白蛋白mRNA

白蛋白mRNA（精选九篇）

白蛋白mRNA 篇1

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集商丘市第一人民医院2009年9月至2010年12月手术切除新鲜胃癌标本40例及远端正常胃黏膜组织40例作为对照,均经病理证实。患者术前均未接受化疗、放疗及免疫治疗, 年龄35～71岁,平均56.6岁;分化程度:高中分化腺癌21例,低分化腺癌19例;浸润深度:T1+T2 (侵及黏膜、下或肌层)8例;T3+T4(侵及浆膜层和侵出浆膜层)32例;淋巴结转移:无淋巴结转移者10例,有淋巴结转移者30例。

1.2 主要试剂KiSS-1羊抗人单克隆抗体购自美国公司DAKO公司, MMP-9兔抗人多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

Trizol试剂购自Sigma公司,一步法RT-PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。引物由北京赛百盛生物工程公司合成,引物序列如下:KiSS-1上游5′-ATG AAC TCA CTG GTT TCT TGG-3′,下游引物序列为5′-TCA CTG CCC CGC ACCTG-3′,产物为438bp; MMP-9基因上游引物序列为5′-GGT GGA CCG GAT GTT CCC-3′, 下游引物序列为5′-GCC CAC CTC TCC TCC-3′, 产物为300bp;β-actin为内参照物, 引物序列为5′-ACA CTGTGC CCA TCT ACG AGG-3′,下游引物序列为5′-AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT-3′,产物为621bp。

1.3 KiSS-1和MMP-9蛋白的免疫组织化学检测

采用SP法,KiSS-1和MMP-9多抗工作浓度均为1:100,DAB显色,苏木素复染,实验步骤按说明书进行。PBS代替一抗作为阴性对照。KiSS-1和MMP-9阳性显色均为棕黄色颗粒,主要位于肿瘤细胞胞质。参照文献[3],在高倍镜视野下(200×)随机取8～10个视野,计数棕黄色染色细胞所占的百分数,≥10%者为阳性,<10%者为阴性。

1.4 KISS-1和MMP-9基因的RT-PCR检测

每份冷冻标本取0.1g剪碎,加入1mL预冷的Trizol裂解液,充分匀浆,严格按Trizol RNA提取试剂盒说明书进行,所得的总RNA用分光光度计测定其浓度和纯度。RT-PCR反应条件:51℃×30min;94℃×2min,94℃×40s,KiSS-1为48℃×30s(MMP-9为61℃×30s),72℃×1min,共36个循环;72℃延伸10min。取5L扩增产物用15g/L琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪上成像及测定分析,以目的基因与内参条带的比值作为目的基因的相对含量。

1.5 统计学处理

应用SPSS 13.0行X2检验和t检验,检验水准a=0.05。

2 结果

2.1 食管鳞状细胞癌组织中KiSS-1和MMP-9蛋白的表达

见表1。

2.2 胃癌组织中KiSS-1和MMP-9mRNA的表达

见表2。

2.3 胃癌组织中KiSS-1和MMP-9蛋白和mRNA表达的相关性。

KiSS-1 蛋白和mRNA的表达与MMP-9蛋白和mRNA的表达均呈负相关性(P<0.05)。见表3, 4。

*:P<0.05。

rs=-0.381,P<0.05。

rs =-0.329,P<0.05。

3 讨论

KiSS-1 是LEE等[1]于1996年在黑色素瘤细胞株发现的一个新的肿瘤转移抑制基因,其蛋白又称KiSS-1肽,可与其受体GPR54结合引起一系列生理生化改变,从而抑制肿瘤转移。IKEGUCHI等[4]发现,伴有淋巴结转移的食管癌中KiSS-1基因的表达明显低于无淋巴结转移的食管癌,说明KiSS-1基因缺失与食管转移密切相关,KiSS-1可能起着抑制转移的作用。本研究结果显示胃癌组织中KiSS-1蛋白和mRNA 的表达均低于正常胃黏膜组织(P<0.05) ,并且其低表达与浸润深度及淋巴结转移有关(P<0.05) ,该结果提示KiSS-1不仅与食管癌的发生有关,还可能影响到食管癌的侵袭、转移能力。

MMP为一组Zn2+依赖性内肽酶, 几乎能降解细胞外基质的所有成分, 在肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用[5]。本研究结果也证实了上述观点。提示MMP-9在胃癌的浸润和转移过程中起重要作用,MMP-9的检测可成为评价胃癌恶性行为的生物学标志物。

本研究还显示,KiSS-1蛋白和mRNA的表达与MMP-9蛋白和mRNA的表达均呈负相关性。YAN等[6]研究发现KiSS-1基因对MMP-9的表达存在明显负调控作用,主要是通过使 HT-1080细胞胞质内抑制性蛋白kB含量增高,胞质中核因子kB(NF-kB)的核内转移受抑, 最终导致NF-kB与MMP-9启动子结合减少所致。

综上所述,KiSS-1可能是影响胃癌转移的众多基因之一,并且降低MMP-9的表达可能是其作用机制之一,但KiSS-1的确切功能和机制目前尚不完全清楚。了解KiSS-1抑制肿瘤浸润和转移的具体机制,可为肿瘤的预后评估及临床治疗提供理论依据。

摘要：目的 探讨肿瘤转移抑制基因KiSS-1及基质金属蛋白酶9(MMP-9)与胃癌侵袭、转移的关系。方法 采用免疫组织化学SP法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测40例胃癌及40例正常胃黏膜组织中KiSS-1及MMP-9蛋白和mRNA的表达情况,分析其与胃癌患者各临床病理特征的关系及二者的相关性。结果 胃癌组织中KiSS-1蛋白的阳性表达率(52.5%)低于正常胃黏膜组织(95.0%)(P<0.05),并且其低表达与肿瘤浸润深度和淋巴结转移密切相关(P<0.05)。胃癌组织中MMP-9蛋白的阳性表达率(77.5%)高于正常胃黏膜组织(52.5%)(P<0.05),并且其高表达与肿瘤浸润深度和淋巴结转移相关(P<0.05)。胃癌组织中KiSS-1 mRNA的阳性表达率及表达水平(57.5%,0.869±0.063)均低于正常胃黏膜组织(92.5%,1.103±0.152)(P<0.05),并且其低表达与肿瘤浸润深度和淋巴结转移密切相关(P<0.05)。胃癌组织中MMP-9 mRNA的阳性表达率及表达水平(75.0%,1.083±0.137)均高于正常胃黏膜组织(47.5%,0.902±0.035)(P<0.05),并且其高表达与肿瘤浸润深度和淋巴结转移密切相关(P<0.05)。KISS-1与MMP-9蛋白和mRNA的表达均呈负相关(P<0.05)。结论 KiSS-1的低表达和MMP-9的过表达可能与胃癌的浸润、转移有关。二者有望成为判定胃癌侵袭和转移能力的指标。

关键词：胃癌组织,KiSS-1,基质金属蛋白酶-9

参考文献

[1] Lee J H, Miele ME, Hicks DJ, et al.KiSS-1, a novel human malignant melanoma metastasis suppressor gene[J].J Natl Cancer Inst,1996, 88(23):1731-1737.

[2]Sun XM,Dong WG,Yu BP,et al.Detection of typeⅣcollage-nase activity in malignant ascites[J].World J Gastroenterol,2003,9(11):2592-2595.

[3]Hou YK,Wang Y,Cong WM,et al.Expression of tumor metasta-sis suppressor gene KiSS-1 and matrix metalloproteinase-9 inportal vein tumor thrombus of hepatocellular carcinoma[J].AiZheng,2007,26(6):591.

[4]IKEGUCHI M,YAMAGUCHI K,KAIBARA N.Clinical signifi-cance of the loss of KISS-1 and orphan G-protein-coupled re-ceptor(hOT7T175)gene expression in esophageal squamous cellcarcinoma[J].Clin Cancer Res,2004,10(4):1379-1383.

[5] Thorns V, W alter GF, Thorns C. Expression of MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-10 and MMP-11 in human astrocytic and oligodendroglial gliomas[J].Anti cancer Res,2003, 23(5A):3937.

mRNA差异显示方法研究进展 篇2

[关键词] DD-PCR 骨科学 研究

健康网讯:

马庆军 100083 北京医科大学第三医院骨科

党耕町 100083 北京医科大学第三医院骨科

宋国立 美国加州大学圣地亚哥分校骨科与生物工程系

哺乳动物细胞约有100?000个不同的基因，在一定时间、空间中仅有10%～15%的基因表达，这种表达受到严格调控[1]。运用mRNA 差异显示(differential display,DD)方法[2]，可将不同细胞类型或同一细胞在不同环境下表达的基因进行比较，从分子生物学水平上提供信息，这对理解细胞的生命过程极有帮助。该技术一经问世，立即得到广泛应用，但同时也遇到许多问题，所以Debouck[3]曾对该方法提出质疑。现将DD的研究进展简要综述如下。

一、DD方法基本原理

DD的基本原理是将具有可比性的细胞在某一条件下可表达的mRNA 群体通过逆转录方法变成相应的cDNA 群体，以此为模板，利用一对特殊引物，即3?anchor 引物和5?arbitrary引物，在一定条件下进行PCR扩增，得到与mRNA相对应的“标签”(tags)，然后用变性聚丙烯酰胺测序胶分析其差别，将有差别的基因克隆化，进一步分析其结构与功能。DD依赖三种技术：(1)mRNA逆转录技术;(2)以特定引物进行的`PCR技术;(3)DNA测序胶电泳技术。

