鼻咽癌细胞（精选七篇）
鼻咽癌细胞 篇1
1 材料与方法
1.1 主要试剂
鼻咽癌5-8F细胞系,JM109大肠杆菌株(科学实验中心保种);质粒表达载体pGenesil-1.1(武汉晶赛公司);限制性内切酶Eco31Ⅰ,MluⅠ和SalⅠ(Promega公司);高纯度质粒提取试剂盒(天根公司);T4DNA连接酶、DL2000 DNA和RT-PCR试剂盒(Takara公司);TRzol提取试剂(Invitrogen公司);1640培养基,G418(Gibco公司);新生牛血清(杭州四季青公司);转染试剂Effectene Transfection Reagent(QIAGEN公司);通用蛋白裂解液(Generay公司);PVDF膜(Millipore公司);兔抗人stathmin一抗(Bioworld公司);小鼠抗人β-actin一抗,辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgG二抗、辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG二抗和BCA蛋白定量试剂盒(碧云天公司);ECL发光液(北京博奥森生物技术有限公司)。
1.2 仪器
CO2培养箱(美国Thermo Fisher);多功能高速冷冻离心机,生物分光光度计(德国Eppendorf);基因扩增仪(德国BIOMETRA);酶标仪和小型垂直电泳转印系统(美国Bio-Rad);全自动数码凝胶成像分析系统(上海培清);制冰机(日本三洋);DY-CP-31系列水平电泳仪;生化培养箱;温控培养摇床等。
1.3 S tathm in特异性S i R N A质粒表达载体的构建及鉴定
Stathmin基因序列来源于GeneBank,按照si R-NA设计原则设计stathmin特异性干扰DNA片段,命名为STM(片段序列为GCGAGAGAAGGATAAG-CACAT)。BLAST分析表明:该序列与人的其他基因序列无同源性,合成DNA插入片段的序列为:正义链5'-CACCGCGAGAGAAGGATAAGCACATTTCAA GACGATGTGCTTATCCTTCTCTCGCTTTTTTG-3';反义链5'-AGCTCAAAAAAGCGAGAGAAGGATAAG-CACATCGTCTTGAAATGTGCTTATCCTTCTCTCGC-3'。
将合成的单链DNA片段进行退火形成双链DNA,Eco31Ⅰ酶切pGenesil-1.1质粒表达载体,1%琼脂糖凝胶回收线性化质粒载体,采用T4连接酶将退火的双链DNA片段与线性化的pGenesil-1.1质粒载体连接,连接产物转化感受态JM109,接种于含卡那霉素(终浓度为30 ug/mL)的LB平板上,37℃培养过夜,挑取单个菌落进行扩增培养。采用质粒提取试剂盒提取质粒进行MluⅠ和SalⅠ双酶切分析,并对重组质粒表达载体进行测序鉴定,重组质粒表达载体命名为:pGenesil-1.1-STM。同时构建通用阴性对照质粒表达载体,插入片段序列为GACTTCATAAGGC GCATGC,与人的任何基因无同源性,命名为:pGenesil-1.1-HK。
1.4 G 418筛选
用0.25%胰酶消化5~8F细胞,制成细胞悬液接种于24孔板,第2 d分别加入G418,其终浓度为300、400、500、600、700 mg/L,每隔3 d换液,筛选14d,选择能够杀死全部细胞的最少G418浓度为最佳筛选浓度,最后确定筛选浓度为500 mg/L。
1.5 质粒表达载体阳性细胞的筛选
细胞采用RPMI1640培养液(含10%小牛血清,100 U/m L青霉素,100μg/m L链霉素)培养,置37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。0.25%胰酶消化制成细胞悬液,按2×105/孔接种于6孔板,细胞达60-80%融合时,利用Effectene Transfection Reagent(QIAGEN公司)将si RNA重组表达载体转入5-8F细胞,实验设:阴性对照pGenesil-1.1-HK重组质粒表达载体;stathmin干扰pGenesil-1.1-STM重组质粒表达载体。具体操作步骤按说明书进行。转染24 h后,在倒置荧光显微镜下观察细胞(发绿色荧光)与照相。然后,细胞用0.25%的胰蛋白酶消化,按1∶5传代培养,24 h后,换含G418(500μg/m L)的选择性培养基进行抗性筛选,每3 d换液,1周有80-90%的细胞死亡,换用200μg/m L的G418维持筛选,筛选14 d后,有抗性克隆出现,转染阳性细胞在荧光显微镜下呈绿色荧光,用滤纸法挑取单克隆进行扩大培养,得稳定转染的5-8F细胞株;以未转染载体的5-8F细胞为对照,显微镜下观察、比较,并拍照。
1.6 R T-P C R检测stathm in表达
PCR引物由invitrogen公司合成。GAPDH(594bp)上游引物:5'-TCAGCCGCATCTTCTTTTG-3';下游引物:5'-GATGGCATGGACTGTGGTC-3'。Stathmin(449 bp)上游引物:5'-ATGGCTTCTTCTGATATCCAG G-3';下游引物:5'-TTAGTCAGCTTCAGTCTCGT-CA-3'。将各组细胞置于50 m L玻璃培养瓶中培养2 d,去上清,PBS洗3次,采用Trizol法提取总RNA,测定其浓度,各组取0.5μg总RNA进行RT-PCR,具体操作按One-step RT-PCR说明书进行,扩增条件:50℃30 min,94℃3 min,94℃30 s,62℃30 s,72℃1 min,共28个循环,最后72℃5min。PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统分析电泳结果。
1.7 W estern blotting检测stathm in表达
将各组细胞置于50 m L玻璃培养瓶中培养2d,去上清,PBS洗三次,加入适量通用蛋白裂解液裂解细胞,置冰上15 min,收集细胞裂解液,超声波处理3次,每次30 s,每次间隔30 s,然后4℃,12 000rpm离心30 min,收集上清液。用BCA方法测定总蛋白浓度。取50μg总蛋白加上样buffer混匀,煮沸5~10 min后,置冰上冷却,先用100 V进行15%SDS-PAGE电泳,当样品进入分离胶后,转换为120V电泳至样品分离结束,取出玻璃板,采用湿转法将蛋白转移到PVDF膜上,恒流300 m A,1.5 h。用丽春红染色检测电泳结果,5%脱脂奶粉(TBST配置)封闭1 h,加入stathmin一抗(1:500),30℃,50 r/min,2h,或4℃过夜;用TBST洗4次,每次5 min,加入辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG二抗,30℃,50 r/min,2h,TBST洗4次,每次5 min,采用ECL发光试剂进行发光;压片、显影、定影,然后,进行图像分析。同样操作检测β-actin表达。
2 结果
2.1 质粒表达载体鉴定
酶MluⅠ和SalⅠ切pGenesil-1.1-HK和pGenesil-1.1-STM质粒表达载体,产物约316 bp,见图1。测序表明,插入质粒表达载体中的片段与预测相符合。重组质粒表达载体构建成功,见图2。
2.2 质粒表达载体阳性的5-8F细胞建立
质粒表达载体阳性5~8F细胞表达绿色荧光蛋白(GFP),荧光显微镜下观察显绿色荧光,载体的转染效率达60~70%;G418筛选后得稳定转染的单克隆细胞株,见图3。
M:DNA Marker;1:pGenesil-1.1-HK质粒;2:pGenesil-1.1-STM质粒
A:p Genesil-1.1-HK质粒;B:pGenesil-1.1-STM质粒
A:普通光源下观察转染细胞(×10);B:荧光激发光源下观察转染细胞(×10);C:普通光源下观察单克隆化细胞(×10);D:荧光激发光源下观察单克隆化细胞(×10)
2.3 Stathm in si R N A质粒表达载体下调stathm in m R N A
与空白对照组和pGenesil-1.1-HK组比较,pGenesil-1.1-STM组stathmin m RNA明显降低;空白对照组与p Genesil-1.1-HK组比较,stathmin m RNA无明显差别,见图4。
M:DNA Marker;1:空白对照组;2:p Genesil-1.1-HK组;3:pGenesil-1.1-STM组
2.4 S tathm in si R N A质粒表达载体抑制stathm in蛋白表达
与空白对照组和pGenesil-1.1-HK组比较,pGenesil-1.1-STM组stathmin蛋白表达明显降低;空白对照组和p Genesil-1.1-HK组比较,stathmin蛋白无明显差异,见图5。
1:空白对照组;2.pGenesil-1.1-HK组;3:pGenesil-1.1-STM组
3 讨论
