3’RACE基因克隆

3’RACE基因克隆（精选三篇）

3’RACE基因克隆 篇1

基于以上,本研究采取race方法,从云芝中克隆出云芝免疫调节蛋白,为真菌免疫调节蛋白基因克隆的研究提供新的方法。为进一步开发真菌资源提供基础的研究数据。

1 实验材料和试剂

1.1 实验材料

云芝(Coriolus versicolor),购自于吉林农业大学菌物研究所。

1.2 菌种

细菌菌株E.coli DH5α为本实验室保存。

1.3 实验试剂

DNA Marker等购自于大连宝生生物有限公司;其他生化试剂均为国产分析纯。

1.4 培养基

YPG培养基:胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,葡萄糖20g/L(或麦芽糖15g/L),Mg SO40.5g/L,KH2PO41g/L。配制固体培养基时加琼脂粉15g/L。110℃高压灭菌30min。

2 实验方法

2.1 云芝菌丝体的培养

在无菌条件下,将云芝菌种用接种针挑取一小块菌丝体接种于液体YPG培养基中,在25℃培养箱中震荡培养5~7d。

2.2 云芝免疫调节蛋白基因的克隆和表达载体的构建

2.2.1 云芝基因组总RNA提取

无菌水洗菌丝体,用液氮预冷研钵,在液氮中研磨菌丝体至细粉状,转入1.5m L离心管中,加入500μL提取液;

继续加入1ml RNAiso Reagent;

将上述研磨好的粉末加入以上离心管中,轻轻混匀,离心(12000rpm,5min);

吸取上清,放入一个新的离心管中,向其中加入200μL氯仿,混匀,离心(12000rpm,15min);

吸取上清,加入等体积异丙醇,充分混匀,在15~30℃静置20min,离心(12000rpm,10min);

弃上清,加入1m L75%的乙醇,上下颠倒,12000rpm,离心(12000rpm,5min)弃乙醇;

干燥沉淀2~5min(室温),加入50μL的RNase-free水使RNA完全溶解,置于-80℃保存备用。

2.2.2 云芝免疫调节蛋白(Fip-cve)基因的克隆

2.2.2. 1 中间片断的获得:

以赤灵芝(G.lucidum)Fip-glu基因序列(Gen Bank No:M58032)为基础,设计同源引物P1和P2,来完成云芝同源区域中间片断的克隆。引物序列为:

P1:5’TGACCGACAAGGCGTACACGTAC’3

P2:5’ACCTGGATCGTGTTCGTGTCCG’3

反转录反应体系:10μL体系,1.0μL d NTP,0.5μL Primer oligod T,0.25μL RNase inhibitor,1μL10×RT Buffer,2.75μLRNase Free H2O,2μL Mg Cl2,2μL RNAsample 0.5μL AMV。

程序为:30℃10 min,42℃30min,99℃5min。

PCR反应体系:50μL体系,包括0.25μLTaq酶,5μL PCR buffer,1μL d NTP(2.5 nmol/L),1μL引物A(20 nmol/μL),1μL引物B(20 nmol/μL),模板DNA 1.5μL,dd H2O40.25μL。

反应程序为:(94℃预变性5min,94℃10s,55℃20s,72℃30s,共31个循环,然后72℃5min)。凝胶回收扩增产物,将产物连接于p MD18-T载体,转化大肠杆菌,提取质粒后测序用于下一步。

2.2.2. 2 3’RACE程序

根据上述片断的测序结果,设计上游引物P3,用于3’RACE,引物序列为:P3:5、ACCTCGGTGTG-CGCCCCTCATACGC、3反转录反应体系:10μL体系,包括2μL Mg Cl2,1μL 10×RT Buffer,2.75μL RNase Free H2O,1.0μL d NTP,0.25μL RNase inhibitor,0.5μL AMV,0.5μLPrimer oligod T,2μL RNA样品。

PCR反应体系:50μL体系,包括1μLd NTP(2.5 nmol/L),0.25μLTaq酶,1μL引物E(20 nmol/μL),5μL PCR buffer,模板DNA 5μL,1μL adaptor primer(Kit primer),dd H2O 36.75μL。

反应程序为:(94℃预变性5min,94℃20s,57℃30s,72℃40s,共31个循环,然后72℃5min)。凝胶回收扩增产物,将产物连接于p MD18-T载体,转化大肠杆菌,提取质粒后测序用于下一步。

2.2.2. 3 5’RACE程序

以3’RACE序列、中间片断的序列信息为依据,继续设计5’RACE引物,引物序列如下:

