游离细胞（精选七篇）
游离细胞 篇1
关键词：替米沙坦,血管内皮细胞,血管紧张素Ⅱ,钙离子
高血压、动脉硬化、冠心病等心血管系统疾病的发生发展过程中均存在着以内皮细胞所分泌的一氧化氮(NO)减少而致血管舒张反应下降为主要特征的血管内皮系统功能障碍[1]。导致血管内皮细胞损伤的因素中,肾素-血管紧张素系统(RAAS),尤其是局部RAAS所产生的血管紧张素Ⅱ(angiotensin ,AngⅡ)在病理生理方面起着重要的作用[2]。异常升高的AngⅡ可通过与血管内皮细胞内的AT1受体结合, 引起细胞钙超载并启动一系列的细胞凋亡信息转导过程。替米沙坦(Telmisartan)是新型的长效AngⅡ受体拮抗剂,其作用机制主要是与AT1受体结合, 阻断AngⅡ对AT1受体的激动作用 ,作为临床一线降压药被广泛应用。以往的研究显示,替米沙坦对由高糖或AngⅡ等因素所致的血管内皮细胞损伤具有保护作用[3,4,5,6]。静息生理状态下, 细胞内钙离子主要储存在内质网内,使细胞内游离钙离子保持在极低的水平约1×10-7mol/L,细胞内外的钙离子浓度差大约为一万倍[7]。当遇到相应的刺激时,细胞会通过多种途径瞬间提高胞内局部或全部的钙离子浓度。其中主要的途径包括胞外钙离子的内流和胞内内质网应激释放储存在其的钙离子。细胞内钙离子浓度在细胞死亡过程中有变化,并且这种变化与许多病理状态相关。已有的研究报道中,在探讨替米沙坦对内皮细胞胞内游离钙离子浓度影响时,较少区分引起胞内钙离子浓度变化的途径或给予限制,本文通过采用无钙离子细胞培养基,消除细胞应激后钙离子从胞外内流的途径,探讨AngⅡ刺激后胞内钙离子的变化,观察替米沙坦对内质网源游离钙离子浓度的调控作用,以细化这两类物质(药物)对胞内钙离子影响及其诱发细胞凋亡的基础研究。
1 材料与方法
1.1 材料
人大动脉血管内皮细胞株(VEC),Pri Cell公司;替米沙坦,森瑞化工有限公司;AngⅡ,Sigma公司;胎牛血清,美国Hyclone公司;高糖DMEM培养基,美国Hy-clone公司;无钙DMEM培养基,美国Hyclone公司;Fluo-3/AM,Sigma公司。替米沙坦和AngⅡ均用无钙无血清DMEM培养液溶解配成10 mg/L和2μmol/L母液 ,用时以无钙无血清DMEM细胞培养液调节终末浓度。
1.2 细胞培养
常规复苏血管内皮细胞株, 以含血清DMEM培养基(90%高糖DMEM培养基,10%胎牛血清)制备浓度为1×105/m L的血管内皮细胞悬浮液。取10 m L血管内皮细胞悬浮液置于75 cm2无菌培养瓶内,在5%CO2、37℃、湿度95%的条件中孵化培养 ,隔天置换培养液。当内皮细胞长至80%~90%融合时,以0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合液消化传代。当细胞传至第3代时,将细胞接种于35 mm激光共聚焦玻璃底细胞培养皿中,细胞密度为5×104个/m L,置回培养箱中继续培养, 待细胞长满后进入分组、Fluo-3/AM负载及干预试验程序。
1.3 实验分组及 处理
根据健康人体口服40、80、120 mg替米沙坦片测得的血浆药物峰浓度 (Cmax)[8], 实验药物浓度设计为60、300、1000μg/L。
1.3.1预防性实验将接种于35 mm细胞培养皿中的血管内皮细胞分为5组:正常对照组、替米沙坦60、300、1000μg/L预处理组和AngⅡ0.1μmol/L组。试验添加药物前每组分别测定初始钙离子浓度 (0 h),设为T0。随后,各组培养基中分别加入培养液10μL(正常对照组 )、浓度为0.036 g/L的替米沙坦10μL(60μg/L替米沙坦组 )、浓度为0.18 g/L的替米沙坦10μL (300μg/L替米沙坦组 )、浓度0.60 g/L的替米沙坦10μL(1000μg/L替米沙坦组)和培养液10μL(AngⅡ0.1μmol/L组)。替米沙坦预处理30 min后检测细胞内游离钙离子浓度(T1), 除正常对照组外 , 其余组均加入浓度2μmol/L的AngⅡ10μL,并分别继续共同培养,于AngⅡ加入后瞬时(T2)、0.5 h(T3)、2 h(T4)、8 h(T5)和24 h(T6)抽样检测细胞内游离钙离子浓度。
1.3.2治疗性实验将接种于35 mm细胞培养皿中的血管内皮细胞分为5组:正常对照组、AngⅡ0.1μmol/L组,AngⅡ+替米沙坦60、300、1000μg/L组。试验添加药物前每组分别测定初始钙离子浓度(0 h),设为T0。随后,除正常对照组外,其余各组加入0.1μmol/L的AngⅡ10μL培养30 min后检测细胞内游离钙离子浓度 (T1), 再加入替米沙坦 ( 加入浓度和体积同“1.3.1”项下),并分别继续共同培养,于替米沙坦加入后瞬时(T2)、0.5 h(T3)、2 h(T4)、8 h(T5)和24 h(T6)抽样检测细胞内游离钙离子浓度。
1.4 胞浆游离钙离子浓度测定[9]
按照检测时间,分别取各组细胞应用激光共聚焦扫描显微镜调节激发波长为488 nm,发射波长为526 nm,置负载Fluo-3的内皮细胞于镜下,于每个检测时点,每组随机选取活细胞8个,各细胞共扫描16次,每次扫描间隔时间为2 s,取16次扫描测得的平均荧光强度数值作为该内皮细胞内钙离子浓度值。
1.5 统计学方法
应用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 替米沙坦预处 理对 AngⅡ导致的血管内皮细胞胞内游离钙离子浓度的影响
替米沙坦预处理加入AngⅡ0.1μmol/L后,胞浆游离钙离子浓度立即(0 h)显著升高,均显著高于正常对照组(P < 0.05),但显著低于AngⅡ组,并且替米沙坦预处理浓度越高抑制作用越强(P < 0.05),作用时间对此无影响。见表1。
2.2 替米沙坦 对 AngⅡ导致的血管内皮细胞胞内游离钙离子浓度的影响
与正常对照组相比,AngⅡ0.1μmol/L诱导30 min,钙离子浓度显著升高(P < 0.05)。与AngⅡ0.1μmol/L相比,加入替米沙坦60μg/L作用24 h,对升高的胞浆游离钙离子浓度无抑制作用; 替米沙坦300μg/L作用2 h或替米沙坦1000μg/L作用0.5 h才显示其抑制作用(P < 0.05),均显著高于同一时间点的正常对照组;替米沙坦的作用时间对此无影响。见表2。
3 讨论
本试验结果显示,AngⅡ能诱导内质网钙库向胞浆释放游离钙离子,而替米沙坦具有效拮抗AngⅡ对内质网的应激作用及促使胞浆游离钙离子重新被内质网重吸收。血管内皮细胞具有物质转运、自分泌、旁分泌等多重功能,是易受损的功能性界面,对各种不同的病理生理干预均可发生形态学和生物化学方面的改变。多种心血管病变均可引起内源性AngⅡ分泌增加,超生理浓度的AngⅡ可通过与血管内皮细胞内的AT1受体结合,激动G蛋白,使4,5-二磷酸磷脂酰肌醇水解生成三磷酸肌醇(IP3),生成的IP3激动细胞内内质网IP3受体(IP3敏感型钙库),致使内质网向胞浆释放大量游离Ca2+, 同时损害内质网钙泵(endoplasmic reticulum Ca2+ATPase,SERCA) 的活力 ,影响其对细胞质游离钙离子的重新吸收,引起细胞钙超载并启动一系列的细胞凋亡信息转导过程[10,11,12],这一系列的改变将进一步引起细胞骨架降解,导致细胞出现自溶反应[13,14,15]。而血管内皮细胞凋亡是动脉粥样硬化病变的独立危险因素[1]。