Stathmin蛋白是一种重要的微管解聚蛋白,通过自身磷酸化调节其活性,影响微管系统的动力学平衡及细胞周期的转换[4]。大多数微管都表现出动力学的不稳定性,以动态的聚合、解聚及两者之间随机转换的形式存在。微管蛋白的解聚与肿瘤细胞的迁移、运动有关。据报道,肿瘤细胞通过与基底膜粘附,产生蛋白激酶溶解细胞外基质(ECM),然后,向周围组织浸润和发生远处转移[5,6]。Stathmin蛋白在白血病、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、神经胶质瘤、骨肉瘤、淋巴瘤、及消化系统等多种恶性肿瘤中有异常高表达。Stathmin高表达已成为乳腺癌的预测因子。Stathmin基因正成为恶性肿瘤生物治疗的新靶点。Stathmin高表达对维持白血病细胞的转化表型至关重要,应用反义核酸技术抑制stathmin表达能逆转白血病细胞恶性表型,降低白血病细胞在活体中的致瘤性[7]。Stathmin的表达水平与肺癌的分化程度成反比,stathmin表达水平越高,肺癌分化程度越低,stathmin可以作为肺癌诊断的标志物[8]。SUCHARITA等[9]将腺病毒介导的抗stathmin核酶转染前列腺肿瘤细胞,stathmin表达明显下降,肿瘤细胞生长与增殖明显抑制,细胞分裂停滞在G2/M期。MISTRY等[10]报道,靶向stathmin si RNA表达载体沉默stathmin抑制肿瘤细胞生长。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介导的同源m RNA高效特异性基因沉默现象,具有高特异性与高效性等特点。目前,si RNA主要通过化学合成、体外转录和si RNA表达载体等方法获得,但si RNA表达载体法除了效果好,经济外,还能通过细胞转染和筛选,获得稳定的、特异基因表达抑制的细胞系,能对基因的功能进行较长时间的研究。WANG等[11]采用pGenesil-1.1质粒表达载体构建APE1特异性重组质粒,质粒转染乳腺癌T47D细胞后,能有效抑制APE1基因的表达。本研究采用si RNA质粒表达载体pGenesil-1.1,构建stathmin特异性si RNA的重组质粒,经酶切和测序分析,插入质粒中的片段与预测相符合,说明构建的stathmin特异性si RNA质粒表达载体成功。由于载体带有绿色荧光蛋白(GFP)和新霉素抗性基因,可建立稳定基因抑制表达的细胞系。
本实验通过构建stathmin si RNA重组表达载体,利用Effectene Transfection Reagent转染试剂将stathmin si RNA重组表达载体转入5-8F细胞,荧光显微镜下,观察质粒载体的转染效率达60-70%。经G418筛选后,获得稳定表达的单克隆细胞株。RT-PCR和Western blot检测结果表明:pGenesil-1.1-STM重组质粒转染细胞后,stathmin m RNA和蛋白的表达明显受到抑制,表明构建的stathmin si R-NA质粒表达载体能沉默stathmin基因,为进一步研究stathmin基因在鼻咽癌的生物学作用提供了前期准备,为鼻咽癌的基因治疗提供了实验基础。
摘要：目的 建立stathmin表达抑制的鼻咽癌细胞系,为stathmin在鼻咽癌中的生物学功能研究提供实验基础。方法 合成stathmin特异性干扰DNA片段,将合成的干扰DNA片段克隆到siRNA质粒表达载体pGenesil-1.1,载体导入JM109菌株进行扩增,酶切和测序对重组表达载体进行鉴定。应用脂质体将质粒表达载体转入鼻咽癌5-8F细胞,采用G418进行筛选;RT-PCR和Westernblot检测stathmin表达。结果 酶切和测序分析证实,插入siRNA质粒表达载体中的stathmin干扰DNA片段的序列和方向正确。表达分析表明,构建的stathmin特异性siRNA质粒表达载体能有效沉默stathmin在鼻咽癌5-8F细胞中的表达。结论 stathmin表达抑制的鼻咽癌细胞系建立成功。
关键词：stathmin,鼻咽癌,RNA干扰,基因沉默
参考文献
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鼻咽癌细胞 篇2
CD44是一种细胞表面跨膜糖蛋白,属于细胞黏附分子家族成员。CD44编码基因定位于人类染色体11p13上,长约为50kb [1]。根据表达方式不同CD44外显子分为标准型(CD44S) 和变异型(CD44V) 两大类。CD44选择性剪接与多种肿瘤的侵袭和转移密切相关[2]。笔者在具有高转移能力的5-8F鼻咽癌细胞系中克隆了一个新的CD44剪接变异体(Gene Bank登陆号:EF581837)[3]。研究表明,新CD44剪接变异体在有转移鼻咽癌组织和细胞系中高表达。本实验通过构建CD44新变异体siRNA质粒表达载体,建立CD44新变异体抑制表达的鼻咽癌5-8F细胞株,为CD44在鼻咽癌中的生物学功能及机制研究提供实验基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
JM109大肠杆菌株、鼻咽癌5-8F细胞系(桂林医学院科学实验中心保种)。
1.1.2 试剂
pGenesil-1.3质粒表达载体(武汉晶赛公司);限制性内切酶Eco31Ⅰ、SalⅠ和MluⅠ(Promega公司);T4 DNA连接酶和DL2000 DNA(Takara公司);Effectene Transfection Reagent 转染试剂(QIAGEN 公司);胰蛋白酶、G418(GIBCO公司);新生牛血清(浙江天杭生物科技有限公司);高纯度质粒提取试剂盒(天根公司); PVDF膜(Millipore 公司);CD44兔抗人抗体(武汉博士德公司);β-actin抗体、辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG和辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgG(碧云天有限公司);蛋白裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、ECL发光液(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
1.1.3 仪器
CO2培养箱(美国Thermo Fisher);倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS);多功能高速冷冻离心机和生物分光光度计(德国Eppendorf);酶标仪和小型垂直电泳转印系统(美国Bio-Rad);制冰机(日本三洋);全自动数码凝胶成像分析系统(上海培清);DYCP-31系列水平电泳仪等。
1.1.4 培养基
RPMI-1640培养基,LB培养基(GIBCO公司)。
1.2 方法
1.2.1 新CD44基因SiRNA质粒表达载体的构建及鉴定
根据GeneBank中CD44新变异体碱基序列,按照siRNA设计原则设计、合成CD44特异性干扰DNA片段。经BLAST分析:该序列与人已知基因序列无同源性,插入片段的DNA序列为:
正义链 :
5’-CCTCGCCGCTTTGCAGGTGTATTCTATGGACAAATA-CACCTGCAAAGCGGCTTTTTTG-3’;
反义链:
5’-AGCTCAAAAAAGCCGCTTTGCAGGTGTATTTGTCCA-TAGAATACACCTGCAAAGCGGC-3’。
将合成的单链DNA片段进行退火形成双链DNA,用T4连接酶将双链DNA与Eco31Ⅰ酶切的线性化pGenesil-1.3质粒表达载体进行连接,连接产物转化感受态JM109进行扩增培养。然后提取质粒,采用MluⅠ和SalⅠ双酶切及测序进行分析鉴定,并命名为pGenesil-1.3-CD44 。同时,构建阴性对照重组质粒表达载体,插入片段核心序列为GACTTCATAAGGCGCATGC,命名为pGenesil-1.3-HK。
1.2.2 G418筛选GFP表达的单克隆鼻咽癌5-8F细胞株
实验分组:阴性对照pGenesil-1.3-HK组;CD44特异干扰pGenesil-1.3-CD44 组。细胞采用RPMI1640培养液培养,消化调整细胞密度为5×104个/ml,接种于6孔板,第2d,利用脂质体Effectene Transfection Reagent(QIAGEN公司)将siRNA重组表达载体转入5-8F细胞,转染操作按说明书进行。转染24 h后,在倒置荧光显微镜下观察细胞转染效率。然后按1∶5传代培养,24 h后,用G418(500μg/ml)进行抗性筛选,当有 80～90%的细胞死亡时,换用G418(200μg/ml)维持筛选,有抗性克隆细胞出现时,在倒置荧光显微镜下可见呈绿色荧光阳性克隆细胞,然后用滤纸法挑取克隆细胞进行扩大培养,获得GFP表达的单克隆鼻咽癌5-8F细胞株。同时,筛选pGenesil-1.3-HK阴性对照质粒表达载体的5-8F细胞株。
1.2.3 Western blot 检测CD44蛋白表达
取对数生长期的pGenesil-1.3-HK组和pGenesil-1.3-CD44 组单克隆鼻咽癌5-8F细胞株,未转染载体的鼻咽癌5-8F细胞株进行传代培养,PBS洗3次,蛋白裂解液裂解细胞,置冰上15 min,收集细胞裂解液,超声波处理,然后,12000 r/min、4℃离心30 min,用BCA法进行蛋白定量。取总蛋白40μg进行12% SDS-PAGE电泳,电泳完后,采用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上,5% 脱脂奶粉封闭膜1 h,加入CD44一抗(1:500),50 r/min、2 h,用TBST洗3次,10min/次,加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗,50 r/min、2 h,TBST洗3次,10min/次,采用ECL发光液发光,然后进行图像分析。
2 结果与分析
2.1 获得重组质粒抑制表达载体
限制性内切酶MluⅠ和SalⅠ酶切pGenesil-1.3-HK和pGenesil-1.3-CD44重组质粒表达载体,产物约340 bp,见图1。测序分析表明,插入质粒表达载体中的DNA片段与预测相符合,见图2。成功构建重组质粒表达载体。
2.2 获得GFP表达的5-8F细胞株
细胞转染24 h后,重组质粒表达载体阳性5-8F细胞表达绿色荧光蛋白(GFP),细胞转染效率达70%, G418筛选获得GFP表达的单克隆鼻咽癌5-8F细胞株,见图3。
M:DNA Marker;1: pGenesil-1.3-HK质粒;2: pGenesil-1.3-CD44质粒。
M:DNA Marker;1: pGenesil-1.3-HK plasmid;2: pGenesil-1.3-CD44 plasmid.
