粗蛋白质（精选九篇）
粗蛋白质 篇1
1材料
饲料样品为苜蓿、玉米、豆粕。
五水硫酸铜、无水硫酸钠、浓硫酸、硼酸、氢氧化钠、盐酸等试剂,均为国药分析纯。消化炉( 型号为KDN - 020D) 、消化管、凯式蒸馏装置,均由内蒙古农业大学动物科学学院提供。
2方法
2.1试验设计
试验过程参考半微量凯氏定氮法[3],选用苜蓿、 玉米、豆粕3种饲料,由于是无水硫酸钠与五水硫酸铜2个因素,设定每个因素为3个水平,每种饲料分为9个处理,每个处理设3个重复( 见表1) 。每个处理分别添加不同量的五水硫酸铜和无水硫酸钠,通过消化蒸馏观察现象,并得出数据。其他试剂添加量及试验过程均相同,试验过程中准确记录试验现象及结果,并统计数据。试验处理及分组,见表1。
g
2.2饲料的消化
用差减法在分析天平上称取约0. 5 g的被测样品倒于消化管底部,并分别按照上述处理向消化管中加入无水硫酸钠和五水硫酸铜,然后用量筒慢慢加入浓硫酸15 m L。将消化管放在消化炉上加热,先小火加热,当泡沫停止产生时再加强火力,使之维持微沸状态,温度保持在420 ℃左右。加热消化时应不时转动消化管,使硫酸能冲洗附着于瓶壁上的样品,缩短消化时间,直至瓶内溶液透亮清彻为止,即消化完毕。
2.3氨的蒸馏
采用半微量水蒸气蒸馏法将试样消煮液冷却,加纯化水20 m L,然后将消化管中的消煮液用漏斗无损失地转移至200 m L容量瓶中,冷却后用水稀释至刻度,摇匀,作为试样分解液。用量筒取20 g /L硼酸溶液25 m L置于锥形瓶中,加混合指示剂2滴,置于蒸馏装置冷凝管下,使管口浸入硼酸溶液中。用移液管移取试样分解液10 m L,注入蒸馏装置的反应室中, 用少量纯化水冲洗进样入口,再加400 g /L氢氧化钠溶液10 m L,用少量纯化水冲洗进样入口,将玻璃塞塞好,并且在入口处加水封好,防止漏气,蒸馏5 min。 使锥形瓶离开冷凝管,用纯化水冲洗冷凝管末端,洗液均流入锥形瓶内,然后停止蒸馏。
2.4滴定
用盐酸标准滴定溶液进行滴定,溶液变为灰紫色为滴定终点。
2.5结果计算
[4]。式中: C为盐酸标 准滴定溶 液浓度( mol/L) ; A为试样质量( g) ; V为滴定试样时所需盐酸标准滴定溶液体积( mL ) ; V1为试样分解液总体积 ( mL ) ; V2为蒸馏用试样分解液体积( mL ) 。每个试样取2个平行样进行测定,以其算术平均值为最终结果。
2.6数据的统计分析
对试验数据采用Excel进行初步处理,然后用SAS 9. 0软件进行统计分析,并对试验数据进行ANOVA方差分析和Duncan’s多重比较,结果均以平均值 ± 标准差表示。
3结果与分析
3.13种典型饲料粗蛋白质含量检测(结果见表2)
由表2可知,A因素、B因素、A × B因素的P值均大于0. 05,说明五水硫酸铜添加量、无水硫酸钠添加量、五水硫酸铜与无水硫酸钠的交互作用对粗蛋白质含量测定的结果均无显著影响( P > 0. 05) 。
3. 2粗蛋白质消化过程中冷却后结晶情况观察( 结果见表3)
由表3可知,当五水硫酸铜添加量相同,无水硫酸钠添加含量不同时,消化液冷却后结晶量逐次增加,说明无水硫酸钠添加量对消化液冷却后结晶状态有影响。当无水硫酸钠添加量相同、五水硫酸铜添加含量不同时,消化液冷却后结晶状态相同,说明五水硫酸铜添加量对结晶状态无影响。
3. 3粗蛋白质消化过程时间统计( 结果见表4)
由表4可知,五水硫酸铜添加量相同,随着无水硫酸钠添加量的增加,消化时间缩短,但无水硫酸钠添加量为4 g和6 g时,时间相差较少( 0. 5 h以内) 。 当无水硫酸钠添加量相同时,添加五水硫酸铜0. 3 g和0. 4 g,消化时间基本一致。
4讨论
饲料中粗蛋白质的检测是实验室必须检测的项目,也是最主要的检测指标,数量大、任务重,因此要求检测方法准确、方便。针对生产实践中常用饲料粗蛋白质含量通常在7% ~ 50% 范围内,试验选择了有代表性的玉米、豆粕、苜蓿3种饲料原料进行检测。 试验结果表明,饲料粗蛋白质含量未受五水硫酸铜及无水硫酸钠的影响,为消化时间和试验现象的确定提供了基本保证。黄晓东[5]研究表明,硫酸铜∶无水硫酸钾( 或无水硫酸钠) 主要有1∶9、1∶10、1∶15、1∶17的比例,国家标准为五水硫酸铜( 0. 4 g) ∶无水硫酸钾或无水硫酸钠( 6 g) 的比例为1∶12。若无水硫酸钠的比例加大,则消化液易结块不易转移; 若五水硫酸铜添加量减少,则消化时间加长或者消化不完全。这一现象在本试验中得到充分验证。
硫酸钠的作用是提高浓硫酸的沸点,使消化效力提高。纯硫酸的沸点为317 ℃,加入无水硫酸钠后, 硫酸沸点可增至325 ~ 341 ℃[6]。Na2SO4+ H2SO4→ 2Na HSO4,2Na HSO4→Na2SO4+ H2O + SO3。
在消化过程中,随着硫酸的不断分解,水分不断蒸发,无水硫酸钠的浓度逐渐增大,则沸点升高,加速了对有机物的分解作用。因此,试验中当无水硫酸钠添加量为6 g时消化时间明显提高,但结晶也非常明显。
五水硫酸铜在反应过程中作为催化剂,王雅[7]认为,试验中五水硫酸铜的用量对消化时间有主要影响,浓硫酸和硫酸钠的用量为第二和第三因素。硫酸铜除了具有催化作用外,也可在下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。消化后溶液的颜色为蓝绿色,这是催化剂中硫酸铜的颜色[8,9]。从试验的结晶状况来看,未受五水硫酸铜添加剂量的影响,但在消化时间上,添加五水硫酸铜0. 2 g的试验组消化时间较长。
5结论
利用半微量凯氏定氮法检测饲料中粗蛋白质含量时,五水硫酸铜和无水硫酸钠的添加量对试验结果没有影响。无水硫酸钠的添加量越多,消化液的结晶越多。综合消化时间和消化液的结晶量表明,添加五水硫酸铜0. 3 g和无水硫酸钠4 g作为催化剂效果较好。
对样品中粗蛋白测定的商榷 篇2
关键词：取样；消化；蒸馏；滴定；计算
KDN-04（08）A、C、D定氮仪为粮食、饲料、乳品、土肥、化工、医药、商检样品的理想检测设备，与传统的仲裁法测定样品粗蛋白方法相比，具有速度快，准确率高，安全简单易操作等优点。KDN型定氮仪检测整套装置，由消化器（见图一）、蒸馏器（见图二）两大部分组成。提高蛋白质含量测定的检测速度，关键要加速样品消化的时间。KDN系列定氮仪消化装置，由于采用井式电加热方式，增大了消化管受热面，使消化样品在消化管内取得最佳的消化效果。如果使用硒片作为催化剂可进一步加速消化煮解，大大缩短了消化时间。消化时产生的SO2等有害气体，通过消化炉上的排污管经过抽气泵把气体融合在水中排入下水道，有效的抑制有害气体的外逸，又省去实验中安装毒气通风柜。试样经过40分钟的消化，即能完全消化。自来水进入蒸馏器，经稳压器流入蒸发炉，因水位的上升碰到电极产生电流，快速加热产生蒸汽，对已消化完全的样品进行蒸馏，将蒸馏过程中产生的硫酸铵转化成铵并与硼酸反应生成硼酸氢铵。然后经滴定计算蛋白质含量，滴定的过程是盐酸（或硫酸）和硼酸氢铵反应的过程。澧县农产品质量安全检测中心在样品中粗蛋白测定上进行一些探索，现将工作中的体会与质检工作者作些商讨交流。
