凋亡诱导因子研究

凋亡诱导因子研究（精选十篇）

凋亡诱导因子研究 篇1

1 TRAIL概述

TRAIL位于染色体3q26, 1769bp片段, 包含5个外显子, c DNA长度为1050bp, 相对分子量32.5KDa, 编码281个氨基酸, 等电点7.63的Ⅱ型跨膜蛋白[1]。TRAIL被广泛地应用于肺、脾、卵巢、淋巴结、肾、外周血淋巴细胞以及前列腺等正常组织的表达中。在脑组织、肝组织以及睾丸中没有发现其表达。TRAIL能特异性诱导肿瘤细胞、病毒感染细胞或转化细胞等发生凋亡, 却对正常细胞没有任何影响。另外, 在单核细胞、自然杀伤细胞、激活T细胞以及树突状细胞中同样发现TRAIL表达, 这有力地证明, TRAIL和维持免疫稳态以及宿主防御有很大关系, 同时, 其也参与机体的免疫调节。

TRAIL受体包括死亡受体、诱骗受体、可溶性受体。死亡受体包括DR4、DR5, DR4和DR5均包含胞内死亡结构域, 二者和TRAIL相结合之后, 可以将TRAIL死亡信息传至细胞中, 从而激活caspase系统, 进而引起细胞凋亡, 当DR4和DR5过度表达的时候, 其可不依赖配体直接诱导细胞凋亡[2]。诱骗受体包括Dc R1、Dc R2, Dc R1中没有胞内死亡结构域, Dc R2含有24个氨基酸截短的死亡结构域。通常情况下, 诱骗受体和死亡受体可竞争着和TRAIL相结合, 但因为诱骗受体没有死亡结构域, 所以, 其和TRAIL结合之后就不能诱导细胞凋亡。可溶性受体是分泌型糖蛋白, 作为TNFR超家族新成员, 可溶性受体胞内也缺少死亡结构域, 其和TRAIL结合之后不能转导凋亡。可溶性受体可有效增加骨骼密度, 抑制破骨细胞发生。

TRAIL与细胞膜上面死亡受体结合激活凋亡信号途径, TRAIL和死亡受体DR4、DR5结合之后, 会形成配体、受体三聚复合物, 从而诱导死亡受体胞浆段死亡结构域和Fas相关蛋白死亡结构域C端DD结合。Fas相关蛋白的死亡结构与以其N端死亡效应结构域DED和Procaspase-8相结合, 而形成DR4/DR5/FADD/Procaspase-8死亡诱导信号复合物, 促进procaspase-8自身催化成有活性的caspase-8。当活化caspase-8之后, 可通过两条信号途径传递凋亡信号。第一条信号途径为:caspase-8激活下游效应蛋白caspase-7、caspase-3或caspase-6, 诱导凋亡, 第二条途径为:活化的caspase-8催化bcl-2家族蛋白bid, 断裂成截短bid, tbid定位于线粒体膜, 从而破坏线粒体跨膜电位, 导致线粒体释放细色素C、Smac, 从而刺激procaspase-9催化形成活性caspase-9, 活化效应蛋白, 最终诱导细胞凋亡。

2 TRAIL临床应用

2005年起, 我国进入重组人TRAIL临床研究, 根据Guo Y等[3]人的报道, 应用大肠杆菌表达可获取重组人TRAIL对癌症患者积极进行Ⅰ期研究, 临床研究证实TRAIL安全性及有效性, 与此同时, 临床经验表明患者非重度肝功能异常或干转移对于重组人TRAIL蛋白药代动力学没有显著的影响。胡璧[4]指出接受TRAIL重组蛋白治疗之后, 大部分患者血清中的凋亡信号分子和染色体DNA水平提高, 并且和重组TRAIL蛋白剂量呈现正相关。这说明, 可将血清作为基础, 利用药效学检测方法监测患者TRAIL活性。值得注意的是, TRAIL单独应用具有抗肿瘤活性, 多种药物联合应用具有明显的协同作用, 比如, 和化疗药物细胞因子白介素2、细胞诱导分化剂、足叶乙苷、糖皮质激素等连用能提高肿瘤细胞对TRAIL诱导凋亡敏感性。目前, 针对化疗药物增强TRAIL肿瘤诱导凋亡的机制未明确, 临床则认为化疗可通过调节死亡受体或胞外与胞内途径对话增强肿瘤细胞的TRAIL诱导凋亡敏感性, 但作用在正常的细胞时, 不会改变对TRAIL的敏感及耐受性。TRAIL能逆转肿瘤细胞对于化疗产生的耐药性。TRAIL和药物联合使用一方面可降低药物单独使用的毒副作用, 另一方面可增强临床效果, 应用前景广泛。

目前, 虽然证实了TRAIL重组蛋白的安全性及有效性, 但在人体内TRAIL重组的半衰期结果不理想。比如, 8mg/kg的速度静脉注射重组TRAIL的时候, 半衰期是36分钟, 但6mg/kg静脉注射mapatumumab时, 半衰期18.8天。另外, 与重组TRAIL相比, 死亡受体单克隆抗体安全性和特异性更高, 还可以激发T淋巴细胞及天然免疫从而增强免疫力, 可给予长时间保护, 防止肿瘤复发。

3 结语

临床研究指出, TRAIL可参与很多的生物学过程, 其在免疫自稳、调节机体免疫、免疫监视、自身免疫性疾病以及病毒性感染疾病等方面有很大的作用, 其在临床有较为广阔的应用前景。但随着TRAIL凋亡途径更进一步的研究, 有关TRAIL及其受体旁路途径激活等问题需进一步阐明。

摘要：肿瘤坏死因子诱导凋亡配体TRAIL作为肿瘤坏死因子超家族成员之一, 其能和死亡受体相结合从而选择性诱导肿瘤细胞凋亡, 却不会影响正常细胞, 其正逐渐成为临床上新型抗肿瘤制剂。本文从肿瘤坏死因子诱导凋亡配体TRAIL何受体诱导凋亡机制入手, 探讨其在临床方面的应用。

关键词：肿瘤坏死因子诱导凋亡配体TRAIL,肿瘤,临床应用

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凋亡诱导因子研究 篇2

[摘要] 目的 ?^察阿魏酸对氧化应激诱导的黑素细胞凋亡的影响。方法 采用随机数字表法将A375细胞分为五组：空白对照组，模型组，阿魏酸高、中、低浓度组。空白对照组常规培养，模型组和阿魏酸各浓度组培养基中加入过氧化氢，使其终浓度为0.1 mmol/L，处理4 h。采用荧光染料DAPI染色细胞，荧光显微镜观察各组细胞凋亡情况，Caspase活性试剂盒测定各组细胞Caspase活性。结果 与空白对照组相比，模型组Caspase-3、8、9活性水平显著升高，差异有统计学意义（P < 0.01）。模型组细胞核、细胞质内可见致密浓染的颗粒，松散淡染的新月体或环状荧光，提示过氧化氢可诱导A375细胞凋亡。与模型组比较，阿魏酸高浓度组可显著下调Caspase-3和Caspase-8的表达，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），但对Caspase-9作用不明显。阿魏酸高剂量组细胞核呈均匀亮蓝色，无致密凝集现象，阿魏酸低、中浓度组大多数细胞细胞核出现染色质凝集和边缘化。结论 阿魏酸通过下调过氧化氢诱导的Caspase活性而起到保护黑素细胞凋亡作用。

[关键词] 阿魏酸；Caspase；凋亡；A375细胞；氧化应激

[中图分类号] R758.41 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）11（b）-0011-03

[Abstract] Objective To observe the effect of ferulic acid on the apoptosis of melanocyte induced by oxidative stress.Methods According to random number table，A375 cells were divided into five groups： control group，model group，and high，middle，low concentrations of ferulic acid groups.Cells in the control group were cultured normally，while peroxide hydrogen was added into the cultured A375 cells of model group and high，middle，low concentrations of ferulic acid groups at the final concentration of 0.1 mmol/L，duration for 4 hours.The cells were stained with fluorescent dye DAPI.The apoptosis of each group was observed by fluorescence microscope.Caspase active kit was used to measure the activity of Caspase in each group.Results Compared with the control group，the activities of Caspase-3，8 and 9 in the model group were significantly increased，with statistically significant differences（P < 0.01）.In the model group，dense and concentrated particles and the loose light colored crescent or annular fluorescence could be seen in the nucleus and cytoplasm，which implied that hydrogen peroxide can induce apoptosis of A375 cells.Compared with the model group，the expression of Caspase-3 and Caspase-8 were significantly reduced in the high does concentration of ferulic acid group，with statistically significant differences（P < 0.05 or P < 0.01），but the effect on Caspase-9 was not obvious.The nucleus of cells in the high does concentration of ferulic acid group were even bright blue，without the phenomenon of dense condensation.There were chromatin agglutination and marginalization of most cell nucleus in the low and medium does concentrations of ferulic acid groups.Conclusion Ferulic acid can protect the apoptosis of melanocyte through lower the activity of Caspase induced by hydrogen peroxide.[Key words] Ferulic acid； Caspase； Apoptosis； A375 cells； Oxidative stress

皮肤黑素细胞凋亡是色素缺失性皮肤病发病的主要因素[1]，而凋亡的诱发因素中，氧化应激损伤占重要地位[2]。在生理状态下，L-酪氨酸经过一系列氧化反应最终形成黑色素，在这一过程中会同时引起表皮中过氧化氢的蓄积，而表皮黑素细胞在合成黑素小体的过程中也可导致胞浆内活性氧（ROS）蓄积[3]，当自由基的产生超出机体清除能力时，会产生氧化应激损伤。黑素细胞受氧化攻击后易发生凋亡[4]，黑素细胞凋亡又是色素缺失性皮肤病发病的重要原因，传统中药当归对本病有较好的治疗作用[5-6]，但其有效成分研究较少。阿魏酸（4-羟基-3-甲氧基肉桂酸）是桂皮酸的衍生物之一，也是当归的主要活性成分。研究显示，阿魏酸对过氧化氢导致的细胞损伤有很好的保护作用[7-8]。本研究在前期研究基础上，观察阿魏酸对黑素细胞氧化应激损伤的影响，为色素脱失性皮肤病治疗和药物研究提供理论依据。材料与方法