P4:5,ACGACGACACGGTACGTGTACGCC,3

P5:5,TCCAGGTGTACGTCATTGACCCCG,3

首链c DNA的合成:

反转录体系如下:1.5μL10×RT Butter,0.5μLRNase Inhibitor,1μLAMV Reverse Transcriptase XL,1μL5端磷酸标记反转录引物F,5μL总RNA,再加入RNase Free d H2O至总体积15μL。反应条件为30℃反应10min,50℃反应1h,99℃5min。

单链c DNA环化:向干燥的单链c DNA中加入12μL的dd H2O和8μL的5×RNA(ss RNA)Ligation Buffer溶解,继续加入20μL的40%PEG6000均匀混合,再加入1μLT4RNA Ligase,16℃反应24h。

PCR反应:取上步反应液5μL作为模板,加入0.25μLLA Taq酶,5μL10x LA PCR buffer,2.5μLd NTP(2.5 nmol/L),1μL引物I,1μL引物J。

反应程序为:同上,凝胶回收扩增产物,将产物连接于p MD18-T载体,转化大肠杆菌,提取质粒后测序用于下一步。

3 实验结果

3.1 云芝菌丝体的培养

挑取云芝菌丝体适量,取250m LYPG液体培养基中,在超净工作台中接种,摇床震荡培养(26℃,110转/min,培养7d),培养后可见质量比较好的球状菌丝体,结果如图1所示。

3.2 云芝免疫调节蛋白基因的克隆

提取云芝菌体总RNA,总RNA的电泳图谱结果如图2所示。以此作为反转录模板,根据赤灵芝(G.lucidum)Fip-glu基因序列在Gen Bank中同源保守区序列,设计引物P1和P2来克隆中间片断。PCR扩增出160bp长度左右的片断,结果如图3所示,回收纯化以上的目的片段,连接于p MD18-T载体,用大肠杆菌DH5α转化,送测序公司对结果进行测序。根据测序结果设计3‘RACE正向引物来进行3’末端的克隆,3’RACE扩增出250bp的片断(结果如图4所示)。根据以上测序信息设计5’RACE引物来进行5’段序列扩增,5‘RACE最终扩增出300bp左右长度的序列(结果如图5所示)。最终将这四段序列进行拼接形成完整的Fip-cve基因基因全序列,序列长度为481bp,全序列结果如图6所示。

4 实验结论

真菌免疫调节蛋白(Fip)是真菌中重要的药理成分之一。本研究利用race方法成功的从云芝中克隆了云芝免疫调节蛋白基因Fip-cve,基因片段长度为481bp。

摘要：云芝是非常具有应用前景的药用真菌,但是目前关于真菌免疫调节蛋白基因克隆的方法还较少,因此本研究以云芝菌丝体为研究材料,通过Race方法从云芝中克隆出云芝免疫调节蛋白基因,并获得了云芝基因的全序列,通过本研究,以期为药用真菌的克隆方法提供有价值的参考。

关键词：race,免疫调节蛋白基因,克隆

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3’RACE基因克隆 篇2

摘要：应用PCR方法克隆了少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)ZX4菌株的儿茶酚2,3-双加氧酶基因(c23O-ZX4).核苷酸序列测定与分析表明,该基因片段全长924 bp且具有一个完整的阅读框,编码306个氨基酸残基.该基因与已报道的来自菌株S.yanoikuyae B1和Sphingomonas sp.KMG425的xylE基因(编码产物均为C23O)具有较高的核酸序列同源性,分别为94.37%和94.05%.通过Hind Ⅲ和Xho Ⅰ两个限制性酶切位点将该基因连接到质粒pET30(a)+上得到重组表达质粒pET-S3,并在E. coli BL21进行了表达,得到了42.3 kD的.融合蛋白.酶活测定发现该基因工程菌株的发酵产酶活力明显高于出发菌株.作 者：周德平 吴淑杭 闵航 姜震方 ZHOU De-ping WU Shu-hang MIN Hang JIANG Zhen-fang 作者单位：周德平,吴淑杭,姜震方,ZHOU De-ping,WU Shu-hang,JIANG Zhen-fang(上海市农业科学院环境科学研究所,上海,06)

闵航,MIN Hang(浙江大学生命科学院,杭州,310029)