一、KDN-04 （08） A、C、D定氮仪技术参数
1.测定品种：粮食、饲料、食品、乳制品、土肥、医药；
2.测定范围：含氮量0.05%-90%；
3.精度：相对差≤2%，平行差≤0.2%；
4.测定时间：消化45分钟左右（视样品含氮量而定，催化剂用硫酸铜、硫酸钾则需2.5小时），蒸馏6分钟左右；
5.电源：AC220V/50HZ；
6.功率：消化器（四孔）1200W（八孔）2400W；
7.体积：04消化器650×220×150
08消化器730×300×150；
蒸馏器380×330×740单位（mm），1000Kw；
二、操作过程
1.选取具有代表性的试样用四分法缩减至200g，粉碎后全部通过40目筛，装于密封容器内，防止试样成分变化。
2.混合催化剂：2g硫酸铜加上30g硫酸钾，磨碎混匀。（或用35g硒粉代替）
3.称取0.5g试样，精确至0.0002g，，放入消化管内，加上6.4g混合催化剂与试样混合，加入10ml的浓硫酸和2粒玻璃珠，将消化管分别放入各个消化架各个孔内，然后置于消化器上，放上已经装好密封圈的排污管，打开抽气三通进水（自来水）使抽气通处于吸气状态，在接通电源，打开各自控制开关，转动电位器，调节电压指示220v，使其快速消化。消化结束后（一般2.5小时），消化管及排污管和整个托架一起移到冷却架上进行冷却。注意：在冷却过程中，排污管必须保持吸气状态（千万不能将消化管放入水中冷却）防止废气逸出。
4.混合指示剂：0.05g甲基红加上50ml乙醇混匀后为0.1%的甲基红乙醇溶液，0.25g溴甲酚绿加上50ml乙醇混匀后为0.5%溴甲酚绿乙醇溶液，然后把两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月。
5.配制0.1mol的硫酸标准滴定液：3ml硫酸缓缓的注入1000ml去离子水中，冷却，摇匀。
6. 0.1mol的硫酸标准滴定液的标定：称取0.2g无水碳酸钠（270℃-300℃的高温炉中灼烧），溶于50ml水中，加入10滴溴甲酚绿-甲基红指示剂，用配制好的硫酸溶液滴定至溶液由绿色变成暗红色，记住加了多少毫升，然后煮沸2分钟，冷却后继续滴定至溶液再呈暗红色，记住加了多少毫升，两次的和为V1，同时做空白试验，代入公式：
C=m×1000/〔（V1-V2）M〕
M为无水碳酸钠的摩尔质量的数值，为52.994
m为无水碳酸钠的质量的准确数值，单位为g
7.40%氢氧化钠水溶液（M∕V）：20g氢氧化钠加上50ml蒸馏水混匀。
8.2%硼酸水溶液（M∕V）：2g硼酸加上100ml蒸馏水混匀。
9.打开定氮仪的开关，关掉排水阀打开自来水，打开面板蒸汽开关，水位达到后蒸汽开关的灯会自动亮，这时关掉自来水，打开冷却水龙头，仪器进入自动加热状态，直到蒸汽喷出来为止（再喷半分钟）。关掉蒸汽开关，把接收液（25ml硼酸加上2滴溴甲酚绿———甲基红指示剂）的三角烧瓶放到大圆盘上，接收管浸入液面。
10.把消化好的样品的消化管与蒸馏器连接，稍加旋转使其密封后打开蒸馏水开关H2O加蒸馏水20ml，关掉开关，再打开NaOH开关加50mlNaOH，关闭NaOH开关。打开蒸汽开关，仪器进入正常工作状态，当三角烧瓶的接收液满150ml，下移三角烧瓶继续蒸馏半分钟。关闭蒸汽开关，倒掉消化管内废液，进行滴定计算。
三、讨论
1.如果开机电源指示灯不亮，检查电源插头和15A熔丝管，请必须使用良好接地的三眼插座。
2.消化时如有气体外逸，加大三通抽气泵的进水量。在消化初始阶段，需注意观察防止试样因急速加热而飞溅。缓解办法可在消化过程，当发现试样飞溅时关机5分钟后再开机继续加热。
3.如果开机后电流上升中，指示灯突然不亮，请先切断电源，检查熔丝管是否损坏（如损坏，应更换15A熔丝管），然后关闭冷却水，打开排水阀和蒸汽开关进行排水，故障排除后重新开机操作。冷却水接口必须连接自来水，其他水源不能使用（如蒸馏水或经过处理后的深井水），如果其他水源的话，仪器内蒸发炉因不导电引起仪器不能加热，仪器将无法工作。开机前先观察仪器右侧面下部蒸发炉内水位，应不能超过电极底部。（如果超过请先排水，否则很容易造成仪器损坏，操作时应先关闭冷却水，再打开排水阀和蒸汽开关，然后排水。）打开面板上“蒸汽”开关，机器开始自动加热，加热期间请注意观察面板上电流表指针是否有电流指示（如果没有电流指示，表示仪器没有加热或加热功率很小，其原因为可能水质有问题），直到蒸汽从前下方蒸馏塑管内喷出，让其喷半分钟左右。关掉蒸汽开关，仪器进入待机状态。（如果待机时间过长，蒸馏前应先开一下蒸汽开关，待蒸汽喷出后再关掉蒸汽开关）接收液取下（在取下接收瓶时，用少量蒸馏水冲洗导出管前端，洗液与吸收液合并），关掉蒸汽开关，倒掉蒸馏完的废液仪器还原到待机状态，接收液待滴定之用。
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4.如果开机后自来水不能正常进水蒸发炉（右下方有一个观察窗口）请用手挤压出水口胶管或打开后盖挤压稳压器连接到蒸发炉的橡胶管
（可能橡胶管内有空气）。使水正常流入蒸发炉内进行加热。
5.如果打开水泵或碱泵有工作声音，但不出液体，检查仪器内部单向阀是否连接，消除方法是拔掉单向阀一头橡胶管，用硬物使单向阀中间蓝色维体活动即可。如果水泵或碱泵没有工作声音时，应检查2A保险丝是否断裂。
6.试验做完后，冷却水不能关，每天工作结束后，清洗碱泵，方法如下：碱液管从容器中取出，放入蒸馏水容器内（蒸馏水必须在40℃左右）的温水中然后在蒸馏器前放上一只空的消化管，打开NaOH开关，抽取200ml蒸馏水（温水）2-3次清洗完成，保证使用寿命，尽量减少碱泵因结晶而无法使用。
7.KDN系列定氮仪采用凯氏定氮的原理进行测定，但是不同的样品，实际含氮量也有区别。所以，不同的样品必须采用不同的换算系数。如花生、大豆、蚕豆、大麦小麦、燕麦等的含氮量为17.6%，求得K=5.7；荞麦、葵花籽、亚麻籽、棉花籽、蓖麻子等换算系数则为K=5.5；玉米菜籽则为6.0；水稻为5.95，上述以外的其他样品换算系数均适用6.25，在计算公式中A也就不一样。
蛋白含量（%）=[（V1-V2）C×0.014×A×100]/W
公式中：V1-消耗盐酸（或硫酸）的毫升数
V2-空白实验时消耗盐酸（或硫酸）的毫升数
C-盐酸（或硫酸）的当量浓度
0.014-1ml盐酸（或硫酸）的当量数
A-A固定系数（6.25，5.7等）
W-试样重量g
空白测定：用0.1克糖代替样品或不加样品作空白测定。