替米沙坦是新型的AngⅡ受体拮抗剂,其作用机制主要是与AT1受体结合, 阻断AngⅡ对AT1受体的激动作用。Selman等[11]对心肌细胞的研究中观察到,替米沙坦能在一定程度上阻断IP3对IP3受体的激动作用,并在进一步的动物试验中观察到,长期给高血压大鼠灌服替米沙坦可令IP3受体的数量下调。Abiko等[10]等Maczewski等[14]研究表明,AngⅡ、甲状腺素等作用内皮细胞后,SERCA m RNA和蛋白质的表达显著下降且和内质网摄取Ca2+的能力下降相关,咪达普利和替米沙坦干预后,SERCA m RNA表达无明显变化,但可显著提高SERCA的活力。
注:与正常对照组比较,*P < 0.05;与AngⅡ组比较 ,#P < 0.05;与替米沙坦60μg/L组及替米沙坦300μg/L组比较 ,△P < 0.05 ; 与T2比较,▲P <0.05;T0:试验前 ;T1:替米沙坦共同培养后0.5 h;T2:加入AngⅡ瞬时 ;T3: 加入AngⅡ后0.5 h;T4: 加入AngⅡ后2 h;T5: 加入AngⅡ后8 h;T6: 加入AngⅡ后24 h
注:与T0及空白对照组比较,*P < 0.05;与T1、T2、AngⅡ组及替米沙坦组60μg/L比较 ,#P < 0.05;与替米沙坦60μg/L组和替米沙坦300μg/L组比较,△P < 0.05;T0:试验前 ;T1:替米沙坦共同培养后0.5 h;T2:加入AngⅡ瞬时 ;T3:加入AngⅡ后0.5 h;T4:加入AngⅡ后2 h;T5:加入AngⅡ后8 h;T6:加入AngⅡ后24 h
从本试验的预防性和治疗性试验观察到,血管内皮细胞经 替米沙坦 预处理30 min后均能有 效拮抗AngⅡ引起的胞浆游离钙离子浓度上升。这可能与替米沙坦为AngⅡ受体拮抗剂,经替米沙坦预处理30 min后 , 药物优先占据AngⅡ的AT1受体结合位点,阻碍或(和)减弱了AngⅡ对结合位点的激动作用及由于受体激动后所诱发的连锁反应。替米沙坦的预防作用也可能与其阻断IP3对IP3受体的激动作用,部分阻断钙库内质网钙离子的释放有关。
AngⅡ预先诱导30 min的试验中 ,300μg/L替米沙坦作用2 h或1000μg/L替米沙坦作用0.5 h才显示其抑制胞浆游离钙离子浓度的作用。这可能由于AT1受体被AngⅡ预先占据并激动 ,而AngⅡ在细胞和组织中的半衰期为15~30 min,在此期间AT1受体等结合位点依然被AngⅡ所占据但由于替米沙坦与AngⅡ竞争相同的作用位点。因此,替米沙坦同样起到一定的拮抗作用,以至于抑制了胞内游离Ca2+的持续上升(与AngⅡ模型组比较)。随着AngⅡ被活细胞逐渐代谢,原先被AngⅡ占据的结合位点重新暴露并被替米沙坦占据。其后胞内游离钙离子浓度的降低可能与沙坦类药物同时抑制多种细胞内氧化反应[16,17,18,19,20,21],或替米沙坦提高了SERCA的活力, 促使胞浆游离钙离子重新被内质网等细胞器重吸收有关。
从观察到的结果可以得出,替米沙坦对AngⅡ引起的胞浆游离钙离子浓度的上升拮抗作用具有剂量相关性, 高浓度的替米沙坦拮抗作用明显优于低浓度。但基于受体具有饱和性,组织或细胞中含有某种受体的数目是相对固定的, 当受体与配体结合达到饱和时, 生物效应并不会因为配体数目的增加而又有增强。故此,替米沙坦或许存在拮抗AngⅡ受体外的其他保护血管内皮细胞的作用机制, 如阻断钙离子从内质网中释放、提高SERCA的活力加快胞内游离钙离子的重吸收等,以终止和(或)延缓细胞凋亡的进程。
游离细胞 篇2
[关键词] 糖尿病；游离脂肪酸；内皮细胞；bcl-2；BAX；PI3K/AKT
[中图分类号] R34[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701（2012）10-0004-04
Influence and mechanism of free fatty acid and glucose on endothelial cell of rat aorta
GUO Hailian1 LIU Xiaoling2 LI Pengcui3 HAN Le2 WANG Dongqing1
1.Graduate School of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2.Department of Endocrinology, the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001，China； 3.Department of Orthopaedic Laboratory, the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China
[Abstract] Objective To explore the influence and mechanism of free fatty acid（FFAs） and glucose on endothelial cell proliferation and apoptosis. Methods Rat aorta endothelial cell （RAEC）were cultured in vitro, glucose(5.5 mmol/L, 30 mmol/L) and palmitic acid (200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L) in different concentration were applied，alone and together, to RAEC for 24 h， 48 h， 72 h. Immunohistochemistry were used to determine CD31-related antigen and detectedIL-8, Bcl-2, BAX protein expression changes; Applied four methyl azo thiazole blue (determined by MTT) colorimetric detection different environment RAEC proliferation capacity. Results Glucose and FFAs, alone and together, can lead to apoptotic morphological changes in RAEC； FFAs and glucose display strong growth inhibitory effect in a-time and does-development manner against RAEC (P < 0.05), and the combination group was significantly lower than the proliferation of cultured alone group (P < 0.01). After intervention, IL-8, BAX expression were increased, Bcl-2 protein expression were gradually decreased, Bcl-2/BAX ratio wrere decreased, and more obvirous expression of the combination group. Conclusion High FFAs and high glucose can inhibit the growth of RAEC and promote their apoptosis, its mechanism may be involved by glucose and palmitate PI3K/AKT pathway activation oxidative stress-induced apoptosis.