A: pGenesil-1.3-HK质粒;B: pGenesil-1.3-CD44质粒。
A: pGenesil-1.3-HK plasmid;B: pGenesil-1.3-CD44 plasmid.
A:普通光源下观察细胞(10×);B:荧光激发光源下观察细胞(10×); C:普通光源下观察单克隆化细胞(10×);D:荧光激发光源下观察单克隆化细胞(10×)。
A: observing cells with ordinary light(10×);B: observing cells with excitation light (10×); C: observing clonal cells with ordinary light(10×);D: observing clonal cells with excitation light(10×).
2.3 CD44 siRNA质粒表达载体抑制CD44蛋白的表达
与空白对照组和pGenesil-1.3-HK组比较,pGenesil-1.3-CD44组CD44蛋白表达明显降低;空白对照组和pGenesil-1.3-HK组比较,CD44蛋白表达无明显差异,见图4。
1: 空白对照组;2.pGenesil-1.3-HK组;3: pGenesil-1.3-CD44组。
1:control group;2: pGenesil-1.3-HK group;3: pGenesil-1.3-CD44group.
3 讨论
鼻咽癌是常见的恶性肿瘤,由于鼻咽癌的组织学类型和生物学特性较特殊(发病部位隐蔽,局部侵蚀力强,易浸润性侵犯邻近组织器官,以及早期区域性淋巴结转移率高),初诊病例约70%为Ⅲ、Ⅳ期患者,治疗效果欠佳,局部复发率和远处转移率高达40%～50%,5年生存率仅20%～30% [4]。因此,寻找有效的治疗方法一直是鼻咽癌研究的重点。
CD44与透明质酸结合介导细胞间相互作用,涉及细胞许多生理的事件,包括细胞与细胞和细胞与基质的附着、细胞的迁移、细胞增殖、透明质酸摄取与降解等。目前,日益清楚,肿瘤微环境产生的信号对肿瘤细胞行为,如:生存、发展和转移致关重要。建立这些恶性行为,瘤细胞需要获得新的从原发部位分离、定位于远处器官的黏附和迁移属性。CD44,一个黏附/归巢分子,是瘤细胞外基质糖胺聚糖透明质酸的一个主要受体。具有结构和功能多性,能探查到细胞外基质的成分变化,并对这些微环境的变化做出恰当的反应,在肿瘤中起重要作用[5,6]。在乳腺肿瘤中,CD44异常表达,不同CD44剪接变异体与不同乳腺癌亚型和临床指标相关[7]。CD44剪接变异体与细胞的癌变、分化和淋巴结转移相关,在胃癌的发生、发展、治疗和预后中发挥重要作用[8]。CD44V3、V8-10变异体与大肠癌的发生、发展和转移相关[9]。Wang SJ等[10]报道:在头颈部鳞癌细胞株HSC-3中,CD44变异体与细胞的增殖、转移相关,有可能作为临床诊断和治疗的重要分子标志物。Weber GF等[11]报道,通过敲除CD44基因,发现接种小鼠体内肿瘤虽然能够存活但不能够转移,CD44 在肿瘤的转移中起重要作用。在大肠癌中,RhoE可通过抑制CD44基因启动子中活性的部分而逆转肿瘤的恶性生物学行为[12]。CD44 在鼻咽癌的侵袭转移过程中起重要作用,有淋巴结转移的鼻咽癌组织中CD44表达水平高于无淋巴结转移鼻咽癌组织[13]。
鼻咽癌细胞 篇3
SSA具有抗炎、抗病毒、抗癌的作用, 本实验通过研究SSA对鼻咽癌细胞细胞外调节蛋白激酶 ( extrallular signal regulated protein kinase, ERK) 蛋白磷酸化及细胞凋亡水平的影响, 以期对SSA诱导肿瘤细胞鼻咽癌增殖抑制的相应机制进行进一步的探讨。
1 材料与方法
1. 1主要试剂
鼻咽癌细胞5-8F细胞株来源于中国科学院上海生命科学研究院; 胎牛血清购自北京中杉生物科技有限公司产品 ( 批号: 20110628011) ; Dulbecco改良的Eagle培养基 ( dulbecco's modified eagle medium, DMEM) 高糖培养基为美国Hyclone公司产品 ( 批号: 12100046) ; 二甲基亚砜 ( dimethyl sulfoxide, DMSO) 为天津市大茂化学试剂厂产品 ( 批号: 201010036) ; 二辛可酸 ( bicinchoninic acid, BCA) 法蛋白定量试剂盒购自碧云天生物制品有限公司; SSA购自于中国药品生物制品检定所 ( 批号: 2073609-8) ; ERK及p-ERK抗体为美国Abcam公司产品 ( #4376) 。
1. 2 仪器
超净台为苏州净化仪器厂产品; 细胞培养箱购自于北京安若生化科技有限公司; 低温高速离心机, 美国贝克曼库尔特公司生产; 电泳仪及转印槽为北京六一仪器厂产品; 24孔板为美国CORNING公司产品。
1. 3 细胞培养及传代
鼻咽癌5-8F细胞株接种于无菌细胞培养瓶中, 置于5% CO2的恒温培养箱中37℃常规培养, 至培养瓶底面积80%之后进行传代, 0.25%胰蛋白酶消化约2分钟, 加入DMEM高糖培养基 ( 含10%的灭活胎牛血清, 100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素) , 制成单细胞悬液, 重新接种于无菌培养瓶, 常规培养。
1. 4 SSA 药物配制
研究显示, 当体积分数为0. 1% ~0.4%时, DMSO对癌细胞的形态及增殖能力没有明显影响[7], 故本研究中将SSA标准品粉末溶于含0.2% DMSO的DMEM培养基, 按照SSA终浓度分为不同处理组, 分别为0 ( 对照组) 、5μmol/L组、10μmol/L组、20μmol /L组。
1. 5 流式细胞术检测鼻咽癌细胞凋亡水平
鼻咽癌细胞常规培养并给予0、5μmol/L、10μmol /L、20μmol /L SSA不同浓度的SSA, 继续作用48小时, 0. 25%的胰酶消化2分钟, 制成单细胞悬液, 进行膜联蛋白V ( Annexin V) -异硫氰酸荧光素 ( fluorescein isothiocyanate, FITC) 、碘化丙啶 ( propidium iodide, PI) 双染色流式细胞术检测, 测定存活细胞 ( Live) 、早期凋亡细胞 ( Early Apop. ) 、晚期凋亡或死亡细胞 ( Late Apop. /Dead) 、死亡细胞 ( Dead) , 每组重复检测6次。绘制不同浓度SSA干预鼻咽癌细胞后细胞凋亡情况的二维点图。
1. 6免疫印迹法检测 t-ERK 及 p-ERK 蛋白表达 水平
鼻咽癌细胞 以含0、5μmol/L、10μmol/L、20μmol /L SSA的DMEM培养基培养48小时后, 吹打收集细胞, 4℃预冷的裂解液裂解10分钟, BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量, 之后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳, 4℃低温条件下进行半干法电转。50 g/L脱脂奶粉封闭, ERK及p-ERK一抗分别用封闭液按1∶1000稀释后孵育, 4℃过夜。后用TBST液洗膜3次×5分钟, 将二抗用封闭液按比例稀释后滴加于硝酸纤维素膜 ( nitrocellulose filter membrane, NC) 上, 37℃孵育1小时, TBS洗膜3次×5分钟。在膜上滴加1 ml化学荧光液反应1分钟, 在暗盒中用X光胶片压片成像。内参为甘油醛-3-磷酸脱氢酶 ( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 。图像扫描形成* . tif电子文件, 经Gel Pro凝胶成像分析系统进行分析蛋白含量。每组重复检测6次。
1. 7 统计学分析
实验数据均以表示, 使用SPSS 13.0软件进行统计分析。细胞凋亡率, p-ERK、t-ERK蛋白表达的校正光密度值, 以及这两个光密度值间的比值, 均采用非参数检验, P <0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 流式细胞仪检测细胞凋亡率
