分化诱导因子（精选四篇）
分化诱导因子 篇1
关键词：胰岛干细胞,糖尿病,诱导分化,分离培养
近年来, 糖尿病发病率呈上升趋势, 而且更趋年轻化。据世界卫生组织 (world health organizatin, WHO) 预计, 截止到2025年, 世界范围内将有3.34亿人患糖尿病[1]。自加拿大EDMONTON胰岛移植方案在糖尿病的治疗上取得突破以来[2], 多个研究小组相继取得成果。RAMIYA等最先报道从分离的胰腺导管培养中获得了胰岛干细胞[3];ZULEWSKI等发现成年大鼠和人胰岛中均存在巢蛋白 (Nestin) 阳性细胞, 该细胞具有多向分化的潜能, 体外培养可分化为胰腺内分泌细胞、外分泌细胞和导管细胞以及肝细胞[4];HUNZIKER等将表达Nestin的胰腺导管上皮样细胞诱导其转分化为胰岛细胞, 从而证明了Nestin是胰岛干细胞的一个分子标记物[5]。现已证明, 存在于胰腺组织的干细胞主要分布于胰腺的导管及胰岛内, 并具有进一步分化为胰岛外分泌和内分泌细胞的可能。笔者从SD大鼠的胰腺中分离和纯化培养得到胰岛干细胞, 通过体外扩增和定向分化使其成为胰岛素分泌细胞并形成胰岛样结构。本研究为探索可靠的胰岛干细胞的分离方法并寻找胰岛干细胞诱导方案提供了实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
取6~8周龄成年SD大鼠, 体质量150~200 g, 雌雄不限, 由贵阳医学院医学动物实验中心提供;SD (Sprague Dawley) 远交群大鼠, 美国Sprague Dawley农场的RW DAWLEY用杂合的雄性大鼠和Wistar雌性大鼠杂交成的一个白化封闭群。
1.2 实验试剂
胶原酶V (Sigma, 美国) ;胎牛血清 (Hyclone, 美国) ;RPMI1640 (Hyclone, 美国) ;DMEM/F12 (Hyclone, 美国) ;维甲酸 (Merck, 美国) ;Percoll液 (Pharmacia) ;胰蛋白酶/EDTA消化液 (Hyclone, 美国) ;D-Hank's液 (Hyclone, 美国) ;活化素A (Peprotech, 美国) ;巢蛋白抗体Nestin (武汉博士德生物工程有限公司) ;胰岛素抗体 (武汉博士德生物工程有限公司) ;胰高血糖素抗体 (武汉博士德生物工程有限公司) ;SABC兔-FITC试剂盒 (武汉博士德生物工程有限公司) 等。
1.3 实验设备
超净工作台 (苏州美创净化设备有限公司) ;离心机 (LG16-A型, 北京雷勃尔离心机有限公司) ;CO2恒温培养箱 (MCO-175型, SANYO, 日本) ;倒置显微镜 (TS100型, Nikon, 日本) ;荧光显微镜 (E801型, Nikon, 日本) ;精密电子天平 (JA1003型, 上海舜宇恒平科学仪器有限公司) ;高压蒸汽灭菌机﹑水浴箱 (上海) 等, 以上仪器设备由贵阳医学院组织工程与干细胞中心提供。手术器械 (眼科剪、0号线、注射器、持针器等, 北京医疗器械公司) ;6、24孔培养板 (Corning, 美国) ;15 m L离心管 (Corning, 美国) ;25m L培养瓶 (Corning, 美国) ;150目金属滤网 (上海苏豪智能系统有限公司) 。
1.3 方法与步骤
1.3.1 大鼠胰岛干细胞的分离和培养