摘要：用高效液相色谱法对饲料中维生素D3的检测过程中，BHT（2，6-二叔丁基对甲酚）对测定会产生影响。当维生素D3含量较低或检测人员经验不足时，检测峰易发生误判，造成检测结果的偏离。从BHT结构和实验入手，对检测过程进行优化，可消除BHT对饲料中维生素D3检测的影响，达到准确定性和准确定量的目的。
关键词：维生素D3；高效液相色谱仪；抗氧化剂；准确定量
维生素D3是维持机体正常活动必不可少的物质，常用于维生素D缺乏症的预防与治疗，适量的各种维生素D3作为饲料添加剂能促进禽畜生长，增强禽畜体质，产生显著的经济效益。
饲料中维生素D3的检测一般是按照GB/T 17818-2010进行，但是在分析检测过程中，经常会有饲料中维生素D3超过标准值的情况，在排除了企业添加值错误的情况外，本文首次发现了在检测过程中添加的抗氧化剂BHT对维生素D3含量测定结果产生的影响，并且对其进行了详细的讨论，达到了准确定量饲料中维生素D3的目的。
1.实验部分
1.1 实验仪器与试剂
高效液相色谱仪：岛津；电子分析天平（德国梅特勒）；氮吹仪；圆底烧瓶（带回流冷凝器）；电热套；抗坏血酸；乙醇；氢氧化钾；乙醚；氯化钠；BHT（2，6-二叔丁基对甲酚）。
1.2 样品前处理
称取样品10g，精确至0.0001g，置于250mL圆底烧瓶中，加入50mL L-抗坏血酸乙醇溶液，10mL氢氧化钾溶液，混合均匀，沸水浴上回流30min皂化。
皂化完成后，皂化液转移至装有50mL乙醚的250mL分液漏斗中提取，再分别用40mL、30mL乙醚重复提取2次，弃去水相，合并三次乙醚相。用氯化钠溶液50mL洗涤一次，弃去水相，再用50mL水洗涤乙醚提取液至中性。乙醚提取液用无水硫酸钠脱水，转移到100mL棕色容量瓶中，加入100mgBHT使之溶解，用乙醚定容至刻度。
取5.0mL乙醚溶液，氮气吹干，用甲醇定容至1.0mL，高效液相色谱仪分析。
1.3 色谱条件
色谱柱：C18 5μm 150×4.6 mm，流动相：甲醇：水=95：5，流速：1.0 mL/min，柱温：30℃，进样量：20.0μL，波长：264 nm
2.结果讨论
2.1 结果影响
实际测定中，我们发现，在1.3色谱条件下，维生素D3的含量普遍比标示含量偏高，而且在空白基质中，在与维生素D3对照品同一保留时间出现了强吸收峰，而且面积比较大，见图2，与维生素D3对照品检测重叠，对饲料中维生素D3的检测产生影响，具体谱图见图1-图4。
2.2 影响因素分析验证
通过对样品的分析过程进行拆解，对可能存在的影响因子一一进行排查，最后确定，用GB/T 17818-2010方法对样品进行分析检测，是BHT对整个的分析结果产生了影响。
2.2.1BHT结构剖析验证
维生素D3对光、热不稳定，在空气中容易氧化，光化成前反式维生素D3和后维生素D3等产物而失去活性。在实际测定中，加入BHT抗氧化剂，可防止其氧化。
在维生素D3提取过程中，在最后一步加入了抗氧化剂BHT，对其结构进行分析后发现BHT结构与维生素D3有相似的紫外吸收基团（具体结构式见图5）。维生素D3在264nm下，有较强的吸收。而BHT由于具有苯环结构，因此在由苯环共轭系统下π-π※跃迁产生B带特征吸收在254nm下有较强的吸收，又由于在BHT结构中，苯环上面有羟基，作为助色基团，会导致BHT最大特征吸收波长发生红移，因此BHT最大吸收波长会大于254nm，因此，可以考虑，在图2空白玉米样中，出现与维生素D3相同保留时间下出现的物质，是BHT带来的干扰
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2.2.2 BHT的影响实验验证
介于BHT对维生素D3分析可能存在的影响，称取一定量的BHT，用甲醇溶解，按照1.3中色谱条件，进行分析，色谱图见图6.
从图6中可以看出，维生素D3对照品以及样品和单独的BHT在保留时间都为8.45min，因此可以证明，BHT对维生素D3含量的测定产生了影响，在图2中也得到了验证。在图3样品中出现的色谱峰物质，不完全是样品中维生素D3，而是维生素D3与BHT叠加后得到的色谱吸收峰。因此，在GB/T 17818-2010方法下，如果单纯的以保留时间作为维生素D3检测峰的话，对测定结果会产生很大的影响。
2.3 BHT影响的解决方法
2.3.1流动相的优化
为消除BHT的干扰，我们尝试更改有机相比例。
2.3.1.1调整流动相比例为90：10
当减小有机相甲醇的比例，调整为甲醇：水为
2.3.1.2调整流动相比例为98：2
更改流动相有机相比例为98：2时，发现此时维生素D3对照品和BHT能够彻底分开，见图8A；样品中的VD3和BHT也能完全的分开，见图8B，可排除BHT对维生素D3检测的干扰。
2.3.1.3调整流动相比例为100%甲醇
继续调整流动相比列为100%甲醇，我们发现，此时维生素D3对照品和BHT均无显著相应，具体情况见图9。
2.3.2BHT的添加及放置时间影响剖析
介于BHT对维生素D3存在的影响，本文取同一样品X，平行称取两份，X1样品按照1.2前处理方法进行前处理检测，X2样品亦按照1.2前处理方法进行前处理，但最后一步，X2样品定容时不加BHT，分别于4℃条件下放置0天（样品编号X1、X2）、3天（样品编号X3、X4）、7天（样品编号X5、X6）、15天（样品编号X7、X8），然后以2.3.1.3的色谱条件对其进行高效液相色谱检测分析，具体实验设计见表1。
从图8A中，可以看出，X样品在未加BHT的情况下，放置3天、7天以及15天的情况下，样品中维生素D3的含量与其加入BHT检测后的结果是基本不变的，也就是说，在检测饲料样品中的维生素D3时，半个月之内检测完毕，为了防止BHT对维生素D3的结果产生影响，是完全可以不添加BHT的。
3结论
本文首次发现了在检测过程中添加的抗氧化剂BHT对维生素D3含量测定产生的影响，并且从结构剖析方面以及单独的实验对其进行了验证，优化流动相比例，对其进行分离，同时对于检测过程中，BHT的添加与否在不同时间内对饲料中维生素D3含量测定的影响进行了详细的讨论。最后确定，在饲料中维生素D3的检测过程中，流动相的比例优化为98：2时，BHT与维生素D3可以有效的分离；其次，为避免BHT在检测过程中产生的干扰，在放置15天以内进行检测，不加BHT进行检测，亦可得到准确的结果，排除了BHT对其的影响，达到了准确定量饲料中维生素D3含量的目的，但由于维生素D3的前处理方法比较复杂，如何能够更快速有效的检测其含量还有待进一步研究。
参考文献（略）
粗蛋白质 篇3
1 材料与方法
1.1 样品的采集与处理
从2010年1月份—2011年5月份, 陆续收集来自口福、嘉冠、阳光、汇福、牧通、牧丰、华越、正昌、玉林等生产单位的豆粕样品102个, 用杯式万能粉碎机粉碎, 过80目筛, 混匀;选取72个具有代表性的样品组成定标集, 用于建立豆粕粗蛋白质含量检测的近红外分析模型, 30个样品组成验证集, 用来检验定标模型的可靠性。