结果显示, 鼻咽癌5-8F细胞给予不同浓度SSA作用48小时后, 对照组凋亡细胞数达 ( 8.28±0. 87) % , 5μmol /L SSA组凋亡细胞数为 ( 10. 16±0. 96) % , 10μmol /L SSA组凋亡细胞数达 ( 29. 87±3. 01) % , 20μmol /L SSA组凋亡细胞则达 ( 62. 95±6. 79) % , 非参数检验分析结果显示各组凋亡率不完全相同 ( P =0. 000) , 结果显示, 5μmol/L SSA组与对照组 相比无显 著差异 ( P = 0.214) , 而10μmol /L和20μmol /L SSA组与对照组相比均有显著差异 ( P =0. 000) ; 且随着SSA浓度增加, 凋亡细胞数逐渐增多, 二者呈明显的剂量效应关系。见表1, 图1。图1横、纵坐标为两种染色在流式细胞仪中测得荧光信号的lg值。
2. 2 SSA 对鼻咽癌细胞 t-ERK 及 p-ERK 蛋白表达 光密度值的影响
免疫印迹结果如图2。鼻咽癌细胞给予0、5、10、20μmol /L SSA作用48小时后, 非参数检验分析, 对照组, 5μmol/L、10μmol/L及20μmol/L SSA组, t-ERK蛋白表达光密度值水平未见显著改变 ( P =0. 43) 。
而随着SSA浓度的增加, 鼻咽癌细胞p-ERK表达量逐渐减少, 各组间p-ERK/t-ERK比值有显著差异 ( P =0.000) , 其中10μmol/L及20μmol/L SSA组比值与对照组相比显著降低 ( P <0. 05, 表2) 。
3 讨论
柴胡根中主要成分为SS, 其次含有植物甾醇、侧金盏花醇, 以及少量挥发油、多糖。至今为止, 共研究了该属20多种柴胡, 从柴胡属植物已分离出90多种皂苷类成分, 发现了30多种新化合物。近年来, 分离鉴定的皂苷为40余个, 文献报道较多的是SSA、SSB、SSC、SSD等[7,8]。
SS具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、调节内分泌及免疫系统等作用。Motoo等[9]研究了SS不同组分对肝、胰腺肿瘤细胞的作用, 发现SSA的浓度为50 mg /ml或者1000 mg /ml SSB、SSC, 可抑制50% 肝肿瘤细胞, 50 mg/ml SSA还可抑制肿瘤细胞的生长和DNA的合成。Chiang等[10]的研究还发现SS还可通过活化Caspase3, Caspase7诱导HepG2人类肝肿瘤细胞凋亡, 从而实现抗肿瘤的作用。Tsai等[11]研究还证实, SSA、SSB、SSB2、SSC、SSD可诱导小鼠胶质瘤细胞分化。
丝裂原活化的蛋白激酶 ( mitogen-activated protein kinase, MAPK) 是真核生物中的重要的丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶, 在细胞的生长、增殖、存活、死亡相关信号通路中发挥重要作用。在哺乳动物细胞中, MAPK家族中最重要的有ERK, JNK/SAPK ( cjun N-terminal kinase /stress-activated protein kinase) 以及P38-MAPK三个亚家族成员。目前认为, ERK在细胞增殖和分化信号转导网络中处于关键地位。研究显示, ERK蛋白失活可使细胞停滞于G1期, 从而抑制了细胞增殖。而ERK蛋白的过度磷酸化活化则可加速细胞的有丝分裂进程, 促进细胞增殖[12]。本研究结果表明, 一定浓度的SSA可引起鼻咽癌细胞中p-ERK表达量的明显降低, 且随着SSA浓度的增加, ERK磷酸化水平呈逐渐下降趋势, 提示ERK信号转导通路的抑制作用可能参与了SSA诱导的肿瘤细胞生长增殖抑制。
ERK生物活性具有多样性和复杂性, 在不同的条件下对不同的细胞可以表现出促进或抑制凋亡的双重作用。如Zhao等[13]研究发现, 依达拉奉可通过抑制ERK的磷酸化激活而减轻H2O2引起的细胞凋亡; 而Zhuang等[14]经实验证实氧化应激、毒物及生长因子缺乏等刺激因素可激活ERK1/2, 并进一步诱发神经细胞和肾上皮细胞凋亡, 说明ERK信号转导通路的活化可促进相应细胞的凋亡。Kim等[15]证实酪氨酸蛋白酶抑制剂可通过抑制ERK磷酸化而使细胞周期停滞于G1期, 从而诱导细胞凋亡, Karimian等[16]也证实血管紧张素Ⅱ可通过增强ERK的磷酸化活性而减轻胆汁酸盐引起的细胞凋亡, 而且这一过程可能与内质网引起的细胞凋亡途径活化有关。本研究表明, 一定浓度的SSA在引起鼻咽癌细胞中ERK蛋白磷酸化抑制的同时, 细胞的凋亡率也随着SSA浓度的增加而升高, 提示ERK信号转导通路的抑制作用可能参与了SSA诱导的肿瘤细胞生长增殖抑制及凋亡过程。
摘要：目的 初步研究不同浓度的柴胡皂苷A (saikosaponin A, SSA) 对鼻咽癌细胞凋亡诱导作用及其机制。方法 体外常规培养人鼻咽癌5-8F细胞, 将SSA溶解于含0.2%二甲基亚砜 (dimethyl sulfoxide, DMSO) 的Dulbecco改良Eagle培养基 (dulbecco's modified eagle medium, DMEM) 高糖培养基中, 分别以0 (对照组) 、5、10和20μmol/L SSA作用于鼻咽癌细胞48小时, 之后用免疫印迹法检测不同浓度的SSA对鼻咽癌细胞总的细胞外调节蛋白激酶 (total extrallular signal regulated protein kinase, t-ERK) 及磷酸化的细胞外调节蛋白激酶 (phosphorylated extrallular signal regulated protein kinase, p-ERK) 蛋白表达量的影响, 并通过流式细胞仪检测细胞凋亡水平的变化。结果 与对照组相比, 1020μmol/L SSA作用48小时, 鼻咽癌细胞中ERK蛋白磷酸化水平明显降低, 差异有统计学意义;而与对照组相比, 1020μmol/L SSA处理的鼻咽癌细胞凋亡细胞数明显增加, 差异有统计学意义, 且随着SSA浓度的增加, 凋亡细胞数也相应增多。结论 一定浓度的SSA可引起鼻咽癌细胞凋亡率的上升, 其机制可能与抑制ERK蛋白磷酸化表达有关。
鼻咽癌细胞 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2、TWO3 和C666-1由本实验室保存。SD大鼠30 只, 体重 (200±20) g, 雌雄各半, 普通级, 广西医科大学实验动物中心提供, 普通饲料喂养, 自由饮水, 生长情况良好。复方天仙胶囊 (天花粉、威灵仙、急性子、莪术、蜈蚣、蟾酥、龙葵、黄芪等) , 通化白山药业股份有限公司生产, 批号10880008。
1.2 试剂及仪器
环磷酰胺为德国爱斯达药厂产品;IMDM、新生牛血清、胰蛋白酶为美国GIBCOBRL公司产品;噻唑兰、PI染液购自美国Sigma公司。OLYMPUS倒置显微镜购自日本;RT-2100 型酶标仪购自美国;流式细胞仪FACSCa Libur为美国贝克曼库尔特公司产品;病理图像分析仪Leica DMR+Q550 购自德国。
1.3 实验方法
1.3.1鼻咽癌细胞培养
鼻咽癌细胞贴壁生长, CNE1、CNE2和TWO3细胞株培养于含10%灭活新生牛血清, 100μ/mL青霉素和100μ/mL链霉素的IMDM培养液中, C666-1细胞株培养于含15%灭活新生牛血清, 100μ/mL青霉素和100μ/mL链霉素的IMDM培养液中, 置于37℃、相对湿度90%、5%二氧化碳培养箱内培养, 定期观察, 每周换液3次, 传代2次, 用0.25%胰蛋白酶联合0.02%EDTA消化传代。
1.3.2药物血清的制备
