以显著提高牛精液冷冻后的活率以及顶体完整率, 降低精子的畸形率。发明人赵有璋等[15]研究发现在稀释液中添加山梨醇和板蓝根可以提高绵羊精子冻后存活率、生存指数、顶体完整率、GOT释放量、LDH释放量和ALP释放量等重要指标方面均有显著优势。

2.2 冷冻承载工具

家畜精液冷冻保存研究中, 采用的分装承载工具主要有颗粒、细管、大管以及袋装型。

2.2.1 颗粒型

发明人王金勇等[16]研究发现利用氟板凹窝制备的猪冻精颗粒, 其大小为0.1ml, 其操作简单, 取用方便, 且精液解冻后的存活时间不低于420min。发明人卢晟盛等[17]在液氮上方5cm高处放置一个铝盘, 把平衡好的猪精液按照0.25ml/滴滴在铝盘上制成冻精颗粒, 该方法冻精效果好。发明人马绪融等[18]利用铜网进行牦牛颗粒精液制备, 使得解冻后活率可得30～50%之间, 且用此精液进行人工授精妊娠率高。

2.2.2 细管型和大管型

发明人芮荣等[19]发明了一种采用0.25ml细管高密度冷冻保存猪精液的方法, 其解冻后精子活力稳定在50%以上, 体外授精后获得54.3%的卵裂率和48.5%的桑葚胚发育率;同时, 1支0.25ml细管所含精子量可以满足生产中1个输精剂量。发明人邢小军[20]发明了一种冷冻框, 并采用0.25ml和0.5ml的细管对牛的冷冻精液进行了研究, 冻后精子的复苏率可达70～85%。发明人张建新等[21]发明了一种超高活力羊细管精液冷冻方法, 其利用0.25ml细管对处理后羊精液进行保存, 解冻后活率可达45～60%, 完全满足了羊冷冻精液人工授精需求。发明人张德福等[22]采用5ml的大管对猪的精液冷冻进行了研究, 结合其冷冻保存液, 冻后精子活力可达30～60%, 精子顶体完整率超过50%, 其完全符合目前人工授精的要求。

2.2.3 袋装

发明人权凯等[23]则认为目前的颗粒冷冻精液以及细管类冷冻精液很难满足一头母猪的输精剂量, 因此发明了一种袋装冷冻精液保存方法, 该方法采用5ml的无菌袋, 其使用简单、方便, 成本低廉。解冻后精子活力在40%以上、畸形率20%以上。

2.3 精液制作新方法

发明人李喜和等[24]研究了包括添加异种家畜精液制作低剂量目的家畜冷冻精液。通过异种家畜精液辅助作用, 使用少量目的家畜的精子 (正常所需浓度的1～50%) 达到正常受精、受胎水平。该技术能够大幅度提高目的家畜的利用率, 用于目的家畜的育种和繁殖。

2.4 冷冻后精液的检测方法

通常情况下由于冷冻液中添加一些保护剂, 如蛋黄等, 解冻后需要通过传统的抹片、染色、固定等步骤来进行观察精子的状态。针对传统方法存在繁琐不易观察的问题, 发明人夏伟铭[25]发明了一种牛冷冻精液畸形率检测的方法, 该方法首先将精液滴于载玻片上, 接着滴一滴0.2%的甲醛溶液, 然后加盖玻片后在显微镜下观察。该检测方法提供了一种操作简便、省时且检测数据更加精确的牛冷冻精液畸形率检测方法。

水牛精液冷冻稀释液研究现状 篇7

1 营养成分

营养物质主要是给牛精子提供外源性的营养和能量, 以延长精子的寿命。由于牛精子的代谢过程只是简单的分解作用, 不能利用复杂的合成作用将外源物质转变其自身成分, 所以稀释液中的营养成分必须是最简单的能源物质。现在奶牛精液稀释液中一般添加葡萄糖、果糖、蔗糖、鸡卵黄、奶类等, 水牛稀释液基本上参照奶牛, 但是近年来在水牛上也有不少关于应用其他物质代替单糖类、鸡卵黄的研究。易康乐在水牛精液冷冻稀释液中分别添加鹌鹑卵黄和鸡卵黄, 试验结果发现:稀释液中添加鹌鹑卵黄的水牛精子解冻后其活力、分裂率和囊胚孵化率都显著优于鸡卵黄组 (p<0.05) [2]。近年来因卵黄内可能携带病原菌的隐患, 现国外生产的一些稀释液中采用大豆卵磷脂代替卵黄。Akhter等在水牛精液稀释液中分别添加5.0%、10%、15%的大豆卵磷脂和20%的鸡卵黄, 结果发现水牛精液冷冻-解冻后添加的10%大豆卵磷脂精子受胎率显著高于添加20%的卵黄组 (p≤0.05) 。金海关于无动物源性水牛精液冷冻稀释液的研究中, 用大豆卵磷脂代替卵黄, 发现3%大豆卵磷脂的冷冻精子的运动速度比卵黄稀释液解冻后的差异显著, 其他方面与卵黄稀释液没有明显差异。