1.1 材料

阿魏酸标准品（0773-9910）购自中国药品生物制品检定所，人黑素瘤细胞（A375）购于武汉细胞典藏中心；胎牛血清（NXB0568）、胰蛋白酶（SH30042.01B）、DMEM培养基（AC10220191（）HyClone公司）；二甲基亚砜（D5879（）Sigma公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）（ST476）、细胞培养用双抗（C0222）、噻唑蓝（MTT）（ST316）、Caspase3（C1115）、Caspase8（C1151）、Caspase9（C1157）活性检测试剂盒、DAPI染色液（C1005）（碧云天生物技术研究所）；MK3型酶标仪（热电上海仪器有限公司），过氧化氢等其他试剂均为国产分析醇。荧光显微镜（U-RFL-T，奥林巴斯）。

1.2 细胞培养与受试药

A375细胞常规培养，培养液由DMEM培养基、FBS、双抗按89∶10∶1比例配制。在处于对数生长期时，经胰蛋白酶消化，1000 r/min离心，弃上清用新鲜培养基重悬细胞，分瓶培养。待细胞生长至融合度达约70%时，随机数字表法将细胞分为空白对照组，模型组，阿魏酸低、中、高浓度组。空白对照组常规培养、模型组和阿魏酸各浓度组均预先用含0.1 mmol/L过氧化氢的培养基预处理相同时间。在前期工作中本课题组已摸索到阿魏酸在100 μmol/L浓度时增殖作用最强[9]，本研究以100、1、0.1 μmol/L 3个浓度进行后续实验，并命名为高浓度、中浓度和低浓度组。

1.3 凋亡形态学

调整细胞浓度约为2.0×104个/mL接种在24孔板中，每孔1 mL，每组设3个复孔。药物作用结束后弃培养基，用PBS清洗2次，按说明书操作，荧光显微镜测定。

1.4 Caspase-3、8、9活性测定

调整细胞数为1.5×104个/mL接种在96孔板中，每孔200 μL，每组设6个复孔。空白对照组加培养液常规培养，各实验组加入含不同浓度药物的培养基，每孔200 μL，?^续培养24 h后，按说明书要求操作，酶标仪405 nm波长测定各孔OD值。Caspase酶活性用OD405值表示。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。结果

2.1 阿魏酸对A375细胞形态学的影响

正常细胞的细胞核为暗蓝色，颜色较深，在用含过氧化氢培养基作用1～2 h后，细胞形态变化不明显，过氧化氢作用4 h出现较明显的凋亡形态改变，细胞核呈明亮鲜艳的蓝色荧光，作用8 h细胞出现部分死亡，见图1。空白对照组细胞核的荧光为弥散均匀的圆形或椭圆形；模型组细胞核或细胞质内可见致密浓染的颗粒、新月体或环状荧光，呈松散和淡染状，提示过氧化氢可诱导A375细胞凋亡；阿魏酸高剂量组细胞核呈均匀亮蓝色，无致密凝集现象；阿魏酸低、中剂量组大多数细胞细胞核出现染色质凝集和边缘化。见图2。

2.2 各组Caspase-3、8、9活性比较

与空白对照组相比，模型组Caspase-3、8、9活性显著升高（P 0.05）；而阿魏酸中、低浓度组的抑制作用不明显。见表1。讨论

白癜风是一种常见的色素脱失性皮肤病，发病率高，虽无明显的自觉症状，由于皮损部位黑素保护功能缺失，在日光照射下可出现局部皮肤潮红、瘙痒，严重者出现皮炎。白癜风因皮肤上的皮损色差影响患者的容貌，造成患者精神上的巨大压力，影响其工作、学习和生活。氧化应激致色素细胞功能异常并导致皮肤黑素的代谢障碍，产生白癜风等色素缺失性皮肤疾病[10-11]，严重者可累及毛发，造成灰发、白发等[12-13]。有研究证实，白癜风患者表皮黑素细胞存在氧化应激状态，并存在水平不断增高的现象[14-17]。氧化应激可通过线粒体、内质网和死亡受体等细胞内外途径引起黑素细胞的凋亡，促进了白癜风的发生、发展[18]。本研究从黑素细胞氧化应激损伤角度入手，以含0.1 mmol/L过氧化氢的培养基作用于A375细胞，造模方法参考了田军等[19]的研究结果，以细胞形态学和Caspase为观察对象，探讨阿魏酸对氧化应激诱导的黑素细胞凋亡的影响。

细胞凋亡过程中伴随着明显的形态学改变，通过使用荧光染料染色可以通过形态学改变观察细胞在凋亡中的进程。DAPI是一种结合于DNA双链的荧光染料，对凋亡过程中的DNA变化可以作出准确反映。观察含0.1 mmol/L过氧化氢的培养基作用细胞1、2、4、8 h后DAPI染色，结果可见，作用1、2 h对细胞损伤作用不明显，作用4 h开始出现较明显的变化，作用8 h后细胞死亡较多，不利于后续实验。本研究以0.1 mmol/L过氧化氢作用4 h为处理条件。在用药后，细胞凋亡的中心环节是由Caspase半胱氨酸蛋白酶家族引发的级联反应，其激活过程主要包括胞外死亡受体介导和线粒体依赖途径，依次激活下游的Caspase，通过切割特异性底物，导致细胞凋亡过程的不可逆。Caspase-

8、9都是细胞凋亡过程中的关键因子，参与该过程的程序化调控，这些因子受外源死亡受体途径和内源线粒体途径的激活，Caspase-

8、9是两个途径的共同部分。在应激状态下，酶原形式的Caspase-

8、9活化并激活Caspase-3触发细胞凋亡[20]。本实验检测了各组细胞中Caspase-3、8、9的活性，结果显示：模型组Caspase-3、8、9活性水平显著高于空白对照组，提示过氧化氢所致的氧化应激可激活A375细胞凋亡基因，阿魏酸高剂量组可显著下调Caspase-3和Caspase-8的表达，从而抑制过氧化氢诱导的A375细胞凋亡，这可能是阿魏酸抗细胞凋亡作用机制的环节之一，中、低剂量组作用不明显。

综上所述，阿魏酸通过下调过氧化氢诱导的Caspase活性而起到调节细胞凋亡作用。

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凋亡诱导因子研究 篇3

（1.广东汕头大学医学院,广东,汕头,515041,2.北京大学深圳医院肝胆腔镜外科，广东，深圳，518036）

【摘要】HSS具有促进肝癌细胞增生和抑制其分裂增生、引起肝癌细胞凋亡的双向作用。HSS可能与多种化疗药物诱导肝癌细胞凋亡有协同作用，并且明显减轻化疗药物的毒副作用，对化疗性肝损伤具有保护作用，有可能开创一种细胞因子与化疗药物相结合治疗肝癌的极具潜力的新疗法。

【关键词】肝细胞刺激因子；肝癌；凋亡

【中图分类号】R735.7【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)02-0016-02

肝脏是生物体内一种具有很强再生能力的器官，从中分离纯化出具有再生刺激功能的物质一直是国内外研究人员关注的重点。特异性的肝细胞生长刺激因子，HGF（血源性）、HSS（肝源性）、ALR（胞源性）在功能机制方面有许多共同和相似之处，又具有各自独特的功能。在临床上，它们既能启动肝损伤后的再生与修复，又能抑制某些肝癌细胞的生长，在肝病治疗药物中占有极其重要的地位。由于HSS特异性地促肝细胞生长的活性，参与肝细胞再生的调控等，一直是肝炎治疗、肝细胞调控的研究热点。而HSS对肝癌细胞株的作用各家报道不一，限制了HSS临床应用。本文就HSS诱导肝癌细胞凋亡的研究进展作一综述。

1HSS研究概况

1975年LaBrecque从初断乳大鼠和肝部分切除后的再生肝中提取出一种生物活性物质，称为肝细胞刺激因子(HSS)。它能刺激肝细胞有丝分裂，促进肝细胞再生和肝细胞DNA的合成，加速肝脏修复，保护肝细胞的作用。其机制仍不清楚。国内目前临床用的促肝细胞生长素即属于HSS类。HSS至今尚未得到纯化单一的活性物质，其分子结构和DNA序列仍不清楚，但有研究显示是一类分子量约为12～18kD，带强负电荷、微弱疏水的多肽类物质的总和。HSS没有种属特异性，但有器官特异性：HSS在体内对骨髓、脾脏、肾等器官均不作任何反应；在体外，对8种正常的或恶变的非肝脏起源细胞株也没有作用，然而无论体内、外，正常或恶变的肝脏起源的细胞均能对HSS产生较强的反应。HSS可由胎肝、再生肝中提取得到，但成年鼠肝脏提取物则无此物质。体外翻译实验表明，人胎肝细胞的多聚A-mRNA可以引导人HSS的生物合成，表明HSS是人胎肝组织的基因表达产物，而不是酶催化加工的结果。HSS存在乳肝组织或再生肝组织的肝细胞胞浆中，肝细胞膜上有相应的受体，在非肝细胞中未发现HSS。HSS与其他肝再生调控因子的主要不同之处在于具有耐热性并仅存在于生长状态的肝脏中。