将SD大鼠随机分为3组, 复方天仙胶囊组、环磷酰胺 (CTX) 组、空白对照组, 每组10只。实验前禁食12 h, 灌胃给药。给药剂量按人鼠体表面积法换算法, 大鼠剂量 (g/kg) =[人剂量 (g/kg) ×人转换因子 (36) ]/大鼠转换因子;每天灌胃2次, 间隔4 h, 连续3 d, 末次给药后1 h采血。无菌条件下颈总动脉插管采血, 静置4 h, 4℃、3 000r/min离心20 min, 分离血清 (药物血清) 。同种条件血清混匀, 于56℃水浴30 min灭活, 经0.22μm滤膜抽滤除菌, -20℃保存, 经培养无菌生长[1]。
1.3.3鼻咽癌细胞形态观察
取对数生长期细胞按每孔2×103个细胞接种于96孔板中, 24 h后换液, 加入含不同浓度 (5.0%、10.0%、15.0%、20.0%和25.0%) 药物血清的10%新生小牛血清IMDM培养液200μL, 另设相应浓度的阳性对照组和阴性对照组。置5%二氧化碳孵箱内培养, 每天在倒置显微镜下观察细胞生长状态。
1.3.4 MTT比色实验
取对数生长期细胞按每孔2×103个细胞接种于96孔板中, 24 h后换液, 加入含不同浓度 (5.0%、10.0%、15.0%、20.0%和25.0%) 药物血清的10%新生小牛血清IMDM培养液200μL, 另设相应浓度的阳性对照组和阴性对照组。置5%二氧化碳孵箱内培养5 d, 隔天换液, 每个浓度每个时点均设4个复孔。于终止前4 h, 每孔加入5 g/L MTT溶液20μL, 继续孵育4 h后弃去上清液, 加入150μL二甲基亚砜, 轻轻振荡10 min, 使结晶物完全溶解, 于580 nm波长处在荧光酶联分析仪上测光吸收值 (A值) , 计算抑制率 (IR) 。IR (%) = (对照孔A值-实验孔A值) /对照孔A值×100%。
1.3.5流式细胞仪检测细胞周期分布
取IC50药物血清及相应浓度阳性、阴性对照血清作用细胞12 h后, 收集各组细胞悬液1 mL, 浓度约为106个/mL, 离心 (1 000 r/min, 5 min) , 弃掉培养液, 70%冷乙醇固定, 4℃PI暗染30 min, 流式细胞仪检测, 采用ModfitLT 3.0软件对各组样本进行DNA含量及细胞周期分析。
1.3.6统计学方法
用SPSS 13.0统计软件进行student t检验和成组单因素方差分析。药物对细胞的IC50是根据药物浓度对细胞存活率建立的线性回归方程确定。
2 结果
2.1 复方天仙胶囊药物血清对鼻咽癌细胞生长的影响
2.1.1细胞生长形态变化
对照组细胞呈上皮型贴壁生长, 细胞呈延展、扁平, 细胞均质而透明, 核膜、核仁轮廓明显, 细胞间结构紧密, 细胞生长旺盛。复方天仙胶囊组、阳性对照组细胞轮廓增强、反差增大, 变圆浮起, 细胞间接触变松, 增殖减慢, 胞质中颗粒增多。
2.1.2细胞数量的变化
不同浓度处理组分别培养细胞5 d, 复方天仙胶囊对CNE1、CNE2、TWO3和C666-1细胞生长均有抑制作用, 且其抑制作用具有时间和浓度依赖性, 具有良好的量-效、时-效关系。见图1。
2.2 流式细胞仪技术检测细胞周期
CNE1、CNE2、TWO3、C666-1 四株细胞经复方天仙胶囊处理后G1期细胞比例数分别高于对照组18.3%、11.8%、12.1%和14.0%, 而S期细胞分别降低了4.1%、1.6%、3.0%和0.3%, G2/M期细胞分别降低了14.2%、10.2%、10.2%和13.7%。四株细胞经CTX处理后G1期细胞比例数分别高于对照组21.1%、25.4%、18.2%和14.2%, 而S期细胞分别降低了12.4%、12.7%、10.9%和12.2%, G2/M期细胞分别降低了8.7%、12.7%、7.3%和2.0%。可见复方天仙胶囊作用下, G1期细胞比率显著上升, 多数细胞阻滞在G1期。见图2、3。
A：CNE1；B：CNE2；C：TWO3；D：C666-1
A:CNE1对照组;B:CNE1复方天仙胶囊;C:CNE2对照组;D:CNE2复方天仙胶囊;E:TWO3对照组;F:TWO3复方天仙胶囊;G:C666-1对照组;H:C666-1复方天仙胶囊
3 讨论
鼻咽癌主要发生在我国沿海地区, 以广东、广西、湖南、江西、福建等南方5 省区多见, 广西鼻咽癌的发病率为10/10 万左右, 仅次于广东, 是严重影响人民群众身体健康的恶性肿瘤之一。目前治疗鼻咽癌的主要手段为放射治疗, 但5 年生存率仅70%左右, 化学治疗在鼻咽癌病人尤其晚期病例仍占有重要的地位, 但化疗药物毒副作用大, 往往影响疗程的完成, 故寻找针对鼻咽癌更有效、毒副反应更少的药物是临床治疗迫切需要解决的问题之一。目前抗癌药物的研究已逐渐转向对动植物来源的天然化合物的研究, 我国传统的中医中药已越来越受到人们的青睐。中药抗肿瘤作用已经得到证实[2], 从中草药及植物中提取并用于肿瘤治疗的成分越来越多[3,4,5], 植物提取成分已成为新抗肿瘤药物的重要来源, 南美抗肿瘤药物研发办公室就从植物中提取抗肿瘤成分制定了有关标准, 将体外实验IC50≤50 mg/L的植物提取成分确定为有效抗肿瘤成分[6]。复方天仙胶囊由天花粉、威灵仙、急性子、莪术、蜈蚣和蟾酥等药物组成。具有清热解毒散结止痛、补气养血之功能。对食管癌、胃癌和肠癌有抑制作用;配合化疗、放疗可提高其疗效[7,8,9,10,11,12]。1989 年11 月, 由国家中医药管理局科技司主持, 在京召开中药复方天仙胶囊抗癌研究鉴定会, 一致通过鉴定并申报国家科技进步奖。肯定该方剂为我国首创。研究证实, 胶囊中含精制的有防癌抗癌作用的有效成分, 其质量稳定并含多种氨基酸和微量元素。
无论是正常组织细胞还是肿瘤细胞, 其增殖均与细胞周期密切相关, 细胞周期中的G1/S和G2/M这两个检查点在DNA损坏因素的作用下可发生阻滞。G1期制造和产生r RNA、m RNA、t RNA及核蛋白体, 糖原合成在G1期最为显著, 所以说G1期是细胞周期运行之关键, 同时也是药物等因素作用的靶点。因此, 抑制细胞周期的G1期的RNA及核蛋白体的合成, 可间接地使肿瘤细胞的RNA合成减少。本实验中MTT结果显示鼻咽清毒颗粒对CNE1、CNE2、TWO3 和C666-1 细胞的增殖具有明显的抑制作用, 其细胞生长抑制随着药物浓度的升高和时间的延长而增加, 具有量- 效、时- 效关系。倒置显微镜结果说明复方天仙胶囊可以诱导鼻咽癌CNE1、CNE2、TWO3 和C666-1 细胞凋亡。同时, 复方天仙胶囊能明显抑制CNE1、CNE2、TWO3 和C666-1 细胞的周期变化, 阻滞细胞停止于G1期, 使细胞周期改变而诱导细胞凋亡。复方天仙胶囊毒性低, 价格便宜, 有可能是一种具有应用前景的诱导肿瘤细胞凋亡的天然药物。
参考文献
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鼻咽癌细胞 篇5
1 资料与方法
1.1 一般资料
所有患者需经过病理确诊为不同进展阶段的NPC患者,年龄<70岁,需放化疗后3个月以上,预期生存时间>3个月。肝、肾、骨髓功能正常。签署知情同意书,自愿接受DC-LMP2免疫。
1.2 材料DC
接受免疫的NPC分离外周血单核细胞体外诱导获得。人重组细胞因子rh GM-CSF、rh IL-4、rh TNF-α购自Peprotech公司。CD83、CD86和CDDR抗体购于BD公司。Cell Gro DC培养基购于上海微科生化试剂公司。
1.3 DC诱导与培养
外周血分离自体PBMC,以5×106/孔接种六孔板。置37℃5%CO2,饱和湿度的培养箱中培养贴壁2h,轻轻摇晃,弃去悬浮细胞,再缓慢往细胞孔中加入3mL含细胞因子的CellGro DC培养基(rhGM-CSF终浓度500U/mL,rhIL-4终浓度500U/mL)。置5%CO2,37℃饱和湿度的培养箱中培养7d。培养至第3天,半量更换Cell Gro DC培养基。每天光镜下观察细胞形态变化。第7天发现的不规则的,具有树突状形态的细胞为DC。
1.4 DC检测