[Key words] Diabetes mellit; Free fatty acid; Endothelial cell; bcl-2; BAX; PI3K/AKT
糖尿病血管病变是糖尿病的主要并发症之一，也是糖尿病患者致残和致死的主要并发症，其中血管内皮细胞的损伤在血管并发症中起着关键作用[1]。2001年美国糖尿病学会年会上，BANTING科学奖得主McGarry JD 教授提出，脂代谢障碍是2型糖尿病及其并发症的基本病理生理改变[2]。伴随着葡萄糖利用和代谢障碍，脂肪的合成代谢障碍而分解代谢异常增高，血液中FFAs含量增多，而FFAs在一定程度上可反映2型糖尿病患者体内脂代谢异常状况。FFAs尤其是棕榈酸（palmitic acid，PA）可导致内皮细胞功能障碍,是糖尿病血管病变的关键因素。因此，探讨脂毒性对糖尿病血管病变的影响及可能的机制对临床具有一定的指导意义。本实验观察高糖状态下不同浓度的棕榈酸对大鼠主动脉内皮细胞的影响，并探讨其可能的作用机制，为糖尿病血管病变的防治提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 主要材料和试剂
SD大鼠（山西医科大学实验动物中心），软脂酸（Gibco，USA），RPMI 1640（武汉博士德），胎牛血清（Cyagen Biosciences，USA），大鼠内皮细胞生长因子（VEGF）（Prospec，USA），胰蛋白酶（TRYPSIN 1：250）（Solarbio），去脂牛血清白蛋白（d-BSA）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）（sigma，USA），即用型兔抗大鼠CD31单克隆一抗试剂盒（武汉博士德）、即用型兔抗大鼠bcl-2单克隆一抗试剂盒（武汉博士德）、即用型兔抗大鼠BAX单克隆一抗试剂盒（武汉博士德）、即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒（武汉博士德），DAB显色液（武汉博士德）。
1.2 主动脉内皮细胞的培养与鉴定
颈椎脱臼处死SD雌性大鼠，碘伏酒精消毒后，逐层剖开胸腹腔，于脊柱旁暴露主动脉，游离主动脉周围筋膜及结缔组织，分离后取主动脉弓至髂总动脉段，剪下放入无菌PBS液中漂洗去除附壁血细胞后，放入1640培养液中，使用眼科镊将主动脉内膜翻转朝外，并剪成1～2 mm宽动脉环，平均摆放入25 cm2培养瓶中，37 ℃、5%CO2培养箱中静置1 h后，加入配制好的大鼠专用内皮细胞培养液（RPMI1640、20%胎牛血清、大鼠内皮生长因子、肝素、青链霉素），静置68 h以上。每3天更换培养液一次，待细胞生长单层融合后，0.25%胰酶消化传代，实验使用3～5代细胞。采用形态学、倒置显微镜及抗CD31抗体免疫组化染色法行内皮细胞鉴定。
1.3 实验分组
试验共设置7组：（1）游离脂肪酸干预组设3组：以去脂牛血清白蛋白（d-BSA）为溶解软脂酸的载体，以加入培养液中软脂酸浓度的不同分为200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L（各组载体d-BSA含量为0.2%、0.4%、0.6%）；（2）葡萄糖干预组，30 mmol/L GLU；（3）联合培养组：30 mmol/L GLU + 400 μmol/L PA；（4）对照组：①正常培养液组（含5.5mmol/L GLU），②0.5% d-BSA+正常培养液组。
1.4 形态学观察
以每孔1×104个细胞接种于6孔板中，细胞贴壁后加入PA及葡萄糖。设正常培养液组和0.5%d-BSA+正常培养液组为对照，于5%CO2、37℃温箱中孵育48 h，在倒置显微镜下观察并照相。
1.5 生长曲线的测定
取90%单层融合的鼠主动脉内皮细胞P3代细胞消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为3×104/mL，接种至24孔培养板中，每孔1 mL，每三孔为1组，共8组。每隔24 h抽查一组，用血球计数板数细胞数目，以时间为横坐标，培养细胞数对数为纵坐标绘制生长曲线。细胞倍增时间以以下公式计算：TD =T×log2/（log Nt-log No），T为培养时间，Nt和No分别代表接种后及培养T小时后的细胞数。
1.6 主动脉内皮细胞生存率的检测（MTT比色法）
将细胞培养至单层融合时，换无血清RPMI1640培养液同步化细胞24 h，分别给于不同浓度的干预液，共同孵育24 h、48 h、72 h终点时，每孔依次加入MTT溶液20 μL（5 mg/mL），避光继续培养4 h，弃培养上清液；每孔加入DMSO 150 μL，置37℃水浴摇床均匀震荡10 min，室温放置10 min，使结晶物充分溶解；用酶标仪在492 nm波长处测定其吸光度（A）值。
1.7 免疫化学染色法测定IL-8、Bcl-2/BAX表达水平
常规消化，收集主动脉内皮细胞，按照每孔1×105接种于放有盖玻片的6孔板内，每孔加入2 mL 1640内皮细胞培养液，置于37℃、5%CO2孵育箱细胞爬片24 h，换无血清培养液培养24 h同步化细胞后加入不同浓度的棕榈酸及葡萄糖继续培养48 h，在48 h终点进行试验：先用PBS洗两次，加入4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗两次，灭活酶室温30 min，蒸馏水洗2次，胰酶37℃修复10 min，PBS洗2次，山羊血清37℃封闭30 min，按操作说明滴加抗体，苏木素复染，脱水透明风干后封片，每次试验均以PBS代替一抗作为阴性对照组，以胞质出现棕黄色颗粒为阳性。采用Image-Pro Plus（IPP）分析免疫组化图片。
1.8 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较显著性检验采用方差分析（ANOVA），两两比较用q检验，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 主动脉内皮细胞形态
原代细胞在培养5～7 d后，在主动脉贴壁附近可见少量游出的内皮细胞，呈多角形或短梭形；培养到12～13 d，可见迁移出的细胞呈片生长，70%～80%单层融合，分布密度不均。见图1。大鼠主动脉内皮细胞在传代接种2 h后开始贴壁，24 h后90%细胞贴壁生长，24～48 h间细胞量有所减少，48 h后可见新长出的细胞为单层、互不重叠，呈梭形或鹅卵石状，边界清晰，胞浆丰富，核清晰，呈多角形。第3～5天，可见细胞呈小片状集落生长，细胞涨势增快，第5～7天细胞生长融合成片，中间排列紧密，部分可见典型的“铺路石”状排列的单层细胞。培养至7～8代后，细胞变瘦小，分泌物增多，可见细胞分化，成老化状态。
图1 原代大鼠主动脉内皮细胞100×
2.2 CD31相关抗原免疫组化鉴定结果
可见细胞呈圆形、梭形或多边形，细胞胞浆内可见棕黄色颗粒（图2a）,而对照组内未见着色（图2b）。证实培养的细胞为大鼠主动脉内皮细胞。
2.3 各组细胞（MTT）增殖状况
