肺成纤维细胞

肺成纤维细胞（精选四篇）

肺成纤维细胞 篇1

关键词：百草枯,人胚肺成纤维细胞,CTGF,肺纤维化

近年来, 农药百草枯中毒的发生率有明显增加, 其死亡率高, 是中毒急救的一大难点, 中毒所致肺纤维化是死亡的重要原因, 但发病机制尚不完全明确[1]。目前认为百草枯进入机体后主要聚集于肺部, 引起以肺出血、肺水肿等为特征的肺损伤, 炎症细胞渗出和浸润逐渐减少, 肺成纤维细胞和胶原纤维增生, 肺泡壁增厚, 后期气腔 (肺泡、肺泡管、细支气管) 变形, 扩张成囊状, 进行性地发展为不可逆的肺纤维化。肺成纤维细胞的增殖、活化, 在肺纤维化的发生发展中起着重要作用[2]。结缔组织生长因子 (Connectivetissuegrowthfactor, CTGF) 是一种富含半胱氨酸的多肽, 在生理状态时, 机体组织细胞可有基础量CTGF分泌, 病理状态下, CTGF过度表达与某些增生性或纤维化性疾病的发生密切相关。因此了解百草枯中毒后肺成纤维细胞CTGF的表达情况, 对于阐明百草枯致中毒性肺纤维化的发病机理以及探索以肺成纤维细胞为靶细胞的治疗方法有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人胚肺成纤维细胞 (MRC-5) , 购于中科院细胞库;MEM培养基 (上海正极生物科技有限公司) ;胎牛血清 (杭州四季青) ;PBS;胰蛋白酶;CTGF ELISA试剂盒 (USA, RapidBio Lab) 等。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养:

人胚肺成纤维细胞 (MRC-5) 培养于MEM培养基中 (内含10%的胎牛血清) , 于恒温恒湿的CO2孵箱内培养, CO2含量5%, 温度37℃。

1.2.2 百草枯处理人胚肺成纤维细胞 (MRC-5) 。

配制不同百草枯浓度的MEM培养液:50mg/L、100mg/L、200mg/L。收集MRC-5细胞并制成细胞悬液, 细胞密度为1×104个/ml, 然后均匀接种于六孔培养板, 待细胞贴壁生长后换含有百草枯的细胞培养液, 于恒温恒湿的CO2孵箱内培养, CO2含量5%, 温度37℃, 12h。12h后换不含百草枯的细胞培养液继续培养。续培养, 分别于12h、24h、36h、48h、60h、72h收集细胞上清液, 离心去杂质后-70℃冷藏备用。采用双抗夹心ELISA法检测各组上清液样品中CTGF浓度。

1.3 数据处理

实验数据均采用均数±标准差表示, 采用SPSS17统计软件, 多个样本均数比较用单因素方差分析, 多个样本均数间的两两比较用最小显著差法, 以P<0.05为有显著性差异。

2 实验结果

以标准品的OD值为纵坐标, 以标准品浓度为横坐标, 绘制标准曲线, OD值和标准品CTGF浓度呈正相关, 根据标准曲线和样品的OD值得到样品中所含CTGF的浓度, 如表1。

经统计学分析, 如图1所示, 正常MRC-5细胞少量CTGF, CTGF浓度在0~48h, 随时间变化而明显增加 (P<0.05) , 而60h与72hCTGF的浓度与48h无明显差异 (P>0.05) ;50mg/L百草枯处理后, 0~36hCTGF浓度有少量表达, 无明显差异, 48h时CTGF表达明显增加 (P<0.05) , 48~72h CTGF浓度随时间变化而明显增加 (P<0.05) , 在72h时CTGF浓度有大幅度的提高;100mg/L百草枯处理后, 0~36hCTGF浓度有少量表达, 无明显差异 (P>0.05) , 48h时CTGF表达明显增加 (P<0.05) , 48~72hCTGF浓度随时间变化而明显增加 (P<0.05) , 在72h时CTGF浓度有大幅度的提高;200mg/L百草枯处理后, 0~48hCTGF浓度有少量表达, 无明显差异 (P>0.05) , 60h时CTGF表达明显增加 (P<0.05) , 在72h时CTGF浓度有大幅度的提高 (P<0.05) ;百草枯处理组, 在48~72h时, CTGF的表达随百草枯浓度的增加而呈减少趋势, 特别是在200mg/L百草枯处理后, CTGF的表达相对其他浓度显著减少 (P<0.05) 。