将SD大鼠随机分为实验组 (A组) 和对照组 (B组) , 每组8只。实验组乙醚麻醉后用5%盐酸氯胺酮按100 mg/kg自腹腔内注射, 麻醉成功后将大鼠固定于超净工作台上, 75%酒精消毒腹部皮肤, 用纱布剪成洞巾覆于大鼠腹部;线剪“V”型剪开大鼠腹部皮肤打开腹腔, 暴露胰腺, 正常胰腺组织呈灰粉色, 色泽较暗, 分叶多, 包绕胆总管。用70针带线于胆总管肝门处及入十二指肠处分别结扎, 并于待穿刺部位预留丝线, 用预先制好的“L”型注射器自胆总管注入预冷的胶原酶V (0.5 mg/m L) , 待胰腺充分膨胀后于胆管近端结扎预先留置的丝线, 将胰腺完整摘除放入青霉素小瓶, 尽可能清除干净脂肪组织, D-Hank's液漂洗2遍后加2倍体积的胰蛋白酶/EDTA消化液, 放入37℃水浴箱中。15 min后取出弃上层2/3的液体, 再加入预热的37℃胰蛋白酶/EDTA消化酶, 用前调整p H值至8.0, 吸管于酒精灯5 cm范围内反复吹打, 不少于20次;静置3 min, 离心机500 r/min离心3 min取混悬细胞液, 将余下的组织同法加入消化酶吹打离心2次, 将所得的细胞液1 000 r/min离心5 min, 将所得细胞加入预先配好的不同密度的Percoll液中1 500r/min进行离心, 分别收集1.096/1.068界面、1.096/1.118 g/L界面细胞, 将获得的细胞加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液于25 m L培养瓶中培养, 10%FBS预先调整p H值至7.4~7.6之间。对照组引颈脱臼法处死大鼠, 用75%酒精浸泡2 min后固定于超净工作台上;剖腹摘取胰腺, 同样清除干净脂肪组织, D-Hank's液漂洗2遍后剪成1 mm3大小, 余下的操作同上述, 将上述2种分离方法取得的细胞分别加入10%FBS培养液中培养24~48 h, 24~48 h后通过倒置显微镜观察细胞的生长状态[6]。
1.3.2 Nestin阳性细胞的鉴定
先倾倒培养瓶中的培养液弃去死亡细胞, 迅速加入1、2滴消化酶, 消化酶同样是预热的37℃胰蛋白酶/EDTA消化液, 将p H值调至8.0, 轻轻晃动培养瓶将贴壁细胞洗脱, 将分离出来的细胞吹打均匀形成单细胞悬液, 以40 g/L的多聚甲醛在37℃下固定20 min, 室温下经体积分数为0.03的过氧化氢孵育30 min除去内源性非特异染色。将细胞与1︰100稀释的羊抗小鼠Nestin抗体37℃孵育60 min, p H为7.6的磷酸盐缓冲液洗涤5 min, 然后加入即用型抗羊兔广谱型二抗, 再37℃孵育30 min, p H为7.6的磷酸盐缓冲液洗涤5min后用过氧化物反应底物DAB作用5 min, 显微镜下观察胰岛干细胞特异性标记物Nestin的表达, 阳性表达的细胞质染色呈棕黄色;阴性对照以磷酸盐缓冲夜代替一抗。两组细胞分别用移液器取液进行免疫组织化学染色。
1.3.3 绘制细胞生长曲线
将实验组贴壁细胞培养传代, 每24~48 h换液 (10%FBS) , 取第3代贴壁细胞, 先倾倒培养瓶中培养液, 迅速加入1、2滴消化酶, 消化酶同样是预热的37℃胰蛋白酶/EDTA消化液, 将p H值调至8.0, 轻轻晃动培养瓶洗脱贴壁细胞, 将分离出来的细胞吹打均匀形成单细胞悬液。按每个方瓶接种102个细胞, 选用无血清的DMEM/F12培养液作为基础培养液, 每个方瓶中加入3 m L培养液。传代过程中分别加入诱导因子, 维甲酸 (1×10-6mol/L) 及活化素A (50 ng/m L) 作为a组, 高糖 (16.7mol/L) 诱导组作为b组, 不加诱导因子作为c组, 每组分别取3瓶细胞, 结果取平均值, 记录细胞的生长状态, 绘制细胞生长曲线[7]。
1.3.4 胰岛细胞的双流棕 (DTZ) 染色
双硫腙 (DTZ) 为螯合剂, 可与铅、铜、锌等螯合, 人和动物 (豚鼠除外) 的胰岛β细胞因含有锌, 双硫棕染色呈猩红色, 其他胰岛细胞不着色。配制及染色方法:用二甲基亚砜 (DMSO) 配制:DTZ 10 mg溶于10 m L DMSO, 用Hanks (p H 7.8) 1︰100稀释, 过滤器滤过, DTZ与胰岛干细胞培养后转分化形成的克隆混合, 室温5~10 min后做镜检。
1.3.5 胰岛素、胰高血糖素的免疫荧光染色