二、DD方法的优点及其应用

用某一方法来寻找mRNA表达的差异，至少要满足下列要求：(1)在一定时间、空间里，每一个细胞约有15 000种mRNA表达，其中除少数属高丰度表达外，大量的属于低丰度表达，即要求使用的方法足以显示低丰度mRNA;(2)重复性要好;(3)实验过程中能够步步验证比较(side-by-side comparison);(4)得到的产物能代表相应的mRNAs或cDNAs，并能由此找到相应的cDNA 序列;(5)省时，简便易行。

既往对mRNA的比较研究中多用减数杂交方法[4](subtraction hybridization)，该方法灵敏，可显示低丰度RNA，但是步骤复杂，需时较长，而且在得到最终结果前无法步步验证对照比较，故不易重复，并且需要大量的RNA作起始研究材料。这一点对RNA来源不易者(如手术活检标本)极不利[5，6]。

DD的优点在于：(1)仅需0.2 μg总RNA作为起始材料;(2)可同时分析多组样品;(3)敏感性高，可检出低丰度mRNA;(4)实验周期短，约8天即可完成[7]，便于重复;(5)最突出的优点是实验过程中可步步验证比较。可简单地将DD的特点概括为“3SRV”，即“Simplicity，Sensitivity，Speed，Reproducibility，Versatility”。

DD方法因有上述优点，被广泛应用。例如：Musholt等[8]应用DD方法对手术切下的髓样甲状腺癌标本与局部转移的淋巴结进行了比较，发现了两个新的表达基因MDF-1和MDF-2，并认为这两个基因在髓样甲状腺癌的进展与转移中起了重要作用;Zuo等[9]研究溃疡

白蛋白mRNA 篇3

关键词 骨性关节炎 金属蛋白酶 软骨细胞

试剂、仪器及实验材料 

主要试剂：①化学试剂：碳酸氢钠、磷酸氢二钠、硫酸镁、考马斯亮兰、MTT、甘氨酸、Tris、SDS、TEMED、二甲基亚砜。②细胞培养试剂与培养板。③聚合酶链式反应（PCR）试剂：RNA提取试剂盒，RNA PCR相關试剂盒。主要仪器：（略）

实验材料：新西兰大白兔，鹿茸多肽，骨肽注射液。

实验方法

动物模型及分组：雄性新西兰白兔8只，3～5个月龄，体重2.5～3.5kg，平均2.85kg。按组间均衡一致的原则随机分为两组，每组4只。采用内侧副韧带、前后交叉韧带切断并切除内侧半月板Hulth骨性关节炎模型，实验组均行内侧副韧带、前后交叉韧带切断并切除内侧半月板；对照组仅行侧膝关节切开术，但不行前交叉韧带切断并切除内侧半月板术。

MTT法检测鹿茸多肽对软骨细胞生长的影响，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测软骨细胞分泌金属蛋白酶，RT-PCR法检测软骨细胞中金属蛋白酶mRNA表达。

统计学方法：均值间差异比较采用组间t检验，数据统计以（X[TX-]±S）表示。

结果与分析

鹿茸多肽对兔骨关节炎软骨细胞增殖的影响：10μg/ml、50μg/ml的鹿茸多肽均不影响软骨细胞的活性，而在72小时内100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml及1000μg/ml的鹿茸多肽对软骨细胞的增殖均有促进作用，与对照组有显著性差异（P<0.05、P<0.01）。依据实验原则（用量最小，疗效最好），判定100μg/ml为促进软骨细胞增殖的最佳药物作用浓度。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测软骨细胞分泌金属蛋白酶：金属蛋白酶1、3在正常、骨性关节炎软骨细胞及不同浓度鹿茸多肽作用软骨细胞分泌的胞外基质中未见异常表达。

RT-PCR法检测软骨细胞中金属蛋白酶mRNA表达实验结果：金属蛋白酶1、3在正常软骨细胞核酸中未见明显表达，而在骨性关节炎软骨细胞中其含量却出现高表达，并且在经鹿茸多肽、法滋隆作用后的骨性关节炎软骨细胞核酸中未见金属蛋白酶1、3表达。

讨 论

骨性关节炎中关节软骨进行性破坏和丧失的机制还不清楚，但其病理过程可划分为三个相互交叉的阶段，即软骨基质的改变，软骨细胞对组织损伤的改变，软骨细胞合成代谢衰退及软骨组织的进行性丧失［1］。可见，软骨细胞作为关节软骨中惟一一种细胞，其功能决定着骨性关节炎的转归，软骨细胞功能的异常是骨性关节炎变化的开始和关键［2］。软骨细胞发生损伤后，受损的软骨细胞发生变性，使软骨细胞细胞周期发生变化，细胞内合成调控机制发生改变，使正常软骨细胞代谢发生改变，增生修复与降解出现紊乱，最终导致骨性关节炎的发生。

鹿茸多肽对软骨细胞生长的影响［3］：本实验研究发现，低剂量鹿茸多肽促进软骨细胞增殖的作用并不明显，中、高剂量鹿茸多肽对骨性关节炎软骨细胞具有显著促进作用。

鹿茸多肽作用前后软骨细胞分泌到胞外基质及胞内产生的金属蛋白酶表达的比较：本实验发现，金属蛋白酶1、3在正常及骨性关节炎软骨细胞和鹿茸多肽作用后正常及骨性关节炎软骨细胞分泌的胞外基质中，均未见异常表达；而在骨性关节炎软骨细胞核酸中，金属蛋白酶1、3均出现高表达，并且在鹿茸多肽及法滋隆作用后骨性关节炎软骨细胞核酸中，金属蛋白酶1、3均受到明显抑制。出现此种现象的原因可能为：金属蛋白酶胞外分泌的含量低，或被金属蛋白酶抑制剂-1结合；缺乏细胞因子或生长因子的协同作用，细胞因子及生长因子对软骨细胞分泌功能及增殖的调节，是成熟个体软骨发育及维持内环境稳定的关键。根据细胞外刺激的不同，软骨细胞可被诱导，分别进行异化基质降解或同化基质形成的功能过程。

本研究提示，鹿茸多肽对兔骨性关节炎软骨细胞具有促进增殖作用，兔骨性关节炎软骨细胞直接分泌到胞外的金属蛋白酶（MMP-1、3）含量无差异，金属蛋白酶（MMP-1、3）在兔骨性关节炎软骨细胞核酸中高表达。可以推断，骨性关节炎软骨细胞细胞周期及细胞功能均发生改变，金属蛋白酶对骨性关节炎软骨基质的降解作用，可能是与骨性关节炎发病相关的细胞因子协同作用的结果；鹿茸多肽可能通过软骨细胞细胞核酸的金属蛋白酶的表达，进而调整病理性软骨细胞功能，使病理性软骨细胞向正常软骨细胞转化。

参考文献

1 郑召民，陈清汉.骨性关节炎血流动力学及代谢研究的现状和未来.河南医学研究，1994，3（2）：188-192.

2 J Bryan.Studies on donal cartilage strains Ⅱ selective effects of diffeveuf growth comditions.Experimental Cell Reseach，1988，52：327-337.

白蛋白mRNA 篇4

1 材料

试验动物为吉林大学种猪厂提供的体重为 (60±5) kg的健康“军牧1号”猪30头。

TRIzol Reagent, 购自Invitrogen公司;Prime ScriptTMRT-PCR试剂盒、p MD18-T载体, 购于Ta KaRa公司;Bio Spin Plasmid DNA miniprep Kit试剂盒, 购自Bio Flux公司。

根据Gen Bank中猪UCP3和GAPDH序列设计上、下游引物及探针, 由上海基康生物工程有限公司合成。

2 方法

2.1 试验动物分组与样品的采集

将30头“军牧1号”猪随机均分为5组, 对照组 (1组) 在 (21±2) ℃条件下饲养后屠宰;试验组 (2~5组) 分别在 (-10±2) 、 (-5±2) 、 (0±2) 、 (5±2) ℃低温条件下冷暴露2 h后屠宰。采集新鲜的颈部脂肪、骨骼肌和肝脏组织, 标记后放入液氮保存。

2.2 c DNA的制备

取1 g左右组织样品, 液氮研磨后采用TRIzol一步法提取总RNA。采用Prime ScriptTMRT-PCR试剂盒对符合要求的总RNA样品进行反转录。甲醛变形凝胶电泳检测总RNA完整性, 采用分光光度计检测总RNA的浓度及纯度。选择完整性好、OD260/OD280值介于1.8~2.2之间的样品用于进一步检测。

2.3 UCP3基因表达的测定

UCP3基因和内参基因GAPDH的引物及探针序列见表1。用p MD18-T载体构建基因重组质粒, 转化至大肠杆菌DH5α宿主菌, 经氨苄抗性筛选后, 用高纯度质粒小量制备试剂盒提取标准质粒, 用于构建标准曲线。根据1个样品的Ct值与其初始浓度的对数成反比, 将上述制备的质粒UCP3与GAPDH以10倍为梯度进行倍比稀释, 并分别制作标准曲线。使用实时荧光定量PCR仪进行荧光定量检测, 反应体系为Premix Ex TaqTM (2×) 12.5μL, 10μmol/L上游及下游引物各0.5μL, 探针1μL, c DNA 2μL, dd H2O8.5μL。反应条件:95℃预变性5 min;95℃变性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 共30个循环;72℃再次延伸5 min。设置无模板阴性对照 (NTC) 和无反转录酶阴性对照 (NRC) 作为质控。每个样品设3个重复, 根据测定的Ct值和标准曲线方程计算样品模板的初始拷贝数。