3 讨论

结缔组织生长因子 (Connectivetissuegrowth factor, CTGF) 最早是Bradham等[3]在1991年用亲和色谱法从人脐静脉内皮细胞条件培养基中发现的, 是一种相对分子量为38kDa的富含半胱氨酸分泌性生长因子, 属于即刻早期基因、高度保守的CCN多肽家族[4]。它是TGF-β1的下游高效反应元件, 可能仅介导着TGF-β1的部分生物学效应, 即刺激成纤维细胞增生和胞外基质合成, 促进组织器官纤维化形成[5]。CTGF参与组织纤维化的生物学活性主要表现在:具有有丝分裂原效应, 促进血管平滑肌等细胞的增殖;在其他细胞因子的协同作用下刺激细胞外基质 (胞外基质) 的合成, 抑制其降解, 导致胞外基质的积聚及结构改建;表达细胞黏附分子 (如整合素) , 使细胞易于黏附及结合基质蛋白, 并促进细胞的趋化效应 (体外亦能趋化成纤维细胞) , 从而加速组织的纤维化进程[6]。

通过本项试验笔者观察到在经过百草枯处理后的肺脏成纤维细胞分泌CTGF蛋白明显上调, 高于正常细胞, 提示活化的成纤维细胞通过产生CTGF, 介导成纤维细胞增殖和胞外基质产生, 在肺纤维化中起关键作用。由此推论, 在百草枯所致急性间质性肺炎患者肺组织中增生活化的成纤维细胞CTGF蛋白表达呈阳性;但经过高浓度百草枯处理后的肺脏成纤维细胞所分泌CTGF较中等浓度百草枯处理后肺脏成纤维细胞含量减少, 表明高浓度百草枯中毒后正常的肺组织消失, 活化的成纤维细胞分布很少, CTGF蛋白表达阳性率降低。以上说明, CTGF较强的表达主要是在肺组织纤维变性的早期阶段, 在一定范围内与百草枯浓度呈正相关, 但是当浓度超过一定限度后, CTGF表达反而降低, 但患者病情可能更为严重。

CTGF在百草枯中毒所致肺脏纤维化过程中起重要作用, 在肺脏纤维化过程中其含量的监测对其发病程度评价具有重要的临床意义同时, CTGF的发现为控制纤维化提供了一个新的治疗靶点, 针对CTGF的治疗可能会比针对TGF-β1的治疗更有实用意义。通过对CTGF基因表达调节, 信号转导途径和受体结合途径的进一步研究, 选择治疗策略阻断CTGF的基因表达, 早期应用CTGF中和抗体或受体拮抗剂来阻断CTGF信号传导表达和生物学活性, 将是控制纤维化疾病发生和发展的一种崭新手段, 为今后防治纤维化疾病带来新的希望。对CTGF发挥生物学活性的受体及其作用的信号转导分子机制以及其在病理过程中异常产生和活化机制的进一步研究, 将为进一步了解CTGF的作用机制, 寻找控制CTGF介导的纤维化的最适分子靶点, 也是进一步实验研究的重要内容。

参考文献

[1]李闯, 郝同琴, 刘建萍, 等.百草枯中毒患者血清肿瘤坏死因子-α白细胞介素-6及百草枯浓度变化的分析[J].中国急救医学, 2010, 30 (8) :739-741.

[2]李伟, 张炜, 刘红梅, 等.吡啡尼酮对百草枯中毒急性肺损伤的保护机制研究[J].中国急救医学, 2011, 31 (2) :148-150.

[3]Bradham DM, Igarashi A, Potter RL, et al.Connective tissue growth factor:a cysteine-rich mitogen secreted by human vascular endothelial cells is related to the SRC-induced immediate early gene product CEF-10[J].Cell Biol, 1991, 114 (6) :1285.