1.2 试验仪器、设备
半微量凯氏定氮蒸馏器, 上海沪峰化工有限公司提供;电子分析天平 (BS124S) , 购自赛多利斯科学仪器 (北京) 有限公司;近红外分析仪 (Infraxact) , 丹麦Foss公司生产;凯氏烧瓶、容量瓶、锥形瓶、酸式滴定管等。以上仪器及用品由河南科技学院动物营养与饲料科学实验室和河南宏展实业有限公司提供。
1.3 试剂
硫酸铜、无水硫酸钠、硫酸、氢氧化钠、硼酸、溴甲酚绿、甲基红、盐酸等, 均为市购。
1.4 豆粕粗蛋白质含量的测定
1.4.1 化学分析法
采用半微量凯氏定氮法测定粗蛋白质含量, 取2次平行测定结果的平均值。
1.4.2 近红外光谱分析法
样品原始光谱数据的采集:在570～1 848 nm波长范围内分别扫描72个豆粕样品, 采集反射量 (R) , 每隔2 nm采集1次, 每份样品重复扫描4次, 取平均值, 并转化为吸光度, 贮存于计算机中, 然后用光谱数据分析软件对各光谱进行预处理和回归统计分析。
近红外光谱定标模型的建立:建立定标模型的过程实质上就是将豆粕的近红外光谱特征与其品质指标之间建立起相关关系。利用定标集样品, 比较不同光谱预处理和回归方法对模型定标效果的影响, 用校正决定系数 (RSQ) 、校正标准误差 (SEC) 、交叉验证决定系数 (1-VR) 、交叉验证标准误差 (SECV) 衡量模型的可靠性;各类决定系数越大则标准误差越小, 表明模型的预测准确度和精确度越高, 依此选择最优的光谱预处理方法和回归分析方法[1]。
近红外光谱定标模型的验证:以验证集样品作为未知样品进行检验。分别用化学分析法和已建立的近红外模型测定30个豆粕样品中的粗蛋白质含量, 通过t检验验证模型的预测性能和可靠性。
2 结果与分析
2.1 定标用豆粕样品粗蛋白质含量的化学分析值
用半微量凯氏定氮法测定72个豆粕样品中的粗蛋白质含量, 结果其范围在41.63%～51.27%之间, 平均含量为46.42%, 标准差为1.79, 说明选取的样品包括不同等级的豆粕, 具有较好的代表性, 可用于建立定标模型。
2.2 定标用豆粕样品的近红外光谱图
用近红外分析仪分别对72个豆粕样品进行扫描, 得到原始光谱图 (见175页彩图1) 。由175页彩图1可见, 不同样品在570～1 848 nm波长范围均有明显的吸收峰, 同一个样品具有多处吸收峰, 不同样品在同一吸收峰处的峰值差异十分明显, 说明吸光度与样品成分含量有关, 豆粕的近红外光谱图可作为粗蛋白质定量分析的依据。
2.3 豆粕粗蛋白质含量近红外分析模型
2.3.1 光谱预处理方法的选择
用标准正常化处理 (SNV) 、标准正常化+散射处理 (SNV+Detrend) 及标准多元离散校正 (Standard MSC) 可以降低散射对光谱分析的干扰;采用1, 4, 4, 1及2, 4, 4, 1和1, 7, 7, 1导数数学处理可以提高光谱的分辨率。不同光谱预处理方法对豆粕粗蛋白质定标效果的影响见表1。
由表1可以看出, 采用标准多元离散校正和2, 4, 4, 1导数数学处理光谱, 校正决定系数、交叉验证决定系数最大, 校正标准误差、交叉验证标准误差最小, 定标效果最好。
注:不同光谱散射校正处理时, 数学处理采用2, 4, 4, 1导数, 回归分析采用偏最小二乘法;不同导数数学处理时, 光谱校正采用标准多元离散校正, 回归分析也采用偏最小二乘法。
2.3.2 回归方法的选择
采用改进最小二乘法 (MPLS) 、偏最小二乘法 (PLS) 、主成分分析法 (PCR) 进行回归分析, 比较不同方法对豆粕粗蛋白质定标效果的影响, 结果见表2。
注:采用不同回归分析方法时, 数学处理采用2, 4, 4, 1导数, 光谱校正采用标准多元离散校正。
由表2可以看出, 采用偏最小二乘法进行回归比较理想, 校正决定系数、交叉验证决定系数最大, 校正标准误差、交叉验证标准误差最小, 定标效果最好。
根据以上分析, 选择标准多元离散校正和2, 4, 4, 1导数数学处理光谱, 用偏最小二乘法回归, 可以建立豆粕粗蛋白质含量分析的最佳近红外光谱定标模型。
2.4 定标模型的验证
采用化学分析法测定验证集30个豆粕样品中的粗蛋白质含量 (真实值) , 然后用近红外光谱分析仪进行扫描, 并调用已建立的分析模型预测结果 (见表3) , 通过比较预测值与真实值, 检验定标模型的预测性能。对2组数据进行t检验后, 得出t=0.22, t0.05 (58) =2.00, ︱t︱
3 讨论
3.1 定标集豆粕样品的数量和粗蛋白质含量范围
在近红外光谱分析中, 定标样品的数量和样品组分含量范围影响分析模型的稳定性和准确性[2]。实际工作中建立较窄范围模型需要50～100个定标样品, 对于较宽范围或开放样品群则需要至少150个以上的定标样品, 并要求样品组分含量范围应能涵盖以后要分析样品的范围, 且含量分布合理[3]。
3.2 豆粕粗蛋白质含量定标模型的建立
任何一台近红外光谱仪对每种组分都要单独定标, 即在近红外光谱值与化学测定值之间建立一种定量的统计关系。由于仪器提供的光谱预处理与数学处理较多, 不同光谱预处理与数学处理组合所得的定标模型不同。张璐等[4]的研究表明, 对豆粕样品光谱进行1, 4, 4, 1导数数学处理和标准正常化+散射处理, 用改进最小二乘法回归, 可以得到预测性能较好的粗蛋白质含量近红外光谱分析模型。孟兆芳等[5]采用一阶导数偏最小二乘法进行定标, 结果表明, 豆粕粗蛋白质化学分析值与近红外光谱分析预测值之间有显著相关性, 校正决定系数为0.978 3, 交叉验证决定系数为0.948 3, 交叉验证标准误差为0.570 0。相关系数的高低及误差的大小是衡量定标模型优劣的重要参数, 杨海锋等[6]认为, 相关系数在0.90以上就可表明豆粕粗蛋白质化学分析值与近红外光谱分析预测值之间的相关性较好。
4 小结
试验选择标准多元离散校正和2, 4, 4, 1导数处理光谱, 用偏最小二乘法回归, 建立了豆粕粗蛋白质含量分析的最佳近红外光谱定标模型;模型的预测值与真实值之间差异不显著 (P>0.05) ;表明模型的预测性能好, 准确度高, 可用于豆粕粗蛋白质含量的快速测定。
参考文献
[1]OSBORNE B G, FEARN T.Collaborative evaluation of uni-versal cal-ibrations for the measurement of protein and moisture in flour by near-infrared reflectance[J].Food Sci, 1983 (18) :453-460.