2.4 数据统计分析

试验数据采用SPSS 11.0统计软件进行单因素方差分析, 用LSD检验进行显著性分析。

3 结果

3.1 UCP3与GHPDH PCR扩增产物及质粒凝胶电泳检测结果

UCP3及其质粒的电泳图谱见图1, GAPDH和质粒电泳图谱见图2。UCP3片段大小为114 bp, GAP-DH为95 bp, 与预期大小相符, 表明质粒克隆成功。

1.UCP3;M.DL-2 000 Marker;2.UCP3质粒。

M.DL-2 000 Marker;1.GAPDH;2.GAPDH质粒。

3.2 标准曲线的制备

根据梯度质粒绘制标准曲线, 得出标准曲线的表达式。UCP3标准曲线表达式:Y=-3.349X+34.29 (R2=0.999 9) ;GAPDH标准曲线表达式:Y=-3.273X+29.87 (R2=0.999 9) 。式中:Y为Ct值, X为拷贝数的对数值。

3.3 猪各组织中UCP3 mRNA的表达 (见图3~5)

注:*表示差异显著 (P<0.05) , **表示差异极显著 (P<0.01) 。

注:*表示差异显著 (P<0.05) , **表示差异极显著 (P<0.01) 。

由图3~5可见:随着环境温度的降低, 骨骼肌和颈部脂肪组织中UCP3 mRNA水平呈逐渐升高的趋势。显著性检验结果表明, 5℃暴露2 h后骨骼肌中UCP3 mRNA水平显著高于对照 (21℃) (P<0.05) ;0℃暴露2 h后骨骼肌UCP3 mRNA水平极显著高于对照 (P<0.01) , 颈部脂肪组织UCP3 mRNA水平显著高于对照 (P<0.05) ;-5℃暴露2 h后骨骼肌和颈部脂肪组织UCP3 mRNA水平极显著高于对照 (P<0.01) ;-10℃暴露2 h后骨骼肌和颈部脂肪组织UCP3 mRNA水平极显著高于对照 (P<0.01) 。说明冷暴露可以提高肝脏组织中UCP3 mRNA表达水平, 但与对照组相比差异不显著 (P>0.05) 。

4 讨论

寒冷是高寒地区动物特别是新生动物的一种普遍的应激因素。寒冷应激可导致动物生长缓慢, 抗病性差, 严重者造成死亡, 使饲养业遭受重大损失, 这也是制约高纬度地区养殖业发展的重要限制因素之一。研究发现, 动物在急性冷应激时, 机体代谢率增加, 糖、蛋白质、脂肪分解代谢加强, 血液中外周代谢产物如游离脂肪酸 (FFA) 、葡萄糖及精氨酸等含量增加[3]。

非颤抖生热作用对于哺乳动物在环境骤变时, 如受到寒冷作用时, 对维持体温恒定具有重要的意义。UCP3作为一种位于线粒体内膜的质子转运载体蛋白, 可引起质子经线粒体内膜回漏增加, 使合成ATP所依赖的线粒体质子跨膜梯度降低, 造成氧化过程与ADP磷酸化过程解耦联, 从而使ATP合成效率下降, 质子所带有的能量以热的形式释放, 从而产生产热过程。UCP3是体内非颤抖产热的重要因素, 同时也是影响脂肪代谢调节的重要因子。

本试验结果表明, 在不同程度冷应激下, 肝脏组织中UCP3 mRNA表达的变化不是很明显, 而脂肪及骨骼肌中的表达量有了显著提高, -5, -10℃处理与常温对照相比差异极显著。这提示体内UCP3表达与冷应激反应有关。有研究表明, 体内UCP3表达与脂肪酸的氧化密切相关, 肌肉中增加脂肪酸的氧化可增加骨骼肌中的UCP3表达, 进而表现出肌肉产热作用[2]。在脂肪组织中, 刺激游离脂肪酸的氧化作用同样也可使UCP3表达增加[4], 而冷应激时机体动员脂肪组织, 使血液中游离脂肪酸浓度升高, 因此肌肉和脂肪组织中UCP3表达增加是对冷环境适应的结果。

在猪适应冷环境的过程中, 当血液中的葡萄糖消耗至一定程度时, 骨骼肌和脂肪组织中贮存的脂肪酸可以用于产热供能。脂肪酸的氧化分解为组织细胞提供重要能量来源。脂肪和其他组织酯解作用强导致血清中游离脂肪酸水平升高, 而血液中保持较高水平的游离脂肪酸可以为机体在低温下维持体热平衡提供充足的能源。而UCP3基因在这一过程中可能发挥重要作用。米玉玲等[5]认为, 骨骼肌脂肪酸氧化激活, 可以使乙酰辅酶A羧化酶浓度降低, 从而降低骨骼肌中丙二酸单酰辅酶A的浓度, 从抑制状态释放肉毒碱辅酶A转移酶1, 提高β氧化, 近而提高UCP3基因的表达[6]。这与冷应激条件下UCP3基因表达水平升高的过程类似。肝脏组织中UCP3 mRNA表达变化不明显, 其确切的机制有待于进一步研究。

V.Bezaire等[7]研究表明, 肌肉组织过表达UCP3时, 辅酶A和肉毒碱含量也升高, 证实UCP3利于肌肉中脂肪酸的氧化, 抑制能量耦联, 从而完成其调节脂类代谢的功能。UCP3基因缺失鼠冷暴露后, 体温明显低于正常鼠, 这也说明UCP3基因在冷适应过程中具有重要作用[8,9]。因此, 有必要深入研究UCP3基因表达调控机制, 探寻适宜的应对措施 (如营养调控、药物干预、育种策略等) , 进而为提高寒区动物养殖提供参考。

5 结论

冷应激能引起猪骨骼肌、颈部脂肪和肝脏中UCP3基因表达量升高, 骨骼肌和颈部脂肪UCP3基因响应程度比肝脏高。

摘要：为探讨不同冷刺激强度对猪解耦联蛋白3 (UCP3) mRNA表达的影响, 试验选择“军牧1号”猪30头, 随机均分成5组, 包括常温对照组和4个冷刺激组, 常温组在 (21±2) ℃饲养后宰杀, 冷刺激组在温度为 (-10±2) 、 (-5±2) 、 (0±2) 、 (5±2) ℃, 冷暴露2 h后迅速宰杀, 分别取颈部脂肪、骨骼肌和肝脏组织, 通过实时定量PCR方法检测各样品中的UCP3 mRNA表达水平。结果表明:冷刺激后猪UCP3在颈部脂肪、骨骼肌表达量升高, 温度越低UCP3基因表达量越高;冷刺激后肝脏组织UCP3基因表达水平提高, 但与对照组差异不显著 (P>0.05) 。说明UCP3在机体适应冷环境过程中具有重要的生物学作用。

关键词：解耦联蛋白3,冷应激,颈部脂肪,骨骼肌,肝脏

参考文献

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[5]米玉玲, 王安.低温高能饲粮对笼养产蛋白鸭生产性能及生化指标的影响[J].动物营养学报, 2003, 15 (1) :21-25.

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白蛋白mRNA 篇5

关键词：口腔鳞癌(OSCC),LATS2,RT-PCR,Western免疫印迹

口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤,其发生发展涉及多种基因的改变[1]。抑癌基因在口腔鳞癌中的表达与其恶性程度有关,抑癌基因表达失活后OSCC的恶性程度显著增加[2,3]。LATS2(large tumor suppressor hom log 2)基因属于拉特抑癌家族,作为肿瘤抑制因子,对于机体的肿瘤发生具有重要的抑制作用。本研究采取逆转录酶链聚合反应(RT-PCR)及Western免疫印迹技术,检测LATS2基因mRNA和蛋白在OSCC组织中的表达,探讨其在OSCC的发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2012-10~2014-08郑州大学第一附属医院57例OSCC患者肿瘤组织及12例正常口腔黏膜组织(口腔同时伴发其他黏膜疾病者不列入本实验),均经病理证实,且所有病例术前均未行放疗及化疗。其中男37例,女20例,年龄26~83岁,平均58.73岁。按组织学分化程度分为:鳞癌Ⅰ级31例,Ⅱ级19例,Ⅲ级7例;临床分期:Ⅰ~Ⅱ期27例,Ⅲ~Ⅳ期30例;其中24例有淋巴结转移,33例无淋巴结转移。设置12例正常口腔黏膜组织为对照组,其中男8例,女4例,年龄35~74岁,平均56.48岁。2组资料的性别及年龄差异均无统计学意义。所有组织均储存于-80℃低温冰箱中。本研究经医院伦理委员会批准和患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR

根据TRIZOL试剂说明书进行总RNA的提取。按照Ta KaRa Primescript II逆转录试剂盒说明书合成c DNA。琼脂糖凝胶电泳后进行凝胶成像分析。利用Image J软件对条带进行灰度、面积扫描,以β-actin作为内参照对LATS2 mRNA水平表达进行半定量。

1.2.2 Western blot

取100 mg组织在加入液氮的研钵中充分研磨,加入1 ml RIPA裂解液和10μl的PMSF,按照说明书提取组织总蛋白,BCA法测蛋白浓度。取30μg总蛋白进行凝胶电泳、电转、封闭,一抗及二抗孵育后,ECL化学发光显影。电泳条带经Image J软件处理,目的条带与内参照条带的比值代表目的蛋白的表达水平。