[4]Leask A, Abraham DJ.The role of Connective tissue growth factor, a multifunctional matricellular protein, in fibroblast biology[J].Biochem Cell Biol, 2003, 81 (6) :353-363.

[5]Cicha I, Goppelt-Struebe M.Connective tissue growth factor:context-dependent functions and mechanisms of regulation[J].Biofactors, 2009, 35 (2) :200-208.

肺成纤维细胞 篇2

2008-06-19 00:00 来源：丁香园

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知识总结

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1517 关键词： MEF小鼠 胚胎成纤维细胞

小鼠胚胎成纤维细胞的富集

1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。

2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。

3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。

4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。

5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/EDTA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。

6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。

7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。

8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。

9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。

10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。

11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。

12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。

13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。

注释：

我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。

培养基成分：

88％ DMEM 10％ FBS 1％ NEAA 1% 双抗

对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。

小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代

1、移去MEF培养基

2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。

3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。

4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。

5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。

6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。

7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。

8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37℃培养箱中进行培养。

注释：

MEF培养基成分：

89% DMEM(Gibco # 12100-046)10% FBS(Gibco # 16000-044)1% NEAA(Gibco # 11140-050)MEF每传一代就会生长得更慢些。你第一次传代的比例可以是1:5，但是最后一次的传代（第4代或第5代）比例应该是1:2。

小鼠胚胎成纤维细胞的冻存

重悬培养基：

80% DMEM 20% FBS 1% NEAA 冻存培养基：

60％ DMEM 30％ FBS 20％ DMSO

1、用不含钙镁离子的PBS洗一次细胞。

2、加入胰蛋白酶/EDTA37℃消化大约5min。

3、将细胞吹打下来。

4、加入与胰蛋白酶/EDTA等体积的培养基以终止胰蛋白酶的消化。

5、吹散大块组织。如果还有大块组织存在，可将悬液加入到50ml的管中使其沉淀。

6、取上清液，将其分装到锥形管中，1000rpm离心5min。

7、每个冻存瓶中加入0.5ml（冻存液的一半体积）的重悬培养基重悬细胞。

8、逐滴加入等体积的（0.5ml/瓶）冻存培养基，混匀。现在DMSO的浓度是10％。

9、每个冻存瓶中加入1ml的细胞。

10、迅速将细胞转移到冻存的容器中，-70℃冻存过夜。（细胞不能长时间放置在室温而含有DMSO的情况下）

11、第二天将细胞放于液氮中长期保存。注释：

提前标注好冻存细胞的以下信息：

细胞系名称

传代的代数

冻存细胞的数目

日期

Initials 注明冻存/解冻形式

小鼠胚胎成纤维细胞的解冻/复苏

1、将冻存瓶从液氮中取出。

2、放在37℃水浴中快速解冻，being careful not to immerse the vial above the level of the cap.3、当仅还有一点冰晶残留时，用95％的乙醇消毒冻存瓶的外面，并将其置于hood中。（为什么用95％的乙醇消毒？hood是什么？）

4、轻轻地上下翻转细胞一次，将它们放入15ml锥形管中。

5、想管中逐滴加入10ml培养基。这一步操作不能少于两分钟。做快了对细胞将是一种打击，你将得到比其他方法具有更低生活能力的细胞。6、1000rpm离心5min。

7、将细胞重悬于10ml培养基中，然后放入T75培养瓶中。

8、放入37℃培养箱。

9、注明冻存/解冻的形式，以更新数据。

1、关于如何确底胚胎期12.5d~13d的小鼠？希望大家能够介绍一下自己所采用的方法，集思广益。我所采用的方法是选择同一天出生的三对小鼠，到成熟（8~10 w）后，分三周合笼，（每周合笼一对），然后待最早合笼的小鼠产崽后，再取另两个雌鼠的胚胎。不知道这样行不行，也没注意别人是怎样做的。另外问了几个外科的同学也没找到可以查出小鼠孕期的仪器。