吹打培养7d的DC,收集悬浮DC(250g/min,离心10min)。再在含成熟因子的DC培养基中(含rhGM-CSF 500U/mL、rhIL-4 500U/mL、TNF-α400U/mol),继续培养48h。第9天收集成熟的DC-LMP2(250g/min,离心10min)。以CD83、CD86和DC-DR抗体标记后及染色,用流式细胞仪检测DC表面特征性分子的表达。
2 结果
2.1 病例特征
本临床试验病例均来源于广西自治区人民医院2010年6月至2011年3月。共24名NPC患者自愿参加了本次试验,女13名,男11名,年龄22~61岁。其中Ⅰ期3名(男2名,女1名),Ⅱ期10名(男4名,女6名),Ⅲ期7名(男3名,女名),Ⅳ期4名(男2名,女2名)。见表1。
2.2 DC形态鉴定
在光学显微镜下,外周血分离的单核细胞经过体外的诱导和培养,细胞开始聚集成团,细胞体积增大,逐步由贴壁转变为悬浮状态,表面开始形成褶皱,周围伸出许多树突状,形成不规则分支呈网状,如图1。
3 讨论
树突状细胞是1973年美国洛克菲勒大学的Steinman和Cohn[7]教授首先从小鼠的脾脏淋巴细胞分离获得,由于其表面有许多突起而形成许多褶皱,象伸展的树枝,故而命名为树突状细胞。DC细胞的功能主要是参与机体的特异性免疫应答,包括体液免疫和细胞免疫。作为专职的的抗原提呈细胞,其活动能力是巨噬细胞和B细胞的10~100倍,可激活初始型T细胞[4]。但DC在体内数目极少,不足外周血单核细胞的1%,因而自然分离DC十分困难。目前用于治疗和研究的树突状细胞,均为体外培养获得。由于一些肿瘤患者体内的DC又发生功能缺陷。那么是否所有的肿瘤患者的前体细胞都可以诱导出成熟的树突状细胞呢?因而我们以鼻咽癌为例,试图从体外培养的角度探讨不同进展阶段的NPC患者的外周血是否可以培养成熟的树突状细胞。从我们的实验结果可以看出:在所选的鼻咽癌患者的外周血中均可以诱导培养出具有典型的树突状细胞形态。通过流式细胞仪检测在其表面表达DC特征性的CD83、CD86和DC-DR分子。这为我们对NPC患者DC为基础的免疫治疗对象的筛选提供了依据。诚然,这仅仅是免疫治疗中对NPC患者筛选的条件之一,除此之外我们还对患者的年龄、生存期、身体状况、临床治疗的时间、本人意愿等进行多方面的具备的条件研究后才能最终确定治疗方案。临床治疗方案及结果另有文章详细报导。
参考文献
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鼻咽癌细胞 篇6
1 材料与方法
1.1 细胞系及细胞培养
CNE-1细胞系由中南大学肿瘤研究所提供。细胞株采用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液(含青、链霉素)。置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。至70%～80%融合时,用胰酶消化传代继续培养。
1.2 C O X-2免疫细胞化学染色
按照AEC免疫组织化学试剂盒(美国Lab vision)操作程序进行。培养的CNE-1为检测细胞。人成纤维细胞作为阴性对照。常规固定、破膜及阻断非特异性背景。一抗小鼠抗人COX-2(1︰200)及二抗孵育,AEC显色及苏木素复染胞核。显微镜下观察并照相记录。
1.3 药物干预与放射处理
西乐葆的配制:西乐葆(普强苏州制药有限公司,西尔大药厂波多黎各分厂生产)以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂配成50μmol/L(200 mg/L)的储存液,置于-20℃冻存。实验分组:西乐葆药物干预分4个剂量水平,分别为A组0μM、B组1.25μM、C组2.50μM、D组5.00μM。其中A组为对照组,只加入与实验组同体积的DMSO液。
1.4 四唑盐(M TT)比色试验
分别将1×104/m L的CNE-1细胞加入96孔培养板,每孔100μL,每组设6个平行孔,置于37℃、5%二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养12 h细胞贴壁后,分别按照上述分组加入西乐葆培养28 h后,每孔加入100μL MTT(5 mg/m L),继续培养4 h,终止培养。小心吸掉孔内的培养基,每孔加入DMSO100μL,摇床上振荡15 min,使结晶颗粒充分溶解。蒸馏水1︰40稀释后,用分光光度计分别检测它们在490 nm波长处的光吸收值。
1.5 集落形成实验
取对数生长期的细胞,用0.25%的胰酶/EDTA消化细胞成单个细胞,用0.4%的台盼蓝染色,计数活细胞数,调整细胞密度为1×104/m L,将每100μL细胞接种在60 mm的培养皿中,置于37℃、5%二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养12 h。待细胞完全贴壁后,按照分组加入不同浓度的西乐葆干预,再置于37℃、5%二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养14 d。取出培养皿,弃去培养上清液,用甲醇固定,Giemsa染色,计数含50个细胞以上的集落,并计算克隆形成率。克隆形成率(%)=克隆数/接种细胞数×100%。
1.6 凋亡检测
用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(美国Chemicon)检测细胞早、晚期凋亡发生率。西乐葆处理后的细胞置继续培养24 h后,中止培养。消化并收集不同实验组中的肿瘤细胞,用预冷的PBS漂洗2遍后,调整待测细胞的浓度为1×106个/m L加入10μL Annexin V-FITC轻轻混匀,避光室温反应30 min。PBS洗涤后加入300μL结合缓冲液,再加入5μL碘化丙啶(PI),上流式细胞仪检测。将AnnexinⅤ与PI匹配使用,可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。AnnexinⅤ阳性而PI阴性的细胞为早期凋亡细胞;AnnexinⅤ与PI双阳性的细胞为晚期凋亡细胞;AnnexinⅤ与PI双阴性的细胞为活细胞。
1.7 统计学方法
每组实验重复6～8次,所有的结果都用均数±标准差(±s)表示,统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行,各组之间采用单因素方差分析,检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 C N E-1细胞高表达C O X-2蛋白
CNE-1鼻咽癌细胞的胞浆内均可见大量棕红色颗粒,提示CNE-1细胞为COX-2阳性表达,而对照组人成纤维细胞内呈阴性,提示CNE-1细胞持续、稳定地高表达COX-2(见图1)。
a为COX-2阳性的人CNE-1鼻咽癌细胞;b为COX-2阴性的成纤维细胞
2.2 单用西乐葆对C N E-1细胞增殖、凋亡的影响
CNE-1细胞在西乐葆作用后的增殖和凋亡值见附表,代表性的凋亡见图2。
A、B、C和D分别代表不同浓度的西乐葆。Q1:死细胞;Q2:晚期凋亡细胞;Q3:正常细胞;Q4:早期凋亡细胞。
上述结果表明,与A组(即不加西乐葆组)比较,随西乐葆浓度增加B、C、D组OD值、克隆形成率明显减少,而早、晚期凋亡率明显降低,除OD值A组与B组比较差异无显著性(P>0.05)外,A组与B、C、D组差异有显著性(P<0.05)。提示西乐葆对CNE-1细胞的增殖、克隆形成能力有明显的抑制作用,而对CNE-1细胞的早、晚期凋亡有明显诱导作用,西乐葆对CNE-1细胞的抑制增殖作用须在1.25μM以上。B、C、D组之间两两比较OD值C、D组间差异有显著性,其余各检测指标B组与C组间、C组与D组间差异无显著性,B、D间差异有显著性。提示西乐葆对CNE-1细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用与西乐葆浓度存在一定相关性:5.00μM西乐葆对CNE-1细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用明显强于1.25μM西乐葆。而1.25μM与2.50μM之间、2.50μM与5.00μM之间比较,差异无显著性。