手工筛选干细胞诱导分化形成的胰岛, 冷冻包埋, 制备冷冻切片。切片用乙醇溶液固定1 min, PBS液洗3次, 用0.1 BSA/PBS室温下封闭30 min, 然后分别加入1︰100稀释的抗胰岛素抗体和1︰100稀释的抗胰高糖素抗体室温孵育45 min。PBS洗3次后, 加入1︰100稀释的荧光标记的二抗, 室温下孵育30 min。封片后在荧光显微镜下观察结果。
1.4 统计学方法
采用SPSS 11.5统计软件进行数据分析, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 组间比较用t检验, 多个样本均数两两比较用q检验, α=0.05。
2 结果
2.1 大鼠胰岛干细胞的分离和培养
2.1.1 活细胞比率
“1.3.1”中实验组和对照组每个样本取3个视野, 取平均值, 活细胞贴壁形态不规则, 死细胞呈球形, 悬浮于培养液中。通过输入数据绘制出条形图 (见图1) , 可以看出, 实验组活细胞比率高于对照组, 差异具有统计学意义 (t=12.5514, P<0.01) , 具体数据见表1。通过两种分离方法取得的胰岛干细胞分别加入10%FBS培养液中培养24~48 h, 24~48 h后通过倒置显微镜观察细胞的生长状态, 见图2~5。
2.1.2 Nestin阳性细胞比率
将分离出的胰岛干细胞进行贴壁培养, 与1∶100稀释的羊抗小鼠Nestin抗体37℃孵育60 min, p H为7.6的磷酸盐缓冲液洗涤5 min, 然后加入即用型抗羊兔广谱型二抗, 再37℃孵育30 min, p H为7.6的磷酸盐缓冲液洗涤5min后用过氧化物反应底物DAB作用5 min, 显微镜下观察胰岛干细胞特异性标记物Nestin的表达, 阳性表达的细胞质染色呈棕黄色 (见图6) ;分别记录实验组和对照组Nestin阳性细胞比率, 重复取样3次, 取平均值, 绘制出条形图 (见图7) , 从图7中可以看出, 实验组的Nestin阳性细胞率明显高于对照组, 差异具有统计学意义 (t=10.8512, P<0.01) , 见表2。
%
2.1.3 细胞生长曲线
将3组施加不同处理因素的细胞连续记录7 d, 绘制出折线图 (见图8) , 从图8可以看出, a组细胞的生长状态明显优于b、c组。
2.1.4 类胰岛细胞团形成时间
取实验组贴壁细胞, 分成3组, 每组5例, 上文“1.3.3”中3种不同处理因素下每两天换液1次, 观察细胞的生长形态, 贴壁细胞不断扩增, 鹅卵石状细胞片迅速扩大, 最终形成类胰岛样细胞团。类胰岛细胞团按上文"2.5"中方法进行免疫荧光染色, 镜下表现见图9。待细胞聚集成团, 双流棕 (DTZ) 染色成黄色, 证实为胰岛细胞后, 计算形成时间, 绘制出条形图 (见图10) , 从图4可以直观地看出, a组类胰岛细胞团的形成时间明显短于b、c组, 见表3。
注:†与b、c组比较, P<0.05
(离体机械消化法×100)
(离体机械消化法×100)
(原位灌注消化法×100)
(原位灌注消化法×100)
3 讨论
3.1 大鼠胰岛干细胞的分离及纯化
提高胰岛干细胞分离纯化后的收获量和质量一直是胰岛干细胞基础研究的重要课题, 也是进一步更好地研究胰岛干细胞及以后的细胞移植治疗成功的关键因素。在细胞的分离过程中, 很多因素都会对实验的结果产生影响。胰腺干细胞的分离方法主要有大鼠脱臼法处死离体机械消化法和麻醉状态下原位灌注消化法, 通过实验观察发现原位灌注的方法在细胞的分离过程中消化彻底, 细胞破坏小, 目的细胞收获量高, 但对临床实践技能要求较高, 操作费时。要注意以下几点:第一, 麻醉的深度要适宜, 不能过浅以免大鼠在实验的过程中活动而影响实验的进行;第二, 结扎胆道两端时要紧靠肝门和近十二指肠处, 以免一些分支胆管被漏扎, 穿刺时靠近肝门, 尽量靠近结扎线且穿刺时动作要轻柔, 从一端开始缓慢用力推注消化酶;第三, 注射器针头事先摩成钝圆形并弯曲成“L”型, 操作起来容易成功且不易损伤胆管;第四, 消化酶灌注成功后立即将预留的丝线结扎, 快速摘取胰腺, 减少对非胰腺组织的摘取;第五, 胰蛋白酶的p H值调至8.0, 在37℃水浴箱中静置15~20 min, 时间不可过长, 否则消化过度, 过短则不能将细胞洗脱下来;第六, 超净工作台内酒精灯要点燃, 实验操作力求在灯焰5 cm范围内进行, 超净台内风速不宜过大, 会形成台内空气对流增加细胞污染的机会;第七, 实验的所有操作要求快、准、稳, 时间过长增加污染的机会。