2、关于提取MEF的比较好的protocol

3、关于MEF转染时起耐受性如何？这个我以后主要做这些，可能会积累一定的经验，但现在肯定有各位朋友已经从事或正在从事着方面的工作，希望能够分享经验。

4、关于其分泌细胞因子能力？我从一些文献上发现，MEF除了作为胚胎干细胞的饲养层以外，也是研究天然免疫的重要材料，如日本东京大学的AKIRA的实验室，大板大学的takashi fujita实验室就发了相当多的文章。从这些文献可以看出，MEF分泌细胞因子能力远远强于HEK293等工程细胞，相当于肝实质细胞，略低于几种免疫细胞。但较免疫细胞，我认为有其不可替代的优势：

（1）其并不是主要发挥免疫功能的细胞，只有在受到外界刺激时才会应答，分泌细胞因子，免疫细胞在不受刺激时也会为了维持稳态而不断产生细胞因子，即使有严格的control 组，但专门的免疫细胞即使是同一种细胞（DC，NK，T）但不同的细胞分泌细胞因子的能力也是参差不齐的。会造成control 相对不一致。

（2）另一方面，由于这些免疫细胞大部分都是悬浮的，不太容易转染，结果阳性率也会较低。（3）现在的分离MEF的方法很便宜，不复杂，而分离纯的免疫细胞（如NK，DC），需要MACS，FACS等，这对目前国内的实验室经费相对紧张的情况来说，不是很划算。因此除非是需要研究某一种免疫细胞，如果是为了研究天然免疫或者adaptive immune过程中某中基因，或者蛋白，或者某一信号通路等的作用，MEF 细胞不失为一种选择。

网友crepi 的观点：

1、我每次取的是16~18天的胚鼠 个人觉得无碍 我倒更喜欢大一点的胚胎 更好操作一点

2、我取的是皮肤 然后胰酶4度消化过夜 第二天终止消化 撕掉表皮 留下真皮 减碎 用的100目滤网过滤 这个胰酶消化的时间是个关键 时间长了 细胞容易死 时间少了，表皮不容易揭下来 我有此就是这样 消化了15个小时 结果接种下来的细胞不能贴壁 全死了

3、我用的培养液是DMEM+10%小牛血清 培养液也是关键 因为虽然都是成纤维细胞比较泼辣 但总归是原代 可能还是比较娇嫩 我前几天就是这样 后来发现是培养液出的问题 测的PH值都8.3了 细胞不死才怪 毕竟细胞耐酸不耐碱

4、原代培养的最大天敌还是污染

网友baichangming的观点：

MEF对培养基和血清的要求不高，一般的都行我用过高糖DMEM和D/F-12，生长情况都行，而且看不出什么差别。血清也是以前用几百块钱的国产标准胎牛血清也长得也不错，因为要养干细胞，所以现在换成进口Gibco胎牛的血清（两千多/500ml），感觉细胞的状态确实好了一些。我的血清浓度一般是16.66666%。

网友北羽迦楼的观点： 细胞没别的，就是很容易老化，一般我都是1:5~1:3传代，3代之后细胞就出现衰老了，我感觉年轻增殖能力强的MEF应该有着清晰的细胞轮廓，细胞立体效果不错，在相差显微镜下，细胞核清晰，细胞纤长，正在分裂或是刚刚分裂的细胞没有伸出伪足，但是同样有着更加明亮的轮廓，与细胞边缘相比，细胞呈深色（我觉得是透光效果不好）。一般在4×下观察最能看出细胞的状态，此时能看到细胞呈梭形或是三角形。细胞铺展很厉害，细胞的透光效果增加，说明开始衰老。衰老的MEF最好不要做feeder,但是也不是完全不好。但是要是做转染或是感染的话，出现衰老的MEF就不行了。所以一般就是3代以内做。

我们用的就是WiCell的protocal养，和前面那位战友发的差不多。只是我们用1mg/ml Collengase IV消化40min，用什么酶不重要，我觉得最重要的就是种盘后的换液。原代2小时不管还有多少米贴都不要，传代复苏后一小时就换。消化的时候也是要舍得，0.05%Trypsin-EDTA(GIBCO)，5min消化不下来的也统统不要。因为健康的MEF就是易消化易贴壁。老化以及混杂的其他细胞（神经、上皮）就没那么快了。