[2]彭玉魁.近红外光谱分析技术及其在农业中的应用[J].陕西农业科学, 2001 (3) :25-27.
[3]陆艳婷, 张小明, 叶胜海, 等.稻米品质近红外光谱法分析中定标样品选择与模型优[J].核农学报, 2008, 22 (6) :823-828.
[4]张璐, 郝永忱, 刘桂宾, 等.近红外光谱法测定豆粕中常规化学成分的研究[J].检验检疫科学, 2003, 13 (1) :25-27.
[5]孟兆芳, 张玺, 陈峥.近红外光谱分析技术在豆粕豆质分析中的应用[J].天津农业科学, 2002, 8 (4) :30-32.
粗蛋白质 篇4
关键词：雪胆；内生细菌；耐甲氧西林金色葡萄球菌；抑菌粗蛋白；提取；抗菌性；热稳定性
中图分类号： Q939.9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0334-02
收稿日期：2014-03-28
基金项目：乐山师范学院科研项目（编号：Z1160）。
作者简介：唐梅（1971—），女，重庆人，硕士，副教授，主要从事微生物分子生物学研究。E-mail：764301686@qq.com。
通信作者：龚明福，博士，教授，主要从事微生物资源及微生物与植物间相互关系研究。E-mail：gongmingfu98@163.com。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是医院内感染率极高的多重耐药性病原菌[1-2]，仅对万古霉素敏感[3]，医源性MRSA感染性疾病与乙型肝炎（HBV）、艾滋病（AIDS）并列为世界范围内三大最难解决的感染性疾病[4]。我国对药用植物抗金黄色葡萄球菌等感染进行过一系列研究[5]，但是针对MRSA的研究较少，近几年MRSA才得到关注[6]。
雪胆（Hemsleya sinesis Cogn.） 为葫芦科雪胆属植物，不但对多种病原菌具有抗菌作用[7]，还有多种药理功效[8-10]，因而应用广泛[11]。生活在雪胆组织中的内生细菌能产生与雪胆相似的活性成分。笔者课题组从雪胆中分离筛选到多株具有抗MRSA活性的内生细菌菌株[12]，其中菌株KLXD06抗MRSA活性极强。本研究采用硫酸铵沉淀法提取KLXD06发酵液中的粗蛋白，并检测其对MRSA的抑菌活性，旨在为进一步开展雪胆内生细菌抗菌活性物质成分和功能研究以及抗MRSA新药研制奠定基础。
1材料与方法
1.1供试菌株
KLXD06為笔者课题组分离保存的具有抗MRSA活性的雪胆内生细菌，经常规鉴定为芽孢杆菌（Bacillus sp.）。MRSA由峨眉山特色生物资源重点实验室提供。
1.2KLXD06抑菌蛋白提取及抑菌活性测定
1.2.1KLXD06抑菌蛋白的提取将活化的KLXD06按接种量7%接入无菌发酵培养基中，该培养基为牛肉膏蛋白胨酵母培养基（BPY）：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠5 g、葡萄糖5 g、蒸馏水1 L，调节pH值7.0～7.2。37 ℃、140 r/min振荡培养3～4 d，4 000 r/min离心15 min后弃沉淀，上清液经细菌过滤器（Φ=0.22 μm）过滤，将滤液缓慢地加入饱和硫酸铵溶液至饱和度达到60%左右放置过夜，12 000 r/min 离心10 min，弃上清液。用0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH值为6.8）溶解沉淀，溶解液置-20 ℃保存备用。
1.2.2抑菌粗蛋白对MRSA的活性测定在直径为9 cm的NA平板中涂布接种0.1 mL活化好的MRSA病原细菌菌悬液，在平板上等距离打4个直径为6 mm的孔洞，用已灭菌的100 μL移液枪向其中加入浓度分别为20%、60%、100%的粗蛋白溶解液100 μL。每个处理加入等量无菌水作为对照，37 ℃ 黑暗培养1～3 d。每个处理重复3次。用“十”字交叉法测量抑菌圈直径。
1.2.3抑菌粗蛋白热稳定性测定取拮抗效果明显的1组粗提蛋白溶解液，分别在40、60、80、100 ℃水浴处理15 min和121 ℃加热处理30 min后，按上述方法测定其对病原菌MRSA的抑菌圈直径。以未经热处理的原液代替处理液为对照，每个处理重复3次。用粗蛋白的剩余抑菌活性表示抑菌粗蛋白的热稳定性。
剩余抑菌活性=（处理液产生的抑菌圈直径/未处理原液产生的抑菌圈直径）×100%。
2结果与分析
2.1KLXD06抑菌粗蛋白对MRSA的抗菌活性
对经硫酸铵盐析沉淀法得到的抑菌粗蛋白溶解液进行抑菌性试验。由表1可见，KLXD06抑菌粗蛋白对MRSA的抑菌活性明显，100% KLXD06粗蛋白提取液对MRSA的拮抗效果较为明显，在0.05水平上与20%、60%KLXD06粗蛋白的抑菌效果有显著差异。该处理下平均抑菌圈直径达到 13.7 mm，具有作为抗MRSA药物开发的潜力。
2.2KLXD06抑菌粗蛋白的热稳定性
由图1可见，KLXD06菌株产生的抑菌粗蛋白在40、60、80、100 ℃水浴处理15 min和121 ℃加热处理30 min后，仍保持一定的抑菌活性。40、60 ℃处理15 min后，剩余抑菌活性与对照保持一致，仍然保持100%的抑菌活性；80、100 ℃处理15 min后，剩余抑菌活性分别降为75.0%、63.0%；121 ℃处理30 min后，剩余抑菌活性仍保留35.5%。表明KLXD06抑菌粗蛋白具有一定的热稳定性，可耐受121 ℃及以下的温度。
3结论与讨论
测定不同浓度雪胆内生细菌KLXD06抑菌粗蛋白对致病微生物MRSA的抑菌活性，结果表明KLXD06能分泌产生具有较高抗菌活性的产物。目前我国主要从黄岑、黄连等中草药及其提取物中筛选抗MRSA的物质[13-15]，但中草药成分复杂，其抑菌机制较难分析。刘佳等从土壤细菌中筛选到1株对MRSA有较好抑菌活性的芽孢杆菌[16]；黄惠琴等从海洋微生物中筛选到1株抗MRSA的海洋放线菌[17]；张守村等从苦豆子内生细菌中筛选到1株抗MRSA活性较强的菌株，并提取到1种抗MRSA的活性成分[18]。从其他药用植物内生细菌中筛选抗MRSA菌株的研究还鲜见报道，对内生细菌抗MRSA成分的分析更少。
nlc202309040045
KLXD06产生的抗菌物质可以通过硫酸铵盐析沉淀法分离得到，并对热稳定，本研究初步认定其抗菌活性物質的主要成分为蛋白类物质，但究竟是什么物质，结构及性质如何，是否存在其他抑菌物质，抑菌物质产生条件等问题还有待深入探讨。
参考文献：
[1]张小青，易婷，林春婵，等. 医院感染现患率调查与分析[J]. 中华医院感染学杂志，2005，15（12）：1352-1354.
[2]Hiramatsu K，Katayama Y，Yuzawa H，et al. Molecular genetics of methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J]. International Journal of Medical Microbiology，2002，292（2）：67-74.
[3]Linares J. The VISA/GISA problem：therapeutic implications[J]. Clinical Microbiology and Infection，2001，7（4）：8-15.