3’RACE基因克隆 篇3

关键词：山葡萄；cDNA克隆；黄烷酮3-羟化酶

中图分类号： S663.101 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0036-05

黄烷酮3-羟化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）是花色素合成途径中的结构基因，是花青素生物合成途径中的关键酶[1]。F3H属于依赖2-酮戊二酸的双加氧酶，反应需要2-酮戊二酸、分子氧、铁、抗坏血酸[2]。其作用为催化柚皮素C3位羟基化，生成二氢山奈酚（dihydrokaempferol，DHK），而DHK是黄酮和异黄酮合成的重要中间产物；因此，F3H调控着黄酮与花青素苷产物的合成，是整个黄酮类化合物代谢途径的中枢位点[3]。有报道指出F3H与花青苷合成关系密切[4]，然而此方面的研究尚较少。Holton等发现F3H对黄烷酮、儿茶酸、原花青素、花青素代谢影响较大，是该代谢途径的关键酶[3]。Lepiniec等研究证实，由F3H和F3′H催化生成的黄烷酮醇在DFR的催化作用下能够合成无色花青素[5]。F3H的活性最初在紫罗兰花中被检测到[6]。Martin等利用鉴别筛选与基因图谱技术首次从金鱼草中分离克隆到F3H基因[7]。研究表明，F3H基因在矮牵牛等植物中是独立表达的，而大多数情况下，F3H与其上游的CHS、CHI基因，以及下游的DFR基因协同表达[8]。在大多数物种中，F3H基因仅以单拷贝形式存在[9-11]。

山葡萄别称野葡萄，最初发现于我国东北和俄罗斯远东地区，在我国主要分布于吉林省长白山、黑龙江省完达山、小兴安岭、辽宁省北部等地[12]。山葡萄是我国重要的野生果树资源，具有极强的抗寒性，是东北地区酿造葡萄酒的主要原料[13]，其浆果含有大量花色苷。目前，分子生物技术已广泛应用于葡萄遗传育种的各个领域，加速了葡萄遗传学图谱、基因的克隆表达、新基因的分离鉴定等研究的进展[14]。F3H基因已在玉米、矮牵牛花、水母雪莲等很多植物中克隆得到并且定性[15]。在拟南芥、茄子、苜蓿、葡萄、苹果、柑橘、梨、康乃馨、翠菊、日本牵牛等植物中均克隆到了F3H基因，但未见山葡萄中F3H基因的相关报道。本研究采用RT-PCR和RACE技术相结合的方法克隆F3H基因，获得全长序列，并进行生物信息学分析，旨在为阐明山葡萄花色苷的生物合成及调控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供试山葡萄品种为双丰（Vitis amurensis Shuang Feng），采自国家山葡萄种质资源圃。采摘无病虫害、饱满的成熟期果粒，立即置于液氮中冷冻，并于-80 ℃冰箱保存，取其果皮作为供试材料。

1.1.2 菌株、酶、生化试剂 Tris-HCl、CTAB、EDTA、无水LiCl、β-巯基乙醇、DEPC水、AMP、IPTG、X-gal均为AITiresco分装试剂；大肠杆菌DH5α、pMD19-T载体、Taq酶、Marker DL 2 000均购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒购自OMEGA公司；反转录酶SuPerscriptll购自invitrogen公司；SMARTTM RACE试剂盒购自Clonteeh公司；其他试剂均为国产分析纯。引物由英俊生物技术有限公司合成，DNA测序由上海生工生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 登录NCBI网站，根据GenBank中已登陆的F3H基因的核苷酸序列和氨基酸序列，通过多序列比对确定其共有的保守区，利用Primer 6.0软件设计1对特异引物用来扩增目的片段。上游引物F1：5′-TGTCTGGTGGCAAGAAAGGC-3′；下游引物F2：5′-CGAGGGTGAGGTCTGGCTGT-3′。

以该引物扩增出的序列设计5′RACE和3′RACE引物，分别为：F3H-a：5′-AGCGTCCTTGTCCAAATCCA-3′；F3H-s：5′-CGTTTCCAGCCATCTTCA-3′。

1.2.2 山葡萄果皮总RNA的提取及cDNA的合成 采用改良的CTAB[16]法提取山葡萄果皮中的总RNA。采用紫外分光光度计测定其230、260、280 nm处的吸光度及总RNA浓度，用1%TAE检测RNA的完整性。

按照Invitrogen公司的SuperScriptⅡ反转录酶试剂盒说明书，以Oligo（dT）20为引物、总RNA为模板进行逆转录反应，合成cDNA的第1条链。

1.2.3 PCR扩增目的基因片段 以山葡萄cDNA第1链为模板，用引物F1、F2进行PCR扩增。50 μL反应体系包括：2.0 μL cDNA、5.0 μL 10×Ex Taq Buffer（Me2+ free）、0.4 μL Ex Taq（5 U/μL）、36.6 μL ddH2O、F1和F2引物各1.0 μL。反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸7 min，于4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检測，并回收纯化目的片段。