肺成纤维细胞 篇3

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

人胚肺成纤维细胞 (MRC-5) 购置中国协和医科大学基础医学院细胞中心;MEM/NEAA培养液购置中国协和医科大学基础医学院;胰酶购于Sigma公司;胎牛血清购于Gibco公司;黄芪注射液购置成都地奥九泓制药厂, 每支10 m L (相当于原生药材20 g) ;0.1%天狼猩红苦味酸染液购置北京海德生物科技有限公司;噻唑蓝 (MTT) , 二甲基亚砜 (DMSO) 购置北京科海军舟有限公司;荧光倒置显微镜为日本尼康公司产品;生化培养箱, SANYO公司;酶标仪, 为美国B.D公司产品。

1.2 细胞的培养

MRC-5细胞培养于含10%胎牛血清、100µg/m L青霉素、100µg/m L链霉素的MEM/NEAA培养液中, 于37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2育箱中培养, 96 h长满瓶底, 3~4 d更换1次培养液, 传代。

1.3 黄芪注射液对MRC-5增生的影响

采用MTT法检测。取对数生长期的MRC-5, 胰酶37℃消化5 min, 以10%胎牛血清的MEM/NEAA培养液制备成1×105/m L细胞悬液, 接种于96孔培养液板中, 每孔200µL, 置于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养, 至细胞长至单层后, 分别在细胞中加入不同浓度的药物培养液, 同时设不加药的阴性对照和只加培养液的空白对照, 每组设10个复孔。分别继续培养24、48、72 h后, 每孔加入20µL MTT, 继续培养4 h, 弃上清液, 加入200µL DMSO, 轻微震荡10 min, 使MTT完全溶解, 于自动酶标仪490 nm波长处测定各孔吸光度A值。

1.4 胶原的检测[3]

取对数生长期的成纤维细胞, 用MEM/NEAA培养液调整细胞数为1×105/m L, 接种到96孔培养板中, 每孔200µL, 37℃、5%CO2及饱和湿度的CO2培养箱中培养, 24 h后在各组细胞中加入含有不同浓度的药物培养液, 另设不加药的正常对照组, 每组设10个复孔。分别培养24、48、72 h后吸去培养液, 每孔加甲醇100µL, -20℃固定一夜, PBS洗1次, 天狼猩红染1 h, 0.1%醋酸洗3次, 每孔加入0.1µmol/L Na OH 20µL, 室温震荡1 h, 置于酶标仪540 nm处检测。

2 结果

2.1 黄芪注射液对体外培养人胚肺MRC-5细胞增殖的影响

见表1。MTT结果:黄芪注射液浓度为400 mg/m L时能显著抑制MRC-5生长 (P<0.05) 。25~200 mg/m L的浓度范围对MRC-5的生长具有促进作用。说明黄芪注射液对人胚肺成纤维细胞的生长增殖既可促进又可以抑制, 呈剂量依赖性。

注:与对照组相比较, P<0.05

2.2 镜下观察成纤维细胞形态的变化

对照组的细胞密度低时, 细胞长梭形或三角形, 有多个细胞质突起 (图1) ;细胞密度高时, 以长梭形为主, 排列紧密, 呈放射状或涡旋状, 边界不清 (图2) 。用药组的细胞:25~200 mg/m L浓度下的细胞形态与对照组差别不大, 仅生长速度快于对照组;400 mg/m L浓度下的细胞数量明显减少, 细胞皱缩, 细胞边缘变钝, 细胞间隙增宽, 分布松散, 甚至可以看到漂浮的死亡细胞 (图3) 。

2.3 胶原测定结果

随着黄芪注射液的浓度增加, 与对照组相比, 当浓度在25~200 mg/m L时, 成纤维细胞的胶原生成量有所增加, 而在400 mg/m L浓度时, 成纤维细胞的胶原生成量明显减少。结果见表2。

注:与对照组相比较, P<0.05

3 讨论

肺纤维化是多种原因引起的慢性肺系疾病的共同结局, 是多种肺系疾病发展到晚期的共同病理变化。其集中表现为成纤维细胞的异常增殖和细胞外基质的过度沉积。在肺部, 细胞外基质的主要成分之一胶原即来自于活化的成纤维细胞。由于成纤维细胞的异常增殖及胶原的分泌增加在肺纤维化过程中起着重要作用[4], 因此, 抑制肺成纤维细胞增殖是防治肺纤维化的一种有效手段。