1.3 统计方法

应用SPSS 17.0统计软件分析,对口腔黏膜正常组织和OSCC的mRNA和蛋白表达量进行配对T检验。临床病理因素间的关系应用χ2检验。

2 结果

在口腔黏膜正常组织中,均检测到LATS2基因mRNA和蛋白的表达,而在OSCC组织中LATS2基因mRNA表达缺失率为52.6%(30/57),LATS2基因蛋白的表达缺失率为57.9%(33/57)。LATS2 mRNA的表达与患者肿瘤的分化程度及淋巴结转移明显相关(P<0.05);LATS2蛋白表达与患者肿瘤的分化程度及淋巴结转移明显相关(P<0.05),且两者均与患者的年龄、性别、临床分期无明显相关(P>0.05,表1)。而在57例OSCC中,出现有LATS2基因蛋白表达缺失的患者中大部分都存在有LATS2基因mRNA表达的缺失,两者明显相关(P<0.01,表2)。

注:χ2=21.508,r=0.614,P<0.01

3 讨论

近期的研究发现LATS2基因在心肌细胞的生长和死亡中具有一定的促进作用,但在调节心肌细胞大小中所起的作用却是抑制的[4]。LATS2蛋白定位于中心体,可通过多种细胞信号转导通路来调控细胞周期的转换。在调控过程中,LATS2通过抑制cdc2激酶的活性使细胞停滞于G2/M期、以及下调E/CDK2激酶的活性使细胞停滞于G1/S期共同抑制细胞的增殖,在中心体复制、维护有丝分裂等过程中起着重要的作用[5,6]。有研究人员[7]在卵巢肿瘤的研究中发现LATS2基因的低表达,同时发现LATS2启动子区域的高甲基化,认为LATS2的高度甲基化导致了LATS2基因表达的失活,继而引起了肿瘤的发生。我们在研究中发现OSCC中LATS2基因mRNA与蛋白的表达明显降低,且与OSCC的恶性程度及预后有关,因此认为LATS2的低表达或失活有可能打破抑制肿瘤发生机制的平衡,最终导致肿瘤的发生发展。

我们的研究结果显示LATS2的mRNA和蛋白的表达具有明显的相关性,并证实了LATS2的表达水平与口腔鳞癌的发生以及恶性程度的负相关趋势。因此LATS2有可能作为一个预测口腔鳞癌病情发展及指导临床治疗的标志之一。

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白蛋白mRNA 篇6

随着近年来对热休克蛋白(heat shock protein,HSP)研究的不断深入,它与肿瘤的关系日益受到重视,成为肿瘤研究者关注的热点领域。我们应用石蜡包埋组织进行的回顾性研究结果表明,食管鳞癌组织中HSP70高表达与淋巴结转移和预后密切相关[1]。为进一步探讨HSP70在食管鳞癌组织中的表达情况以及在食管鳞状上皮癌变过程中的可能作用,我们应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western Blotting的方法,取食管癌新鲜组织,分别从m RNA水平和蛋白水平对比研究了食管鳞癌组织和正常食管黏膜中HSP70的表达情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源

收集湖南省肿瘤医院2006年1~6月食管鳞癌新鲜组织33例。其中,男23例,女性10例,年龄42~74岁(平均57.2岁)。手术切除后立即于无菌状态下切取约0.5 cm×0.5 cm×0.8cm大小食管鳞癌组织(高分化癌13例,中分化癌12例,低分化癌8例)及相应远切端选取正常食管黏膜。标本取下后立即以液氮速冻并保存,RT-PCR和Western blotting检测备用。一部分标本用10%中性福尔马林固定,组织学诊断备用。

1.1.2 主要仪器

centrifuge 5804R型台式高速冷冻离心机和Biophotometer 6131紫外分光光度计由德国eppendorf公司生产;美国Forma Scientific公司超低温冰箱;转膜仪及电泳仪产自美国BIO-RAD公司;BIO-Tek instruments Inc产酶标仪;北京产紫外分析仪;北京产垂直电泳槽及水平电泳槽;美国Bio-Rad公司PTC-200梯度基因扩增仪;恒温循环箱产自北京博医康技术公司。

1.1.3 主要试剂

蛋白质提取及Western blot试剂:RIPA蛋白裂解液购自碧云天生物技术研究所;BCA蛋白测定试剂盒产自美国pierce公司;Hsp70鼠抗人单克隆抗体由美国Santa Cruz公司提供;辣根酶标记兔抗鼠Ig G产自丹麦DAKO公司;蛋白分子量marker由美国Fermentas公司提供;聚偏二氟乙烯膜(PVDF)购自美国Milipore公司。

RT-PCR试剂:Trizol、DEPC、逆转录试剂盒、d NTPs、Taq Plus DNA聚合酶均产自美国Invitrogen公司;引物合成由上海生工生物技术公司完成;Bio Basic Inc产琼脂糖;溴化乙锭(EB)产自美国Amresco公司。

1.2 方法

1.2.1 Western blot检测HSP70蛋白的表达

迅速从超低温冰箱中取出冻存的组织块,用匀浆器把组织研磨成粉末状,加入RIPA蛋白裂解液直至充分裂解;4℃离心3~5 min,吸取上清液,-70℃备用,并按照BCA蛋白测定试剂盒说明进行蛋白质浓度测定。按照分子克隆法灌制SDS变性聚丙烯酰胺凝胶,并点样于胶中电泳,电泳完毕后切取目的片段所在的胶条,电转移液中平衡后于PVDF膜以恒电压(15V)转膜45 min。转膜完毕后,4℃封闭过夜。加入Ⅰ抗(1∶200稀释的Hsp70鼠抗人单克隆抗体),4℃过夜。TBST洗膜后加II抗(1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠Ig G),室温孵育2 h,TBST及TBS洗膜。加DAB显色剂至内参照β-actin处出现明显条带后终止显色,扫描后保存结果。

1.2.2 R T-PCR测定HSP70m R N A表达

引物设计:HSP70的引物参照文献[2],并在基因库上进行核对无同源序列,引物序列上游5-'TTTGA-CAACAGGCTGGTGAACC-3',下游5-'GTGAA-GATCTGCGTCTGCTTGG-3',PCR产物大小为590bp;内参照选用管家基因β-actin,由引物设计软件Primer Premier 5.0自行设计,引物序列上游5-'AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3',下游5-'TCA CCTTCACCGTTCCAGTTT-3',扩增片段大小为150bp。所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

总RNA提取及测定:取-80℃组织块用研钵充分碾磨后,加1ml TRIzol提取液于EP管中彻底匀浆,参照TRIzol试剂盒说明书,用一步法抽提总RNA,-20℃冰箱保存。采用紫外分光光度法测定RNA纯度(A260/A280),琼脂糖凝胶电泳,观察28S、18 S、5 S条带的宽度和亮度,以判断RNA有无降解。

逆转录反应及PCR反应:取上述提取的总RNA 2μL,加入Olig(d T)18(0.5μg/μL)1μL,5×buffer 4μL,10mmol的d NTPs 2μL,20u/μL RNasin 11μL,200 U/μL M-MLV(鼠原性逆转录酶)1μl及DEPC达总体积20μL,混匀,42℃恒温水浴中逆转录60 min,70℃加热10 min终止反应后置-70℃保存。取合成的c DNA模板1μL,加入10mmol d NTP 0.5μL,25 m M Mg Cl22μL,10×Taq Buffer2.5μL,5 U/μL Taq酶0.5μL,20μM目的基因和内参照引物各0.2μL及DEPC水18.4μL达反应体系总体积25μL,充分混匀后95℃5 min预变性,再经94℃50 s变性→58℃45 s退火→72℃40s延伸34循环后,72℃终末延伸10 min,4℃保存。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,溴乙锭染色,紫外光分析仪上观察,结果照相并保存。

1.2.3 结果判定

用Image Tool 3.0软件对Western Blot条带及m RNA电泳条带进行定量分析,确定杂交条带的灰度值;再以β-actin条带的灰度值作内对照进行校正,分别计算出各样本的蛋白质及m RNA相对表达量。计算方法为:目的蛋白质(m RNA)相对表达量=目的蛋白质(目的基因m RNA)条带灰度值/β-actin蛋白(β-actin m R-NA)条带灰度值。

1.3 统计学处理

应用SPSS 11.0统计软件进行统计分析。两组间均数比较,采用t检验;HSP70基因表达与临床病理参数间的分析采用Fisher确切概率法,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HSP70在食管鳞癌组织和正常食管黏膜组织中的表达分析

Western Blotting结果,见图1,显示HSP70蛋白表达产物大小为70 KD,内参照β-actin为42KD。33例正常食管黏膜和食管鳞癌组织中HSP70蛋白表达阳性率分别为45.5%(15/33)和93.9%(31/33),差异有统计学意义(P<0.001)。与正常食管黏膜组织相比较,表达升高的26例,占78.8%,表达无明显差异的5例,占15.1%,表达降低的2例,占6.1%。

RT-PCR产物电泳后可见特异性条带,与分子量Marker比较可知为590 bp的目的基因HSP70和150 bp的内参照β-actin基因。每个泳道β-actin的条带基本一致,而不同泳道之间HSP70的条带明显不同,见图2。RT-PCR结果显示:在33例正常食管黏膜组织中,有10例未检测到HSP70基因m RNA的表达,其余23例均检测到HSP70基因m RNA的不同程度的表达,阳性率为69.7%(23/33);在33例食管鳞癌组织中均检测到HSP70基因m RNA不同程度的表达,阳性率为100%(33/33),差异具有统计学意义(P=0.001)。食管鳞癌组织和正常食管黏膜中的HSP70 m RNA的相对表达量分别为(1.35±0.21)和(0.73±0.19)。食管鳞癌组织和正常食管黏膜相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.2 HSP70表达与食管鳞癌临床病理参数的相关性分析

根据上述的检测结果,分析HSP70基因蛋白表达水平与食管鳞癌临床病理特征的相关性,统计分析结果发现HSP70基因蛋白水平的表达与患者的年龄、性别、以及侵犯深度无关,但与淋巴结转移相关(P=0.033),此结果提示:HSP70基因可能参与了食管鳞癌的淋巴结转移,见附表。