2HSS诱导肝癌细胞凋亡的研究进展

HSS具有较强的抗损伤能力，可能减轻多种因素(病毒、细菌、化学毒物、缺血再灌注等)引起的肝细胞凋亡的发生^[1]，它能刺激肝细胞DNA合成及肝细胞再生，并对肝细胞具有保护作用。HSS对肝癌细胞的作用各家报道不一。由于体外实验证明HSS对肝癌细胞株DNA合成也有促进作用^[2]，因而HSS能否致癌变及能否应用于肝癌治疗，一直是人们关心的问题。李茹冰等研究表明，HSS的某些组份在体外尚可抑制肝癌细胞的增殖活性。大多数研究认为低浓度时，对肝癌细胞生长无明显刺激作用，较高浓度则有明显抑制肝癌细胞生长作用^[3]。吴国庆等实验发现^[4]HSS对正常大鼠肝脏细胞和人肝癌细胞呈促进增生和抑制其分裂增生、引起自溶和死亡的双向作用。研究表明^[5]，HSS对肝细胞生长起双重调控作用，不但能促进肝细胞DNA合成，同时还能抑制肝癌细胞生长，预防黄曲霉素导致的大鼠肝癌前病变。在体外实验，细胞水平证实^[6]，HSS能抑制肝癌细胞活力，但无明显形态学损害的表现。有学者通过琼脂糖凝胶电泳及流式细胞检测证实^[7]，肝癌细胞活性的降低系HSS和ADR的作用下发生细胞凋亡所致。其他学者通过实验亦得出 HSS对肝癌细胞生长具有抑制作用，且对肝癌细胞的凋亡具有促进作用^[8]。但类似的动物实验尚需进一步证实。可见HSS具有诱导肝癌细胞凋亡的作用是肯定的。当然，肝的再生增殖、凋亡等的调控并不是由单一因素决定的，HSS作为一种促肝生长物质是不可能完全独立发挥作用的。HSS单独对肝癌细胞系的凋亡诱导作用很弱，很可能与多种化学药物作为促进剂共同发挥作用。

3HSS诱导肝癌细胞凋亡的作用机制

自发现HSS以来，虽然受到一些学者的关注，但HSS对相同起源的正常和恶性肿瘤细胞为何表现出相反的作用，其机制仍不清楚。首都医科大学生物学实验室报道^[9]，HSS刺激肝细胞生长的机理可能是诱导细胞EGF受体(EGFR)mRNA的转录水平，上调EGFR的数量，提高EGFR的亲和力和磷酸化程度，促使其内向化。EGFR具有酪氨酸激酶活性，其活化后可诱导形成包括Ras在内的细胞信号传导通路，最终导致细胞增殖^[10]。HSS促肝癌细胞生长亦可能通过调节EGFR介导的信号传导通路所为。戴杰等^[2]报道，HSS系通过调节EGFR介导的细胞信号传导通路促肝癌细胞生长。HSS与肝细胞或肝癌细胞膜表面的EGFR结合，促使EGF与受体内向化，继而活化EGFR，后者则作用于膜内面的p21ras，引发胞内信号传导的瀑布效应。因此，在基因水平HSS刺激EGF受体表达，可能是HSS启动肝细胞再生的关键。

有学者通过实验发现HSS作用后的肝癌细胞突变型P53蛋白表达明显降低，可能是HSS促进肝癌细胞凋亡的原因之一^[8]。HSS对肝癌细胞的生长调节作用与肝癌细胞EGFR/DNA表达密切相关^[11]。HSS诱导肝癌细胞凋亡亦可能是通过作用于细胞膜上的EGFR而发挥其生物效应的。实际上EGF于不同细胞系可分别诱导凋亡及减轻凋亡。HSS与EGFR结合后引起EGFR构象的改变^[12]。HSS进入细胞，产生一系列理化反应，最终在核内启动一些基因的表达，如p53基因的表达，进一步表现出其效应。也有学者认为HSS在促进肝细胞再生的同时，可能同时具有促进细胞分化的作用，而肝癌细胞凋亡的发生可能与这种尚未证实的促分化作用有关^[7]。

4HSS抗化疗性肝损伤的作用

HSS通过增强肝细胞抗氧化能力，抑制脂质过氧化反应，在一定程度上拮抗CTX、CCl4的肝毒性^[13]。HSS能够阻止化学毒物或药物导致的肝细胞膜流动性的降低，能够有效地维持急性肝损伤后线粒体的通透性^[5]，线粒体膜通透性改变可能是细胞死亡的关键性机制，改善肝脏线粒体的呼吸功能，因而阻止细胞死亡。据报道，HSS能促进肝细胞膜的稳定性，增强肝细胞对化疗药物的耐受性，减轻肝细胞的损伤，提高化疗效果，明显缩小肿瘤病灶，延长生存期，并能减轻化疗引起的呕吐等消化道反应。可见HSS作为一种有效的天然的肝细胞特异性保护剂应用于临床，可望成为化疗性肝损伤有效治疗方法之一。

5小结

肝癌的化疗敏感性较差，全身化疗反应率在20%左右，且肝癌的联合化疗方案并未显示出比单一药物化疗更明显的优势，相反，联合化疗不可避免的具有更高的毒性。研究结果证实多种化疗药物均有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，诱导细胞凋亡成为肿瘤治疗的一个方向。HSS可能与多种化疗药物诱导肝癌细胞凋亡有协同作用，并且明显减轻化疗药物的毒副作用，对化疗性肝损伤具有保护作用，应用于人体可能发挥显著的抗肝癌作用，有可能开创一种细胞因子与化疗药物相结合治疗肝癌的极具潜力的新疗法。

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凋亡诱导因子研究 篇4

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康Wistar大鼠, 鼠龄3个月～4个月, 体重250 g～320 g, 由兰州军区兰州总医院实验动物中心提供。

1.2 药物与试剂 丹红注射液由济南步长制药有限公司生产, AIF兔多克隆抗体 (北京博奥森生物技术有限公司) , 即用型SABC免疫组化染色试剂盒 (北京中杉生物技术有限公司) , TUNEL凋亡检测试剂盒 (Roche公司) 。

1.3 方法 实验动物随机分为假手术组、局灶性脑缺血再灌注组 (对照组) 、丹红注射液治疗组 (治疗组) 。治疗组予丹红注射液5 mL/kg, 于术前30 min腹腔注射, 每日1次, 连续5 d。对照组给予等量生理盐水。

1.4 动物模型的建立 模型制作根据Nagasawa等[1]的改良线栓法制成大鼠大脑中动脉缺血模型。用水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后, 将其仰卧固定, 分离右侧颈总动脉 (CCA) 、颈内动脉 (ICA) 及颈外动脉 (ECA) , 结扎ECA与CCA, 用动脉夹夹闭CCA远心端后, 迅速于ECA与ICA分叉下方剪一切口, 将一预先用酒精灯烧成圆头的尼龙线插入颈内动脉, 插入深度为 (18.5±0.5) mm, 直到有轻微阻力感为止, 实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血。结扎入口处, 尼龙线外留约1 cm, 缝合皮肤。2 h后轻轻提拉所留线头至略有阻力, 实现大脑中动脉再灌注, 造模完成。动物清醒后, 出现Horner征, 提尾右前肢屈曲或爬行向左侧转圈者为手术成功标志。假手术组除插线1 cm外, 其余步骤同模型组。

1.5 标本采集和组织切片的制备 各组大鼠在规定时间点取材, 假手术组于手术后24 h取材, 其余各组在相应时间点取材。大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉, 经左心室插管至升主动脉, 剪开右心耳, 依次灌注生理盐水、40 g/L多聚甲醛各300 mL, 断头取脑, 置入40 g/L多聚甲醛固定12 h, 于视交叉后1 mm～4 mm取材, 厚约3 mm, 常规石蜡包埋, 冠状面连续取材, 取齿状回与海马互包平面的切片, 片厚4 μm。

1.6 凋亡诱导因子 (AIF) 的免疫组化标记 免疫组化采用SABC法。石蜡切片脱蜡至水, 放入柠檬酸盐缓冲液 (pH6.0) 中, 微波热修复15 min, 3%H2O2室温孵育10 min, 10%山羊血清封闭, 室温孵育10 min, 倾去血清, 勿洗, 滴加1∶200兔抗鼠AIF抗体, 4 ℃冰箱孵育过夜, 37 ℃复温1 h, 滴加适量生物素标记羊抗兔二抗工作液, 37 ℃孵育20 min;滴加适量的辣根酶标记的链霉卵白素工作液, 37 ℃孵育15 min。除血清封闭外, 其余步骤间均用PBS冲洗3次, 每次5 min。DAB显色剂显色2 min～5 min。自来水冲洗, 苏木精复染, 梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片。显微镜下观察, 细胞核中出现棕黄色颗粒者为AIF阳性细胞。阴性对照取PBS代替一抗, 免疫反应阴性, 说明一抗的特异性较强。

1.7 凋亡细胞检测 按照TUNEL试剂盒提供的实验步骤进行操作。用二甲苯浸洗2次, 每次5 min;用梯度酒精 (100%、95%、90%、80%、70%) 脱水, 每次3 min;PBS漂洗2次;用细胞通透液 (0.1% Triton X-100 溶于蒸馏水, 临用前配制) 37 ℃反应8 min～10 min;PBS漂洗2次;制备体积比为1∶9的TdT和荧光素标记的dUTP TUNEL反应混合液混匀;玻片干后, 加50 μL TUNEL混合液 (阴性对照组仅加50 μL 荧光素标记的dUTP液) 于标本上, 在暗湿盒中反应 (37 ℃×1 h) 。PBS漂洗3次;加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞 (激发光波长为450 nm～500 nm, 检测波长为515 nm～565 nm) 并照相;玻片干后加50 μL converter-POD在37 ℃暗湿盒中反应33 min, PBS漂洗3次;在组织处加50 μL新鲜配制的DAB底物, 室温下反应5 min～10 min;PBS漂洗3次;每次漂洗为5 min。苏木精复染几秒后, 立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。光镜下观察, 出现棕黄色颗粒为阳性细胞。显微镜下观察顶叶皮质缺血半暗带区, 取5个非重叠视野, 以计数凋亡细胞数/视野。

1.8 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计学处理。试验数据用均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示, 采用成组 t检验显著性检验水准取α=0.05。

2 结 果

2.1 AIF的表达

AIF阳性细胞呈棕黄色, 假手术组大鼠脑组织中未见明显的AIF阳性细胞。对照组与治疗组AIF阳性细胞在缺血再灌注1 d达到高峰, 随后下降;对照组与治疗组在相同时间点及其组间比较比较均有统计学意义 (P<0.05) 。详见表1。