3 讨论
环氧化物酶-2(COX-2)与多种肿瘤的发生与生长有关。在直肠癌、乳腺癌、宫颈癌等多种肿瘤的早期及发生、发展过程中均可检测到COX-2的升高[1]。本研究发现COX-2在鼻咽癌CNE-1细胞中也呈高表达,提示COX-2与鼻咽癌关系密切。
在本研究中,COX-2选择性抑制剂———西乐葆对CNE-1细胞的影响,以西乐葆的临床镇痛有效药物浓度为基础设计实验组,MTT法测得的OD值A组与C、D组之间差异有显著性,而A与B组差异无显著性(P>0.05),C、D组之间差异有显著性(P<0.05),提示西乐葆浓度在1.25μM以上对CNE-1细胞具有明显的增殖抑制作用,在5.00μM内其抑制作用随西乐葆剂量增加而增大;西乐葆对CNE-1细胞的克隆形成抑制及早、晚期凋亡诱导作用,B、C、D组与A组比较差异有显著性。5.00μM明显强于1.25μM,而2.50μM较1.25μM、5.00μM较2.50μM却未表现出明显差异,可能与浓度差别不大,因而对CNE-1细胞的克隆形成抑制及早、晚期凋亡诱导作用差异也不大有关。证实了西乐葆对CNE-1细胞有抑制增殖和诱导凋亡作用,且其作用与西乐葆浓度存在一定的剂量相关性。提示临床镇痛血药浓度范围的西乐葆对鼻咽癌CNE-1细胞存在抗肿瘤作用,为其日后应用于临床治疗鼻咽癌提供理论依据。
有研究表明COX-2抑制剂抑制COX-2 m RNA的表达和PGE2的分泌,并有浓度依赖性[2]。目前比较一致地认为COX-2基因表达的蛋白是一种原癌蛋白,这种蛋白可以促进PGE2高表达,而PGE2可以刺激诱导肿瘤血管增生,抑制局部免疫功能,调节多种信号传导途径而影响细胞增殖,促进肿瘤细胞生长[3,4,5,6,7]。COX-2抑制剂抗肿瘤增殖和诱导凋亡作用机制中涉及到COX-2依赖和非COX-2依赖途径[8,9]。COX-2抑制剂用于肿瘤治疗越来越被人们重视,本研究发现西乐葆因为能抑制细胞增殖和诱导凋亡,从而对鼻咽癌CNE-1细胞有抗肿瘤作用,并存在剂量相关性。
参考文献
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鼻咽癌细胞 篇7
1 材料与方法
1.1实验材料
人鼻咽癌CNE-2Z细胞株由第三军医大学肿瘤研究所中心实验室提供。 胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限责任公司;DAB显色试剂盒与SP-9000免疫组织化学试剂盒购自武汉百奥斯生物科技有限公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)显色剂购于上海生物工程有限责任公司;RNA酶 (RNase)、PDTC分析纯、碘化丙啶(PI)、二甲基亚砜(DMSO)、RPMI1640培养基、胰蛋白酶等分别购于Hyclone、Sigma、Amresco公司。
1.2 CNE-2Z 细胞的培养
复苏人鼻咽癌细胞株CNE-2Z,将复苏后的细胞接种于100 m L培养瓶中,加入含10% 灭活胎牛血清、100 U/m L青霉素和100 U/m L链霉素的RPMI-1640培养液,放置于37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的恒温培养箱中培养。 常规更换培养液,进行正常传代,选取对数生长期细胞进行后续实验。
1.3 CNE-2Z 细胞形态学观察
随机在倒置显微镜下选取3个视野,观察不同浓度PDTC ( 浓度分别为25、50、100 μmol/L) 作用于CNE-2Z细胞不同时间点(24、48、72 h)的形态学变化。CNE-2Z细胞以5×104/m L浓度接种于预置盖玻片的6孔板中,然后每孔中滴加1 m L细胞悬液,再加入适量含10%灭活胎牛血清、100 U/m L青霉素和100 U/m L链霉素的RPMI-1640培养液 ,于37℃、5%二氧化碳 、饱和湿度的恒温培养箱中培养,细胞贴壁生长后分为4组,分别滴加含PDTC(25、50、100 μmol/L)的培养液;设未加PDTC为对照,继续培养72 h后,去除培养液 ,用PBS洗涤3次,加入95%的乙醇室温下固定30 min,取出盖玻片,常规HE染色,透明树脂封片,自然晾干,光镜下观察细胞形态。
1.4 四 甲 基偶氮唑蓝 比 色 法 检测 PDTC 对 CNE-2Z细胞生长增殖的抑制作用
采用对数生长期的CNE-2Z细胞,0.25%胰蛋白酶消化细胞,调整细胞悬液浓度为5×104/m L, 每孔200 μL接种于96孔板上 ,同时设空白对照组 、 正常对照组(不含药物)和PDTC不同浓度药物处理组(分别为25、50、100 μmol/L),每组重复4孔,于37℃、5%CO2、饱和湿度恒温箱中培养24 h后 ,吸去每孔培养液,实验组分别滴加含不同浓度PDTC培养液,继续培养24、48、72 h,再每孔滴加20 μL MTT(5 mg/m L),继续培养4 h后吸去上清液,每孔滴加150 μl DMSO液,遮光振荡10~20 min,使其溶解,用Quant酶标仪570 nm波长检测各孔吸光度(A570),只加RPMI-1640、未接种细胞的空白对照调零。 每组实验重复3次,取平均值。 计算不同浓度PDTC对CNE-2Z细胞增殖的抑制率。 细胞抑制率=(1-药物处理组吸光度/阴性对照组吸光度)×100%[3]。
1.5 CNE-2Z 细胞周期分析
采用流式细胞仪(FCM)检测细胞周期.选取对数生长期CNE-2Z细胞 ,轻轻吹打,调整细胞 浓度为1×105/m L,将细胞接种于100 m L培养瓶中 ,加入适量含10%灭活胎牛血清、100 U/m L青霉素和100 U/m L链霉素的RPMI-1640培养液,在37℃、饱和湿度、5%二氧化碳的孵箱中培养24 h,待细胞生长至70%~80%融合时,更换为含PDTC为25、50、100 μmol/L的培养液,设对照,继续培养48 h后吸去培养液,用胰蛋白酶消化、收集细胞,PBS冲洗3次,用预冷的70%冰乙醇固定,置4℃冰箱过夜,吸去乙醇,PBS冲洗3次,调整细胞浓度为1×106/m L,加入RNase酶(20 μg/m L)200 μL消化30 min,加入碘化丙啶(20 μg/m L)1 m L, 于室温遮光染色30 min,上流式细胞仪检测,每组重复3次,Cell Quest及Modifit软件分析细胞周期分布。
1.6 免 疫 组 化 法 检 测 PDTC 作 用 下 CNE -2Z 细 胞PCNA 的表达
选取对数生长期CNE-2Z细胞,制成5.0×104/m L浓度细胞悬液,每孔2 m L接种于预置盖玻片的6孔板中,放入37℃、饱和湿度、5%二氧化碳的恒温箱中培养24 h,更换无血清RPMI1640培养液继续培养24 h,去除培养液 ,实验组中分别滴加浓度为25、50、100 μmol/L含PDTC的培养液,对照组滴加含10%灭活胎牛血清RPMI 1640培养液,每孔2 m L。培养48 h后吸去各孔培养液,0.01 mmol/L PBS液洗涤3次,再以乙酸-甲醛溶液(浓甲醛10 m L,冰乙酸3 m L,0.9%的氯化钠溶液加至100 m L)固定10 min。 采用SP染色检测CNE-2Z细胞中PCNA的表达,操作按说明书步骤进行,然后用DAB染色盒染色,晾干,透明树胶封片,光镜下观察CNE-2Z细胞PCNA表达。 CNE-2Z细胞中PCNA阳性表达标准为细胞核中可见棕黄色颗粒。HSCORE评分:排除爬片边沿细胞,在低倍镜下随机选取细胞分布均匀的视野10个,然后在高倍镜下每个视野随机选择50个细胞,根据细胞核着色深浅进行PCNA蛋白表达评分:1阴性:0分,胞核不着色;2弱阳性:1分,胞核呈淡黄色;3阳性:2分,胞核呈黄色;4强阳性:3分,胞核呈深棕色。 根据公式HSCORE=ΣPi(i+1)(i=0,1,2,3;Pi表示评分为i的比例)计算细胞HSCORE得分[4]。
1.7 统计学方法