2 缓冲和维持渗透压成分

公牛体内精液微环境的p H值一般在6.4~7.8之间, 精液的p H值和稀释液的p H值的变化, 将直接影响到精子的活力。精液冷冻保存时, 在稀释液中添加适量的缓冲物质, 如柠檬酸钠、磷酸氢二钠等, 这些弱酸盐类在溶液中能够维持酸碱平衡, 从而有利于精子存活。在牛精液冷冻稀释液中常用磷酸盐、柠檬酸盐、Tris或者几种盐类组合来调节p H值。易康乐比较了TRIS、TEST、EYC三种不同的缓冲液对冻后水牛精子的影响, 结果表明这三种缓冲液都能用于水牛冻精生产, 但Tris和Tes这两种缓冲成分对水牛精子的保护作用更明显[2]。国外许多学者在水牛稀释液的研究中大多都以Tris-柠檬酸钠-卵黄作为基础液, Tris-柠檬酸钠缓冲体系能够调节精液的p H值, 维持精液酸碱平衡, 从而延长家畜精子的存活时间[3]。

一般认为精子周围的微环境基本上是等渗的, 如果精子生存的液体环境渗透压升高将会导致精子内部脱水;如果其液体环境渗透压过低则将会导致精子膨胀进而死亡, 所以维持精子微环境一定的渗透压是十分重要的。调节p H值的缓冲盐类和糖类对精液的渗透压维持具有重要作用, Chaveiro等研究表明, 在公牛精液中添加Tris和蔗糖的稀释液维持渗透压效果比较理想。但是某些电解质或非电解质会破坏精子的等渗压环境, 对精子产生刺激和损伤, 例如添加甘油的稀释液会使精液渗透压升高, 进而因高渗冲击使精子受损, 水牛精子相对黄牛来说抵抗力较差, 体外存活时间短, 对缓冲和维持渗透压物质要求相对要高, 但当前针对水牛精液的特点研发的稀释液配方较少。

3 抗冻和防休克成分

精液在体外冷冻保存时, 需要由常温降至零度以下, 温度骤降形成的冷刺激或者物态变化, 将会使精子遭受冷休克或冻害而死亡, 因此稀释液中添加的抗冻或防休克物质能够保护精子在温度骤降过程中不受损害。稀释液中添加的卵黄就具有防冻和冷休克的作用, 许多研究表明, 卵黄因其含有卵磷脂或者LDL (低密度脂蛋白) 等物质所以可以保护精子顶体和质膜的完整性, 从而防止精子冷冻或冷休克的发生。近年来, 关于利用LDL来取代卵黄的报道也有不少。胡建宏等研究报道, 牛精液稀释液中用8%LDL取代20%鸡蛋黄, 其精子冻后活力、运动等方面效果明显提高。Akhter等将尼里水牛的精液用含有LDL的稀释液稀释, 添加20%鸡蛋黄的稀释液作对照, 结果发现添加10%LDL的水牛精子解冻后的活力、质膜完整性和受胎率均显著高于20%的卵黄对照组[4]。

精液冷冻稀释液中最常用的防冻剂是甘油, 大多数学者认为甘油是目前稀释液中抗冻效果最好的, 但是甘油的添加量必须适中, 太少不能起到保护作用, 太多容易造成精子渗透性损伤或使精子中毒。张鹏等研究报道, 荷斯坦种公牛稀释液中添加4%的甘油浓度对精子冻后活率和顶体完整性效果最好。考虑到甘油对精子的毒性, 一些研究中用乙二醇、丙二醇、二甲基亚砜等来代替甘油, 效果不尽相同。Rasul等将甘油和二甲亚砜按不同的比例添加到尼里水牛精液的稀释液中, 结果发现, 仅添加6%甘油的水牛精子解冻后其活力和质膜完整性效果最好, 二甲亚砜反而会降低甘油对水牛的冷冻保存效果。