在胰腺细胞分离的过程中, 麻醉状态下原位消化酶灌注, 操作过程虽然复杂, 但只要明确胰腺的解剖形态并配备一名助手也能迅速完成。胆总管灌注消化酶对组织机械破坏小, 不仅起到机械扩张的作用, 膨胀的胰腺组织还易与腹腔脂肪组织明显区别, 同时还可起到对胰腺的初步消化作用, 消化时间短, 消化彻底, 通过密度梯度离心后于10%FBS培养液贴壁培养, 胰腺导管细胞在Percoll纯化后主要存在于1.096/1.068界面, 而胰岛细胞主要存在于1.096/1.118 g/L界面[7,8]。倒置显微镜下观察记录数据, 显著提高了获取细胞的存活率及Nestin阳性细胞率。机械消化法对组织的机械损伤大, 不可避免地损伤部分胰腺细胞, 消化时间长对细胞的破坏大, 让含量较少的胰岛干细胞更难获得。
消化的过程中, 采用多次短时快速消化, 时间易于掌握, 并且可以减轻消化酶对细胞的过度消化, 目的细胞的获取量更多。单次消化的缺点是时间不易掌握, 消化的过程不易控制, 极易造成消化过度, 大大减少细胞的活性[9]。
纯化的过程中, 笔者采用的是Percoll密度梯度离心, 1.096/1.068界面收集的细胞主要为胰腺导管细胞, 由于胰岛干细胞表面缺乏特性性标记物, 在实际纯化过程中, 目前缺乏有效的纯化方法, 很难获得纯度比较高的目的细胞, 在一定程度上影响对目的细胞的研究[10,11]。并且在纯化的过程中不可避免地造成对细胞的损伤[12]。这些都要求研究者在胰岛干细胞纯化的道路上探索更快捷、确切的方法。
3.2 胰岛干细胞的体外定向诱导分化
来源的干细胞经诱导后可表达胰腺内分泌细胞并能分泌胰岛素, 但对其分化机制尚未完全清楚, 目前还缺乏公认的诱导方案[13,14,15];且目前已知的诱导剂在使用剂量、浓度、作用时间上都需要进一步探讨和研究。维甲酸广泛用于神经细胞的体外诱导, 新近的研究表明其信号通路对早期内胚层的胰腺分化具有促进作用, 在体外可促进胰腺前体细胞的生成[7]。活化素是转化生长因子的超家族成员, 是近年来发现的一组重要因子, 具有广泛的生物学活性, 可诱导胰腺前体细胞Ngn3的基因表达, 从而形成胰腺前体细胞, 然后分化成熟为各种胰岛细胞[16]。本实验研究发现, 在胰腺细胞培养获得Nestin阳性细胞后, 通过在细胞的不同生长时期加入维甲酸及活化素A, 相当于在细胞的指数生长期后期加入因子观察到细胞汇集加速并很快形成类胰岛细胞团, 表达胰岛素和胰高血糖素。本实验表明, 维甲酸及活化素A在促进胰岛干细胞分化成熟方面具有明显的促进作用。然而, 维甲酸及活化素A的浓度, 有关诱导后的胰岛素分泌细胞的生长状态及分泌活性如何, 需要进一步的实验研究[17]。
分化诱导因子 篇2
神经生长因子对神经干细胞向少突胶质细胞分化的诱导作用研究
目的体外分离和培养大鼠海马神经前体细胞,在此基础上探索在体外环境下使神经干细胞定向分化为少突胶质细胞,为后续的神经干细胞移植提供实验基础.方法取孕10 d的Wistar大鼠胚胎脑的海马,分离神经前体细胞,将单克隆的神经干细胞球贴壁,并使用生长因子(NGF),分析不同浓度的NGF对神经干细胞分化的影响.在含NGF的NSC培养基中进行体外培养,以GalC免疫组化标记分化后的少突胶质细胞,对神经干细胞的.分化特性进行鉴定.结果NGF可促进神经前体细胞的增殖及神经球的克隆形成,并获得了Nestin阳性的神经前体细胞,其可分化为分别表达GaIC的阳性细胞.结论体外分离和培养的大鼠海马神经前体细胞,在NGF生长因子的作用下,神经干细胞可定向分化为少突胶质细胞,并与培养基中NGF的浓度有一定的关系,有望应用于脱髓鞘神经系统疾病的细胞移植治疗.