2.2 凋亡细胞检测

TUNEL检测凋亡细胞, 凋亡细胞荧光显微镜显示为绿色, DAB显色后, 出现棕黄色颗粒者为凋亡细胞, 正常细胞核无着色, 主要在缺血周围区, 假手术组未见明显阳性细胞。对照组与治疗组TUNEL凋亡细胞在缺血再灌注1 d达到高峰, 随后下降;治疗组与对照组比较, 凋亡细胞明显减少, 在相同时间点比较均有统计学意义 (P<0.05) 。详见表2。

3 讨 论

神经元凋亡在脑缺血再灌注继发的神经损伤的机制中起重要作用。因此, 通过抑制神经元凋亡防治脑缺血再灌注继发神经元损伤成为研究脑保护的热点。细胞凋亡的发生是一个极其复杂的病理生理过程, 涉及能量衰竭、酸中毒、细胞内钙离子超载、兴奋性氨基酸毒性作用和自由基损伤等[2], 但就其机制来说有Caspase依赖途径及AIF介导的非Caspase依赖途径。AIF是近年来发现的一种凋亡效应分子, 它是一种在进化上较为保守的黄素蛋白, 定位于细胞线粒体膜间隙, 具有凋亡诱导的活性。AIF是一种双功能蛋白, 具有氧化还原酶的活性, 与线粒体的生理活动有关[3], 它在不依赖Caspase途径中扮演重要角色。

丹红注射液是目前较为常用的临床药物, 它由中药红花和丹参科学提取精制而成, 主要成分为红花黄色素、丹参酮和丹参酚酸等。丹参可以使缺血再灌注的脑组织表达iNOS明显下降, 从而减轻NO的神经毒性, 保护脑组织[4], 红花黄色素也可以降低iNOS和nNOS的表达, 而对eNOS的表达无影响[5]。丹参酚酸和红花有抑制血小板黏附、聚集、激活的作用, 以及能抗血栓形成, 改善微循环等作用[6], 其抗血小板作用可能通过抑制血小板的活化, 减少GPⅡ b/Ⅲa受体的激活, 从而减少血小板聚集, 有效改善脑血流。丹红注射液还可提高超氧化物歧化酶 (SOD) 活性, 减少丙二醛 (MDA) 含量, 从而减轻氧自由基对脑组织的毒害, 并有效清除缺血再灌注后自由基对神经细胞继发损伤[7]。丹红注射液具有扩张脑动脉, 降低血管阻力, 降低血液黏度, 增强红细胞变形能力, 并能清除氧自由基, 拮抗Ca2+内流, 改善酶活性, 同时也可提高脑组织耐氧能力, 对脑组织具有明显的保护作用[8]。已有的研究发现, 丹红注射液具有明显减

少脑梗死体积, 明显降低脑组织含水量[7], 并可显著改善神经功能缺损评分及预后[9]。本实验证实, 丹红注射液可显著减少凋亡细胞及AIF 阳性细胞表达, 对脑缺血再灌注损伤有积极的治疗作用。

摘要：目的 研究丹红注射液对脑缺血再灌注后凋亡诱导因子 (AIF) 表达及神经元凋亡的影响。方法 将Wistar大鼠随机分为3组, 假手术组、局灶性脑缺血再灌注组 (对照组) 、丹红注射液治疗组 (治疗组) , 改良线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型, 各组分别于1 d、3 d、5 d取脑组织, 测定AIF及神经元凋亡的变化。结果 治疗组大鼠脑组织AIF及神经元凋亡在造模后的1 d、3d、5 d均明显低于对照组 (P<0.05) 。结论 丹红注射液可通过抑制AIF的表达, 减少神经元的凋亡, 对大鼠脑缺血再灌注具有脑保护作用。

关键词：丹红注射液,凋亡诱导因子,脑缺血,凋亡

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凋亡诱导因子研究 篇5

【关键词】 皂角刺总黄酮；线粒体跨膜电位；细胞因子

【中图分类号】Q2 【文献标识码】B 【文章编号】1007-8231（2011）11-1888-01

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,占全部恶性肿瘤的41% ［1]。20世纪以来，在我国，肝癌在城市仅次于肺癌,在农村仅次于胃癌,我国肝癌已上升为恶性肿瘤的第二位［2]。原发性肝癌发病隐匿, 迅速发展,患者生存期短。目前,手术是早期肝癌治疗的首选方法,放疗和化疗则是中晚期肝癌及转移性肝癌常用的治疗方法。然而, 手术疗法复发率较高;而放疗和化疗伴有明显的毒副反应［3]。而以中医药为主的综合治疗,对控制肝癌患者病情发展,提高生活质量,延长生存时间有着重要价值。因此，寻找高效低毒的中医药已经成为国内外医药学家追寻的目标。

皂角刺 (Gleditsia sinensis Lain)是我国传统中药材，具有较强的抗肿瘤作用，已被列为抗癌中草药之一，可用于多种肿瘤的治疗。皂角刺总黄酮是皂角刺的提取物。黄酮类化合物是一类天然有机化合物, 广泛存在于许多药用植物中, 具有多种潜在的药用价值, 其抗肿瘤作用的研究已经由来已久, 从20 世纪70年代起就有人发现黄酮类化合物具有较好的抗肿瘤作用［4]。据研究报道：黄芩甙能诱导肝癌细胞BEL27402凋亡和半枝莲提取物可有效诱导肝癌H22细胞凋亡,其机制可能与降低肿瘤细胞线粒体膜电位有关［6]。曹学锋等为了探讨中药皂角刺总黄酮的免疫调节作用,利用酶联检测其皂角刺总黄酮作用小鼠腹腔巨噬细胞释放肿瘤坏死因子(TNF) 的情况, 发现皂角刺总黄酮对TNF 有明显的抑制作用［7]。

1 材料与试剂

小鼠，雌雄各半，15～18g，购自贵阳医学院实验动物中心；CD3+ 、CD4+ 、CD8+ 抗体及成套试剂盒,购自美国RD公司；interleukin-2（IL-2）、tumor necrosis factor－α（TNF-α）放免试剂盒，购自购自北京华英生物技术研究所; TUNEL检测试剂盒, 购自罗氏公司；皂角刺总黄酮, 由本课题组制备保存；RPMI- 1640培养液, 购自凯基生物科技发展有限公司; 新生胎牛血清,购杭州四季青生物公司；凯基细胞凋亡罗丹明123染色试剂盒, 购自南京凯基生物科技发展有限公司；BD FACS -Aria流式细胞仪, 美国BD公司生产。

2 方法

2.1 线粒体膜电位的检测

2.1.1 细胞培养及分组

用含10%新生胎牛血清的RPM I-1640培养液（含双抗）, 在5% CO2的37℃培养箱中培养。实验设空白对照组和经皂角刺总黄酮处理的实验组, 随机选取对数期生长的肝癌HepG2分成5份, 其中4份分别加入皂角刺总黄酮溶液使其终浓度分别为0.4, 0.8, 1.6, 3.2 mg/ml作为实验组。其中1份, 加入与实验组等量体积的培养液作为阴性对照组。

2.1.2 线粒体膜电位的检测

两组细胞孵育24 h后, 經消化后用冷PBS（pH7.2）悬浮。取细胞数为1×106个/mL离心管内离心, 冷PBS洗涤3次后，移至流式测定管内离心,用100 l结合缓冲液悬浮细胞。随后加入罗丹明123染液10mg /mL ,置于 37℃ 5% CO2 培养箱孵育20 min, 取出离心后用培养液洗涤2次, 上流式细胞仪检测。实验重复3次。

2.2 皂角刺总黄酮对荷瘤小鼠免疫功能的影响

2.2.1 动物模型建立

抽取HepG2传代第7d的小鼠腹水2 mL，在无菌条件下，采用灭菌生理盐水配制成浓度为2×107个/mL 的接种用瘤液。20只小鼠皮下注射接种用瘤液0.2 mL。

2.2.2 动物分组及指标检测

将20只皮下注射接种用瘤液的小鼠随机分为对照组和给药组，另外设10只正常小鼠作为正常组，对照组和正常组均用生理盐水进行灌胃，用药组采用皂角刺总黄酮按照0.25 g／kg剂量进行灌胃， 对照组、正常组和用药组均每日灌胃2 次。灌胃给药5 d 后眼球采血法获得外周血，具体操作参照试剂盒说明书采用流式方法检测CD3+ 、CD4+ 、CD8+ 及NK 细胞的百分含量和采用放射免疫方法检测血清中IL-2、TNF-α 的水平。

2.3 统计学处理 所有实验数据均采用SPSS15.0软件进行统计分析，数据采用（x±s）表示。

3 结果

3.1 线粒体跨膜电位的检测

皂角刺总黄酮处理肝癌HepG2作用24h, 经罗丹明123染色后采用流式细胞仪检测。结果显示: 与对照组相比，皂角刺总黄酮处理组均明显低于对照组,有极显著差异(P < 0. 01), 且随皂角刺总黄酮作用浓度的增高而减少,呈为负相关，结果见表1。

表1 线粒体跨膜电位的检测结果(x±s)

注：*与对照组比较, ** P＜0.01; #与对照组比较, ## P＜0.01

3.2 小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+ 及NK 细胞百分含量的测定

与对照组比较, 用药组能显著上调小鼠外周血CD3+（P＜0.05）、CD4+（P＜0.01）、CD8+（P＜0.01）及NK 细胞（P＜0.01）; 与正常组比较, 用药组能显著上调小鼠外周血CD3+（P＜0.01）、CD4+（P＜0.01）、CD8+（P＜0.01）及NK 细胞（P＜0.01） 结果见表2。

表2 小鼠外周血CD3+ 、CD4+ 、CD8+ 及NK 细胞百分含量

注：*与正常组比较， ** P＜0.01；#与对照组比较，## P＜0.01。

3.3 小鼠血清中细胞因子IL-2和TNF-α 的表达

小鼠血清中细胞因子TNF-α和IL-2 的浓度采用放射免疫标记的方法进行检测。对照组中TNF-α含量最低（1.25±0.35），药物干预后TNF-α（2.54±0.43）明显升偏高且接近正常组的值（2.72±0.52）（P＜0.01）。小鼠血清中细胞因子IL-2的浓度测定结果为，与正常组（2.32±0.43）和对照组（2.53±0.57）比较，用药组小鼠血清中细胞因子IL-2（3.29±0.49）显著升高（P＜0.01）。