注:覮低表达组指与正常食管黏膜组织比较,HSP70表达水平相同或者降低

3 讨论

HSP之所以被称作热休克蛋白,是因为它们首先在处于高温环境的细胞中被发现的。但是后来研究证实它们的合成受很多因素的影响,如感染、氧自由基、缺血、中毒以及恶变等状况下均可诱导细胞表达HSPs。肿瘤的环境状况是缺氧、酸中毒和营养缺乏等,这些因素均可诱导肿瘤细胞表达HSPs[3]。在正常细胞中HSPs的表达是受细胞周期调控的,但是在肿瘤细胞中HSPs的表达不需要应激。在肿瘤形成过程中,肿瘤细胞不断增殖,合成代谢增强,产生大量的异常蛋白,这些变性的或不正常的蛋白质的存在刺激HSPs的大量合成,使其呈现持续的高诱导表达[4]。

本组实验发现,HSP70 m RNA和蛋白在食管鳞癌新鲜组织中的阳性率分别为100%和93.9%,显著高于正常黏膜组织的69.7%和45.5%,并且在食管鳞癌组织中的表达强度也明显高于正常黏膜组织,说明癌变后细胞内HSPs的合成增加。

HSP70的高表达能与多种原癌基因(c-fos、c-myc、scr、raf等)相互作用,与癌基因产物结合形成HSP70-癌蛋白复合物,介导癌蛋白构象成熟及转运,维持癌蛋白结构与功能的完整,从而参与细胞的转化[5,6]。目前的研究表明[7],HSP70与突变p53的结合在调控p53功能方面起着重要作用。作为最重要的伴侣分子,HSP70可使p53构象稳定,以保护p53免受蛋白酶的降解,并参与p53的胞质装配及核转运;HSP70还可使p53在胞质中的半衰期延长,导致p53在胞奖积聚;突变p53的构象改变暴露出结合HSP70的高亲和力位点,亦可能使p53在胞质积聚,胞核中HSP70与p53结合DNA结构域结合,封闭p53结合DNA的功能,使p53失去调控蛋白的作用,从而促进肿瘤的增殖。同时,HSP70的高表达增强了肿瘤细胞抗凋亡能力,减弱了细胞的生长抑制效应。WU等[8]研究结果显示HSP70可能通过与Bcl-2,Bcl-XL,Cr-m A等抗凋亡蛋白协调作用、下调凋亡相关基因、蛋白和蛋白酶如SAPK/JNK和胱冬肽酶等的活性,从而达到拮抗细胞凋亡的作用。王莉[9]等发现肿瘤细胞中过量的HSP70抑制了p38MAPK的激活,是使肿瘤细胞得以持续恶性增殖的机制之一。

笔者在这部分的研究中同时发现,HSP70的表达与淋巴结转移相关,这与笔者先前的研究结果一致[1],也与国内外学者的研究结果一致[10,11],提示HSP70可能通过某种机制参与了食管鳞癌的淋巴结转移,并与食管鳞癌的预后有一定关系。但是目前关于HSP70与淋巴结转移的关系存在不同观点[12,13]可能是由于癌组织来源或组织学类型不同,或是HSP70在不同肿瘤中的作用不尽相同,还有待于进一步的研究。

总之,本部分通过采用RT-PCR和Western Blotting技术检测发现HSP70 m RNA和蛋白在食管鳞癌中表达与食管正常黏膜相比明显升高,提示HSP70 m RNA在食管鳞癌中有不同程度的表达增加,HSP70参与了食管鳞癌的的发生、发展过程。笔者也在随后的研究中证明了HSP70反义寡核苷酸能抑制Eca-109细胞的生长并诱导其发生凋亡[14],这为将来HSP70用于食管鳞癌的生物治疗提供了一定的理论依据。

白蛋白mRNA 篇7

1 资料与方法

1.1 一般资料

购买由陕西超英生物科技有限公司生产的结直肠癌组织芯片标本共90例 (实验组) , 正常结直肠组织芯片70例 (对照组) 。另选择2009年11月-2013年2月手术治疗的原发性结直肠癌患者90例, 男52例, 女38例;年龄20~75岁, 中位年龄53岁;其中<55岁共43例, ≥55岁共47例;直肠癌37例, 结肠癌53例;肿瘤TNM分期:Ⅰ期12例, Ⅱ期48例, Ⅲ期24例, Ⅳ期6例;分化程度:高分化63例, 中低分化27例。所有标本均经组织病理学检查证实为结直肠癌。

1.2 实验方法

1.2.1 实验仪器

Santa Cruz公司生产的人重组PTN细胞因子、PTN单克隆抗体以及PTN多克隆抗体;西安沃尔森生物科技有限公司生产的原位杂交试剂盒、碱性磷酸酯酶显色试剂盒、免疫组化试剂盒及无水乙醇;上海生工生物工程有限公司制造的PTN探针;浙江临安电子器材厂制造的YWY781型医用微波仪;德国Leica光学显微镜。

1.2.2 PTN m RNA检测

原位杂交法: (1) 二甲苯脱蜡处理石蜡切片, 1 g/L蛋白酶K作用15 min;双蒸水洗1 min后用无水乙醇洗2 min, 吹干。 (2) 预杂交:预杂交液 (50μL) 滴加在切片上, 置于42℃恒温箱孵育30 min, 去除预杂交液。 (3) 杂交:杂交液 (20μL) 滴加在切片上, 硅化盖玻片盖好后放置在37℃湿暗盒中24 h。 (4) 免疫检测:0.5 m L Buffer1清洗2 min后, 滴加30μL浓度为0.1 mol/L中性盐溶液和10%聚乙二醇辛基苯基醚, 再滴加1.0 m L Buffer1, 室温孵育30 min, 滴加15μL浓度为0.1 mol/L的NSS和45μL 10%Triton X-100, 滴加Buffer1到1.5 m L, 同时滴加50μL抗地高辛抗体, 室温下孵育2 h;Buffer1清洗2次后Buffer3清洗, 光学显微镜下, 在暗盒内监控显色反应程度, 细胞浆染色与细胞外背景表现为明显差异时用Buffer4终止反应; (5) 核固红衬染5 min, 脱水后以中性树胶封片。PTN探针序列:地高辛标记3′端, 锁核酸修饰中部“ (T) ”的碱基。阴性对照使用PBS替代杂交液。

1.2.3 PTN蛋白检测

免疫组化染色法:参照文献[5]采用微波-Eli Vision TM法进行操作。阳性对照为PTN蛋白阳性表达的直肠癌组织, 阴性对照为PBS代替一抗。

1.3 评价标准

参照文献[5]对原位杂交及免疫组化染色结果进行评价。 (1) PTN探针杂交阳性:细胞质和细胞核中发现浅蓝色至深蓝色颗粒。每张切片随机选择5个高倍视野进行测定平均阳性反应面积。阴性:阳性面积≤20%;阳性:阳性面积>20%。 (2) 免疫组化染色阳性:细胞浆内发现浅棕至深棕色颗粒。随机选取5个高倍视野, 计算平均阳性染色细胞率。阴性:阳性染色细胞率<5%;弱阳性:阳性染色细胞率5%~25%;阳性:阳性染色细胞率25%~50%;强阳性:阳性染色细胞率>50%。 (3) 染色强度计分:不着色:1分, 淡黄色:2分, 浅棕色:3分, 深棕色:4分。两种计分相乘后, 乘积值依次对应0、2、6及12分, 0和2为阴性, 6和12为阳性。

1.4统计学处理

应用SPSS 16.0统计学软件对数据进行处理, 计量资料以 (±s) 表示, 比较采用t检验, 计数资料应用X2检验, 以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTN m RNA及其蛋白表达结果

两组组织芯片均能够发现PTN m RNA表达 (图1、图2) 。PTN m RNA在正常结直肠组织中主要在黏膜上皮细胞表达, 而结直肠癌组织中, 主要在肿瘤细胞细胞质, 呈弥漫性或灶性分布。PTN蛋白在正常结直肠组织中在正常腺体细胞的细胞浆进行表达 (图3) ;而在结直肠癌组织中, 不仅表达于结直肠癌细胞, 在血管内皮细胞中也可表达 (图4) 。

2.2 两组PTN m RNA及其蛋白阳性表达率比较

实验组PTN m RNA阳性表达率为62.2%, PTN蛋白阳性表达率为58.9%, 对照组分别为41.4%、34.3%, 两组比较差异均有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。

2.3 PTN m RNA及蛋白表达与临床病理的关系

通过观察结直肠癌组织中PTN m RNA及其蛋白的表达情况, 结果表明, 年龄、性别及肿瘤类型对PTN m RNA及其蛋白无显著影响 (P>0.05) ;而TNM分期、分化程度与PTN m RNA及其蛋白阳性表达率有显著关系 (P<0.05) , 见表2。