[4]马翔宇，易龙，宋治远. 医源性MRSA感染及其防治研究进展[J]. 临床医学，2003，23（5）：53-54.
[5]王嵩. 中草药抗细菌感染的研究[J]. 北京中医，2002，21（4）：249-251.
[6]肖丽英，黄焯坡. 23种中草药对耐药金葡菌的敏感性探讨[J]. 时珍国医国药，2001，12（10）：878-879.
[7]李亮，朱玲，刘蓉，等. 雪胆素的药效学试验[J]. 四川生理科学杂志，2005，27（3）：135.
[8]陶朝阳，易杨华，林厚文，等. 雪胆根抗肿瘤活性成分研究[J]. 第二军医大学学报，1999，20（5）：337-338.
[9]刘艳丽，李笑然，范金胤，等. 雪胆胃肠丸对胃溃疡的作用实验研究[J]. 时珍国医国药，2010，21（2）：301-302.
[10]陈夏静，伍怡颖，匡文娟，等. 雪胆素片抗炎镇咳作用的实验研究[J]. 四川生理科学杂志，2009，31（4）：153-154.
[11]杨群芳，王贤英. 中药雪胆及其制剂的研究进展[J]. 中国药业，2003，12（9）：76-77.
[12]康琳，魏金莉，胡蝶，等. 雪胆中抗MRSA内生细菌的多样性[J]. 江苏农业科学，2014，42（2）：303-305.
[13]汪雅萍，陈同钧. 十一种中草药对细菌的体外抑菌作用分析[J]. 上海医学检验杂志，1999，14（4）：206-207.
[14]杨明炜，陆付耳，徐丽君，等. 20种清热解毒中药对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌体外抑菌的初步观察[J]. 中国药师，2006，9（2）：141-142.
[15]左国营，王根春，徐贵丽，等. 30种中草药提取物体外抗MRSA的筛选研究[J]. 中国现代应用药学，2006，23（4）：293-295.
[16]刘佳，谢秀丽，牛天贵. 一株抑耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）芽孢杆菌的筛选与鉴定[J]. 中国农业大学学报，2007，12（6）：20-23.
[17]黄惠琴，吕家森，张开山，等. 一株抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的海洋放线菌的鉴定及系统发育分析[J]. 中国海洋药物，2004，23（6）：23-26.
[18]张守村，韩松，黄晓艳，等. 一株抗MRSA内生细菌的鉴定及其活性物质[J]. 微生物学通报，2011，38（6）：860-864.张怡，史本林. 气候变化对豫东冬小麦产区的综合影响[J]. 江苏农业科学，2015，43（2）：336-339.
粗蛋白质 篇5
应用酶制剂对农作物秸秆进行处理, 不仅可以改善饲料适口性, 提高家畜采食量, 还能提升纤维素利用率。粗纤维包括木质素、纤维素、半纤维素、果胶等, 是植物细胞壁的主要组成成分。反刍家畜瘤胃对粗纤维的消化主要通过微生物对产生其粘连、附着、穿透等作用, 这是一个连续、有机的过程, 然后通过各种酶的分泌来水解纤维素。酶制剂处理秸秆, 利用了纤维素酶的主要功能, 即打乱纤维素的结晶结构, 使其产生形变, 从而深入纤维素分子界面之间进行作用, 有助于水分子破坏纤维素分子之间的氢键, 进而产生部分可溶性的微结晶, 为进一步降解提供条件[3]。因此, 酶制剂处理的秸秆可以大大提高家畜代谢水平, 有利于家畜的生长发育。
为了探求酶制剂对秸秆的处理效果, 提高秸秆的饲用率及家畜对秸秆的消化率, 特开展试验, 同时为提高秸秆利用率、推广秸秆处理新技术提供参考, 积极促进畜牧业的加速发展。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试秸秆为玉米秸秆, 取自吉林省农业科学院试验农场, 为当年生产的秸秆, 其化学成分:干物质96.1%, 灰分7.0%, 粗蛋白9.3%, 粗纤维29.3%, 纤维素32.9%, 半纤维素32.5%, 木质素4.6%。对玉米秸秆进行预处理, 用粉碎机将其粉碎至1~3 cm。
供试酶制剂为混合制剂, 含有木聚糖酶、纤维素酶及B-葡聚糖酶等多种酶成分。
1.2 试验设计
先将玉米秸秆和水按重量比设2个处理:玉米秸秆∶水=1.0∶0.5 (A) ;玉米秸秆∶水=1.0∶1.0 (B) 。
1.3 试验方法
将水喷洒在秸秆上, 一层一层地均匀喷洒并拌匀。将试验用的酶制剂用麦麸采用逐级稀释的办法进行稀释, 麦麸用量为30倍, 在稀释的同时充分拌匀。将稀释后的酶制剂与拌湿的玉米秸秆充分混合均匀, 用量为玉米秸秆重量的10%。再将拌匀的玉米秸秆一层一层地装进事先做好的塑料袋中 (图1) , 每装一层要压实一层, 尤其是袋脚部分, 装好后封好袋口堆放在适当位置用塑料盖好等待发酵。
1.4 测定项目及方法
测定玉米秸秆处理前及经酶制剂处理10 d和15 d粗蛋白和粗纤维的变化, 粗蛋白的测定用凯氏定氮法, 粗纤维采用常规饲料方法测定。
2 结果与分析
玉米秸秆经酶制剂处理前、后其粗蛋白和粗纤维的测定结果如表1所示。由表1可见, 酶制剂处理前、后粗蛋白和粗纤维产生变化。
2.1 玉米秸秆粗蛋白含量比较
处理前的玉米秸秆粗蛋白含量为9.30%, 经酶制剂处理后10 d和15 d, 2个处理的粗蛋白含量与处理前相比, 均有不同程度的提高。其中, 以处理后15 d粗蛋白的提高幅度较大, 但差异不显著 (p>0.05) 。处理B较处理A提高幅度大。
2.2 玉米秸秆粗纤维素含量比较
处理前的玉米秸秆粗纤维素含量为29.30%, 经酶制剂处理后10 d和15 d, 2个处理的粗纤维含量与处理前相比, 均有不同程度的降低, 且差异极显著 (p<0.01) , 表明玉米秸秆经一段时间酶制剂处理后可明显提高纤维素的降解率。不同含水量的玉米秸秆间进行比较, 无明显差异 (p>0.05) , 由此可见粗纤维的降解率随玉米秸秆处理时间的延长未出现明显变化[4,5,6]。
3 结论与讨论
试验结果表明, 玉米秸秆经酶制剂处理后可提高纤维素的降解率, 提高粗蛋白的含量, 提高了玉米秸秆的营养价值, 牲畜食用后提高了牲畜的消化率, 可以节约粮食, 为牲畜的生产降低了成本[4,5,6]。此外, 用酶制剂处理小麦秸秆和燕麦秸秆, 测定其粗蛋白和粗纤维含量, 结果表明:酶制剂处理上述2种秸秆15 d后, 其粗蛋白含量与处理前相比, 分别提高了0.55和0.49个百分点, 差异不显著 (p>0.05) ;与处理前相比, 粗纤维素含量分别降低了9.20和10.05个百分点, 差异极显著 (p<0.01) 。
参考文献
[1]汪建中, 柯丽霞.混菌发酵玉米秸秆基质粗蛋白含量及木质素酶活性的研究[J].食品与发酵工业, 2011, 37 (5) :45-49.
[2]张强, 陆军, 侯霖, 等.玉米秸杆发酵生产蛋白饲料的研究[J].饲料工业, 2005, 26 (9) :20-23.