不同剂量的棕榈酸、葡萄糖及联合培养组处理内皮细胞24 h、48 h、72 h后，与正常培养液组及d-BSA对照组相比差异有统计学意义（P ＜ 0.05），其中24 h低剂量PA组与对照组相比，差异无统计学意义（P ＞ 0.05），说明短时间低浓度的棕榈酸酯对内皮细胞的损害较小；相同浓度时，24 h与72 h组内比较，高糖组、高、中、低剂量棕榈酸组差异有高度统计学意义（P ＜ 0.01），联合培养组不同时间段差异均有高度统计学意义（P ＜ 0.01）；高糖组、中、高剂量棕榈酸组48 h与72 h组内比较，24 h与48 h组内比较差异有统计学意义（P ＜ 0.05），低剂量组24 h与48 h，48 h与72 h组内比较差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。正常培养液组与d-BSA组相比无统计学意义（P ＞ 0.05），见表1。说明棕榈酸及高糖抑制大鼠主动脉内皮细胞增殖，并具有时间-剂量依赖趋势；高糖及高脂联合培养组具有协同抑制作用，且具有时间依赖趋势。见图3。
注：横坐标（X轴）代表分组：①1640组为正常对照组（含GLU5.5 mmol/L）；②d-BSA组为0.5%d-BSA+1640对照组（含GLU5.5 mmol/L）；③高糖组为30 mmol/L GLU组；④联合组为30 mmol/L GLU+400 μmol/L PA；⑤低浓度PA为200 μmol/LPA组；⑥中浓度PA为400 μmol/L PA组；⑦高浓度PA为600 μmol/L PA组；纵坐标（Y轴）代表增殖率
图3 FFAs及葡萄糖对RAEC增殖的影响
2.4 细胞生长曲线
大鼠主动脉内皮细胞在传代接种2 h后开始贴壁，24 h后90%细胞贴壁生长，24～48 h间细胞量有所减少，48 h后可见新长出的细胞为单层、互不重叠，传代细胞增殖速率较原代细胞增长稍快，第4～7天为对数生长期，第8～9天为平台期。细胞生长曲线呈“S”型。见图4。
图4 大鼠主动脉内皮细胞生长曲线
2.5 细胞免疫组化法检测结果
正常对照组、d-BSA对照组培养内皮细胞48 h后，IL-8、BAX几乎不表达或弱表达，两个对照组之间差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。不同浓度FFAs、高糖及联合培养组处理细胞后，细胞IL-8表达明显增高，且具有剂量-时间依赖关系，与对照组相比，差异均具有统计学意义（P ＜ 0.05）；细胞Bcl-2表达随时间延长及浓度的增高表达逐渐减弱，与正常对照组及d-BSA对照组相比，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）；而细胞BAX表达则随时间的延长及浓度的增加表达亦增强，与正常对照组及d-BSA组比较，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。Bcl-2/BAX比值随葡萄糖及棕榈酸浓度增高逐渐减低，联合培养组为甚。见表2。
3 讨论
糖尿病血管病变是糖尿病特异的病理生理改变，是糖尿病多种并发症的共同病理生理基础（糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病心血管病变）。2型糖尿病患者常伴有血脂代谢异常，血清游离脂肪酸浓度随着血糖的增高而发生改变，伴随空腹血糖水平的升高而升高[3]。血管内皮细胞裱衬在整个心血管系统的内表面，是血管壁与血液之间的分界细胞，是形成心血管封闭管道系统的形态基础。血管内皮细胞不仅是炎症反应的中介物，也是受损靶器官，通过一系列复杂的机制从而影响炎症反应的进展和结局。内皮细胞的存活和细胞的程序性死亡在维护血管结构及血管生成中是极其重要的[4]。
bcl-2基因（即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一种原癌基因，具有抑制凋亡的作用。bax基因属于bcl-2基因家族，编码的BAX蛋白可与Bcl-2形成异二聚体，对Bcl-2产生阻抑作用。bax与bcl-2相互制约，在正常情况下二者保持一种平衡状态。研究发现Bax/Bcl-2两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素，因此认为，bax是极重要的促细胞凋亡基因之一。BAX主要位于细胞质中，当凋亡发生时，BAX即刻转移到线粒体并与线粒体膜相结合，通过加速线粒体内细胞色素C的释放和增加Caspases的活性来促进细胞凋亡。目前国内外大多数学者把细胞Bcl-2/BAX值作为判断细胞凋亡是否被抑制或加强的主要标志之一[5]。
高血糖能通过减少Akt活性抑制葡萄糖转运子4（GLUT-4）介导葡萄糖转运，导致2型糖尿病。高葡萄糖可明显引起内皮细胞的早期凋亡，而不影响细胞的坏死，其形成可能与Akt酶活性下降有关。可能是通过PI3K-Akt信号途径抑制内皮细胞增殖，Akt的308位点苏氨酸磷酸化是葡萄糖影响内皮细胞增殖信号级联中的敏感元件[6]。PI3K-Akt信号途径在葡萄糖对内皮细胞增殖和凋亡过程中起了重要的作用[7]。因此，严格控制血糖是有效防治糖尿病血管并发症的措施。
IL-8由多种细胞产生，包括外周血淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞等，近来发现内皮细胞及肾小管上皮细胞也可产生。IL-8参与多种炎症疾患的发病过程，其自分泌和旁分泌功能已被证实在血管新生、肿瘤生长和转移中起重要作用[8，9]。Tashiro等发现，糖尿病患者尿中IL-8水平与HbA1c水平有显著联系，提示高血糖可能刺激IL-8的合成和分泌[10]。我们的实验证实，在高糖条件下，与对照组相比，IL-8表达增加，与Tashiro所观察到的反应一致；而在FFAs干预下，实验组中呈阳性表达，在正常对照组细胞内呈阴性表达，由此推测，在FFAs的诱导下，IL-8的上调，进一步介导炎性反应，在联合组中，高糖及高脂具有协同作用，参与了糖尿病血管病变的发展和恶化。
本实验研究证实大鼠主动脉内皮细胞在葡萄糖及FFAs干预下，细胞凋亡增加，并具有浓度-剂量依赖趋势。在高糖环境下，FFAs引起Akt快速激活，并导致PI3K受体激活，增加了细胞内活性氧水平，通过氧化应激使细胞内IL-8表达增加，同时激活PKC通路，使其转位，引起其下游Bcl-2蛋白表达减弱，BAX表达增强，因此，Bcl-2/BAX比值减小。FFAs诱导内皮细胞凋亡可能部分通过bcl-2改变线粒体膜的功能，并释放细胞色素C，部分通过调整Bcl-2/BAX的比率引起细胞凋亡。因此，Bcl-2可抑制线粒体介导的细胞死亡[11]。高糖环境下，高棕榈酸酯可激活细胞凋亡的机制导致内皮细胞凋亡，PI3K-Akt信号缺陷参与了糖尿病血管病变的发生发展，从而引起2型糖尿病患者心血管并发症。
本研究结果显示，糖尿病患者血浆中升高的FFAs通过影响内皮细胞的功能，损伤内皮细胞的完整性，从而在糖尿病血管病变中扮演一个非常重要的角色。FFAs引起的脂毒性在糖尿病血管病变中有重要的发病学意义，深入研究其发病机制及其作用机制，对预防及延缓糖尿病血管病变的发生发展具有广阔的前景和重要的临床价值。
[参考文献]
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（收稿日期：2012-01-16）
游离细胞 篇3