作 者：李宝园 杨德兵 丰玲 王雁春 郭敏芳 马存根 LI Bao-yuan YANG De-bing FENG ling WANG Yan-chun GUO Min-fang MA Cun-gen 作者单位：山西大同大学医学院,山西大同,037008 刊 名：山西大同大学学报(自然科学版) 英文刊名：JOURNAL OF SHANXI DATONG UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)：2009 25(2) 分类号：Q813.1+1 关键词：神经干细胞 少突胶质细胞 神经生长因子 细胞分化乳腺癌诱导分化治疗药物的研究进展 篇3
有关乳腺癌诱导分化治疗的研究也逐年增多, 乳腺癌诱导分化药物目前主要集中于以下几个方面:发现某些已有药物的诱导分化作用、合成新的诱导分化药物、在表观遗传学的层面上发现新的治疗靶点并研究诱导分化的机制、尝试将诱导分化药物与其他抗癌药物联用以达到增强药效减轻副作用的目的。
维甲酸类药物是经典的诱导分化药物, 包括全反式维甲酸 (all trans retinoic acid, ATRA) 、13-顺式维甲酸和9-顺式维甲酸, 最早被用于诱导分化的研究。此后科学家们逐渐发现了越来越多的诱导分化药物, 它们的作用机制也逐步明确。药物诱导分化的指标一般包括形态和功能的变化, 增殖能力和致瘤性的丧失等。下面对部分重要的诱导分化药物的研究现况逐一介绍。
1 全反式维甲酸
全反式维甲酸在诱导分化治疗中具有重要的地位, 其最早用于急性早幼粒细胞的治疗, 随后被用来作用于其他包括乳腺癌细胞在内的实体瘤细胞。全反式维甲酸在机体中的作用机制包括诱导分化、增殖抑制以及诱导凋亡。
1.1 全反式维甲酸的作用机制及靶点
对于全反式维甲酸作用途径及靶点的研究, 一直是药物研究的热点。全反式维甲酸进入到细胞核中并调节各种信号通路, 全反式维甲酸通过上调基质金属蛋白酶抑制剂1、上皮细胞钙黏蛋白 (E-cadherin) , 下调表皮生长因子受体 (epithelial growth factor receptor, EG-FR) 、核内转录因子、局部黏着斑激酶 (focal adhesion kinase, FAK) 以及a5b1、avb3整联蛋白受体来下调基质金属蛋白酶9 (matrix metalloproteinase, MMP) [2]。而MMP-9在细胞外基质的降解过程中起着至关重要的作用, 因为基底膜和细胞外基质中IV型胶原的降解可以促进肿瘤的进展, 其具体的途径包括侵袭、转移和血管生成[3]。
BP1基因位于乳腺癌细胞中常见的异常基因扩增区域, 有研究表明BP1的高表达与多种肿瘤的发生发展有关, Su等[5]研究证实全反式维甲酸可以抑制乳腺癌MCF-7以及MDA-MB-468细胞系中BP1基因的增殖和表达, 因而BP1基因可能成为全反式维甲酸治疗的一个靶点。Haselberger等[6]的研究发现icb-1基因可以作为全反式维甲酸和维生素D3诱导分化乳腺癌细胞的中介。Paroni等[7]研究乳腺癌细胞的一个亚型, 该亚型雌激素受体表达阴性且表皮生长因子受体的家族成员之一的ERBB2和视黄酸受体α基因 (retinoic acid receptor alpha, RARA) 共扩增, 同时针对相应的基因产物联合应用拉帕替尼和全反式维甲酸会导致协同生长抑制作用、细胞分化和凋亡。
Phipps等[8]利用全反式维甲酸作用于雌激素受体表达阴性的乳腺癌细胞系SK-BR-3, 研究证明其可以快速减少雌激素受体阴性乳腺癌细胞人端粒酶反转录酶 (human telomerase reverse transcriptase, h TERT) 启动子上H3-K9的乙酰化, 这可能是全反式维甲酸介导雌激素受体阴性乳腺癌抗肿瘤作用的机制。
1.2 全反式维甲酸对乳腺癌干细胞的作用