采用统计软件SPSS 17.0对数据进行分析,正态分布计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。 计数资料以率表示,采用 χ2检验。 以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CNE-2Z 细胞形态学观察
倒置显微 镜观察细 胞贴壁生 长24 h后 ,可见CNE-2Z细胞形态呈多角形 ,胞体透亮 ,细胞轮廓清晰,折光性强,胞核大而深染,核仁明显,可见巨核和多核细胞(图1,封四)。 加入PDTC作用后,CNE-2Z细胞的贴壁性下降,细胞皱褶增多,形态逐渐由多角形变为圆形,细胞间隙增宽;细胞结构变得模糊不清,部分细胞明显水肿,胞浆浓缩,胞核聚集,甚至细胞破碎,可见细胞碎片。 随着PDTC浓度的增加和作用时段的延长,较多细胞悬浮于培养瓶中(图2,封四)。HE染色光镜观察,PDTC作用后,CNE-2Z细胞数量显著减少,细胞形态变为不规则形,细胞核空染,随PDTC浓度增高,CNE-2Z细胞死亡增加。
2.2 不同浓度 PDTC 处 理后 CNE-2Z 细胞增殖的抑制率
不同浓度PDTC处理的CNE-2Z细胞增殖活性明显受到抑制(P < 0.05),并呈时间和剂量依赖。 见表1。
注:与对照同时间比较,aP < 0.05 ; 与 25 μmol/L 比 较 ,bP < 0.05 ; 与50 μmol/L 比 较,cP < 0.05;与 同组 24 h 比 较 ,dP < 0.05;与 同组 48 h 比较,eP < 0.05;PDTC:吡 咯烷二硫代氨基甲盐酸
2.3 不同浓度 PDTC 对 CNE-2Z 细胞周期的影响
不同浓度PDTC作用24 h后,随着药物浓度增加,S期细胞所占比例逐渐下降(P < 0.05),G0/G1期细胞所占比例逐渐增高(P < 0.05),细胞主要呈现G0/G1期阻滞。 见表2。
注:与对照比较,**P < 0.05
2.4 不同浓度 PDTC 作 用于 CNE-2Z 细胞后 PCNA蛋白的表达
对数期生长的CNE-2Z细胞,可见细胞核有明显棕色或棕黄色颗粒着色,PCNA蛋白表达强阳性(图3,封四)。 PDTC作用后,CNE-2Z细胞胞核棕黄色颗粒减少,随着PDTC浓度增高 ,细胞核棕 黄色颗粒 颜色变浅(图4,封四),表明PCNA表达减弱。 不同浓度的PDTC(0、25、50、100 μmol/L)作用48 h后,PCNA蛋白的表达评分为(2.92±0.10)、(2.22±0.18)、(1.45±0.22)、(1.02±0.15)分,随着PDTC浓度增高 ,PCNA蛋白的表达评分逐步降低(P < 0.05),呈现一定的剂量依赖。
3 讨论
NF-κB是一种重要的多功能核转录因子,是由P65和P50构成的杂二聚体,在人体的应激、免疫应答、炎性反应等方面以及肿瘤的形成、侵袭、扩散等方面发挥着重要的基因调控作用。 研究发现NF-κB能够显著促进肿瘤细胞生长增殖,抑制细胞凋亡,其抗凋亡机制极可能是通过调控其靶基因相关因子,如肿瘤坏死因子、集落刺激因子、白介素-1、白介素-2等,使NF-κB过度表达,导致肿瘤细胞无限制生长 ,出现细胞增殖,细胞凋亡减少,促使肿瘤发生、侵袭和扩散[5].NF-κB还可以通过直接干扰与细胞周期相关的因子如IL-2等,使细胞的DNA合成异常加速,从而导致肿瘤细胞增殖而形成肿瘤[6]。 有研究发现PDTC和顺铂在体外联合应用后,对人鼻咽癌细胞株CNE-2Z抑制效应增加,中效浓度比单用药要小,这说明PDTC可能具备化疗增敏作用[7]。
PCNA是一种分子量为36 k D的蛋白质,是DNA复制时聚合酶 δ 的辅助蛋白,在细胞核内合成,并存在于细胞核内。 PCNA影响着细胞的增殖周期,在细胞DNA合成 、 细胞有丝分裂中发挥 着重要作 用 。PCNA存在可溶性和不溶性两种 ,不溶性PCNA可以在DNA复制中起作用, 同时调控细胞增殖及细胞周期,研究发现其在G0/G1期细胞中表达不明显,在G1晚期,其表达显著增加,S期表达达最高峰,G2/M期则明显下降[8]。 PCNA表达的量的变化与DNA合成一致,其在细胞核内阳性表达的强弱与细胞增殖活性密切相关,其活性越高,细胞与细胞间张力越大,黏附性越小,容易促使肿瘤细胞向远处转移、侵袭和扩散。 因此PCNA的表达强度可以比较客观地反映肿瘤细胞的增殖活性,是一种能够准确、简便评估肿瘤细胞增殖能力的重要指标[9]。
NF-κB特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲盐酸(PDTC)是一种强抗氧化剂 ,能够特异性抑制多种肿瘤细胞NF-κB的活化,其作用机制主要为:1NF-κB活性亚单位P65的表达能够被特异性抑制;2可能通过抑制NF-κB抑制蛋白(IκB)的降解,从而减少了NF-κB的核移位[10]。 江从军等[11]研究发现,特异性阻断NF-κB的活化可显著抑制体外实体瘤细胞的生长,肿瘤的发生率大大降低。 Gao等[12]研究发现NF-κB抑制剂PDTC通过可下调血管内皮因子(VEGF)的表达,减少路易斯肺癌小鼠肿瘤血管生成,从而抑制肿瘤的形成;Li等[13]发现NF-κB信号途径与视网膜细胞瘤的生物学行为也有关系。 研究发现PDTC对肾癌、肝癌、喉癌细胞有显著的抑制作用[14,15,16];对胃癌、白血病、宫颈癌细胞有明显抑制生长作用[17,18,19],对人鼻咽癌细胞的转移与预后也有较大影响[20]。
本研究中采用NF-κB特异性抑制剂PDTC以不同浓度作用于人鼻咽癌CNE-2Z细胞后, 发现PDTC能显著抑制CNE-2Z细胞生长增殖,表现为细胞黏附性下降,细胞间隙增宽,部分细胞胞核聚集,胞质浓缩,甚至出现细胞碎裂。 在增加PDTC浓度和延长作用时间后,大量细胞悬浮于培养瓶中。HE染色结果显示,PDTC干预后,CNE-2Z细胞数量明显减少, 形态变为圆形或椭圆形, 细胞内出现大颗粒物质及空泡;随着PDTC浓度递增,死亡细胞明显增多。 MTT试验表明,CNE-2Z细胞的增殖代谢能够显著地被PDTC抑制, 同时也具有一定的剂量和时间依赖。 经PDTC作用24 h后,分析CNE-2Z细胞的周期,发现与对照细胞相比,PDTC作用的细胞G2/M期和S期细胞明显减少(P < 0.05),而G0/G1期细胞显著增多(P < 0.05),CNE-2Z细胞生长过程明显受阻于G0/G1期。 免疫组化结果显示,PDTC作用于CNE-2Z细胞后,PCNA蛋白表达下降,浓度越高,细胞核着色越浅。
综上所述,PDTC能显著抑制人鼻咽癌CNE-2Z细胞生长增殖,其机制可能是PDTC阻断NF-κB活化,下调PCNA表达,抑制细胞DNA合成和有丝分裂,减少细胞的生长增殖;改变细胞周期分布,使CNE-2Z细胞受阻于G0/G1期等,促进细胞凋亡,抑制了CNE-2Z细胞生长增殖。PDTC在肿瘤生长增殖方面的作用,使其可能成为肿瘤治疗的新靶点。
摘要：目的 研究核转录因子-κB(NF-κB)特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲盐酸(PDTC)对人鼻咽癌CNE-2Z细胞生长增殖及其细胞核抗原(PCNA)的影响。方法 不同浓度的PDTC(25、50、100μmol/L)作用CNE-2Z细胞不同时间后(24、48、72 h),四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测PDTC对CNE-2Z细胞增殖的抑制效应;不同浓度的PDTC(25、50、100μmol/L)作用于CNE-2Z细胞48 h后,流式细胞术(FCM)分析细胞周期,免疫组化(SP)法检测不同强度PDTC作用下CNE-2Z细胞增殖细胞核抗原(PCNA)的表达情况。结果 25、50、100μmol/L PDTC处理的CNE-2Z细胞增殖活性明显受到抑制(P<0.05),并呈时间和剂量依赖;流式细胞术结果表明S期细胞数减少,细胞受阻于G0/G1期。与对照(无PDTC处理)比较,PDTC作用后CNE-2Z细胞PCNA表达降低(P<0.05),并呈明显的剂量依赖。结论 PDTC具有显著抑制人鼻咽癌CNE-2Z细胞生长的作用,是一种有潜力的抑制鼻咽癌细胞增殖的药物。