3 讨论

结直肠癌是临床高发恶性肿瘤之一, 目前手术治疗是其主要的治疗方法, 但治疗效果较差。TNM分期及肿瘤分化是临床上预测结直肠癌预后的主要依据, 也是进行放化疗的主要参考指标。PTN基因主要分布在7q33~q34, 其长度超过100 kb, 由5个外显子和1个非翻译的外显子组成, PTN编码氨基酸的蛋白质共有168个, 其中包含信号肽 (32个氨基酸共同组成) , PTN基因种属不同呈现出高度保守的特点, PTN是已知的生长因子中最保守的基因之一[4,6]。研究发现, PTN与肿瘤的发生发展具有密切关系, 能够为肿瘤预后提供参考依据[7,8,9]。本实验结果显示, 与正常结直肠组织相比较, 结直肠癌组织的PTN m RNA阳性表达率和PTN蛋白阳性表达率显著升高 (P<0.05) ;TNM分期不同、分化程度不同, PTN m RNA及其蛋白阳性表达存在显著性, 即分期越晚, 分化程度越高, PTN m RNA及其蛋白阳性表达率越高, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。PTN是分泌性生长、分化因子, 与肝素具有高度亲和作用, 能够促进血管生成、改善神经系统及骨发育情况, 增强细胞增殖与迁移, 在肿瘤患者中, PTN能够对V-sis原癌基因转化细胞、子宫细胞DNA合成、内皮细胞和成纤维细胞有丝分裂起促进作用[9]。

例 (%)

目前有研究利用流式细胞术证实PTN显性失活, 神经胶质瘤细胞恶性表型能够逆转, 细胞周期减慢, 提示PTN对染色体分离及细胞周期具有重要调控作用。也有研究发现大脑室管膜下层处于发育中的神经胶质母细胞及室管膜细胞可检测到PTN m RNA, 提示PTN对大脑神经、血管具有重要作用[9,10]。

综上所述, PTN与结直肠癌的恶化程度具有密切关系, 监测结直肠癌患者PTN表达有利于正确判定结直肠癌患者预后。

摘要：目的:探讨结直肠癌组织中多效生长因子 (PTN) mRNA及其蛋白的表达情况及临床意义。方法:购买结直肠癌组织芯片标本90例 (实验组) , 正常结直肠组织芯片70例 (对照组) , 采用原位杂交和免疫组化染色方法, 检测两组PTN mRNA及其蛋白的表达;另选择2009年11月-2013年12月手术治疗的原发结直肠癌患者90例, 分析PTN mRNA及其蛋白表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系。结果:实验组PTN mRNA阳性表达率为62.2%, PTN蛋白阳性表达率为58.9%, 与对照组比较差异均有统计学意义 (P<0.05) ;不同年龄、性别及不同肿瘤类型之间, PTN mRNA及其蛋白表达差异无统计学意义 (P>0.05) ;不同TNM分期和不同分化程度, PTN mRNA及其蛋白阳性表达差异具有统计学意义 (P<0.05) 。结论:PTN mRNA及其蛋白与肿瘤分期和分化程度有密切关系, 可作为判断结直肠癌预后的参考依据。

关键词：多效生长因子,PTN蛋白,结直肠癌组织

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白蛋白mRNA 篇8

1 材料与方法

1.1 材料

检测组织均为10%中性福尔马林固定, 石蜡包埋, HE染色, 光镜观察确诊。标本来源于遵义医学院第一附属医院和第五附属医院病理科。10例正常皮肤表皮取自临床手术切除的带有正常皮肤组织的病变标本;15例皮肤病理性瘢痕上皮病例临床有皮肤烧伤、烫伤或机械性创伤等损伤史, 形成瘢痕的时间为数月至数年不等, 病变部位有胸部、大腿、小腿等处;25例瘢痕癌病例临床有瘢痕形成史, 病变部位有头面部、上肢、下肢等处, 组织学类型均为鳞状细胞癌, 从瘢痕形成到癌变的时间为1~20年不等。

1.2 主要试剂

鼠抗人Cyclin A单克隆抗体、即用型SP免疫组织化学试剂盒及DAB、AEC显色试剂盒均购自福州迈新公司;兔抗人Cyclin D1多克隆抗体、人Cyclin A m RNA寡核苷酸探针原位杂交试剂盒、人Cyclin D1m RNA寡核苷酸探针原位杂交试剂盒, 购自武汉博士德公司;DEPC购自美国Sigma公司。

1.3 实验方法及步骤

1.3.1 组织切片

石蜡包埋标本, 4μm厚连续切片4张, 捞片于处理过的防脱片上, 60℃烤干, 4℃保存备用。

1.3.2 免疫组织化学法

(SP法) Cyclin A、Cyclin D1分别用乳腺癌、结肠癌组织切片作阳性对照, 阴性对照均用PBS代替一抗。切片脱蜡至水, 微波修复抗原, 按试剂盒说明书进行操作, DAB显色, 苏木素复染, 二甲苯透明, 中性树胶封片, 光镜观察。

1.3.3 原位杂交法

Cyclin A m RNA、Cyclin D1m RNA分别用乳腺癌、结肠癌组织切片作阳性对照, 阴性对照用预杂交液代替探针。切片脱蜡至水, 微波修复抗原, 按试剂盒说明书进行操作, Cyclin A m RNA DAB显色, 苏木素复染, 二甲苯透明, 中性树胶封片, 光镜观察。Cyclin D1 m RNA在37℃的烤箱中经AEC显色, 水溶性封片剂封片, 光镜观察。

1.4 免疫组织化学法标记及原位杂交结果判断标准

1.4.1 表达部位

DAB显色:Cyclin A以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞, 部分出现胞质阳性表达;Cyclin A m RNA以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞;Cyclin D1以细胞质/细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞。AEC显色:Cyclin D1 m RNA以细胞质/细胞核出现红色颗粒为阳性细胞。

1.4.2 阳性判断标准

采用半定量积分法, 根据每张切片的阳性细胞百分数和染色强度计分的乘积来判定。每例切片在高倍镜 (400倍) 下随机取10个视野, 计数100个细胞/视野, 分别记录每个视野的阳性细胞数并计算其算术平均值, 对阳性细胞所占百分比计分 (<5%=0分, 5%~25%=1分, 26%~50%=2分, 51%~75%=3分, >75%=4分) ;染色强度计分 (无色=0分, 淡黄色=1分, 棕黄色=2分, 棕褐色=3分) ;阳性表达评分标准以阳性细胞数和染色强度计分的乘积来判定[3], 根据阳性细胞百分数和染色强度得分的积分为4个等级:0~2分为阴性 (-) , 3~5分为阳性 (+) , 6~8分为中度阳性 (++) , 9~12分为强阳性 (+++) 。≥6分为高表达, <6分为低表达。

1.4.3表达水平和强度判断

采用CCD成像系统, 在200倍光镜下每张切片随机选取5个不同视野成像, 应用显微图像分析系统分别检测阳性染色的表达水平 (即阳性面积代数与分析区域面积的比值, 值越大, 阳性表达水平越高) 和表达强度 (即平均光密度值, 值越大, 阳性表达强度越高) [4], 各取平均值, 最后进行统计学分析。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行分析, 图像分析所得实验数据用均数±标准差 (±s) 表示, 对实验结果进行单因素方差分析, 两两比较采用最小显著差异法 (LSD) , 相关性分析采用Pearson、Spearman等级相关, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Cyclin A、Cyclin D1蛋白的表达

Cyclin A、Cyclin D1蛋白的阳性信号呈棕黄色, 均质状, 主要定位于细胞核或细胞质。在正常皮肤表皮中, 两种蛋白呈阴性表达, 仅在基底层有极少数阳性细胞。在皮肤病理性瘢痕上皮, 两种蛋白呈弱阳性或阳性表达, 且阳性细胞数较正常上皮有所增多。在瘢痕癌中, 两种蛋白呈强阳性表达 (见图1~6) 。皮肤瘢痕癌组织与皮肤病理性瘢痕上皮、正常皮肤表皮中两种蛋白的表达水平 (阳性面积) 、表达强度 (平均灰度值) 比较, 差异均有统计学意义 (Cyclin A:FA=14.917, FG=10.029, P<0.01) (Cyclin D1:FOD=63.596, POD=0.000<0.05;FPA=131.768, PPA=0.000<0.05) , 但皮肤病理性瘢痕上皮与正常皮肤表皮的表达水平、表达强度比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表1。

2.2 Cyclin A m RNA、Cyclin D1 m RNA的表达

Cyclin A m RNA用DAB显色, 阳性信号呈棕黄色, 均质状, 位于细胞质。Cyclin D1 m RNA用AEC显色, 阳性表达信号呈红色, 颗粒状, 主要定位于细胞质或细胞核。在正常皮肤表皮中的表达呈阴性或弱阳性, 在皮肤病理性瘢痕上皮中呈阳性, 皮肤瘢痕癌组织中呈强阳性 (见图7~12) 。正常皮肤表皮和皮肤瘢痕癌组织中两种m RNA的表达 (表达水平、表达强度) 比较, 差异均有统计学意义 (Cyclin A m RNA:FA=5.059, FG=10.418, P<0.05) (Cyclin D1m RNA:FOD=49.837, POD=0.000<0.05;FPA=106.728, PPA=0.000<0.05) , 皮肤瘢痕癌、皮肤病理性瘢痕上皮中两种m RNA表达比较, 差异有统计学意义 (P<0.05, P<0.01) , 正常皮肤表皮和皮肤病理性瘢痕上皮中Cy clin A m RNA表达比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表2。

2.3 相关性分析

经过Pearson相关分析, 瘢痕癌中Cyclin A与Cyclin A m RNA的表达呈正相关 (r=0.593, P=0.001) , Cyclin D1与Cyclin D1 m RNA的表达亦呈正相关 (r=0.628, P=0.000<0.01) 。

注:PA代表阳性面积代数和/分析区域面积的比值, OD代表平均光密度。1) 与正常皮肤表皮组比较, P<0.01;2) 与皮肤病理性瘢痕上皮组比较, P<0.01

注:PA代表阳性面积代数和/分析区域面积的比值, OD代表平均光密度。1) 与正常皮肤表皮组比较, P<0.05;2) 与皮肤病理性瘢痕上皮组比较, P<0.05;3) 与正常皮肤表皮组比较, P<0.01;4) 与皮肤病理性瘢痕上皮组比较, P<0.01

