玻璃化转变

玻璃化转变（精选五篇）

玻璃化转变 篇1

1 实验部分

1.1 仪器和试样

实验仪器:功率补偿型示差扫描量热仪, 型号PE-DSC7, 美国Perkin Elmer公司;电子天平, 型号Sartorius-BT25S, 德国赛多利斯, 精度0.01mg。

实验样品:蓝宝石, 比热标准样品, 德国耐池公司提供;三氧化二铝 (α-Al2O3) 粉末, 摩尔质量101.9612g/mol, 岛津DTA随机参比物;复铜板样品1#～4#, 广东生益科技提供。

1.2 仪器校正和测试条件

仪器校正:用铟和锌对仪器的温度和热流进行校正;用蓝宝石对仪器的比热容进行校正。

比热容测试条件:氮气流速20mL/min;温度范围:100℃～200℃;线性升温速率10℃/min, 起始温度恒温3min, 终止温度恒温 2min。铝坩埚重量30mg左右, 精确到0.01mg, 每对坩埚的重量误差小于±0.03mg, 试样重量25～30mg, 精确到0.01mg。比热容精确到小数点后4位, 相对误差精确到小数点后2位。

2 结果与讨论

2.1 DSC测量比热容的可重现性

表1是蓝宝石在100℃～200℃的温度范围, 分别测量三次的比热测量值 (C${}_{\text{p}}^{\text{m}\text{s}}$) , 以及同一温度下, 三次测量值的最大值与最小值的偏差 (ΔC${}_{\text{p}}^{\text{m}\text{s}}$) , 可见ΔC${}_{\text{p}}^{\text{m}\text{s}}$大都在0.002～0.006 J/g·k之间, 最大偏差值为0.0065J/g·k, 说明用DSC测量比热容, 离散性小、一致性好, 可重现。

2.2 用蓝宝石校正DSC仪器的系统误差

图1是蓝宝石比热的文献值 (C${}_{\text{p}}^{\text{s}\text{t}\text{d}}$) 和测量值 (C${}_{\text{p}}^{\text{m}\text{s}}$) 与温度的关系图[8], 可见蓝宝石比热的三次测量值都比文献值大[8], 存在测试的系统偏差。

对系统误差进行校正, 得到校正系数K (T) 公式 (1) :

k (T) =-6×10-7T2+6×10-5T+0.9922 (1)

比热容的校正值 (C${}_{\text{p}}^{\text{m}\text{d}}$) 通过公式 (2) 得到:

C${}_{\text{p}}^{\text{m}\text{d}}$=k (T) C${}_{\text{p}}^{\text{m}\text{s}}$ (2)

2.3 用DSC测量α-Al2O3的比热容

表2是α-Al2O3的比热测量值C${}_{\text{p}}^{\text{m}\text{s}}$、校正值C${}_{\text{p}}^{\text{m}\text{d}}$, 以及C${}_{\text{p}}^{\text{m}\text{s}}$和C${}_{\text{p}}^{\text{m}\text{d}}$与文献值C${}_{\text{p}}^{\text{s}\text{t}\text{d}}$[9]的相对误差E${}_{\text{r}}^{\text{m}\text{s}}$和E${}_{\text{r}}^{\text{m}\text{d}}$, 可见E${}_{\text{r}}^{\text{m}\text{s}}$都小于2.56%, 而E${}_{\text{r}}^{\text{m}\text{d}}$都小于0.67%, 说明对仪器的系统误差校正后, 提高了比热容的测试准确度。

2.4 用DSC测量复铜板的比热容

图2是1#～4#复铜板样品的比热容测试结果与温度的关系图, 从图上可以得到1#、2#、3#和4#样品玻璃化转变的中点温度, 即玻璃化转变温度Tg, 分别为148℃、168℃、154℃和144℃, 玻璃化转变温度越高, 复铜板的使用温度越高, 可见从使用温度的优劣来考察, 从高到低的排列为:2#、3#、1#和4#。玻璃化转变温度以下比热容变化趋势从高到低的排序为:1#、2#、3#和4#, 复铜板的比热容越大, 其传热效果越差, 从传热效果的优劣排序为:4#、3#、2#和1#, 综合使用温度和传热效果的性能, 2#和3#样品比较优越, 这和预期效果相符。

3 结 论

(1) 用DSC测量材料的比热容, 可以得到连续的比热测量值, 研究的温度范围不超过100℃;

(2) 用蓝宝石来校正DSC系统的比热容, 提高比热容测量的准确度, 相对误差小于0.65%;

(3) 从复铜板的比热容温度曲线上, 可以得到玻璃化转变温度。

参考文献

[1]T.Mitsuhashi, A.Watanabe.Anomalies in Heat Capacity Measure-ments of RuO2.TiO2System[J].J.Therm.Anal.Cal., 2000, 60:683-689.