乳腺癌干细胞在复发乳腺癌中扮演着重要的角色, 近年来乳腺癌干细胞的研究越来越成为乳腺癌诱导分化研究中的一个不可忽视的部分。肿瘤干细胞是一种具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞, 由于它有特殊的细胞表面标记, 因而可以将其从普通肿瘤细胞中分离出来[9]。
研究表明全反式维甲酸对乳腺癌MCF-7细胞系有效[10], 而乳腺癌干细胞SK-BR-3细胞系对其更加敏感, 全反式维甲酸有助于提升乳腺癌干细胞的自我更新能力并促使其分化。随着对全反式维甲酸的研究的深入, 有学者尝试合成全反式维甲酸的衍生物或类似物以达到作用机制相同而作用效果更佳的目的。Wang等[11]合成全反式维甲酸的衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯并用其作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞系, 证实其通过p38-MAPK通路下调肌球蛋白轻链激酶 (myosin light chain kinase, MLCK) 以及肌球蛋白轻链 (myosin light chain, MLC) 氧化磷酸化作用蛋白的表达抑制肿瘤细胞增殖和侵袭, 而效果优于全反式维甲酸。而Li等[12]则构建了全反式维甲酸的隐性脂质体, 将其作用于MCF-7以及MDA-MB-231细胞系中的乳腺癌干细胞后, 发现和普通乳腺癌细胞相比乳腺癌干细胞对其更加敏感。而在将乳腺癌干细胞移植到NOD/SCID小鼠体内构建复发乳腺癌的模型中, 全反式维甲酸隐性脂质体联合长春瑞滨隐性脂质体获得了肯定的效果。
1.3 全反式维甲酸与其他药物联用
有学者将全反式维甲酸和其他抗肿瘤药物联用以增强其效用, 有研究表明[13]全反式维甲酸联合靶向药物曲妥珠单抗可以更大程度上抑制乳腺癌细胞增殖促进其凋亡。而将组蛋白去乙酰化酶抑制剂羟氯喹单独或联合应用全反式维甲酸作用于MCF-7细胞可以介导组蛋白的乙酰化, 并证明可以诱导细胞分化[14]。
2 砷剂
砷剂是一类化合物的总称, 目前被用作诱导分化治疗的主要包括三氧化二砷 (砒霜) 、三硫化二砷 (雌黄) 和四硫化四砷 (雄黄) 。由于砷剂的广泛用途, 人们对它的应用可以追溯到2400多年前, 而由于其毒性却导致了痛苦和死亡[15]。在中医中基于“以毒攻毒”的理论, 对三氧化二砷的应用超过500年, 而最初被用来治疗皮肤病、哮喘和促进外伤的愈合[16]。早在20世纪70年代, 哈尔滨医科大学的一个研究小组就开始尝试利用三氧化二砷来治疗某些癌症[17]。有研究证实[18], 砷剂通过改变细胞功能和调整细胞内的信号传导通路, 可以导致细胞凋亡、增殖抑制并诱导分化。
Baj等[19]用三氧化二砷作用于乳腺癌细胞的四个细胞系MCF-7、MDA-MB-231、T-47D和BT-20, 证明三氧化二砷可引起细胞不同程度的分化、凋亡以及溶解。由于单纯使用三氧化二砷活化了MCF-7的丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases, MAPKs) 信号通路而导致其作用下降, Ye等[20]的一项研究使用三氧化二砷联合丝裂原活化蛋白激酶抑制剂, 证明可以诱导MCF-7细胞凋亡。体内DNA的损伤可以通过尿液中8-OH-d G的水平来判断, 而通过8-OH-d G判断DNA损伤目前来说是得到公认的。一项研究表明[21], 三氧化二砷所带来的8-OH-d G水平的升高高于三硫化二砷和四硫化四砷。
此外有研究表明[22], 四硫化四砷对于经全反式维甲酸治疗或化疗后复发的病人有效, 因为小剂量的四硫化四砷的作用表现为诱导分化大于诱导凋亡, 所以诱导分化治疗可以作为其他现有疗法的补充。Zhang等[23]使用三氧化二砷使启动子受体脱甲基, 促使雌激素受体重新表达, 从而使雌激素受体阴性的乳腺癌细胞对他莫昔芬敏感, 为将诱导分化治疗与内分泌治疗联合作用做了有益的尝试。