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2010 年1 月至2014 年6 月我院收治的60 例手足部软组织缺损患者为研究对象, 随机分为研究组和对照组, 每组30 例。研究组男18 例, 女12 例, 年龄18~70 岁、平均 (45.3±4.28) 岁, 采用游离腓浅动脉穿支超薄皮瓣修复10 例、采用游离股前外侧超薄皮瓣修复8 例、采用游离股前内侧超薄穿支皮瓣修复12 例;对照组男20 例, 女10 例, 年龄19~70 岁、平均 (44.7±3.79) 岁, 采用游离腓浅动脉穿支超薄皮瓣修复10 例、采用游离股前外侧超薄皮瓣修复9 例、采用游离股前内侧超薄穿支皮瓣修复11 例。两组患者随机分配, 性别、年龄等资料比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 两组患者具有可比性。
1.2 病例纳入和排除标准
纳入标准: (1) 手足部软组织缺损患者, (2) 患者自愿参与, 并签署知情同意书 (3) 无手足外伤病史, (4) 无法通过植皮修复, (5) 无其他重大疾病。
排除标准: (1) 患者拒绝参与, (2) 小于18 岁患者, (3) 合并心血管、糖尿病等严重疾病, (4) 精神障碍患者, (5) 双侧下肢患有炎症、皮肤病等供区条件不良患者。
1.3 治疗方法
为了提高移植修复成功率, 所有患者先处理受区, 待确定受区供血动脉能正常喷血后再切取游离皮瓣, 游离皮瓣面积需大于缺损面积10%。
1.3.1 对照组
患者行全麻后取仰卧位, 受区彻底清创后, 向近端分离受区动静脉血管, 检查血管是否通畅, 测量缺损区域大小以进行皮瓣设计与切取。采用三种游离超薄穿支皮瓣: (1) 游离腓浅动脉穿支超薄皮瓣:自胫骨外侧髁至外踝顶点做一连线, 中点作为皮瓣血管穿支点, 根据术前设计切开皮瓣外缘, 于浅筋膜层中寻找血管穿支, 并注意保护, 然后沿穿支血管切开深筋膜, 于腓骨短肌与趾长伸肌之间寻至腓浅动脉主干并结扎, 游离至腓浅动脉及伴行静脉至所需长度, 需去除血管周围肌肉组织; (2) 游离股前外侧超薄穿支皮瓣:以髂前上棘至髌骨外缘连线的中点作为皮瓣血管穿支点, 根据术前设计切开皮瓣外缘, 于浅筋膜层中寻找血管穿支, 然后沿穿支血管切开深筋膜, 游离股外侧肌内行走穿支血管至所需长度, 需去除血管周围肌肉组织; (3) 游离股前内侧超薄穿支皮瓣:以髂前上棘与髌骨内沿连线、腹股沟中点与股骨内髁连线交叉点作为皮瓣血管穿支点, 根据术前设计切开皮瓣内缘, 于浅筋膜层中寻找血管穿支, 然后沿穿支血管切开深筋膜, 游离于股直肌与股内侧肌之间行走穿支血管至所需长度, 需去除血管周围肌肉组织。血管游离完毕后, 确认血管全段无损伤且搏动良好后, 将皮瓣完全掀起, 检查皮瓣边沿渗血情况, 根据受区所需血管蒂长度结扎并切断动脉及伴行静脉。供区根据需要直接缝合或植皮, 受区则根据血管情况对动脉行端- 端或端- 侧吻合, 对静脉行端- 端吻合, 在调整皮瓣张力后缝合皮瓣, 常规负压引流。
1.3.2 研究组
患者在彻底清创处理后, 将制备好的自体富血小板血浆凝胶均匀涂抹于创面上, 在此基础上行对照组治疗方法。
1.4 疗效评价
观察两组患者治疗后创面恢复情况及血清促红细胞生成素情况。治愈:创面完全恢复, 手足部外观及生理功能恢复>90%;有效:创面显著修复, 手足部外观及生理功能恢复50%~90%;无效:创面无明显改善, 手足部外观及生理功能恢复<50%[3]。
1.5 统计学方法
采用SPSS19.0 统计软件进行分析, 计数资料用 χ2检验, 以百分比表示, 计量资料用t检验, 以表示, P<0.05为差异有无统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者创面愈合时间、创面愈合率及促红细胞生成素水平比较
研究组患者创面愈合率及促红细胞生成素水平高于对照组, 差异显著具有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。
2.2 两组患者治疗有效率
研究组患者治疗有效率优于对照组, 两组相比差异显著具有统计学意义 (P<0.05) , 见表2。
注:与对照组比较, aP<0.05
3 讨论
随着社会快速发展, 高能量外伤越来越多, 人体主要通过手、足同外界接触, 较易受伤, 手足外伤通常伴随着软组织的缺损, 从而导致血管、神经或肌腱组织的外露, 如不能及时处理很容易致使创伤部位的感染及影响肢体的功能, 给患者精神和生活带来极大困扰。随着显微外科技术的迅速发展, 越来越多的手足部软组织缺损的修复方法应用于临床。
富血小板血浆是自体全血经过离心分离后的血小板浓缩物, 富含能够促进创面愈合和软组织的修复的多种生长因子及纤维蛋白[4], 同时富血小板血浆中还含有一定量的白细胞及单核细胞, 能够一定程度上降低感染率[5]。富血小板血浆是通过离心分离自体全血制备而成, 能够避免免疫排斥反应的发生。自体富血小板血浆凝胶是富血小板血浆用凝血酶凝固而成, 能够黏合软组织缺损处的同时还能够避免血小板的流失, 保证血小板能够在局部长时间分泌生长因子, 从而使生长因子能够长时间保持较高的浓度。
皮瓣移植修复手足部软组织在临床已广泛开展[6], 传统的穿支皮瓣虽然可不带肌肉, 避免了对供区肌肉功能的损害, 但其皮瓣皮下脂肪较多, 厚薄不均匀, 导致外形臃肿, 还需要行二期整形。超薄穿支皮瓣仅带较薄的脂肪甚至部分不带脂肪层, 能够将供区肌肉及血管的损伤降至最低, 且厚薄均匀不需二期整形。由于其皮瓣更薄, 降低了耗氧量, 对皮瓣远端供血有利, 提高了大面积皮瓣的存活率。同时由于其仅带较薄的脂肪甚至部分不带脂肪层, 能够使皮瓣与受区组织紧密结合, 从而避免术后皮瓣松弛情况, 影响该部位的部分功能。
促红细胞生成素是能够促进红细胞增殖、分化及成熟的一种细胞因子[7], 能够促进新生血管生成, 在缺氧的情况下还能够结合促红细胞生成素受体, 促进新生血管的形成, 从而保护受损软组织。如何解决创面的血管化问题是治疗手足部软组织缺损创面关键。新生毛细血管大量出现能充实肉芽组织和改善创面微循环, 还能为创面修复提供必需的氧和丰富的营养物质, 同时还能降低创面感染率, 从而促进创面愈合。
本次研究显示, 采用自体富血小板血浆凝胶联合游离超薄穿支皮瓣移植修复手足创面, 其创面愈合率、促红细胞生成素水平及治疗有效率优于单纯采用 (三种) 游离超薄穿支皮瓣, 临床效果更好, 值得在临床上应用推广。
摘要：目的 探讨应用自体富血小板血浆凝胶联合游离超薄穿支皮瓣移植修复手足创面对患者预后及血清促红细胞生成素的影响。方法 选取2010年1月至2014年6月60例手足部软组织缺损患者, 随机分为研究组和对照组, 每组30例。对照组给予游离超薄穿支皮瓣移植治疗, 研究组给予自体富血小板血浆凝胶联合游离超薄穿支皮瓣移植治疗。结果 研究组患者创面愈合率及促红细胞生成素水平高于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;研究组治疗有效率优于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论 采用自体富血小板血浆凝胶联合游离超薄穿支皮瓣移植修复手足创面, 临床效果优于单纯采用游离超薄穿支皮瓣。
关键词：富血小板血浆凝胶,超薄穿支皮瓣,促红细胞生成素
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半叶紫菜游离丝状体培育技术 篇4
我国的半叶紫菜主要分布在山东青岛至辽宁大连的黄海西部海区, 通过培养半叶紫菜的游离丝状体, 用游离丝状体接种贝壳进行半叶紫菜苗种培育, 或者将半叶紫菜游离丝状体培养成熟, 直接用游离丝状体在半叶紫菜网帘上采集壳孢子, 培养半叶紫菜的游离丝状体, 在一定程度上可以及时、足量、高质量的解决网帘上半叶紫菜海上养殖的苗种供应问题。