4 讨论

4.1 李荣采用皂角刺总黄酮作用于HCTll6细胞,透射电子显微镜检测显示，经皂角刺总黄酮处理后的细胞出现线粒体肿胀，细胞质浓缩，核固缩，核内染色质聚集于核膜内侧成团块状或新月状等凋亡改变。

线粒体通路是抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞凋亡的一条重要途径。线粒体是细胞进行呼吸链、电子传递、三羧酸循环和氧化磷酸化的场所，故线粒体也是细胞能量的场所，如果线粒体发生病变则会影响危及细胞生命。在细胞凋亡过程中，线粒体被认为是处于凋亡调控的中心位置，线粒体通路是最普遍的细胞凋亡机制。本研究采用应用流式细胞术分别检测皂角刺总黄酮肝癌HepG2細胞线粒体跨膜电位变化，研究提示皂角刺总黄酮诱导肝癌细胞凋亡可能是通过某些途径引起线粒体跨膜电位的下降, 进一步导致MMP通道开放的结果。

4.2 刘明华等建立小鼠肉瘤S180 及小鼠肝癌H22 移植性肿瘤模型, 观察皂角刺提取物对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用，结果发现皂角刺提取物在50、100 mg/kg 时对S180 的生长抑制率分别为44.59%、53.38%, 对H22 生长抑制率分别为39.88%、46.63%, 且能提高荷瘤小鼠的脾指数和胸腺指数和提高荷瘤小鼠细胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α等细胞因子的表达水平［8]；张宏文和王占彬对产自伏牛山区野生皂角刺, 用醇提取法提取黄酮类化合物等生物活性物质, 研究其对肉仔鸡免疫功能的影响，研究结果显示：日粮中添加皂角刺提取物, 可以提高免疫器官重量和淋巴细胞转化率, 并有显著促生长作用( P< 0. 05) ［9]。受这些研究成果的启发：本研究采用建立肝癌荷瘤模型后连续给药皂角刺总黄酮，检测外周血中CD3+、CD4+、CD8+及NK 细胞的百分含量并检测血清中IL-2 和TNF-α 的浓度。结果与对照组比较， 皂角刺总黄酮显著上调小鼠外周血CD3+（P＜0.05）、CD4+（P＜0.05）、CD8+（P＜0.05）及NK（P＜0.01）细胞的百分含量及血清中IL-2 和TNF-α（P＜0.01）的表达水平。结论皂角刺总黄酮诱导肝癌HepG2凋亡可能与皂角刺总黄酮干预机体免疫功能，诱导肿瘤凋亡，从而达到抑制肿瘤生长起作用。

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［项目资助] 2010年贵州省科学技术基金（黔科合J字［2010]2262号）和2011年贵州省社会发展科技攻关项目 ［黔科合SY字（2011）3020]资助

作者简介: 何光志（1977—）, 男, 贵州思南人, 博士, 副教授, 硕士导师，主要从事病原生物学及免疫学研究

(接第1887页)

而大多抗抑郁药的起效需2~4周，能否快速有效的抗抑郁治疗是非常重要的［4]。坦度螺酮联合舍曲林治疗成年抑郁症患者取得了较好的疗效，较单用舍曲林治疗起效更快［5]。本研究在青少年抑郁症患者中得到了相同的结果，合用组对抑郁和焦虑的疗效均优于单用组，且见效较快，而且联合用药并不加重药物的不良反应，与对照组差异无统计学意义。但因两药均作用于 5- HT受体，故联合用药过程中应警惕发生5-HT综合征的可能，于开始用药及调整剂量时应加强观察。

综上所述，坦度螺酮联合舍曲林治疗青少年抑郁症疗效优于单用舍曲林，值得临床推广。

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姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展 篇6

近五十年的研究表明, 姜黄素可以用于预防和治疗肿瘤, 对多种肿瘤细胞的产生、增殖、转移均具有抑制作用, 如结肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌、白血病等。其可能的作用机制有诱导肿瘤细胞凋亡、改变细胞受体连接、阻断细胞内信号反应等[3,4]。细胞凋亡 (cell apoptosis) 是一种由基因调控的细胞主动死亡过程, 是机体生长发育、细胞分化、生理及病理性死亡的重要机制。众多细胞实验和动物实验均已经证明, 姜黄素具有确切的诱导肿瘤细胞凋亡的活性。其抗癌谱较广, 是一种具有广阔开发前景的中药, 亟待进一步对其作用机制深入研究, 以便及早在临床上推广使用。

1 抑制NF-KB活化

NF-KB是一类在动物细胞中广泛表达的转录因子, 其主要生理功能之一是通过诱导凋亡抑制基因的转录, 拮抗细胞凋亡的发生[5,6]。姜黄素可以抑制A2780细胞生长和诱导凋亡, 用不同浓度的姜黄素作用于A2780细胞爬片12 h后, NF-KB蛋白 (P65) 表达均有下调[7,8]。最近发现, 姜黄素抑制NF-kB活化是通过抑制诱导IKBa磷酸化的激酶活性而发挥作用, 影响细胞表面黏附分子、趋化因子、TNF、MMP9、COX2和NOS的表达。由于NF-KB参与细胞的存活和增殖过程, 因此抑制NF-KB活化也可部分解释姜黄素诱导的抗增殖和诱导凋亡的效应[9,10]。

2 抑制转录共激活因子P300活性和表达

P300是一种重要的组蛋白乙酰基转移酶, 它能乙酰化核心组蛋白N末端的赖氨酸残基, 使核小体组蛋白与DNA的结合稳定性下降, 进而使转录机器与染色体的结合成为可能。在细胞中可与多种基因转录活化因子结合而形成辅化因子复合体。除乙酰化作用外, P300还可以在转录起始复合体的形成中起支架或桥梁的作用[13]。目前研究表明, P300作为一种核蛋白, 它们具有调节细胞增殖、分化、细胞周期, DNA的损伤修复和凋亡的作用圈。姜黄素能抑制胃癌SGC-7901细胞P300的mRNA和蛋白质的表达, 并能抑制组蛋白H3、H4乙酰化, c-myc表达也明显抑制, 但野生型P53表达则不受抑制。且P300的抑制与组蛋白H3、H4乙酰化程度及c-myc抑制程度具有明显的相关性。这可能是姜黄素抑制乙酰化酶P300后, 抑制了组蛋白的乙酰化, 使染色体的结构变得紧密, 不便于cmyc的启动子区域与调节蛋白结合, 从而抑制了原癌基因c-myc表达。另有研究发现姜黄素能够抑制转录共激活因子p300活性和表达, 可能是姜黄素对抑制B细胞淋巴瘤细胞系Raji细胞增殖作用, 并促进其凋亡的作用机制之一[14]。

3 上调caspases蛋白酶

胱冬蛋白酶属于ICE/CED3蛋白酶家族成员, 目前发现至少有14种之多, 分别命名为casepases1～casepases14。与细胞凋亡密切相关, 它是通过级联反应, 最终激活核酸内切酶来实现的。姜黄素可呈时间及剂量依赖性抑制Raj细胞增殖, 可显著促进Raji细胞凋亡;Western blot检测表明, 在25μmol/L (IC50) 作用24 h, Raji细胞与对照组相比, 胱冬蛋白酶8和9的表达明显增高, 提示胱冬蛋白酶8和9在Raji细胞增殖和凋亡中起重要的作用。说明姜黄素诱导Raji细胞死亡受体Fas的表达增强, 激活了caspase 8, 从而启动caspase级联发应, 使线粒体下游caspase 9效应酶激活, 最终诱导细胞凋亡[11]。姜黄素能够诱导黑色素瘤A375细胞的凋亡, 并呈时间和剂量依赖性。免疫组化检测Caspase-3蛋白表达, 原位杂交检测Caspase-3 m RNA, 结果发现Caspase-3表达增加, 说明Casepase-3参与了姜黄素诱导A375细胞凋亡的发生和发展同。姜黄素能明显抑制U251细胞的增殖并且诱导其凋亡, FAK蛋白表达减少, caspase-3活性增强, 各种caspase抑制剂 (如z-DEVD-fmk, z-IETD-fmk、z-LEHD-fmk、zVAD-fmk等) 可抑制姜黄素诱导的U251细胞凋亡。姜黄素通过抑制FAK蛋白的表达和激活caspase途径可诱导U251细胞凋亡, 这提示我们caspase-3作用于FAK, 以去除FAK抑制凋亡的作用, 使细胞最终凋亡[12]。

4 抑制Survivin表达率

survivin是IAP家族成员之一, 分布于有丝分裂元件, 具有调控细胞有丝分裂和抑制细胞凋亡的功能。survivin在大多数正常组织中未被检测, 但在肿瘤组织中过量表达。survivin已经成为癌症治疗的一个重要靶点[15]。姜黄素能抑制胃癌细胞SGC-7901和MKN-45的生长并促进其凋亡, 其发生与Survivin表达率下降有关[16]。邱学德也发现姜黄素能够诱导膀胱肿瘤细胞株T24和BIU87凋亡, 姜黄素可使肿瘤细胞株的Survivin m RNA表达量降低[16]。

5 调节Bcl-2家族相关基因蛋白表达

Bc1-2家族蛋白是在细胞凋亡过程中起关键性作用的一类蛋白质。线粒体上, Bcl-2家族蛋白通过与其他凋亡蛋白的协同作用, 调控线粒体结构与功能的稳定性, 发挥着细胞凋亡“主开关”的作用。Bcl-2家族包括两类蛋白质:一类是抗凋亡蛋白, 另一类是促凋亡蛋白。姜黄素在初治AML患者原代细胞时, 可使抗凋亡蛋白Mc1-1下调, 促凋亡蛋白Bax、Bak上调。第一次证明了姜黄素可诱导初治AML患者原代细胞的凋亡, 并发现姜黄素诱导白血病细胞凋亡的机制之一是调节Bcl-2家族成员Mc1-1、Bax、Bak的表达, 进一步证实各成员之间存在复杂的相互关系[16]。采用免疫细胞化学法发现, 姜黄素诱导SKOV3细胞凋亡的作用与下调Bcl-2、MTP53的表达及上调Bax、Fas的表达有关[17]。