3 组蛋白去乙酰化酶抑制剂
核小体是真核细胞生物染色质的基本单位, 八聚体的组蛋白位于其核心, 组蛋白的乙酰化和去乙酰化在基因表达上扮演着重要的角色。组蛋白的乙酰化是由和基因转录密切相关的组蛋白乙酰转移酶 (histone acetyltransferase, HAT) 所介导, 然而组蛋白的去乙酰化是由和基因沉默密切相关的组蛋白去乙酰化酶 (histone deacetylase, HDAC) 介导, 当二者之间的动态平衡被破坏, 就有可能导致肿瘤的发生。组蛋白去乙酰化酶基因表达的改变和变异与肿瘤的发生相关。因为它们介导控制细胞重要功能的关键基因的异常转录, 这些重要功能包括细胞增殖、细胞周期的控制以及细胞凋亡。因此, 组蛋白去乙酰化酶是癌症治疗最有希望的靶点之一, 这也鼓舞着研究者们进一步去研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂 (histone deacetylase inhibitors, HDACi) 。
经典的组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A可以将乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231和MCF-10A的细胞周期阻滞于G2-M期并促使其死亡, 原因可能是作为氧化磷酸化的毒副产物的线粒体活性氧自由基 (reactive oxygen species, ROS) 的产生损坏了线粒体的呼吸链[24]。丙戊酸 (VPA) 曾被用来作为抗癫痫用药, 近年来发现其也是HDACi的一种, 研究证明[25]无论雌激素受体阳性还是阴性的乳腺癌细胞均可被其诱导分化。
辛二酰苯胺异羟肟酸 (SAHA) 属于羟肟酸类的HDACi, 是第一个被美国FDA批准用于治疗皮肤性T细胞淋巴瘤的HDACi, 其介导乳腺癌细胞增殖抑制的部分原因或许在于通过下调S期细胞激酶相关蛋白2 (S-phase kinase-associated protein 2, Skp2) 和细胞周期依赖性蛋白激酶亚基1 (cyclin-dependent kinase subunit 1, cks1) 从而提高了P27和p21的稳定性[26]。而SAHA介导MDA-MB-231凋亡的原因在于凋亡过程中最重要的终末剪切酶caspase-3分裂之后p38 MAPK通路的激活[27]。Varga等[28]将SCFAs、SAHA、PMA几种组蛋白去乙酰化酶抑制剂 (HDACi) 作用于MCF-7细胞, 证明可以诱导乳腺癌细胞分化, 并发现Ca2+通道调节细胞质膜Ca2+AT-Pase4b (PMCA4b) 的表达, 这有可能使乳腺上皮细胞正常生长, 也可能使其发展为癌。
SAHA目前在美国已经进入Ⅰ期或Ⅱ期临床试验, 抗肿瘤作用效果肯定。SAHA通过上调组蛋白去乙酰化酶6 (HDAC6) 和热休克蛋白90 (Hsp90) 的表达从而使乳腺癌细胞对紫杉醇类和曲妥珠单抗敏感。研究者收集55例局部晚期乳腺癌患者, 联合应用SAHA、紫杉醇、曲妥珠单抗, 研究终点为病理学缓解, 并证明有较好的效果, 这也验证了体外实验所得到的数据[29]。此外有研究首次表明[30], P53的乙酰化是SAHA和阿霉素协同治疗的主要机制而非组蛋白的乙酰化, 此项研究尚需进一步探究其原因。