4 抗菌成分

精液如果被微生物污染会导致精子活力降低, 存活时间缩短, 并且人工授精后极易造成胚胎的早期死亡, 从而使牛受胎率降低, 所以在牛冷冻精液生产过程中必须控制冻精的细菌含量不超标。牛冻精稀释液中一般添加如青霉素、链霉素等抗生素来抑制精液中细菌的生长。由于精液中微生物的种类很多, 若使用单一的抗生素则不能达到抑菌的效果, 因此现在稀释液中常用的是各种抗生素的组合, 目前水牛中常用的是青-链霉素组合。Hasan等研究报道, 水牛精液稀释液中添加庆大霉素-泰乐菌素-林可霉素-壮观霉素 (GTLS) 抗生素组合, 其细菌数要明显比青-链霉素组的低。易康乐等研究报道, GTLS抗生素组合抑菌效果显著好于青-链霉素组和青-新霉素组。金海使用不同浓度的GTLS抗生素组合代替青-链霉素, 结果证实×1倍的GTLS抗生素组合效果最好。

5 抗氧化成分

在冷冻-解冻的有氧环境中脂质过氧化反应会产生过多的活性氧成分, 从而增加了受损精子和死亡精子的数量, 导致冻后精液质量的下降。在稀释液中添加抗氧化物质可以提高精子抗过氧化损害的能力, 防止解冻后精液质量下降, 目前牛稀释液中常添加维生素类、酶类等抗氧化成分。易康乐等在水牛精液冷冻稀释液中添加不同的维生素组分, 结果发现, 3 ml/100 ml的复合VB、2 mg/L的VB12和1.0 mg/L VC能较显著提高水牛冻精的活力 (p<0.05) 。雷虹等研究也证实添加的3mL/100 mL复合VB可以提高解冻后水牛精子的活力和顶体完整率。易康乐在水牛精液稀释液中添加SOD和GSH, 发现它们可以显著延长水牛精子的存活时间。

6 其他

为了改善家畜精子生存环境的理化特性, 减轻精子冷冻-解冻过程的各种损害, 牛精液冷冻稀释液中常常还加入一些酶类、维生素、激素类及其他物质, 以提高精子复苏后的活力、保持顶体的完整性等, 从而增强牛精子在人工授精时的受精能力。近年来水牛精液稀释液中也有相关添加其他物质的报道。Dorostkar等人将不同浓度的硫酸锌添加到水牛稀释液中, 结果表明, 0.288 mg/L的硫酸锌对水牛精子的冷冻保存效果和抗氧化能力较好。Qadeer等将AFGP (抗冻糖蛋白) 添加到尼里水牛精液的稀释液中, 结果发现精液冷冻-解冻后水牛的精子活力和质膜完整性有了显著提高。

虽然牛精液冷冻稀释液的成分和生产工艺业已成熟, 但是如何根据不同种类的公牛精液的理化特点, 设计适合该类种公牛的精液冷冻稀释液, 仍是今后牛精液冷冻保存技术中需要克服的一个重要难题。

摘要：牛的精液冷冻保存技术已较成熟, 其商品化的精液冷冻稀释液也很多, 而水牛的精液稀释液大多还是沿用奶牛和黄牛的, 但是近年来关于水牛精液冷冻稀释液的研究也逐渐开展。文章对最新水牛的精液冷冻稀释液成分的研究现状进行了综述, 期望在实际生产中对水牛精液的冷冻保存提供一些参考。

关键词：水牛,精液,冷冻稀释液

参考文献

[1]潘红梅, 罗敏, 王可甜, 等.畜禽精液冷冻稀释液主要成分的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医, 2010, (01) :21-22.

[2]易康乐.水牛冷冻精液稀释液配方改进的研究[D].南宁:广西大学, 2005.

[3]Andrabi SM1, Ansari MS, Ullah N, et al.Duck egg yolk in extender improves the freezability of buffalo bull spermatozoa[J].Anim Reprod Sci.2008, 104 (2-4) :427-433.