6 改变线粒体膜电位

有文献报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活, 也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面。而一旦线粒体跨膜电位耗散, 细胞就会进入不可逆的凋亡过程[22]。杨甫文等发现姜黄素诱导鼻咽癌细胞凋亡可能与改变线粒体跨膜电位, 释放CytC, 上调Fas基因表达, 激活caspase-3酶有关[18]。这提示线粒体跨膜电位是姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的新靶点[19]。

7 展望

论中药诱导肝癌细胞凋亡的研究进展 篇7

1 中药诱导肝癌细胞凋亡的作用机制

1.1 改变基因编程

通过改变肿瘤细胞相关基因的编程及表达, 可对肝癌细胞起到控制作用。部分学者对这一作用机制进行了相关的研究。如, 陈洪、秦叔逵等对三氧化二砷 (三氧化二砷) 对癌细胞的效用以及作用机制进行了研究, 发现将三氧化二砷注射入肝癌实体型小鼠中后, 实体内肿瘤出现凋亡迹象, 经进一步检测后验证确实存在凋亡的肿瘤细胞, 并经研究发现, 三氧化二砷的主要作用机制即同步实现对Bax基因表达的上调以及Bcl-2基因表达的下调, 并使Fas基因表达发生比较明显的增强最终实现部分肿瘤细胞凋亡的。

1.2 调节肿瘤细胞内钙离子的浓度

部分中药可以通过调节肿瘤细胞内钙离子的浓度, 对诱发肝癌细胞出现凋亡的相关蛋白表达起到调节作用, 并最终达到促使肝癌细胞凋亡的目的。WangQF等人即通过研究绞股蓝总苷对肝癌细胞的作用机制, 发现了钙离子浓度在肿瘤细胞内受到药物作用后的变化, 验证钙离子浓度会出现迅速升高, 且证明肝癌细胞最终出现凋亡与其他因素, 如活性氧的产生等并没有直接关系, 进而说明中药作用于肿瘤细胞后, 可通过促使钙离子浓度升高这一作用机制完成肝癌细胞的凋亡[1]。

2 中药诱导肝癌细胞凋亡效果的影响因素

2.1 药物浓度

中药对肝癌细胞作用的效果与药物的浓度有着密切的关系, 研究发现, 将药物浓度控制在比较科学的范围内, 更利于肝癌治疗效果的提升。仍以三氧化二砷对肝癌细胞的作用为例, 梁桃、刘铁夫等人在研究中发现, 使用三氧化二砷在治疗肝癌细胞中, 浓度分别为1.25mol/L和2.5mol/L以及5.0mol/L时, 即浓度两次进行加倍使用后, 产生了不同的作用效果, 三种不同药物浓度的实验组中, 2.5mol/L组最终的效果最为理想, 表明三氧化二砷在作用于癌细胞时, 并非浓度越高, 作用效果越明显, 而是在到达一定浓度后会达到效果的最佳化, 而如果浓度继续升高, 则效果会持续下降, 整个效果线呈抛物线状。另外, 部分药物的浓度与作用效果呈现正相关性, 即药物浓度越高, 则效果越佳, 如叶红军、叶炯贤等人的研究中, 在使用浓度分别为0.25g/L、0.5g/L以及1g/L的刺五加皂苷对肝癌细胞进行作用时, 用药2d后, 肝癌细胞的凋亡率呈现出显著性差异, 1g/L达到70%以上, 0.5g/L达到50%, 而0.25g/L浓度组肝癌细胞的凋亡率不足1%。以上研究均表明, 中药在肝癌细胞凋亡时, 药物的浓度对凋亡的效果有着直接的影响[2]。

2.2 时间长度

中药在用到肝癌细胞凋亡中的效果, 除与药物的浓度有密切关系外, 研究同时发现, 中药物在作用于肝癌细胞时, 时间长短不一, 最终的效果也存在比较明显的差异。以上所举叶红军、叶炯贤等人的研究, 在发现肝癌细胞的凋亡效果与药物浓度具有明显关系的同时, 还发现药物时间长短不同对肝癌细胞的凋亡效果也产生了不同的效果, 就刺五加皂苷而言, 用药时间越长, 肝癌细胞的凋亡效果越明显, 也呈现出一种正相关性。另外, 司维柯和罗朝学等人的研究中也发现中药物用药时间的长短与肝癌细胞的凋亡率有着密切关系, 在使用苦参碱作用于肝癌细胞时, 药物在使用6h、12h以及24h后凋亡率分别约为7%、8%以及15%, 即时间越长药物的效用约为理想, 且药性会随着的延长而出现增长, 与中药物比较温和但具有持久性药效的特点比较温和。

3 主要的中药类型

对于可以对肝癌细胞的凋亡起到诱导作用的所有研究中出现的中药物中, 主要有以下几种类型: (1) 活血化瘀型中药。经研究发现对肝癌细胞凋亡能发挥作用的此类药物主要有莪术、姜黄素以及丹参酮。 (2) 清热解毒型中药。当前纳入研究范围的此类中药主要有白花蛇舌草、苦参碱、鸦胆子油乳、半枝莲以及青蒿素等。 (3) 消肿利水型中药。主要有薏苡仁和紫杉醇等。 (4) 怯邪扶正型中药。主要有黄芪和人参皂苷等。 (5) 以毒攻毒型中药。主要有三氧化二砷、斑蝥酸钠以及华蟾素等[3]。另外, 部分药物还可以在避免药物禁忌的情况下, 与其他药物相伍使用, 以增强对肝癌细胞凋亡的诱导力, 如黄芪即可与白术、茯苓以及党参合用, 促使Bax基因表达的上调, 更好地对肝癌细胞产生作用, 这在谭德明以及刘作金等人的研究中有所体现。此外, 其他配伍方式, 如丹酚总酚酸和芍药总苷按照一定的比例进行配伍后, 也可以对肝癌细胞的凋亡起到诱导作用, 这在胡盛和陈世敏等人的研究中进行了关注和报道。

4 小结

我国肝癌发病率很高, 如果按发患者数计算, 我国肝癌的发患者数在全球肝癌总发患者数中早已达到50%以上, 在我国, 每年因肝癌死亡的患者高达60万, 且近些年发病率呈现一定的上升, 给更多的患者造成了生命危险。当前临床常采用手术以及放疗和化疗的方式进行治疗, 虽然对抑制肿瘤细胞的增生起到了一定的效果, 但往往同时对患者的身体产生较大的毒副作用, 甚至对正常的细胞产生一定的杀伤力。随着临床经验的不断丰富, 中药治疗肝癌的方式逐步得到临床的认可, 中药可以通过诱导肝癌细胞的凋亡等方式, 对肝癌的治疗产生比较明显的作用, 同时, 由于中药性质相对比较温和, 对患者身体的损伤较小, 可在今后临床治疗肝癌中进行推广应用。

参考文献

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[2]谢广茹, 吴雄志.中药诱导肝癌细胞凋亡的研究进展[J].临床肿瘤学杂志, 2007, 13 (3) :72-75.

凋亡诱导因子研究 篇8

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂

氧化苦参碱为北京显通时代医药科技发展有限公司生产(规格:200 mg/支);5-氟尿嘧啶为上海旭东海普药业有限公司生产(批号:241101,规格:2 g/L,10 ml/支);Bcl-2、Bax鼠抗人单克隆抗体、羊抗鼠FITC-Ig G二抗工作液为美国Pharmingen公司生产(规格:100μl)。

1.1.2 细胞株与动物

人胃癌细胞MGC-803由郑州大学公共卫生学院馈赠,常规传代培养。BALB/c A-nu裸鼠购自中国药品生物制品检定所实验动物中心,SPF级,SCXK(京)2005-0004,日龄35~40 d,体质量19~20 g,雌雄各半。

1.1.3 主要仪器设备

美国Beckman Coulter公司生产的Epics-XLⅡ型流式细胞仪。

1.2 方法

1.2.1 人胃癌裸鼠移植瘤模型的制备

收集对数生长期MGC-803细胞1×107/ml,无菌条件下,裸鼠右腋皮下注射0.2 ml,观察至出现米粒大小结节,模型复制成功。

1.2.2 肿瘤抑制实验

肿瘤生长至100~300 mm3后将动物随机分成5组,分别为阴性对照组[生理盐水(NS)组]、阳性对照组(5-FU组)、氧化苦参碱小剂量组[64 mg/(kg·d)]、氧化苦参碱中剂量组[128 mg/(kg·d)]和氧化苦参碱大剂量组[256 mg/(kg·d)]。每组不少于6只,每天固定时间注射1次,连续观察25 d。

1.2.3 抑瘤效果的评价方法

采用测量瘤径法,动态观察氧化苦参碱的抗肿瘤效应。肿瘤直径的测量次数为每4天测量1次。肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算公式为:TV=1/2×a×b2,其中,a、b分别表示最大长径和最小短径。根据测量结果计算出相对肿瘤体积(RTV),计算公式为:RTV=Vt/V1,其中,V1为分笼给药时测得的肿瘤体积,Vt为每次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤抑制率(IR),计算公式如下:IR(%)=(1-TRTV/CRTV)×100%,其中,TRTV为治疗组RTV,CRTV为阴性对照组RTV。

1.2.4 裸鼠移植瘤Bcl-2、Bax表达的检测

取部分肿瘤组织制成1×106/ml的单细胞悬液,加入鼠抗人单克隆抗体工作液0.1 ml,室温孵育30 min;加入PBS 10 ml轻洗1次,300~500 g离心5 min;弃上清,加入羊抗鼠FITC-Ig G二抗工作液100μl,避光室温孵育30 min;加入PBS 10 ml轻洗1次,300~500 g离心5 min;弃上清以除去未结合的荧光二抗,加入PBS0.1 ml,经500目铜网过滤后上机检测,应用Expo32ADC进行免疫荧光数据分析。以上机测试的X-mode计算出均道值(蛋白表达量)。公式:均道值=Lg X-mode×340。