Salvador等[31]尝试将广谱组蛋白去乙酰化酶抑制剂abexinostat分别作用于16种乳腺癌细胞系 (breast cancer cell lines, BCL) , 发现出现了截然不同的两种现象:一部分乳腺癌细胞系对低剂量药物敏感而另外一部分乳腺癌细胞系对高剂量药物敏感。证明abexinostat对乳腺癌干细胞作用同样有效。原因在于低剂量诱导乳腺癌干细胞由间质细胞向上皮细胞分化, 高剂量主要表现为细胞毒性可把细胞阻滞于G2-M期并促使其凋亡。另外他们发现长链非编码RNA X染色体失活基因 (Xist) 可能是预测乳腺癌细胞系对组蛋白去乙酰化酶抑制剂反应的潜在标志物。
此外合成了一些新的作用更强的HDACi, Min等[32]合成了一种新的HDACi:IN2001, 其可以诱导细胞周期依赖激酶 (CDK) 抑制物的表达从而阻滞细胞周期, 还可以促进P21的表达。
4 其他天然化合物
近年来越来越多的天然化合物被发现、提取并证明其有抗肿瘤的作用, 其中以中药提取物居多数。姜黄为姜黄属植物, 根茎可以入药, 实验研究证明[33]姜黄素对人乳腺癌细胞系MCF-7具有明显的增殖抑制作用并呈时间剂量依赖性。目前认为bcl-2/bax比例是调控细胞凋亡的“分子开关”, bax升高促凋亡, bcl-2升高抑制凋亡。姜黄素可通过抑制Bcl-2表达, 促进bax表达, 诱导MCF-7细胞凋亡从而阻止细胞进程。中国蜂胶是一种蜜蜂酿造的保健食品, 其含有具有较强抗癌作用的白杨素, 研究证明[34]其对乳腺癌细胞以及移植瘤均有作用, 作为HDAC8的抑制剂可以抑制肿瘤生长。过氧化物酶体增殖激活物受体γ (PPARγ) 通路是近年来发现的乳腺癌治疗的新靶点, 通过诱导肿瘤细胞分化、抑制其增殖、促使细胞凋亡以及抑制肿瘤血管新生等途径调控肿瘤的形成和进展。大豆异黄酮是存在于大豆中的非营养物质, 其主要成分染料木黄酮和大豆苷元可以激活乳腺癌细胞系MCF-7中的PPARγ信号通路从而抑制其增殖[35]。槐耳是槐耳菌质中提取的一种新型真菌类抗肿瘤药, 可以灭活Hedgehog通路, 从而达到清除乳腺癌干细胞的作用[36]。而Hedgehog (Hh) 信号通路是生物进化史上最为保守的信号途径之一, 脊椎动物以及众多非脊椎动物发育过程中细胞的生长及分化受其控制。目前这些天然化合物的效果有待进一步明确, 具体抗癌机制尚未完全探明, 需要进行深入的探究。
5 乳腺癌诱导分化治疗展望
分化诱导因子 篇4
目的探讨人脐血CD34+细胞体外分离、纯化、诱导扩增和分化为内皮细胞的`可行性,并检测其表型.方法采集新鲜脐血经抗凝处理及无菌包装,Ficoll密度梯度离心法得单个核细胞,磁珠分选方法(MACS)分离出CD34+单个核细胞,M-199培养基中诱导分化,细胞形态学观察CD34+和CD34-细胞生长情况,流式细胞仪检测内皮细胞CD31表型,免疫组化验证蛋白水平表达.结果细胞形态学观察发现,刚分离的CD34+ 和CD34-单个核细胞呈圆形,形态小.CD34+细胞培养3 d后有明显集落形成,7 d后呈梭行细胞,出现典型线样排列结构.经诱导培养后,内皮细胞表型CD31阳性率为(70.03±10.27)%.免疫组化染色证实了内皮特异性成分ecNOS和flk-1/KDR蛋白水平的表达.而CD34-细胞单独培养,少部分细胞贴壁,呈现出不规则形态.结论 MACS法分离脐血CD34+细胞,体外诱导扩增和分化后贴壁细胞具有内皮细胞形态,通过流式细胞仪和免疫组化验证了贴壁细胞中大部分细胞具有内皮系标志物表达.
作 者：邵琴 王长谦 范华骅 何奔 刘 聂晓绚 姜萌 高跞 SHAO Qin WANG Chang-qian FAN Hua-hua HE Ben LIU Yan NIE Xiao-xuan JIANG Meng GAO Li 作者单位：邵琴,王长谦,何奔,姜萌,SHAO Qin,WANG Chang-qian,HE Ben,JIANG Meng(上海交通大学医学院仁济医院心内科,上海,01)
范华骅,刘,聂晓绚,高跞,FAN Hua-hua,LIU Yan,NIE Xiao-xuan,GAO Li(上海血液中心血液工程研究室)