3 讨论

本研究从蛋白水平和分子水平对正常皮肤表皮、皮肤病理性瘢痕上皮和瘢痕癌组织中Cyclin A及其m RNA和Cycin D1及其m RNA进行了检测和分析。研究结果具有以下特点: (1) 各项指标在正常皮肤表皮和皮肤病理性瘢痕上皮中的表达很弱, 而且没有统计学意义, 仅仅在阳性细胞的数量上稍有不同, 即皮肤病理性瘢痕上皮中阳性细胞数较正常皮肤表皮略显增多。 (2) 各项指标在瘢痕癌组织中呈强阳性表达, 与正常皮肤表皮组和皮肤病理性瘢痕上皮组比较, 具有统计学意义。经相关性分析, 各项检测指标的表达均呈正相关关系。

Cyclin A是一种细胞周期的正性调控因子, 在G1晚期到有丝分裂期均有表达。它的正常表达是保证细胞S期、G2/M期进程顺利完成的主要因子, 代表着细胞正常的增殖活性。近年来发现, 多种人类肿瘤有Cyclin A的扩增或过度表达, 它的异常表达与细胞的增殖、肿瘤的发生有极其重要的关系[5]。文献报道, 在肝癌、结直肠癌、白血病、乳腺癌等多种恶性肿瘤中存在Cyclin A的异常表达, 其异常表达不仅与肿瘤的发生、发展有关, 且与肿瘤患者的预后有关系[6]。本组研究结论与之相同, 在瘢痕癌中Cyclin A无论在蛋白水平还是在分子水平都存在异常高表达, 提示Cyclin A与瘢痕癌的发生密切相关。研究表明, 在整个细胞周期过程中表达的Cyclin A可持续性激活CDK2磷酸化的底物, 直接或间接地释放过量的转录因子 (如B-Myb、E2F等) , 促进G1/S期转换, 启动DNA合成;同时促使细胞由G2期进入M期, 使细胞周期G2/M转换时间缩短, 进而导致细胞周期的循环加速和细胞过度增殖, 最终导致细胞癌变[7]。

Cycin D1也是一种细胞周期的正性调控因子, 是一种癌基因, 其异常表达与肿瘤关系密切[8,9]。在某些血液系统肿瘤、消化系统肿瘤、生殖系统肿瘤等研究中, 都认为Cycin D1的异常表达与肿瘤的发生有相关性。在皮肤肿瘤的研究中, 认为Cyclin D1多在鳞状细胞癌、恶性纤维组织细胞瘤、恶性黑色素瘤和基底细胞癌中有表达。本组研究的皮肤瘢痕癌 (鳞状细胞癌) 中, Cyclin D1呈明显异常高表达, 提示Cyclin D1与瘢痕癌的发生密切相关。研究表明, Cyclin D1的异常表达, 与CDKs结合, 使视网膜母细胞瘤易感因子发生磷酸化, 其构象发生改变而与转录活化因子E2F分离, E2F被释放而发挥转录因子效应, 促进细胞增殖, 抑制细胞凋亡而癌变, 导致肿瘤的发生[10]。

综上所述, 肿瘤的发生与细胞异常增生和细胞的凋亡抑制密切相关, 细胞周期蛋白作为细胞周期调控的正性调节蛋白, 其基因和编码蛋白的异常, 促进肿瘤细胞异常增生, 在肿瘤的发生、发展中扮演着重要角色。所以, 检测肿瘤组织中细胞周期蛋白的表达, 对全面阐述细胞周期蛋白与肿瘤的关系有重要意义。

摘要：目的 探讨Cyclin A、Cyclin D1蛋白及其mRNA在皮肤病理性瘢痕上皮、瘢痕癌组织中的的表达及意义。方法 以皮肤病理性瘢痕上皮、皮肤瘢痕癌组织为研究对象, 以正常皮肤表皮组织为对照。采用免疫组织化学方法 (SP法) 分别检测Cyclin A、Cyclin D1蛋白的表达, 采用核酸分子原位杂交法检测Cyclin A mRNA、Cyclin D1 mR NA的表达, 结合图像分析, 分别观测正常皮肤表皮、皮肤病理性瘢痕上皮、瘢痕癌组织中检测指标的表达强度和表达水平。运用SPSS 16.0对数据进行统计学处理。结果 ①Cyclin A、Cyclin D1蛋白在正常皮肤表皮为阴性, 在皮肤病理性瘢痕上皮呈弱阳性表达, 在瘢痕癌组织中呈强阳性表达。正常皮肤表皮与皮肤病理性瘢痕上皮中的表达比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 两者与瘢痕癌组织比较, 差异均有统计学意义 (P<0.01) 。②Cyclin A mR NA、Cyclin D1 mR NA在正常皮肤表皮呈阴性表达, 在病理性瘢痕上皮中呈弱阳性表达, 在瘢痕癌组织中呈强阳性表达。瘢痕癌组的表达与正常皮肤表皮组及皮肤病理性瘢痕上皮组相比较, 差异均有统计学意义 (P<0.01) ;但正常皮肤表皮组与皮肤病理性瘢痕上皮组相比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。③相关分析显示, Cyclin A与Cyclin A mRNA, Cyclin D1与Cyclin D1 mRNA在皮肤瘢痕癌组织中的表达均呈正相关 (P<0.01) 。结论 在瘢痕癌中, Cyclin A、Cyclin D1存在蛋白水平和分子水平的异常表达;其高表达可能与皮肤瘢痕癌的发生有关。

关键词：细胞周期蛋白,瘢痕癌,病理性瘢痕上皮

参考文献

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白蛋白mRNA 篇9

前期研究表明, 中药复方糖痹康具有抗氧化应激, 保护DPN大鼠坐骨神经的作用[7]。本实验在前期研究基础上, 观察糖痹康对DPN大鼠II相代谢酶GCLc和GST pi蛋白与m RNA的影响, 探讨糖痹康对DPN大鼠坐骨神经保护作用机制。

1 材料与方法

1. 1 实验动物

SD大鼠, 4 周龄, 雄性, 60 只, 体质量 ( 100 ± 20) g, 由北京维通利华动物实验中心提供, 动物生产许可证号: SCXK ( 京) 2004-0009。

1. 2 药品制备

糖痹康 ( 黄芪15 g、女贞子10 g、桂枝9 g、赤芍9 g、黄芩5 g、黄连3 g、水蛭1 g、鸡血藤15 g、醋制延胡索5 g) 由北京中医药大学中药学院提供; α-硫辛酸 ( alpha-lipoic acid, ALA) , 由德国史达德大药厂提供, 进口药品注册证: H20110104。

1. 3 试剂及仪器

高脂饲料, 购自北京科奥协力饲料有限公司;链脲佐菌素 ( streptozotocin, STZ, 美国, sigma) ; 罗氏血糖仪 ( 罗氏, ACCU-CHEK) ; BL-420S生物机能换能系统 ( 成都泰盟科技有限公司) ; 紫外分光光度计eppendorf ( 德国Biophotometer) ; 电泳后用半干转电转印仪 ( 美国Bio-Rad Trans-Blot SD) ; PVDF膜上 ( 德国, 默克微孔) ; 一抗: 兔来源的单克隆抗体GCLc ( 美国Abcam公司, 货号: ab190685, 批号:GR175654-1) , 兔来源的单克隆抗体GST pi ( 美国Abcam公司, 货号: ab138491, 批号: GR100476-11 ) ;二抗: 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔Ig G ( 北京中杉金桥生物技术有限公司, 货号: ZB-2301, 批号:109525) ; Trizol试剂盒 ( 美国Invitrogen公司) ; 核酸紫外分光光度计 ( 德国Biophotometer公司) ; M-MLV反转录试剂盒 ( 日本Takara公司) ; PCR引物 ( 生工生物工程 ( 上海) 有限公司) ; Oligo ( d T) ( 购自Takara公司, 日本) ; d NTP ( 日本Takara公司) ; DNA Marker ( 日本Takara公司) ; SYBR mix ( 瑞士Roche公司) ; Real-Time PCR仪 ( 美国ABI公司)

1. 4 模型建立与分组

雄性SD大鼠60 只, 适应性喂养1 周后, 随机选取10 只作为正常组, 予普通饲料喂养, 余鼠给予高脂饲料连续喂养, 4 周后腹腔注射STZ35 mg / kg造糖尿病大鼠模型。72 小时后用罗氏血糖仪测大鼠尾尖血随机血糖, 将两次随机血糖水平> 16. 7 mmol / L且血糖水平稳定3 天者视为造模成功, 按体质量和血糖水平随机分为模型组、ALA组、糖痹康高、中、低剂量组, 每组各10 只, 其中ALA0. 0268 g / ( kg·d) 组腹腔注射, 糖痹康高2. 5 g / ( kg·d) 、中1. 25 g/ ( kg·d) 、低0. 625 g / ( kg·d) 剂量组灌胃, 正常组和模型组给予同体积生理盐水。实验期间明暗各12 小时, 大鼠自由摄食摄水, 连续治疗12 周。