迄今为止, 对半叶紫菜叶状体的研究比较多, 也有个别丝状体培育成苗的研究, 但未见关于半叶紫菜游离丝状体培育技术方面的系统报道。
1 使用种菜、工具、用水的准备
1.1 种菜准备
2013 年2 月15 日上午, 在山东省青岛市附近岛屿的岩石上, 找到有半叶紫菜叶状体的岩石, 先铲掉岩石上的藤壶、牡蛎壳, 捡掉杂草、块状物, 反复用干净的海水尽可能的清除岩石和半叶紫菜叶状体上的浮泥, 将全部的紫菜叶状体采集放在水桶里, 到一个安全方便的地方, 再次挑选长度大于10cm的叶状体, 要求叶状体完整、无畸形、无病斑、无难以去除的附着物、表面具光泽, 把叶状体放在装水的带盖的塑料桶内, 之后运到江苏连云港的省紫菜良种繁育场, 待处理。
1.2 器具消毒准备
处理种菜、果孢子的用具有解剖盘、解剖刀、毛笔、纱布、脱脂棉、解剖剪刀、镊子、一次性手套、玻璃培养皿、50 m L三角烧瓶20 个等;扩增的用具有量筒、量杯, 100 m L、250 m L、500 m L三角烧瓶, 3 000 m L、10 000 m L细口玻璃瓶等;消毒用具有酒精灯、酒精喷壶、烧水的锅、电炉、70%的消毒酒精等。
小型器皿放在烧水的锅内沸水消毒;不能加热的器具酒精消毒;三角烧瓶蒸煮消毒;必要时用酒精喷壶消毒;房间用紫外线消毒, 在半叶紫菜送到良种室前, 做好上述消毒准备工作。
1.3 培养海水的准备
所用海水符合养殖用水要求, 盐度28, 经过黑暗沉淀, 再经90 ℃加温消毒处理, 在半叶紫菜到良种室前, 准备好两份海水备用, 一份是10 000 m L加热消毒的海水, 一份是10 000 m L添加营养盐的培养液, 前一份是处理种菜使用, 后一份是将果孢子培养成游离丝状体时使用。
2制作半叶紫菜游离丝状体
2.1 处理种菜
2 月16 日上午, 在保种室的操作车间的操作台上, 先选择个体大的半叶紫菜叶状体, 平摊在解剖盘里, 用脱脂棉蘸取消毒海水, 反复正反两面擦洗半叶紫菜叶状体, 操作2~3 次。然后, 在白瓷盘中装消毒海水, 用毛笔仔细逐个正反两面洗刷叶状体2~3 次。用消毒镊子夹半叶紫菜叶状体放入带盖的广口瓶中, 注入消毒海水, 加盖, 往复振荡广口瓶, 洗涤半叶紫菜叶状体。之后从广口瓶中取出叶状体, 用滤纸吸掉藻体上海水, 将紫菜叶状体平摆在洗刷并消毒的笊帘中, 用消毒纱布盖在叶状体上, 进行阴干刺激24 h。
2.2 种菜放散果孢子
2 月17 日, 在多个三角烧瓶内, 分别添加40m L培养液。
将种菜平摊在解剖盘中, 用解剖刀在半叶紫菜叶状体的端部和前部, 各取5 cm2大小的叶状体小块, 用镊子夹入50 m L的三角烧瓶中, 每个瓶子1块, 共在20 个小三角烧瓶中投放半叶紫菜叶状体小块。每个三角烧瓶加上标签, 纪录紫菜种的名称、来源时间与地点、性状等, 整个操作争取在在无菌的条件下进行。将三角烧瓶放在僻静的地方, 3~5 d摇动瓶子1 次, 一方面促进壳孢子大量放散, 另一方面让果孢子均匀的沉淀于瓶底, 3 月20 日用镊子把种菜取出。这期间, 光线强度为50~200 lx, 水温15~20 ℃, 盐度28。
3 半叶紫菜游离丝状体的扩增
3.1 刚接种丝状体的换瓶
4 月30 日—5 月10 日, 挑选、整理三角烧瓶内游离丝状体, 将肉眼观察有明显绿藻、硅藻、蓝藻等污染以及肉眼还没有观察到丝状体的瓶子, 全部清理。通过统计, 20 个50 m L的三角烧瓶, 硅藻污染7个, 肉眼看不到游离丝状体的5 个, 蓝藻污染的1个, 破碎瓶子1 个, 成功培育出无污染的游离丝状体6 个, 成功率30%。
在室内操作台上, 准备10 个100 m L三角烧瓶和2 000 m L加热处理的海水, 在2 000 m L海水中加入营养液制成培养液。由于大部分半叶紫菜游离丝状体贴附在三角烧瓶底部或瓶壁, 操作时用消过毒的毛笔将藻丝刷离瓶底或瓶壁, 然后将藻丝及其原培养液倒入准备好的100 m L三角烧瓶中, 加入新的培养液到100 m L。用白纸封口放在适当位置, 贴上预先准备好的标签, 这样一个换瓶子的操作就结束了, 在这里要特别说明的是整个操作要做到相互隔离, 即每一个换瓶操作的器皿、工具、一次性手套等都是专用的, 共同使用的器具在进行下一个操作时, 要重新消毒处理;其二, 在每一个换瓶操作中, 每一个环节都要注意消毒处理, 尽量减少每个环节出现丝状体污染的可能性。
营养液的肥料主要为硝酸钠、磷酸二氢钾、柠檬酸铁、碘化钾等, 施肥量为氮14×10-6、磷7×10-6、铁1×10-6、钾0.1×10-6, 由于培养期间, 培养液会不断的蒸发, 为了稳定培养液的盐度, 在换水间隔期间, 根据实际情况, 在培养液中加入一定量的蒸馏水。在此期间, 光线强度为150~300 lx, 水温15~20℃, 盐度28。
3.2 游离丝状体的扩种培养
5 月25 日以后, 开始了半叶紫菜游离丝状体的扩增操作, 由于半叶紫菜养殖试验、推广尚处于探索阶段, 该良种场主要进行了半叶紫菜游离丝状体保种和小规模的扩增, 用果孢子培育的良种游离丝状体数量也有限, 具体扩增的方法参照条斑紫菜游离丝状体培育的相关技术操作。
4 半叶紫菜游离丝状体的保种
4.1 半叶紫菜游离丝状体保种方法
保种主要参照条斑紫菜游离丝状体的保种方法。一级保种:将纯净游离丝状体分装于试管或小三角烧瓶中, 置于展示柜中, 进行长年保存。二级保种:取部分一级保存的游离丝状体, 分装于100 m L三角烧瓶内, 置于10~15 ℃、100~120 lx环境中培养, 控制游离丝状体低速增长, 保证随时扩增需要。
4.2 半叶紫菜游离丝状体保种效果
采取液相低温保存半叶紫菜游离丝状体。从目前的情况看, 保存的半叶紫菜游离丝状体, 绝大多数形态结构正常、状态良好, 保持原种品系特性。
5 半叶紫菜游离丝状体的形态特点
对半叶紫菜游离丝状体、坛紫菜游离丝状体、条斑紫菜游离丝状体培育形态进行了观察, 并将它们的形态特点进行了比较, 形成了一点粗浅的认识。
让生物知识不再游离生活之外 篇5
生物学的产生和发展与广大劳动人民的生产实践密不可分。生物学研究的对象是生命现象和规律, 其中也包括人类自身, 这使得“生活联想”在生物教学中不可或缺。它借助学生对现实生活中生命现象的了解, 用真实的语言, 有趣的活动, 让学生在形象化中理解生命现象的定理、定义、概念等。用此种方法可以培养学生良好的听课习惯, 还可以提高学生的理解能力和解决问题的能力, 对教学成功有极大的帮助。
在新课程标准中有一个显著的特点:在追求课程目标是, 教师应该用经历、体验、探索等方法对课程加以描述。“生活联想”便是这一特点在教学中的体现。学生个人的经历、体验是宝贵的教学资源, 在教学中充分加以运用, 就会取得意想不到的效果。知识来源于经验, 经验来源于实践生活。生活是灵活多变的, 那么对知识的传授和吸取也不能一成不变。教师可以用生活搭建知识与学生的桥梁, 在实践中理解知识, 反过来用知识去指导实践。在教学中, 教师的作用就是将课本教材中缺失了生命的知识重新恢复其活力, 使学生从中充分享受研究与发现的乐趣。但“生活联想”不是凭空的想象, 也不是把生活上的经验往课本内容生搬硬套, 而是通过事物的相近性, 让学生加深对课本知识的理解。