[2]K.L.Ramakumar, M.K.Saxena, S.B.Deb.Experimental Evalua-tion of Procedures for Heat Capacity Measurement by Different ScanningCalorimetry[J].J.Therm.Anal.Cal., 2001, 66:387-397.

[3]Heidenreich, T.Langner, H.Rohm.Heat Capacity of Cheese[J].J.Therm.Anal.Cal., 2007, 89 (3) :815-819.

[4]J.Pak, W.Qiu, M.Pyda, E.Nowak-Pyda and B.Wunderlich.CanOne Measure Precise Heat Capacities with DSC or TMDSC?A study ofthe baseline and heat-flowrate correction[J].J.Therm.Anal.Cal., 2005, 82:565-574.

[5]L.A.Chapman.Application of High Temperature DSC Technique toNickel Based Superalloys[J].Journal of Materials Science, 2004, 39:7229-7236.

[6]Y.Saruyama.Frequency Dependence of Dynamic Heat Capacity at theMelting Temperature of Polyethylene Crystals[J].J.Therm.Anal.Cal., 2000, 59:271-278.

[7]曾春莲, 蔡涛, 张伟庆, 等.用α-Al2O3研究比热测试与MDSC条件的相关性[J].分析测试技术与仪器, 2008, 14 (2) :100-104.

玻璃化转变 篇2

[关键词]彩绘玻璃；哥特式教堂；灰彩饰；饰带窗

作为哥特式建筑的诞生地与兴盛地，中世纪法国的彩绘玻璃呈现出一条比较完整的演变历程。从圣丹尼斯修道院教堂开始，彩绘玻璃就不再仅仅是教堂里的简单装饰或其他艺术门类的替代物，而是开始不断的积极寻找着属于自己的独特表现风格，从色彩到人物造型，再到画面构图，除了在主题选择上受制于基督教义的限制之外，彩绘玻璃几乎在所有形式元素方面都寻找到了新的突破口，沙特尔教堂的彩绘玻璃作品是此时最典型的代表。可以说，13世纪中叶以前的玻璃工匠们将二维平面绘画的表现手法与玻璃材质自身的特点相结合，将彩绘玻璃艺术的魅力发挥到了极致。

13世纪中期，随着法国君主政权势力的增强，彩绘玻璃被赋予了更加重要的地位和作用，它成为了显示宫廷审美趣味与基督教神圣思想的双重载体，巴黎圣礼拜堂内五色斑斓的玻璃窗成为哥特式彩绘玻璃自身魅力发挥到极致的代表。13世纪后期，教堂彩绘玻璃虽然仍然十分繁荣，但是已经出现了一些新的变化趋势，主要体现在玻璃外框架收缩导致的描绘大场面的玻璃作品减少，叙事题材彩绘玻璃减少，矩形切割所导致的画面构图的改变，纯粹图案化的“灰彩饰”（grisaille）玻璃窗与饰带窗（band window）逐渐流行以及对三维空间感的追求等几方面。此时，彩绘玻璃的设计者开始运用大块的菱形形状简化了玻璃切割的工作。组成格子状花纹的玻璃板主要运用直线条切割出来的，而不再是交错或圆形的不规则的切割方式。这种切割方式所构成的彩绘玻璃窗从某种意义上讲更具有画面的统一感和完整性，并且不可避免地对人物造型、构图甚至题材的选择产生了影响。自此，中世纪教堂彩绘玻璃的艺术风格发生了重大转变。下文将详细分析这一转变。

一、灰彩饰的兴起

从13世纪后期开始，灰彩饰在随后的一个半世纪里成为大教堂玻璃窗制作的主要手法。这是一种利用无色玻璃与铅条的组合来形成抽象纹样的一种玻璃窗装饰手法，窗户上没有人物形象的出现。这种类型的彩绘玻璃早在12世纪就已经出现，圣丹尼斯修道院教堂内的格里芬之窗实际上就属于这种类型窗户的一个变体。尤其是在西多会的修道院教堂内，这种窗户最为常见，运用得也最为成熟。例如制作于12世纪下半叶的奥巴曾修道院（the Abbev Of Obazine，1156-1190）的玻璃窗就是很好的例证（图1）。这些窗户上的纹样和图案主要可以分为有机形和几何形两类，显示出中世纪早期塞尔特人图案风格的影响。其娴熟的图案设计曾被许多教堂所沿用，不仅极大地提升了哥特式彩绘玻璃装饰图案的丰富性与多样性，也为后来灰彩饰玻璃窗的广泛流行打下了很好的图案设计基础。但是，在13世纪中叶之前，这种类型的玻璃窗却并没有对彩绘玻璃的创作产生太大的影响，西多会的灰彩饰窗户只传播到了奥地利和德国的少数几个没有受哥特风格影响的地方。在绝大多数城镇中的大教堂里，人们还是更加喜爱那些色彩浓重的人物场景与叙事题材的玻璃窗。直到13世纪后半叶，灰彩饰玻璃窗才开始受到了重视，并逐渐成为彩绘玻璃的主要表现形式。这种转变应该是源于人们对教堂采光度需要的提高，正如格罗德兹基所指出的：“大约从1260年开始，室内空间明亮的、色彩斑斓的效果转变为乳白色的效果。这是由于在原来彩色玻璃的部分采用近乎白色的灰色调的装饰画法而形成的浑然一体的效果。”