本实验以人胚肺成纤维细胞为靶细胞, 研究黄芪注射液对成纤维细胞形态及胶原表达的影响。结果发现, 黄芪注射液在中低浓度条件下对成纤维细胞的生长有促进作用, 在高浓度条件下则有抑制作用。提示其可能有预防或延缓肺纤维化疾病进程的作用。有研究表明, 在肺纤维化的发生发展过程中, Ⅰ、Ⅲ型胶原合成与降解失衡起主要作用, 在肺泡炎症阶段或肺纤维化早期主要以Ⅲ型胶原增加为主, 此期病变尚可逆转, 随后病变转为慢性, 则以Ⅰ型胶原沉积为主, 形成不可逆转的改变[5,6]。天狼腥红染液能与胶原紧密吸附, 反应极其稳定, 染色后不褪色, 有特异性, 是目前胶原染色最好的染料。在普通光镜下观察, 胶原纤维呈红色。

综上所述, 黄芪注射液在中低浓度下能够促进成纤维细胞的生长, 高浓度下可以抑制成纤维细胞的生长, 因此可以延缓肺纤维化的进程。同时提示黄芪对人体的作用具有双向性。

参考文献

[1]ArauJo CC, Leon LL.Biological activities of Curcuma longal[J].Meminst Oswald Cruz, 2001, 96 (4) :7232-7238.

[2]陈珍旭, 吴蓉易.葛根素对实验性大鼠肺纤维化影响[J].临床肺科杂志, 2006, 11 (4) :4232-4236.

[3]Brnton MH, Kopp JB.TGFβ-1 and Fibrosis[J].Microbes Infect, 1999, 1 (15) :1349-1365.

[4]赵洪文.肺成纤维细胞在肺纤维化中的作用[J].国外医学?呼吸系统分册, 1996, 16 (3) :116-117.

[5]侯杰, 戴令娟.川芎嗪、丹参治疗大鼠肺纤维化对Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因表达的影响[J].中华结核和呼吸杂志, 1999, 22 (1) :43-44.

肺成纤维细胞 篇4

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

细胞培养超净台(苏州安泰空气技术有限公司),CO2孵箱(HERA CELL),倒置显微镜(OLYMPUS),酶联免疫检测仪(Bio-TEK Instruments,INC),4020与4010 NA(企业提供,母液浓度为10 mmol/ml的贮备液,-20℃保存备用),噻唑蓝(MTT,美国Sigma公司,购自AB公司)。

1.2 细胞培养

HELF(中国科学院上海细胞生物研究所)。培养液:达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)+体积分数为10%的胎牛血清+双抗(青霉素、链霉素各100 U/ml),于恒温细胞培养箱(37℃,5%CO2)中培养,每2天换液1次,每3~4天传代1次。

1.3 MTT试验

选取HELF,以2×104个/孔的密度种于96孔板上。以终浓度为3、6、9和12μg/ml的4020和4010 NA处理细胞,培养24 h,吸出药液。检测前,每孔加入20μl新鲜的DMEM培养液和20μl MTT(1 mg/ml),37℃5%CO2培养箱中孵育4 h后吸出原液,加入150μl二甲亚矾(DMSO),在摇床上震荡10 min,使结晶物充分溶解,然后在酶联免疫检测仪上490 nm波长处读取吸光度(A)值。细胞增殖抑制率=(1-试验组A值/对照组A值)×100%。每组设5个平行样。

1.4 统计学分析

利用SPSS 13.0统计软件对4020、4010 NA在不同浓度下对HELF细胞的增殖抑制率进行t检验,并分别对两者在不同浓度时的增殖抑制率进行单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4020和4010 NA对HELF细胞的增殖抑制效应对比

4020、4010 NA在其浓度分别为3、6、9、12μg/ml时,对HELF细胞增殖抑制率的平均值依次为:4020,8.44%、33.94%、50.50%、92.56%;4010 NA,12.78%、50.46%、81.68%、98.24%。经t检验发现,4020相对4010 NA,在3、6、9、12 mg/ml浓度时对HELF细胞增殖抑制率的差异均有统计学意义(均P<0.01)。见表1。