1. 5 血糖检测

分别在第0 周和12 周末测试大鼠尾尖血, 观察随机血糖的变化。

1. 6 神经电生理的测定

应用BL-420S生物机能换能系统, 采用双通道法, 分别测定SD大鼠右侧坐骨神经运动神经 ( motor nerve conduction velocity, MNCV) 和感觉神经传导速度 ( sensory nerve conduction velocity, SNCV) 。麻醉后的大鼠置于恒温垫上俯卧位固定, 暴露大鼠右侧坐骨神经, 将暴露的神经轻轻挂在包含两组刺激电极和记录电极的电极钩上, 神经表面滴加37℃ 预热的石蜡油使神经保持在湿润温暖的环境中。参数设置: 细电压, 单刺激, 延时100 ms, 波宽1 ms, 刺激强度1 v。测量方法: ( 1) MNCV: 将电极挂钩通道1刺激电极的一端置于神经近端, 通道2 记录电极的一端置于神经远端, 刺激后记录诱发动作电位, 施予刺激到出现诱发电位的时间称为潜伏期, 刺激电极起始点与记录电极起始点间的长度为距离, 本实验采用双通道记录法, 故以两通道动作电位出现峰位的时间差为潜伏期值, 以两通道刺激电极间距离0. 8 cm为刺激电极起始点与记录电极起始点间长度值。代入公式: MNCV = 刺激电极起始点与记录电极起始点间的长度 ( m) /潜伏期 ( s) 。 ( 2) SNCV: 交换刺激电极与记录电极的位置, 使之与测定MNCV的位置相反。SNCV的计算方法同MNCV。

1. 7 Western Blot测定GCLc、GST pi的蛋白表达

提取大鼠坐骨神经总蛋白, 分别以10% 和12%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白, 转膜、封闭, 分别加入一抗GCLc ( 1∶ 2000) 和GST pi ( 1∶ 2000) , 孵育, 4℃ 过夜。次日加入二抗 ( 1 ∶ 10000 ) , 显影、定影。以GADPH为内参。用IPP软件对扫描图象的目的条带进行灰度分析。

1. 8real-time PCR测定GCLc和GST pi的m RNA表达

Trizol法提取坐骨神经总RNA, Real-Time PCR检测GCLc和GST pi的m RNA表达水平。用2- ΔΔCT计算各个样本目的基因的表达变化。

1. 9 统计学方法

数据采用SPSS 17. 0 统计软件分析, 计量资料以均值 ± 标准差 (  ± s) 表示, 组间比较采用单因素方差分析 ( one-way ANOVA) , 符合方差齐性的MNCV、GCLc蛋白、GST pi蛋白和m RNA的两组间差异比较采用LSD法, 不符合方差齐性的随机血糖、SNCV、GCLc m RNA两组间差异比较采用Dunnett T3 法, P < 0 . 05 表示差异有显著统计学意义。

2 结果

2. 1 糖痹康改善SD大鼠随机血糖

与正常组相比较, 治疗前、后各组大鼠随机血糖水平均显著升高 ( P < 0. 01) ; 与模型组比较, 治疗后, ALA组、糖痹康高、中剂量组大鼠血糖显著降低 ( P < 0. 01 或P < 0. 05) 。见表2。

注: 与正常组比较, aP < 0. 01; 与模型组比较, bP < 0. 05, cP < 0. 01

2. 2 糖痹康改善SD大鼠坐骨神经传导速度

与正常组比较, 治疗后, 模型组大鼠MNCV和SNCV显著下降 ( P < 0. 01 ) , ALA组, 糖痹康高剂量组大鼠MNCV和SNCV无明显下降 ( P > 0. 05) ; 与模型组比较, ALA组, 糖痹康高、中剂量组大鼠MNCV和SNCV明显升高 ( P < 0. 01 或P < 0. 05 ) , 糖痹康低剂量组无明显变化 ( P > 0. 05) 。见表3。

注: 与正常组比较, aP < 0. 05, bP < 0. 01; 与模型组比较, cP <0. 05, dP<0.01

2. 3 糖痹康对GCLc和GST pi蛋白表达的影响

与正常组相比较, 各糖尿病组GCLc蛋白表达显著降低 ( P < 0. 01) ; 与模型组比较, ALA组、糖痹康高、中剂量组大鼠坐骨神经GCLc蛋白表达显著升高 ( P < 0. 01 或P < 0. 05) , 糖痹康低剂量组大鼠坐骨神经GCLc蛋白表达与模型组比较无显著差异 ( P > 0. 05) 。见图1, 表4。

与正常组比较, 各糖尿病组GST pi蛋白表达显著降低 ( P < 0. 01) ; 与模型组比较, ALA组、糖痹康高、中剂量组大鼠坐骨神经GST pi蛋白表达明显升高 ( P < 0. 01 或P < 0. 05) , 糖痹康低剂量组大鼠坐骨神经GST pi蛋白表达与模型组比较无显著差异 ( P > 0. 05) 。

注: 与正常组比较, aP < 0. 01; 与模型组比较, bP < 0. 05, cP < 0. 01

2. 4糖痹康对GCLc和GST pi的m RNA表达的影响

与正常组比较, 模型组、糖痹康中、低剂量组GCLc的m RNA表达显著降低 ( P < 0. 01 或P <0. 05) ; 与模型组比较, ALA组、糖痹康高、中剂量组大鼠坐骨神经GCLc的m RNA表达显著升高 ( P <0. 01 或P < 0. 05 ) 。 低剂量组坐骨神经GCLc的m RNA表达升高不明显 ( P > 0. 05) 。

与正常组比较, 各组GST pi的m RNA表达明显降低 ( P < 0. 01) ; 与模型组比较, ALA组、糖痹康高、中剂量组大鼠坐骨神经GST pi的m RNA表达明显升高 ( P < 0. 01 或P < 0. 05) 。低剂量组坐骨神经GST pi的m RNA表达升高不明显 ( P > 0. 05) 。

注: 与正常组比较, aP < 0. 05, bP < 0. 01; 与模型组比较, cP < 0. 05, dP < 0. 01

3 讨论

DPN是DM慢性并发症之一, 其发病率高, 严重威胁着患者的生存质量及寿命, 给家庭和社会造成了巨大的经济负担, 因其发病机制复杂, 是多种因素共同作用的结果, 因此其治疗一直成为研究的热点和难点[8]。

中医药治疗DPN有独特优势, 其全方位、多靶点的中医药治疗方案临床效果显著[10,11,12], 但其作用机制尚未完全阐明。糖痹康 ( 已获国家专利:ZL200810167551. 1) 在《金匮要略·血痹虚劳》黄芪桂枝五物汤的基础上加减化裁, 临床疗效显著, 前期研究表明[7], 糖痹康能显著升高DPN大鼠血清中消除过氧化物的超氧化物岐化酶和分解过氧化物的谷胱甘肽过氧化物酶水平, 从而改善坐骨神经传导速度。

应激蛋白的上调是机体对抗不利条件的一种普遍保护机制, 这其中包括氧化应激反应。GCLc和GST pi是II相解毒酶, 具有神经保护作用[9,10,11,12]。GCLc是GSH的限速酶, 是维持细胞内GSH动态平衡的关键因素, 而GSH在细胞防御氧化侵害和维护氧化还原动态平衡起重要作用, 是保证细胞凋亡功能正常的重要酶[13]。GST催化谷胱甘肽与各种亲电物质结合并促进其排泄, 并可以去除机体内过氧化氢, 降低脂质过氧化物[9]。GSH以多种形式存在于机体内, 其中GST pi形式在胶质细胞与黑质多巴胺能神经元中高度表达[10,11]。研究表明, GST pi敲除小鼠对四氧嘧啶的神经毒性更易感, 而GST pi的过表达可降低鱼藤酮诱导的皮层神经元的神经毒性, 从而减少氧化应激[12]。本实验研究发现糖痹康可显著上调GCLc和GST pi的蛋白和基因表达, 说明糖痹康通过调节II相代谢酶保护和修复DPN坐骨神经损伤。

Nrf2-Keap1-ARE信号通路是体内重要的抗氧化信号通路, 在II相酶的表达中起着关键作用[14]。生理状况下, Nrf2 存在于胞浆中并被Keap1 抑制, 当受到外来物质的刺激后, Nrf2 与Keap1 迅速解离进入核内, 并与抗氧化反应元件相互作用, 促进II相酶基因转录[15]。本研究团队将进一步研究糖痹康对Nrf2-Keap1-ARE信号通路的影响, 以进一步解释糖痹康对DPN坐骨神经的保护机制。

摘要：目的 观察糖痹康对糖尿病大鼠坐骨神经II相代谢酶谷氨酸半胱氨酸连接酶亚基 (glutamate-cysteine ligase catalytic subunit, GCLc) 和谷胱甘肽-S-转移酶 (glutathione s-transferase, GST) pi蛋白与mRNA的影响, 探讨糖痹康对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经保护作用机制。方法雄性SD大鼠, 高脂饲料与小剂量链脲佐菌素 (streptozotocin, STZ) 联合诱发糖尿病大鼠模型, 模型成功后将糖尿病大鼠随机分为5组:模型组、α-硫辛酸 (alpha lipoic acid, ALA) 组 (0.0268g/ (kg·d) , 糖痹康高 (2.5g/kg) 、中 (1.25g/kg) 、低 (0.625g/kg) 剂量组, 每组10只, 另将雄性SD大鼠10只设为正常组。治疗12周后测大鼠右侧坐骨神经传导速度;Western blot检测大鼠坐骨神经中GCLc和GST pi蛋白的表达;实时荧光定量PCR检测大鼠坐骨神经中GCLc和GST pi mRNA的表达。结果与模型组相比, 12周后ALA组、糖痹康高、中剂量组大鼠坐骨神经传导速度明显升高 (P<0.05) ;ALA组、糖痹康高、中剂量组GCLc和GST pi蛋白及mRNA表达均明显高于模型组 (P<0.05) 。结论糖痹康可通过诱导Ⅱ相代谢酶GCLc和GST pi改善糖尿病大鼠坐骨神经损伤。