1.2.4 5′RACE和3′RACE法获得基因片段 参照SMARTTM RACE试剂盒说明书，以逆转录分别合成的5′-RACE-Ready-cDNA和3′-RACE-Ready-cDNA为模板，以F3H-a、F3H-s分别同UPM为引物，进行5′RACE、3′RACE扩增以获得5′端片段、3′端片段。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共35个循环；最后72 ℃延伸7 min，于4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测以确定条带。

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1.2.5 目的片段的回收和连接 按照胶回收试剂盒说明书对PCR产物的DNA片段进行回收、连接、转化。将回收的DNA片段与pMD-18载体连接，于16 ℃连接3 h。反应体系为pMD-18载体0.5 μL、DNA片段4.5 μL、SolutionⅠ5.0 μL。

1.2.6 转化 将DH5α感受态细胞解冻后，取50 μL加入10 μL连接产物，冰浴30 min；取出后热激90 s，并置于冰上2～3 min；加入预热的LB液体培养基300 μL，于37 ℃、190 r/min培养1 h；取适量菌液涂布于含有AMP、X-Gal、IPTG的LB固体培养基平板上，于37 ℃培养箱中倒置培养过夜。次日，挑白色单克隆置于37 ℃摇床中，200 r/min培养12 h。随后进行菌液PCR检测，将成功克隆的菌样测序。

1.3 VamF3H基因序列及其编码蛋白质的生物信息学分析

利用DNAstar软件查找VamF3H基因的开放阅读框（ORF）并推导其氨基酸序列；利用NCBI的BLAST程序检索数据库，对VamF3H基因全长cDNA序列及其氨基酸序列进行比对分析；利用ProtParam在线软件（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）分析VamF3H基因编码蛋白质的理化性质；运用ProtScale在线软件（http：//ca.expasy.org/tools/protscale.html）、TMHMM在线软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）、SignalP在线软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）对所编码蛋白质的亲水性、疏水性、跨膜结构域、信号肽进行分析；通过ExPASY中的HNN工具分析其蛋白质序列的二级结构；采用GeneDoc软件进行多序列比对，并采用MEGA 6.0软件构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 山葡萄VamF3H基因cDNA全长的克隆及序列分析

以山葡萄果皮总RNA反转录的cDNA为模板，用特异引物F1和F2扩增出1条324 bp的预期片段（图1-a）。经Blastn分析发现，该序列与其他物种F3H基因高度同源，与欧亚种葡萄（FQ389950）的同源性高达99%，初步确认其为山葡萄F3H基因的核心序列。根据所得中间段序列设计末端扩增的特异引物F3H-a和F3H-s，经RACE扩增、产物克隆、测序后，分别得到长度为965 bp的3′末端和647 bp的5′末端（图1-b）。将RT-PCR和RACE扩增片段进行序列拼接得到VamF3H基因cDNA全长序列，最终获得1条长为1 398 bp的cDNA全长序列，经Blastn比对发现，该cDNA序列与其他物种的F3H基因同源。

经DNAstar软件分析发现，该cDNA包含1个1 092 bp的完整开放阅读框、214 bp的3′-非翻译区、92 bp的5′-非翻译区，推测其编码363个氨基酸。GenBank登录號为KP966099，将其命名为VamF3H。

2.2 VamF3H基因编码蛋白质的理化性状

利用ProParam软件在线预测分析VamF3H基因编码蛋

白的理化性质，发现该蛋白由363个氨基酸组成，相对分子质量（MV）为40.81 ku，等电点值为5.37。组成VamF3H蛋白的20种氨基酸中亮氨酸（Leu）含量最高，达到9.9%；半胱氨酸（Cys）、色氨酸（Trp）含量最少，仅为1.4%。正电荷残基（Arg+Lys）数为45个，负电荷残基（Asp+Glu）数为55个，不稳定指数为44.25，脂肪指数为84.33，表明VamF3H基因蛋白属于不稳定蛋白质。

2.3 VamF3H蛋白保守区预测

利用NCBI的BlastP程序，在蛋白保守区数据库预测山葡萄VamF3H基因的蛋白保守区。结果表明，VamF3H具有2-酮戊二酸的双加氧酶（2-ODD）结构域、非血红素双加氧酶结构域。VamF3H具有特征性结构域FE2OG_OXY PS51471（图2），属于双加氧酶家族。