2.2 4020、4010 NA对HELF细胞增殖抑制效应的剂量反应趋势

单因素方差分析显示,4020、4010 NA在3、6、9、12 mg/ml不同浓度时,对HELF细胞的增殖抑制率差异有统计学意义(P<0.05)。观察数据发现,4020、4010 NA对HELF细胞的增殖抑制率都表现出随着剂量的增大而作用增强。见图1。

3 讨论

对苯二胺类防老剂作为全球轮胎制造业中用量最大的橡胶防老剂产品[2],其毒性研究在国内外早已引起广泛关注。MATSUMOTO等[3]在大鼠模型中研究抗氧剂N,N'-二苯基-对苯二胺(DPPD)的生殖发育的毒性,在50 mg/(kg·d)喂食剂量组观察到雌性小鼠的妊娠期显著延长,在300 mg/(kg·d)剂量组不仅出现妊娠期延长,而且产崽成活率低甚至出现死亡。BHARALI等[4]对雄性大鼠分别用0、1、2和3 mg/(kg·d)浓度的对苯二胺(PPD)进行亚慢性局部毒性试验,研究发现雄性大鼠的精子数量显著减少,提示DPPD存在潜在生殖发育毒性。刘全中等[5]发现PPD有较强的致敏性,并进一步探讨对机体免疫功能的影响。YAMANO等[6]用PPD的5种衍生物PADPA、DPPD、IPPD、DMBPPD、MHPPD在豚鼠模型中证明PPD及其衍生物有致敏性以及相互间的交叉反应为阳性。且局部淋巴结试验(LLNA)的敏感性为:IPPD和PADPA>PPD>DMBPPD和MHPPD>DP-PD。CHVNG等[7]在艾姆斯沙门菌株中研究PPD及其衍生物的致突变性,表明PPD的致突变能力较弱,但2-N-对苯二胺等有直接的诱变性。本文从最常用的PPD类橡胶防老剂4020、4010 NA着手,结合职业工人接触可能的暴露途径,研究两种防老剂对HELF细胞的毒性差异,发现4020相对4010 NA而言,细胞毒性要低,且两者都有随着浓度的增加细胞毒性增强的趋势,这与CHEN等[8]研究相一致。

因此,我们建议我国轮胎制造行业应选用细胞毒性相对低的4020作为PPD类橡胶防老剂,同时应防止高浓度接触,做好设施防护和个人防护,从而为我国轮胎制造业的安全健康发展提供条件。

作者声明

本文无实际或潜在的利益冲突

参考文献

[1]吕咏梅.对苯二胺类橡胶防老剂技术进展及市场需求分析[J].橡胶科技市场,2010,8(21):1-5.

[2]SATHIAKUMAR N,GRAFF J,MACALUSO M,et al.An updated study of mortality among North American synthetic rubber industry workers[J].Occup Environ Med,2005,62(12):822-829.

[3]MATSUMOTO M,YAMAGUCHI M,YOSHIDA Y,et al.An antioxidant,N,N'-diphenyl-p-phenylenediamine(DPPD),affects labor and delivery in rats:a 28-day repeated dose test and reproduction/developmental toxicity test[J].Food Chem Toxicol,2013(56):290-296.

[4]BHARALI MK,DUTTA K.Testicular toxicity of para-phenylenediamine after subchronic topical application in rat[J].Int J Environ Health Res,2012,22(3):270-278.

[5]刘全中,傅志宜.对苯二胺皮肤外涂对豚鼠细胞免疫功能的影响[J].天津医药,1994(5):291-292.

[6]YAMANO T,SHIMIZU M.Skin sensitization potency and cross-reactivity of p-phenylenediamine and its derivatives evaluated by non-radioactive murine local lymph node assay and guinea-pig maximization tes[tJ].Contact Dermatitis,2009,60(4):193-198.

[7]CHUNG KT,MURDOCK CA,Stevens SJ,et al.Mutagenicity and toxicity studies of p-phenylenediamine and its derivatives[J].Toxicol Lett,1995,81(1):23-32.