[3]王海珍, 王加启.瘤胃内粗纤维的降解机制及其调控[J].国外畜牧科技, 2002 (4) :3-6.
[4]原现军, 闻爱友, 郭刚, 等.添加酶制剂对西藏地区青稞秸秆和黑麦草混合青贮效果的影响[J].畜牧兽医学报, 2013 (8) :1269-1276.
[5]马双青, 李太平, 杨保贵.酶制剂处理秸秆后粗蛋白和粗纤维的变化[J].饲料工业, 2005 (23) :31-32.
粗蛋白质 篇6
饲料中粗蛋白质包括纯蛋白质和氨化物, 在一定的处理下也包括硝酸态氮。凯氏定氮法系根据有机物在与浓硫酸一起消化时, 首先浓硫酸使有机物脱水而炭化, 随后浓硫酸再将碳氧化成二氧化碳, 本身被还原为二氧化硫, 二氧化硫则将非氨态氮还原成氨态氮, 本身又被氧化成三氧化硫, 从而使有机态氮都转变成氨而与硫酸结合生成硫酸铵。
2CH3-CH (NH2) -COOH+13H2SO4= (NH4) 2SO4+6CO2↑+12SO2↑+16H2O
为了加速消化过程, 通常多使用还原性催化剂硫酸铜, 其作用机理是二价铜离子先被还原后被氧化, 从而促进了有机物的消化。
2CuSO4+C=CuSO4+SO2↑+CO2↑
CuSO4+2H2SO4=2CuSO4+ SO2↑+2H2O
消化液中加入硫酸盐, 目的在于提高浓硫酸的沸点, 加快反应速度, 缩短消化时间。消化液在浓氢氧化钠的作用下, 进行水汽蒸馏, 放出氨用硼酸溶液吸收。
(NH4) 2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4
H3BO3+NH3=NH4H2BO3
最后以甲基红-溴甲酚绿为指示剂, 用标准盐酸滴定至紫红色, 求出氮的含量, 再乘以折合成蛋白质的系数 (通常为6.25) , 即得粗蛋白质的含量 (NH4H2BO3+HCl=NH4Cl+H3BO3) 。由于粗蛋白质测定过程较复杂, 笔者根据自己的实际经验, 总结在用凯氏定氮法测定粗蛋白质的过程中应注意以下几个问题。
(1) 开始消化要用小火, 待样品焦化, 泡沫消失后, 逐步缓慢加强火力, 消化过程中经常转动凯氏瓶, 将溅到瓶壁上的黑渣全部浸入凯氏烧瓶底部的硫酸溶液内, 以避免消化不完全。消化时要控制好温度, 380 ℃较好, 过低消化时间长且不完全, 过高会引起氮的损失。由于电炉不好控制温度, 最好使用可调电炉或功率为800 W的电炉。
(2) 消化液达到透明并非表明样品已经消化完全, 为防止测定结果偏低, 需要进一步加热补充消化至少2小时。
(3) 在样品停止加热后, 如冷却时间过长易引起硫酸样液凝结不易溶解 (尤其冬天季节) , 故应冷却至不烫手时加入少量蒸馏水 (约20 ml) , 摇动凯氏瓶, 转移到容量瓶中, 冷却, 定容。但要注意水与热硫酸的剧烈反应, 以免凯氏瓶破裂。
(4) 样液加入蒸馏装置后, 应先用棒状玻璃塞封口, 并加水密封, 防止漏气, 然后再加入碱液。这个顺序不能弄错, 否则会造成测定结果偏低。同时注意碱液要缓慢加入, 不可太快。
(5) 滴定用的盐酸标准滴定溶液必须准确, 使用前应将溶剂瓶上下摇动几次, 保证溶液浓度均匀一致。滴定时注意排空滴定管底部的气泡, 确保滴定结果准确。
(6) 严格按规定做空白试验, 蒸馏水会消耗一定量的盐酸, 因此滴定结果应减去空白所消耗的酸, 结果才准确, 且以空白试验的颜色为对照。
粗蛋白质 篇7
1 材料
水杨酸盐溶液: 将32 g无水水杨酸钠( HOC6H4COONa) ,40 g磷酸三钠( Na3PO4·12H2O)和0. 5 g亚硝基铁氰酸钠[Na2Fe ( CN)5NO ·2H2O]溶于1 L纯化水中,可稍微加热以促进溶解。
次氯酸钠溶液: 取次氯酸钠( Na Cl O) 50 m L,加纯化水稀释至1 L,在室温避光条件下保存。
氮标准溶液: 配制4 g /L的氯化铵( NH4Cl) 水溶液,然后根据需要再适当稀释。
本试验所用试剂除特别说明外均为分析纯。
玉米、麦麸、豆粕、棉籽粕、菜籽粕、大豆浓缩蛋白、鱼粉、鸡全价配合饲料,市购。
2 方法
2. 1 凯氏定氮法
按GB /T 6432—1994 方法操作。具体如下: 精确称取0. 3 ~ 0. 5 g的饲料样品于凯氏消化管中,加入硫酸铜( Cu SO4·5H2O) 0. 3 g,无水硫酸钾( K2SO4)2. 5 g,与试样混合均匀,再加入10 m L浓硫酸,在200℃ 下消化1 h后升温到400 ℃ 持续3 h,至消化液变澄清为止。利用自动蒸馏器在添加400 g /L氢氧化钠溶液后蒸馏5 min,用标准盐酸溶液滴定硼酸吸收液。
2. 2 R. B. Willis改进的水杨酸钠- 次氯酸钠比色法
氮标准曲线的制备: 取氮标准溶液0,25,50,75,100,125,150,175 和200 μL,然后分别加入10 m L水稀释; 再从中取200 μL试液于试管中,加入4 m L水杨酸钠溶液和1 m L次氯酸钠溶液,漩涡混合,放置12 min以上,然后用1 cm比色皿在波长为680 nm处比色,测定其吸光度。绘制以氨氮含量( μg) 对吸光值的标准曲线。
样品氮的测定: 精确称取待测样0. 2 ~ 1. 0 g于100 m L消化管中,加入10 m L浓硫酸,3. 5 g无水硫酸钾和35 mg硒粉,在200 ℃ 下消化1 h后升温到400 ℃ 持续3 h,至消化液变澄清为止。然后冷却,缓慢加入水,并混合均匀,定容至100 m L。其他测定过程与绘制标准曲线过程相同。
3 结果与讨论
3. 1 氮标准曲线的建立
本研究在680 nm波长下建立了氮测定的标准曲线,见图1。由图1 可知,在680 nm测定时,吸光值与氮含量在0. 02 ~ 0. 20 mg氮范围内呈良好的线性关系。
3. 2 比色法与标准凯氏定氮法的比较
将玉米、麦麸、豆粕、棉籽粕、菜籽粕、大豆浓缩蛋白、鱼粉和鸡全价配合饲料同时采用R. B. Willis改进的水杨酸钠- 次氯酸钠比色法和凯氏定氮法测定,结果见表1。经最小显著极差法( LSR法,Least significant ranges) 检验,比色法与凯氏定氮法的测定结果差异均不显著。因此,Willis等改进的水杨酸钠-次氯酸钠比色法可以准确有效地测定饲料含氮量。
%