精液冷冻 篇8

1资料与方法

1.1精液来源

符合卫生部人类精子库有关管理规范标准的供精者精液标本,冷冻保存于中信湘雅生殖与遗传专科医院人类精子库,随机从精子库数据库中选取标本162例。

1.2分组

按其冷冻保存年限分为8组:Ⅰ组为冻存0~1年组(n =11),Ⅱ组为冻存1~2年组(n =42),Ⅲ组为冻存2~3年组(n =16),Ⅳ组为冻存3~4年组(n = 11),Ⅴ组为冻存4~5年组(n =16),Ⅵ组为冻存5~ 6年组(n =27)Ⅶ组为冻存6~7年组(n =25),Ⅷ组为冻存7~8年组(n =14)。

1.3复苏

将选取的标本在37℃水浴摇床中解冻复苏,行精液常规分析。

1.4回顾

在数据库中检索所解冻精液(对应供精者编号及捐献日期)冷冻前的精液常规结果(进行室内质控,保证不同工作人员间误差在允许范围内)。计算精液冷冻复苏率 [(冻后活率 / 冻前活率)×100%], 并对各组间的冻前活率进行比较。冷冻保护剂为自制的改良甘油蛋黄复合物,使用程序冷冻仪进行冷冻。

1.5统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,用t检验,P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

Ⅰ~Ⅷ组随冷冻年限的增加,冷冻复苏率呈下降趋势;而从精子冻前活率来看,更早的捐献标本略高于近年捐献标本(见附图)。Ⅰ组与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组的冷冻复苏率比较,差异无统计学意义(P >0.05);而 Ⅰ组与Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ组冷冻复苏率比较,差异有统计学意义(P <0.05)。见附表。

3讨论

冷冻对精子所造成的损伤是不可逆的[3],因此要求医师在实际临床工作中选用合适的冷冻保护剂[4,5]、 摸索最佳的程序冷冻程序[6]以及把握好冻存的年限等[7],以获得最佳的冷冻复苏率,从而达到卫生部人类精子库基本标准与技术规范的要求,即对外供精用于供精人工授精或体外受精 - 胚胎移植的冷冻精液,冷冻复苏后前向运动精子(a+b级)>40%,每份精液中前向运动精子的总数 >12×106个。

本实验研究长时间冷冻对精子冷冻复苏率的影响,发现冷冻保存1~8年的冷冻复苏率有随冷冻年限增加而下降的趋势。冻存1年内与冻存2~5年的冷冻复苏率比较,差异无统计学意义;但与冻存6~ 8年比较差异有统计学意义。提示长时间冷冻存储对精子冷冻复苏率有影响,而且需要相对较长的时间才能体现出来。另外,目前精子库的实际运行管理模式也可能是导致该现象的原因之一:精子库每年需对库存精子进行清理登记,在这个过程中,冷冻精子会短时间暴露于室温中(冻存年限越长,暴露次数越多),可能对精子冷冻复苏率有不良影响。

因此,在精子库工作中,目前比较实用的建议是尽量按冻存的顺序进行供精。而对于已成功使5例妇女受孕的标本,应统一封存于专用液氮罐中,尽可能减少不必要的降低冷冻复苏率的操作。清点库存时,应在盛有液氮的泡沫盒中进行操作,以尽量减少冷冻精子在空气中暴露的时间。

摘要：目的 通过研究精液经不同年限冷冻后的冷冻复苏率,来探索长时间冷冻存储对冷冻复苏率的影响。方法 从精子库中随机取162例正常供精者标本进行解冻,标本按所保存的年限划分为8组:Ⅰ组为冻存0~1年组(n=11),Ⅱ组为冻存1~2年组(n=42),Ⅲ组为冻存2~3年组(n=16),Ⅳ组为冻存3~4年组(n=11),Ⅴ组为冻存4~5年组(n=16),Ⅵ组为冻存5~6年组(n=27),Ⅶ组为冻存6~7年组(n=25),Ⅷ组为冻存7~8年组(n=14)。解冻进行精液常规分析后,从数据库中调出冻存前精液常规分析结果,计算冷冻复苏率。结果ⅠⅧ组冷冻复苏率随保存年限的增加而呈下降趋势,I组与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组比较差异无统计学意义(P>0.05),但是Ⅰ组与Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 冷冻储存于液氮中的精液标本,短期内的冷冻复苏率无明显变化,但长期来看,保存时间越长,冷冻复苏率明显降低。