1.3 统计学分析

应用SPSS 15.0软件进行统计学分析,计量资料数据以均数±标准差表示,两组间比较采用t检验。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 氧化苦参碱对裸鼠移植瘤生长的抑制

见表1。由表1可知,氧化苦参碱能有效抑制肿瘤的生长,且呈一定的量效关系,以中、大剂量组抑瘤作用明显,与阴性对照组比较,差异有高度统计学意义(P<0.01)。

2.2 裸鼠移植瘤细胞Bcl-2、Bax的检测

流式细胞仪定量分析发现,氧化苦参碱组裸鼠移植瘤Bcl-2的表达均降低,其中以中剂量组Bcl-2的表达最低,而大剂量组移植瘤细胞Bcl-2的表达又稍升高,与阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。与此相反,移植瘤细胞Bax的表达则升高,且氧化苦参碱中剂量组升高最为明显,高于此剂量的氧化苦参碱并不能更有效地升高Bax的表达。见表2。

3 讨论

本研究结果显示,氧化苦参碱对人胃癌细胞MGC-803裸鼠移植瘤的生长具有良好的抑制作用,且随剂量的增加而增加。氧化苦参碱小、中、大剂量组的平均抑瘤率分别为10.25%、36.50%和43.20%。朱艳琴等[2]的研究表明,苦参素对人胃癌细胞MGC-803具有显著的抑制作用,且具有浓度和时间依赖性,其机制主要与抑制增殖、促进凋亡和直接杀伤三个方面有关。孙宁等[3]从形态学角度阐明氧化苦参碱对人胃癌细胞MGC-803裸鼠皮下移植瘤生长具有抑制作用。本实验旨在研究氧化苦参碱诱导人胃癌细胞MGC-803凋亡的分子机制。

注:与阴性对照组比较,*P<0.05,**P<0.01

注:Bcl-2、Bax指标为均道值,无单位;与阴性对照组比较,*P<0.05,**P<0.01

在凋亡进程中起调节作用的调控分子中,Bcl-2家族起着决定性作用。Bcl-2和Bax是两类典型的抑凋亡和促凋亡蛋白。Bcl-2定位于线粒体外膜、内质网膜和核周膜;Bax正常情况下位于胞质,在凋亡信号诱导后很快迁移到线粒体,呈现高分散的亚细胞定位。Bax和Bcl-2通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡。当Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡;当Bax与Bcl-2形成异源二聚体时则实现了Bcl-2抑制细胞凋亡的功能[4]。Bcl-2与Bax蛋白的比率决定异源二聚体(Bcl-2/Bax)与同源二聚体(Bax/Bax)的比值,这对决定细胞凋亡的易感性起关键作用。一般而言,Bcl-2的过度表达与Bax形成异源二聚体而阻抑凋亡[5]。

本研究中,经流式细胞仪定量检测,氧化苦参碱3个剂量组裸鼠移植瘤细胞Bcl-2的表达均下降,其中,中、大剂量氧化苦参碱组裸鼠移植瘤Bcl-2的表达与阴性对照组相比,差异有统计学意义;与此相反,裸鼠移植瘤Bax的表达则明显升高,与阴性对照组相比,差异有高度统计学意义,但并无剂量相关性,以氧化苦参碱中剂量组效果最好。

综上所述,氧化苦参碱对人胃癌细胞MGC-803裸鼠移植瘤有一定的抑制作用,且其抑制作用可能是通过下调瘤细胞Bcl-2的表达和上调瘤细胞Bax的表达,从而促进人胃癌细胞MGC-803凋亡实现的。但毕竟接种于裸鼠皮下为异位移植,已脱离了其起源组织器官的微环境。Yamashita[6]证实皮下移植瘤和胃壁原位种植移植瘤对药物的敏感性不同,皮下肿瘤的疗效不等于原位种植的疗效,如要确定氧化苦参碱的体内抗肿瘤作用,需要在胃癌的原位种植移植瘤模型中及在动物胃腺癌模型中进一步研究。

参考文献

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[3]孙宁,徐玉芳,刘粉霞.氧化苦参碱对人胃癌MGC-803细胞裸鼠皮下移植瘤形态学影响的作用[J].中医学报,2010,25(6):1041-1043.

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凋亡诱导因子研究 篇9

1犬细小病毒的分类

1978年, 由加拿大Thomson和澳大利亚Atwell等学者首次从患盲肠炎的病犬粪便中分离到犬细小病毒, 为了将其与1967年由Binn等从健康犬粪便中分离到的犬极细小病毒 (Minute virus of canine, MVC, 即CPV-1) 相区分, 将后发现的犬细小病毒命名为2型犬细小病毒, 即CPV-2[2,4]。自发现CPV-2至今, 人们已经发现了多种变异基因型, 主要有CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、CPV-2c (a) 、CPV-2c (b) 等, 抗原基因型变异主要源于犬细小病毒粒子表层抗原位点上的决定性关键氨基酸发生变异。目前, 新抗原基因型已经取代原病毒基因型, 广泛流行于世界各地, 如多数欧洲国家以CPV-2a流行为主;美国和南美等国家以CPV-2b为流行主;意大利等国家则以CPV-2c流行为主[4]。1982年, 梁世哲等[5]首次在中国发现类似于感染CPV-2的患病犬。次年, 徐汉坤等[6]正式报到了CPV-2在中国的存在。目前, 在我国已分离得到多株CPV, 遗传进化分析表明, CPV-2a、CPV-2b、C P V-2 c在我国均有流行, 但以C P V-2 a、CPV-2b流行为主[2,4]。本课题组于2014年从延边地区疑似CPV-2感染犬病料中分离到一株CPV (YBYJ株) , 后经测序分析证实为CPV-2a型, 为CPV强毒株, 这是延边地区首次报告有关CPV-2a的分离和基因分型[2], 也进一步验证了我国主要以CPV-2a、CPV-2b流行为主。

2犬细小病毒的生物学特征

CPV-2是细小病毒科, 细小病毒亚科, 细小病毒属成员, 具有细小病毒属的典型结构和形态, 病毒颗粒直径约为26 nm, 无囊膜, 为等轴对称二十面体[4]。CPV-2属自主复制型细小病毒, 基因组为单股、线形、负链DNA, 基因组含有大约5 323个核苷酸, 共含有两个开放阅读框 (Open Reading Frame, ORF) , 3`端ORF即由668个氨基酸组成的非结构蛋白, 即早期转录的非结构蛋白 (NS1和NS2) , 5`端ORF即为由722个氨基酸组成的结构蛋白, 即晚期转录的病毒衣壳蛋白 (VP1和VP2) , 两个ORF各自有自己的启动子, 非结构蛋白和结构蛋白的m RNA终止于共同的Poly (A) 末端, 通过m RNA的选择性剪接形成不同的模板。在基因组中, 结构蛋白VP1和VP2有重叠区, VP1比VP2多143个氨基酸, 病毒核衣壳的90%以上由VP2蛋白构成, 成为病毒主要保护性抗原蛋白, 同时具有决定病毒组织嗜性和识别宿主细胞受体的功能, VP1构成病毒核衣壳成分的10%左右[4]。CPV-2的两个非结构蛋白中, 有关NS2的报导较少, 功能尚不清楚, 关于NS1的研究较多, 前期研究发现NS1蛋白具有解旋酶活性和内切酶活性, 能够影响宿主细胞DNA复制, 只有其与病毒DNA结合后病毒DNA才会进行复制, 已证明CPV-2促使宿主细胞凋亡与NS1非结构蛋白有关, 并且其它细小病毒的NS1蛋白也被发现具有同样的特性。

3犬细小病毒可诱导细胞凋亡

自CPV-2被发现以来, 由于该病毒对犬的高感染率和高致死率, 国内外学者对犬细小病毒病的病原生物学、流行病学、诊断和防治等方面做了大量研究[7,8], 但对CPV-2的发病机制研究甚少, 尤其是关于CPV-2如何诱导宿主细胞凋亡的研究还不够深入。在国外, Bauder等研究发现体内CPV-2感染可诱导肠粘膜上皮细胞的凋亡和坏死, 进而引起继发感染和病毒血症。Nykky等研究发现在体外CPV-2感染犬纤维瘤细胞A72和猫肾细胞NLFK可以引起细胞凋亡。国内学者潘红丽等研究发现, 在体外CPV-2感染猫肾细胞F81也可引起细胞凋亡。至于细小病毒如何诱导细胞凋亡, 这一作用与病毒的哪一种编码蛋白有关呢?后继的研究发现, 相关细小病毒感染细胞以后会引起宿主细胞的凋亡和坏死, 主要与非结构蛋白NS1有关。如Hristov等研究发现鼠细小病毒H-1 (Rat parvovirus H-1, H-1PV) 的NS1蛋白能够使细胞周期停滞在G2期, 从而诱导细胞凋亡;Moffatt等研究显示人细小病毒B19 (Human parvovirus B19, B19) 的NS1蛋白通过激活caspase-3诱导红细胞系K562和UT7/EPO细胞凋亡。Best等研究发现, 阿留申水貂病毒 (Aleutian mink disease virus, AMDV) NS1蛋白在克兰德尔猫肾细胞中表达后可介导caspase依赖的细胞凋亡。Mincberg等研究发现鼠细小病毒 (Minute virus of mice, MVM) 感染后, N S 1蛋白表达量明显提升, 且MVM感染和细胞转染表达NS1蛋白都可引起细胞凋亡, 部分凋亡细胞的细胞核发生形态学改变, 提示NS1是MVM促使细胞凋亡的主要原因。