本试验所使用的方法基本是参照R. B. Willis等[6]提出的测定方法,但是所用试剂、水源以及仪器等存在差别。本试验所选用的测定波长与R. B. Willis等所提出的有所偏差,与张佳程等[7]的报道基本一致,在680 nm波长下建立了相关性较好的标准曲线; 而且与凯氏定氮法测定结果相比差异不显著。因此,水杨酸钠- 次氯酸钠比色法可以用于测定饲料含氮量,方法简便、结果可靠,而且本方法显色反应比较稳定,短时间内不易褪色,适合批量测定的要求。R B. Willis等提出的比色法还可以测定动物组织含氮量,例如反刍动物瘤胃中氨氮含量、动物肠道中的含氮量等,而凯氏定氮法很难测定出组织中微量的氨氮量,所以比色法也可以用于测定一些组织中微量的含氮量,这一优点已经在反刍动物瘤胃中氨氮含量的测定上得到了体现[4]。
猪血发酵对其粗蛋白消化率的影响 篇8
1 材料与方法
1.1 供试菌株
米曲霉菌 (Aspergillus oryzae) 。
1.2 培养基及培养方法
1.2.1 斜面培养基培养
按1 000 mL纯化水中加入葡萄糖2 g、蛋白胨5 g、酵母2.5 g、琼脂10 g的比例制成斜面培养基后接入米曲霉菌, 置于 (30±1) ℃培养箱内培养3 d。
1.2.2 三角瓶扩大培养
按1 000 mL纯化水中加葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、酵母10 g的比例制成培养液, 置于三角瓶内, 在126 ℃下灭菌, 取出冷却, 接入米曲霉菌, 在28～30 ℃培养箱内培养3 d。
1.3 制曲 (共200 g)
以麸皮40% (80 g) 、玉米粉20% (40 g) 、统糠20% (40 g) 、豆粕20% (40 g) 的比例混合均匀后, 置于三角瓶内, 加适量水以拧不出水且松散为宜。密封后在126 ℃高温下灭菌, 取出冷却, 倒在托盘内 (无菌操作) , 接入菌种 (即1.2.2中的菌种) , 在 (30±1) ℃培养箱内培养3 d。
1.4 猪血发酵
主原料:取经检疫合格的猪新鲜血5 kg[加0.5%抗凝剂 (草酸钠) 23 g], 将猪血置于60 ℃烘干箱内烘8 h。辅料:共5 kg, 其中麸皮40%, 玉米粉、统糠、豆粕各20%。方法:将猪血 (约含水分50%) 与辅料按1∶1的比例混合在不同条件下 (温度、接种量、时间、pH值) 进行发酵。
试验选择温度、接种量、时间、pH值4个因素, 每个因素取3个水平, 即接种量0.5%、1%、2%;温度26 ℃、32 ℃、37℃;时间分别为3, 4, 5 d;pH值6, 7, 8。发酵结束后65 ℃烘干, 粉碎, 备用。
1.5 发酵猪血的粗蛋白质消化率测定
使用前现配0.6%胃蛋白酶溶液消化 (离体消化) :分别将发酵后及未经发酵的猪血和辅料混合物 (各称取1 g放入300 mL三角瓶内, 再加入胃蛋白酶溶液 150 mL, 密闭) 放入37 ℃振荡器中振荡消化16 h。消化后用滤纸过滤不消化的物质, 将不消化物质及滤纸转入凯氏消化分解瓶内, 采用凯氏定氮法测定其粗蛋白含量。
2 结果 (见表1) 与讨论
2.1 不同发酵时间对发酵结果的影响
在发酵过程中, 米曲霉在适宜条件下能大量繁殖, 产生大量的发酵热, 并释放大量促消化分解的酶, 使猪血迅速降解。若条件适宜, 接种量为1%时, 猪血发酵3 d内可完全降解, 当猪血降解完全后延长发酵时间对发酵效果起不到太大的作用。如果菌体量不足则需要较长的发酵时间方可完全降解。
2.2 不同接种量对猪血发酵效果的影响
接种0.5%、1%、2%不等的接种量, 菌体都能迅速形成群体优势, 猪血都能正常降解。在发酵过程中, 当菌体大量繁殖并释放大量的酶使猪血得到充分降解时, 过量的菌丝生长对降解效果不起主要作用。
2.3 发酵温度对猪血降解的影响
经试验发现, 猪血的发酵降解与物料的发酵温度有密切关系。发酵温度高, 在各种酶的作用下, 猪血降解的速度快, 降解完全。而温度又与菌体的生长繁殖和物料厚度有密切关系。菌丝体大量生长繁殖产生发酵热, 加上料层较厚, 热量不易散出。因此, 在物料发酵第2天时应翻拌物料、适当补充水分。原来在表层的物料因相对温度较低而得不到充分降解, 将之拌入中间继续发酵, 可以使猪血充分发酵降解。
2.4 pH值对猪血发酵降解的影响
pH值是否适宜同样会影响猪血发酵降解的效果。当pH值适宜于米曲霉菌的生长繁殖时, 细菌能够迅速生长繁殖, 产生大量发酵热和各种酶, 使得猪血充分降解, 反之则不能促进猪血充分降解, 影响发酵效果。
2.5 猪血发酵对粗蛋白质消化率的影响
发酵后的猪血在胃蛋白酶作用下 (离体消化试验) , 其粗蛋白质消化率为51.01%～72.59%, 平均消化率为59.33%, 而未经发酵猪血的粗蛋白质消化率仅为27.31%。在发酵过程中, 各种作用使得血细胞结构变得易于消化, 同时发酵过程中产生的酶类及一些活性物质有促进消化的作用。另外在整个发酵过程中, 避免了血在黏稠状态下长时间高温处理, 因而氨基酸破坏程度低, 发酵后蛋白质中的游离氨基酸增多, 水溶性物质增多, 发酵后猪血粗蛋白质消化率大大提高。
3 结论
粗蛋白质 篇9
1.材料和方法
仔猪全价饲料 (由辽宁禾丰牧业股份有限公司兴城分公司生产) , 自配饲料 (由建昌县民盛荷包猪养殖专业合作社自主配制) 。选用4月龄荷包猪育肥仔猪30头 (由建昌县民盛荷包猪养殖专业合作社提供) , 随机分为两组, 每组3个重复, 每个重复5头。设实验组和对照组, 实验组饲喂自配饲料, 对照组饲喂仔猪全价饲料, 两组每日投喂饲料重量相同, 试验期为180天。全封闭式猪舍, 干料饲喂、充足饮水 (鸭嘴式自动饮水器) , 约2平方米饲养一头荷包猪, 干清粪, 按国家有关要求进行疫苗注射。两组饲料营养成分见表1。记录指标包括增重、日增重、料重比。
2.实验结果
全期猪只生长情况良好, 对照组和实验组均未出现死亡及疫病;两组粪便情况均正常, 对照组猪只粪便略显黑色, 为全价饲料中高铜所影响。实验组在实验期间, 猪群状况良好, 未出现打斗及其他不良反应。从表2可见, 两组饲料中蛋白含量不同, 但在育肥速度和育肥性能上, 两组均无差异, 可见饲料中较高的粗蛋白含量对荷包猪的育肥并没有提高。
荷包猪的祖先是辽西野猪, 后期经过长期的人为驯化逐渐形成了遗传性能稳定的品种。荷包猪属于肉脂兼用型猪种, 其长期生活在土地贫瘠的辽宁西部山区, 在不断的家养驯化过程中, 逐渐培养成耐粗饲的特性, 所以荷包猪对饲料中粗蛋白的吸收利用率有限。在实际生产中, 荷包猪饲料中的粗蛋白含量过高, 会造成大量的优质蛋白饲料浪费, 不能对粗蛋白充分的消化吸收及利用;粗蛋白含量过低, 会导致营养缺乏或育肥增重效果不理想。在制作荷包猪饲料配方时, 尽量把荷包猪的营养需要调低, 应略低于国家肉脂兼用型猪种的营养标准, 可保证养殖荷包猪的成本最低化、效益最大化, 避免不必要的浪费。