2.4 VamF3H蛋白的亲水性

利用ProtScale程序分析山葡萄VamF3H基因氨基酸序列的亲水性及疏水性（图3）。图中纵坐标为氨基酸标度值，横坐标为氨基酸序列位置。依据氨基酸分值越低亲水性越强、分值越高疏水性越强的规律，可明显看出疏水性最大值在第168位点，值为1.900；最小值在第145位点，值为-2.722。总平均亲水性指数为-0.444，整体表现为亲水性。

2.5 VamF3H蛋白的跨膜结构域

根据TMHMM、TMpred Server网站分析，超过500分才被认为显著。可见VamF3H蛋白无跨膜螺旋，故可推测VamF3H不含有跨膜结构域。

2.6 VamF3H蛋白的信号肽预测及二级结构

利用SignalP 4.1 Server软件对山葡萄VamF3H基因蛋白进行信号肽预测。结果表明，VamF3H基因编码的蛋白不具有信号肽。

利用HNN软件在线预测VamF3H基因的二级结构（图4）。该蛋白的二级结构由48.48%的无规卷曲（random coil）、32.78%的α-螺旋（alpha helix）、18.73%的β-折叠（extended strand）组成。

2.7 山葡萄VamF3H编码蛋白质的同源性及进化

登陆NCBI主页，利用BlastP在线软件将克隆得到的VamF3H基因编码氨基酸序列进行同源性搜索比较。结果表明，该基因与欧亚种葡萄（FQ389950）、圆叶葡萄（KF040970）、美洲种葡萄（JX087441）、桑树（KF438044）等的F3H类基因同源性较高，相似性分别为99%、99%、96%、81%。利用GeneDoc软件对包括VamF3H在内10个物种的F3H基因编码的氨基酸序列进行多重比对分析（图5），图中划线部分为保守结构域。

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為进一步分析VamF3H与其他植物F3H之间的进化关系，在多重比对的基础上，利用Mega 6.0软件对该基因及其他植物F3H基因的氨基酸序列进行系统进化分析（图6）。结果表明，山葡萄VamF3H基因与欧亚种葡萄、圆叶葡萄、美国蔓藤的同源性最高，与梨、风毛菊等亲缘关系较远。

3 结论与讨论

本研究利用同源克隆和RACE技术相结合的方法，从山葡萄果皮中克隆获得F3H的同源基因VamF3H，并对其编码的蛋白质进行生物信息学分析。二级结构预测发现，该蛋白的二级结构以无规卷曲为主，其次为α-螺旋，再次为β-折叠，无其他二级结构元件，此预测结果与已报道的草莓、葡萄、海棠F3H蛋白的二级结构一致[17]。保守结构域分析表明，该基因编码的蛋白具有典型2-O-酮戊二酸和Fe2+-依赖的双加氧酶家族（2OG-FeⅡ_Oxy）的保守结构域，该结构域中含有与铁离子结合所需的组氨酸、天冬氨酸，以及与2-O-酮戊二酸结合所需的精氨酸、丝氨酸保守位点，这些都是植物双加氧酶超家族基因的典型特征。系统进化分析显示，VamF3H与同属的欧亚种葡萄F3H亲缘关系最近，而与蔷薇科的梨、菊科的风毛菊亲缘关系较远，可见VamF3H的进化具有明显的种属特性。

从以上核苷酸、氨基酸较高的相似系数可知，F3H基因在进化上较为保守，因为F3H仅以单拷贝形式存在于大多数物种中，提示F3H基因可能在花青素生成中具有重要地位。单拷贝基因比多拷贝基因更易于调控，且F3H基因在进化上保守性很高，少数几个碱基的突变就可能造成基因失活，从而阻碍花青素的生成。目前，关于控制花青素生成的研究主要集中于控制花青素生成的结构酶，并通过转入结构酶的基因以获得结构酶的过量表达，从而增加花青素的生成，而关于调控结构酶的基因或调控因子的研究尚未见报道；因此，研究花色素调控基因比单纯研究结构酶更具有意义。

通过获得的F3H基因cDNA全长序列，可在以下方面做进一步研究。验证F3H基因在山葡萄中是否为单拷贝存在。F3H基因在很多物种中均以单拷贝存在，而葡萄中的F3H则为2个拷贝[18-20]，因此推测VamF3H也同为2个拷贝。可使用Southem Blot技术验证F3H基因在山葡萄的果皮、果肉、根、茎、叶、种子等部位中是否为2个拷贝。将已有的F3H基因作为探针，与山葡萄基因组文库杂交，可获得F3H基因组DNA序列，以进行内含子组成、外显子组成、结构预测等分子生物学分析，为山葡萄花色素的研究提供分子生物学基础。

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