4犬细小病毒诱导细胞凋亡的机制研究

目前, 关于CPV-2诱导细胞凋亡的分子机制不够深入。Nykky等[9]研究发现CPV-2感染猫肾细胞后与线粒体共定位, CPV-2感染期间线粒体受到损伤, 随着被感染线粒体的膜发生去极化, 在早期感染过程中细胞内ROS水平升高, 但细胞质内钙浓度不变, 细胞外调节蛋白激酶ERK1/2被激活, 提示CPV-2主要通过内源性通路来诱导细胞凋亡。而Saxena等研究证明CPV-2的NS1蛋白可在Hela细胞中诱导细胞凋亡, 并且依赖于p53。因此, 虽然已证实CPV-2可以诱导细胞凋亡, 且NS1非结构蛋白直接导致了细胞的凋亡, 但CPV-2通过NS1蛋白具体以什么信号通路导致细胞凋亡还存在争议, 这就需要以常见的三条细胞凋亡信号通路 (即外源性通路、内源性通路和内质网通路) 为依据, 经系统研究阐明NS1在CPV-2诱导细胞凋亡中的作用和分子机制, 进一步明晰CPV-2的致病机理, 为预防和治疗CP提供理论依据。

5小结与展望

细胞凋亡主要经由三条不同但又相互关联的信号通路诱导发生, 分别是外源性通路、内源性通路和内质网通路, 半胱天冬蛋白酶 (caspase) 是三者有共同的凋亡效应物, 其以非激活的形式存在于多种类型的细胞中。虽然细胞凋亡的通路仅包括三条通路, 但没有研究人员从三条凋亡通路对CPV-2诱导细胞凋亡进行系统研究, CPV-2诱导宿主细胞凋亡的分子机制仍不清楚, 并且国内未见关于CPV-2诱导犬本身宿主细胞凋亡的研究。本课题组前期研究发现, 以分离到的Y B Y J株C P V-2为病原体, 克隆到NS1基因[10] (Gen Bank:KM014813) , 在成功构建真核表达载体pc DNA-NS1的基础上, 将CPV-2感染和pc DNA-NS1转染犬肾细胞 (MadinDaby canine kidney cells, MDCK) , 经DNA Ladder法检测和Annexin V-FITC/PI双染法检测, YBYJ株CPV-2和NS1非结构蛋白均能诱导MDCK宿主细胞凋亡。这一研究结果为进一步阐明NS1非结构蛋白在CPV-2诱导MDCK宿主细胞凋亡中的分子机制奠定了基础。因此, 很有必要以三条细胞凋亡信号通路为依据, 经Western blot检测、ELISA检测、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测、荧光素酶活性检测、RNAi干扰检测和Real-time PCR检测等方法, 确定上下游信号蛋白的名称和作用顺序, 最终阐明CPV-2非结构蛋白NS1诱导MDCK宿主细胞的凋亡作用和分子机制, 为研究CPV-2的致病机理提供理论依据。

参考文献

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凋亡诱导因子研究 篇10

1 材料与方法

1.1 材料

食管癌EC9706细胞株由中国医学科学院肿瘤研究所肿瘤学国家重点实验室惠赠，河南省肿瘤病理重点实验室冻存。细胞复苏后用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养液培养。PN购自Alexis公司，纯度99%，用二甲基亚砜(DMSO)溶解配成0.1M的储存液，-20℃冰箱避光保存，实验前用RP-MI1640培养液稀释成工作浓度。MTT购自Sigma公司，用磷酸盐缓冲液(PBS)配成5 mg/m L过滤除菌置4℃冰箱储存。鼠抗人NF-κB p65单克隆抗体浓缩液，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PN处理后细胞生长曲线的测定

将细胞浓度调整为6×104/m L，每孔100μL细胞悬液接种到96孔板中，待细胞贴壁后换用含终浓度为20、40和80μmol/LPN的培养液，1‰DMSO为溶剂对照组，并设空白对照组和凋零组。将96孔培养板置37℃，5%二氧化碳孵育箱再培养，于24、48和72 h取出一块培养板，每孔加入5 mg/m L MTT试剂20μL，继续培养4 h，吸除上清液，每孔加DMSO 150μL，放于水平摇床上震荡15 min，用酶标仪(波长为492 nm，参考波长为630 nm)测每孔OD值。根据OD值计算肿瘤细胞的抑制率，公式为抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值。以作用时间为横坐标，抑制率为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.2.2 PN处理后细胞内NF-κBp65蛋白表达的测定

NF-κBp65(用PBS稀释为1∶100的工作浓度)用SP法检测，细胞爬片用PBS洗3遍，每遍5min,0.3%屈立通在冰上细胞通透30 min，余方法步骤按照SP 9000试剂盒说明书操作。用PBS液代替一抗作为阴性对照。乳腺癌组织为阳性对照。根据染色程度和染色细胞百分比进行评分。

1.2.3 流式细胞术检测PN对EC9706细胞凋亡的影响

收集对数生长期的细胞，分别用20μmol/L和40μmol/L的PN处理细胞72 h，收集各组细胞，调整细胞浓度为1×106个/m L，各取1 m L,1 000r/min离心5 min，吸弃上清，PBS离心洗涤2次后，弃上清备用。并设空白对照组。PBS洗涤样品细胞后，以稀释的结合缓冲液重悬细胞(用蒸馏水1:4稀释结合缓冲液)，并调整细胞浓度为(2～5)×105/m L，取195μL细胞悬液，加入5μL Annexin-V-FITC混匀，室温反应10 min,PBS洗涤1次，再以190μL稀释的结合缓冲液，加入10μL的120μL/m L PI，用流式细胞仪分析，每个样本收集20×103个细胞荧光信号，采用Cellquest软件分析结果。实验重复3次。

1.3 统计学处理

采用SPSS 10.0统计软件进行分析，实验结果用均数±标准差表示，MTT结果用重复测量资料的方差分析，免疫细胞化学结果和流式结果采用单因素方差分析，方差不齐将数据进行变量变换，否则用非参数检验。α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 MTT法检测P N对食管癌细胞EC9706增殖的抑制作用

20、40和80μmol/L的PN作用EC 9706 24、48和72 h后，细胞生长受到不同程度的抑制。不同浓度组间(F=394.175,P<0.05)，不同时间组间(F=110.599,P<0.05)，时间组和浓度组间(F=10.55,P<0.05)抑制率均差异有显著性。(见表1，图1)。同一时间段不同浓度PN两两比较，24 h 80μmol/L的PN与对照组差异有显著性(P<0.05);48 h 40μmol/L,80μmol/L的PN与对照组差异有显著性(P<0.05),20μmol/L组与80μmol/L组差异有显著性(P<0.05);72 h PN各浓度组两两比较均差异有显著性(P<0.05);各时间段DMSO组与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。同一浓度不同时间段的两两比较，40μmol/L组24 h和72 h抑制率的比较差异有显著性(P<0.05);80μmol/L组24 h、48 h与72 h差异有显著性(P<0.05)，余各组比较无显著性差异。

2.2 P N对食管癌细胞EC9706中NF-κBp65蛋白表达的影响

NF-κBp65蛋白在EC9706的细胞质中阳性表达。不同浓度(20μmol/L,40μmol/L)的PN作用EC9706 48 h后，NF-κBp65蛋白的表达与对照组比较降低，差异有统计学意义(P<0.05);浓度组两两比较，差异有统计学意义(P<0.05)。(见表2，图2，图3)。

注：覮表示NF-κBp65蛋白相比较差异有显著性(P<0.05)

2.4 P N对食管癌EC9706细胞凋亡的影响

用流式细胞术检测PN(20μmol/L,40μmol/L)作用EC9706 72 h后细胞凋亡的变化。结果显示：随着PN浓度的增加，细胞早期凋亡率和晚期凋亡率逐渐升高，PN20μmol/L和PN40μmol/L组与对照组比较，早期凋亡率和晚期凋亡率的差异均有显著性(P<0.05);浓度组两两比较差异有显著性(P<0.05)。(见表3，图4)。

注：1)表示早期凋亡率两两比较差异有显著性(P<0.05)2)表示晚期凋亡率两两比较差异有显著性(P<0.05)

3 讨论

PN在民间常用于治疗偏头痛、牙痛、胃痛、发热和风湿性关节炎。现在的研究表明，PN具有抗肿瘤活性。HARIKRISHNA NAKSHATRI等[6]在乳腺癌中的研究表明，PN抑制多种乳腺癌细胞株的增殖，逆转乳腺癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导凋亡的抵抗。MONICA L GUZMAN等[7]用溶解度和生物利用度强于PN的类似物DMAPT进行实验发现，DMAPT诱导髓性和淋巴性干细胞发生快速死亡。分子水平研究显示DMAPT诱导凋亡的机制在于诱导氧化应激反应、抑制NF-κB及激活P53。本实验结果显示，20μM的PN对食管癌EC9706细胞的增殖有抑制作用，抑制作用呈时间和剂量依赖性。随着PN浓度的增加，作用时间的延长，抑制作用更明显。PN对EC9706细胞的凋亡有显著影响，PN处理的EC9706细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均明显增加，PN可以诱导EC9706细胞凋亡。

NF-κB传导通路与肿瘤的发生、发展、浸润和转移密切相关。因此，抑制肿瘤细胞中NF-κB的活性是抗肿瘤治疗的主要策略之一。研究表明，PN通过抑制IκB激酶复合物(IKC)，使NF-κB滞留在细胞质中，不能转位进细胞核与相应基因结合。PN还可以直接阻断NF-κB与DNA的结合[8]。本实验结果显示，PN处理后的EC9706细胞NF-κB p65蛋白表达降低，说明PN对NF-κB有抑制作用。抑制NF-κB的表达，NF-κB不能活化下游抗凋亡基因如凋亡蛋白抑制子(IAPs)、肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)，和细胞周期相关基因如cyclin D1,c-myc，从而抑制肿瘤细胞的增殖，使肿瘤细胞易于经历凋亡或对细胞因子和抗肿瘤药物诱导的细胞死亡敏感[9,10]。另有研究证实，PN可以增加肿瘤细胞内反应氧化物和钙水平，消耗谷胱甘肽和蛋白硫醇[11,12]，对STATs有抑制作用，这可能也是PN抗肿瘤的机制之一。

综上所述，PN可以抑制食管癌细胞的增殖，诱导凋亡，其作用机制可能与抑制NF-κB传导通路有关。PN以NF-κB为作用靶点抑制肿瘤增殖，诱导肿瘤凋亡，有望成为未来抗肿瘤治疗新的候选药物。

参考文献

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