教师将生活引入课堂, 通过对生自学成才的联想, 激发学生的学习热情, 启发他们的思想, 可以借助以下几种方法:第一, 借助新教材的优势, 引入生活联想。我们可以依据新教材, 课前布置一些与生活有关的作业, 让学生带着问题深入生活, 然后把生活中的问题带入课堂中与教师共同解决。第二, 用常识引入生自学成才联想。课本中的每个知识点都与生活常识密不可分, 而学生对生活常识的兴趣往往大于对课本内容的兴趣, 这时教师把生活常识引入课堂中, 让学生通过常识联想到知识, 就能够吸引学生的注意力。第三, 把生活经验引入课堂。每个学生都有不同的经历, 也有不同的经验, 这些日常生活积累下来的经历和经验对于课堂教学来说是一笔宝贵的财富, 教师让学生充分运用这笔财富, 主动深入课堂。这要求教师首先了解学生所知所感, 联系课本提出与学生生活的有关问题, 让他们根据自己的生活经验回答, 然后再根据科学知识找出他们的不足。这样既让学生学习到知识, 又让他们对学习产生浓厚的兴趣。第四, 运用实例, 建立生活联想。生活中有很多的实例, 看似与课程无关, 但是只要仔细找出它们之间的联系, 教师就可以用形象化的事物来解释抽象的事物, 加深学生的理解, 促使他们认真听课。
土壤游离氨基酸研究概述 篇6
关于传统陆地生态系统氮循环主要关注的是无机氮元素的循环,即矿质氮元素(NH4+,NO3-)的增加、分布、消耗等[1,2]。植物———土壤———微生物如何利用和调节生态系统无机氮源平衡的相关研究已比较成熟,并且已建立了比较完善的概念模型以供参考[3]。早期学术界普遍认为,植物并不需要直接利用有机氮源,并且在与微生物竞争利用无机氮源中处于劣势,只有微生物利用剩余的无机氮源(NH4+,NO3-),才能予以植物利用[4]。直到最近20年的相关研究揭示,陆生生态系统中的植物可以利用有机氮源,在有机氮源(氨基酸等)浓度等于或高于无机氮源(NH4+,NO3-)时,植物能够直接利用土壤中游离的氨基酸作为氮源。但目前关于土壤生态系统中氨基酸等有机氮源的利用研究仍处于初期[5,6,7]。目前土壤中游离氨基酸的相关研究主要集中两极、高海拔生态系统、北方寒冷森林系统中。这些地方气候严寒,导致氮元素矿化受到抑制,无机氮元素含量相对较低,因此这些条件下的生态系统中植物氮源主要以氨基酸为主,所以土壤中游离氨基酸对生态系统中的植物微生物具有重要作用。目前,普遍将土壤中的氨基酸作为低肥力生态系统中的氮库组成之一嵌入到生态系统中经典氮素循环模型中。Aber等人提出了植物对氮源的利用随着土壤中氮素的含量变化而改变,在低肥力的土壤中,植物主要以氨基酸为主要氮源,随着土壤肥力提高,逐步依次利用NH4+和NO3-,造成以上现象的主要原因是与生态系统中微生物的作用相关。在低肥力土壤中的微生物主要将N源合成有机物而矿化作用受到抑制,在高肥力土壤中主要是将N源进行矿化,因此低肥力土壤中植物主要利用氨基酸等有机氮源,而高肥力土壤中则利用无机氮源[1,8]。Aber等人的理论不仅与目前研究实验结果数据相吻合,同时也与两极、高海拔生态系统、北方寒冷森林系统实际情况相一致[9]。
目前相关研究显示土壤中的氨基酸不仅仅为植物还有微生物提供碳源和氮源,同时还在生态系统中碳氮循环中起到至关重要的作用[10,11]。对土壤中氨基酸等有机氮源的研究,不仅可以了解不同生态系统中物质循环的规律与机理,同时对生态系统的改造、保护及农业发展具有重要意义。
2 土壤中游离氨基酸的种类及来源
2.1 土壤中氨基酸的种类
生命系统中主要是20种天然的α-氨基酸参与生命过程中功能载体蛋白质的合成。研究发现,从土壤溶液或土壤提取液中鉴定出多种氨基酸,其中谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸含量相对较高,其次是丙氨酸、精氨酸、赖氨酸等氨基酸[12]。土壤中氨基酸的含量受地域、季节、采样时间、生物分布于活动等多种因素的影响,同时因为土壤中游离氨基酸易被植物吸收利用,因此土壤中主要氨基酸种类处于动态变化之中[13]。土壤中氨基酸的种类的丰富化是有机氮库的重要组成部分,也是植物氮源的保证。
2.2 土壤中氨基酸的来源
土壤中的氨基酸主要是各种来源的高分子有机物质通过微生物的分解后进入土壤中[14],其主要来源包括以下途径:
2.2.1 植物地上部分凋落腐败。
植物的枯枝落叶花瓣等凋落后,通过微生物的腐败分解作用后释放出大量的含氮物质,其中包括大量的氨基酸,释放出的氨基酸通过直接的沉降或者雨水的冲刷淋入土壤。地面植被的种类直接影响土壤中氨基酸的种类和含量[14,15]。
2.2.2 植物根系的死亡腐败。
植物根系功能复杂而强大,其中含有丰富的蛋白质,植物根系死亡腐败后能释放出各种丰富的氨基酸[14,15,16]。
2.2.3 其他来源途径。
主要包括土壤中微生物集中死亡释放出的氨基酸、植物根系自身分泌释放出的氨基酸、外源性氮源的添加如人工施肥后进入土壤中的氨基酸、动物活动因素如动物粪便偶然的动物尸体腐败而进入土壤的氨基酸。总之,蛋白质来源的氨基酸是土壤中氨基酸最稳定也是最主要的来源途径[14,15,16,17]。
3 土壤中氨基酸含量及测定方法
要保证植物的生长,提供其所需的氨基酸,则需要保证土壤中氨基酸的含量在一定指标之上。研究显示,氨基酸的含量常占土壤中氮元素含量的20%~50%,其含量与土壤中的微生物代谢息息相关,有机碳源和无机碳源共同为生态系统循环提供物质基础[18]。
土壤中氨基酸总含量是相当丰富的,然而游离的氨基酸含量却是很少。土壤中游离氨基酸的含量通常在每4μg/g以下,而土壤中氨基酸的总含量在500~1600μg/g之间,游离氨基酸占土壤中氨基酸总量1%以下,也只有土壤中游离的氨基酸才能够被植物吸收并利用。其中,丙氨酸(7%~15%)、组氨酸(5%~10%)、谷氨酸及其盐类(0~20%)、天冬氨酸及其盐类(0~20%)占游离氨基酸总量的80%以上[19]。同样,土壤中游离氨基酸的含量随地域、季节等多重因素的变化而变化。
土壤中氨基酸的鉴定与含量测定主要基于氨基酸自身特性,如分子量、碳含量,碳氮比、溶解性、离子交换性等物理化学性质[20]。如前所述,土壤中的氨基酸主要包括游离氨基酸和其他类型的氨基酸(如多肽、蛋白质中的氨基酸)。氨基酸总量的测定可以通过常规的显色反应进行,如茚三酮分光光度法、邻二苯甲醛和β-巯基乙醇荧光光度法。以上检测方法能够快速、准确、便宜地检测出土壤中氨基酸含量,但不能对氨基酸的组成进行分析。在不同地域、气候等条件下,植物对不同的氨基酸具有不同的吸收速率,因需要对土壤中的氨基酸组成进行定性和定量,才能揭示氨基酸在生态系统中氮素循环的重要作用[21]。
研究中,常用于个体氨基酸定性和定量分析的方法主要包括气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气质联用色谱法(GC-MS)、液质联用色谱法(LC-MS),柱后水合茚三酮显色阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法等。气相色谱是发展比较成熟的分析技术,其应用于土壤中氨基酸的测定操作简便快捷;但是气相色谱法也由于专一性差等因素限制了其在土壤中氨基酸测定中的应用。随着分析技术的发展,气相色谱与其他方法联用的检测技术开始出现,如气相色谱与质谱联用(GC-MS),气相色谱与同位素比例质谱联用等技术。气相色谱与同位素比例质谱联用,不仅能测定土壤中氨基酸含量,同时能够利用同位素标记追踪土壤中氨基酸的转化和生态循环过程。高效液相色谱法是目前分析方法中最常用,也是应用最为广泛的检测方法,高效液相色谱法测定土壤中的氨基酸关键是进行衍生和检测器的选择。常用于土壤中氨基酸测定的高效液相色谱衍生方法主要是二硝基氟苯衍生法、邻苯二甲醛衍生法等[21]。不同检测方法各有特点和检测特性,需根据待检测样品的性质和实验目的综合考虑选择检测方法。
气相色谱和液相色谱在土壤中氨基酸检测中不足之处在于样品的前处理。土壤成分十分复杂,常常需要水解、提取、脱盐甚至衍生化后才能进行检测。操作步骤的繁琐常导致最终测定结果的偏差较大。目前出现的一些新兴分析技术,如毛细管电泳技术、荧光OPAME技术能够快速、准确定量,已经开始逐渐在测定土壤氨基酸含量中使用[22]。
4 影响土壤中游离氨基酸含量的因素
土壤中游离氨基酸主要来源于生物有机体蛋白质的分解。因此能够影响土壤氨基酸来源的因素均会影响土壤中氨基酸的含量。主要包括非生物因素和生物因素。
4.1 非生物因素
非生物因素主要包括地域土壤性质、温度、氨基酸本身的性质等。由于不同区域土壤组成成分存在差异,如三氧化二物能够吸附氨基酸,导致氨基酸不易流失而使得土壤中氨基酸含量相对较高。土壤中矿质元素的含量和种类对土壤中氨基酸含量变化也有影响。氨基酸会与矿质元素发生相互作用(如络合等)[23,24],从而影响氨基酸的流向。土壤的酸碱性会影响土壤中蛋白水解酶的活性,因而影响土壤中氨基酸含量的变化。相关研究显示,土壤中氨基酸的含量随土壤肥力的升高而减低,这也在一定程度上解释为什么严寒地域的植物对氨基酸的吸收利用高于无机氮源。在低湿度的土壤中,氨基酸的含量随湿度的增加无显著变化,但湿度达到一定程度后,土壤中氨基酸的含量随湿度的变化出现显著性差异,这可能是由于土壤中水分含量较高时微生物综合利用合成氨基酸量增加而导致。温度主要是通过影响土壤中水分的含量和影响蛋白水解酶的活性而影响土壤中氨基酸的含量。氨基酸本身的性质如分子量、疏水性、电性、CN比等因素会通过影响土壤对氨基酸的吸附、交换和生物利用而影响土壤中氨基酸含量。
4.2 生物因素
首先,微生物和植物吸收土壤中的氨基酸加以利用,使得土壤中氨基酸的含量降低,同时植物和微生物通过分泌和死亡分解释放出氨基酸成为土壤氨基酸的来源,氨基酸含量的变化取决于上述2个过程的综合作用结果,同时植物和微生物的相互作用也是影响土壤中氨基酸含量的因素之一。其次,人类社会生产活动(农业灌溉、施肥)和动物活动都会影响土壤中氨基酸的含量。
5 土壤氨基酸在土壤中氮循环中的意义
19世纪中期,Liebig等人提出的纯矿质营养论认为,生态系统中氮的有效性和植物营养都是基于矿质化的氮,即使有研究显示植物根部能直接吸收氨基酸加以利用,但当时普遍认为植物吸收的氨基酸仅是微生物利用剩下的极少部分,并且植物和微生物在有机氮源的竞争中一直处于劣势。因此传统的纯矿质营养论长期处于主导地位,矿质氮(NH4+,NO3-)和氮净矿作用一直是生态系统中土壤氮的有效性评价核心。通常以土壤中矿质氮(NH4+,NO3-)含量及变化和土壤矿质氮的通量来作为生态系统中有效性氮的指标[21]。
1960年以后,随着相关研究的深入,越来越多的研究结果揭示,植物能够直接吸收氨基酸等有机氮源,许多土壤生态系统中有机氮源是充足的,并且植物能够竞争过微生物直接利用这些有机氮源。传统纯矿质理论开始受到挑战,植物对土壤中氨基酸的吸收利用,让人们重新思考氮的矿质化是否仍是土壤生态系统中氮循环的核心。植物对氨基酸类有机氮源的吸收,直接跨越了生物体内矿质氮(NH4+,NO3-)向有机氮转化过程,成为生态系统中氮循环的快速通道[21],加快了土壤中氮元素的库存周转,对研究整个生态系统中氮循环具有重要意义。同时也要求人们进行更加细致深入的研究,提出更加完善的生态系统氮循环模型,以解释氮循环的奥秘及作用。
6 总语
游离细胞 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
石家庄康普生科技有限公司KPS-KM化学发光免疫分析仪及北京科美生物技术有限公司提供的进口配套FT3、FT4、S-TSH的化学发光检测试剂。
1.2 标本
收集我院门诊和住院的甲状腺相关病人血清276例, 其中, 男126例, 女150例, 年龄17～75岁, 确诊甲亢151 例、确诊甲低 124例;正常对照组300 例, 男150 例, 女 150例, 年龄20～50岁, 来自本院职工体检标本。
1.3 标本要求
血液标本无脂血、无溶血, 在规定时间内分离血清, 经标记后分组在-20℃冻存, 最终统一取出融化后, 进行检测, 每个标本只能冻融1次, 检测严格按试剂盒说明书进行, 在3周内完成。所有血清在KPS-KM化学发光免疫分析仪进行FT3、FT4、S-TSH检测, 记录检测结果。
1.4 统计学方法
数据采用SAS软件处理, 计量资料以
2 结果
2.1 不同甲状腺功能状态下血清甲状腺激素水平
300例甲状腺功能正常者血清此三项指标检测结果均在正常范围;与正常者比较, 甲亢患者和甲低患者FT3、FT4、S-TSH检测结果均异常, 差异有统计学意义 (P<0.05, 见表1) 。
2.2 FT3、FT4、S-TSH与不同甲状腺功能临床诊断的符合率
正常组分别为82.3%, 83.0%, 96.0%;甲亢组分别为76.8%, 75.5%, 91.4%;甲低组分别为73.4%, 69.4%, 97.6%。由此可知S-TSH对甲亢、甲低的诊断符合率明显高于FT3和FT4, 而FT3和FT4对甲状腺疾病的诊断则无差异。
3 讨论
血清中总甲状腺激素 (T4、T3) 绝大部分和运载蛋白结合。由于结合态T4、T3无生理活性, 血清FT4、FT3测定则更准确地反映甲状腺功能[1]。化学发光免疫技术既具有发光检测的高度敏感性, 又具有免疫分析的高度特异性[2]。
美国国家临床生物化学协会以促甲状腺激素 (TSH) 检测为中心的策略评价甲状腺功能[3]。将TSH作为一线检测项目, 根据TSH的检测结果是否异常, 再检测游离甲状腺激素 (FT4) , 对甲状腺疾病进行鉴别诊断。在甲状腺功能亢进临床分型中的轻度、亚临床型甲状腺功能亢进及非甲状腺疾病 (NTI) 者出现一过性的TSH异常, TSH通常在0.01～0.1μIU/ml, 此时只有TSH才能检测到轻度、亚临床甲状腺功能异常[4]。
本研究结果表明, 甲亢患者血清FT3和FT4水平显著增高, FT3和FT4的持续增高反馈抑制S-TSH的分泌, 使血清TSH水平降低;而甲低患者血清FT3和FT4水平显著减低, S-TSH水平显著增高。此外, S-TSH在正常、甲亢、甲低组临床诊断的符合率分别为96%、91.4%、97.6%, 由此可知S-TSH对甲亢、甲低诊断的灵敏度优于FT3和FT4。在反映甲状腺功能状态上, 因其不与血浆蛋白结合, 干扰因素较FT3和FT4更少, 结果更可靠, 所以血清S-TSH是比甲状腺激素更敏感的指标。S-TSH含量的测定主要用于研究小丘脑-垂体-甲状腺轴之间的关系, 评价垂体-甲状腺功能状态。甲亢患者S-TSH水平偏低, 甲低患者S-TSH水平偏高。甲状腺素升高, S-TSH也升高多为下丘脑-垂体功能受损引起的继发性甲低。因此S-TSH在鉴别原发性甲低和继发性甲低方面有特别重要的意义。
综上所述, 将S-TSH、FT3和FT4 3项指标有机结合起来, 对甲状腺疾病进行实验室诊断具有重要价值。
关键词：甲状腺素,促甲状腺素,发光免疫分析仪
参考文献
[1]陶义训.免疫学和免疫学检验[M].2版.北京:人民卫生出版社, 1997:174.
[2]张丽民.化学发光标记及发光免疫分析[J].基础医学与临床, 1995, 15 (4) :247-248.
[3]郑沁, 黄亨建, 张国福, 等.Roche E170检测系统测定促甲状腺激素 (TSH) 分析灵敏度的验证[J].现代检验医学杂志, 2007, 22 (3) :58-60.