彩绘玻璃窗出现改变的第一个完整的例子是一个比较小的建筑一一特鲁瓦的圣乌尔班教堂。圣乌尔班教堂是由教皇乌尔班四世（Urban IV，1261-1264在位）为他的出生地捐资建造的，大约建造于1262-1277年。圣乌尔班教堂在建筑风格上与巴黎圣礼拜堂近似，属于法国辐射式风格作品，但是在彩绘玻璃的风格上却发生了巨大变化，灰彩饰成为主要的装饰画法（图2）。整个建筑被设想为一个由无数闪烁着光芒的挂毯代替墙面所支撑起来的笼子。尤其在后殿，窗户透明的程度进一步增大，铺装在一起的彩色玻璃组成灰彩装饰画法装饰的玻璃屏使建筑显得极为精致。透过灰彩装饰法的玻璃洒向室内的光芒使得着色的镶片仿佛漂浮在一种神圣超然的气氛之中，人像作品则被进一步简化为剪影式的形状以加强其可识别度一一这种处理手法体现了当时的一种倾向：人们开始希望更多的光线照进室内。

二、饰带窗的出现

但是，如何才能够既允许更多的光线照进室内，又可以表现传播宗教教义所必需的人物形象呢？中世纪的玻璃艺术家不断地探索着这个问题的解决方案。一种是在特定的少数几扇窗户上运用灰彩装饰的玻璃窗。这种窗户一般安装在教堂东南角的位置上以便于采光，例如圣丹尼斯修道院教堂的格里芬之窗以及沙特尔教堂内的一扇13世纪初期的灰彩装饰窗户。亚眠大教堂的彩绘玻璃窗采用了中间为人像主题，两侧为灰彩饰窗户的方式，也是对这种方法的发展（图3、图4）。一种是在边饰图案中运用灰彩饰装饰的玻璃，这在13世纪前期的一些玻璃作品中也已经有所运用。还有一种是把着色的人像直接安排到灰彩饰装饰的背景里。但是，这些处理方法都不能很好地解决这个问题。

大约在1265年，饰带窗（band windows）——一种全新的窗户结构设计方式终于出现了。饰带窗是13世纪后期玻璃画面设计的典型特征之一，主要出现在高侧窗上，在窗户中间的一横排或一竖列描绘的是人物形象，而窗户的剩余空间则均用灰彩饰装饰的图案纹样来填充，并与人像组成一组完整的图像。这种设计方式的出现，在很大程度上解决了描绘人物形象与提高室内采光度之间的矛盾。在沙特尔的圣皮埃尔（St.Pierre）教堂，许多作品都显示了这种将灰色装饰画法与人物形象相组合的手法（图5）。在中厅的高窗上，充满整个画幅的人像的玻璃窗随着灰色装饰构成的中轴线以及哥特式尖顶蓬下的站立形象而调整。这种手法在13世纪末以后成为玻璃图像的典型特征。在此后，法国的欧塞尔大教堂（Auxerre Cathedral，图6、图尔大教堂（图7）、鲁昂圣旺修道院教堂（Abbey Church 0f Saint-Ouen，Rouen，图8）的13世纪后期以及14世纪的彩绘玻璃窗上也都出现了这种“饰带窗”的设计。

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三、氧化银的运用与绘画感的提升

为了进一步提高采光度，进入14世纪以后的法国彩绘玻璃除了灰彩饰与饰带窗的广泛运用之外，又出现了一个新的趋向一一红、蓝等艳丽色彩的减少以及画面趋于淡雅化。1310年前后，金属氧化银添加剂开始在玻璃上运用，可以产生出不同色调的黄色甚至金色。这样，经过煅烧，在一块玻璃上就能呈现出两种以上的不同色彩，从而取代了把几块不同色彩的玻璃拼接起来的那种镶嵌画般的效果。1317-1339年建造的鲁昂圣旺修道院教堂（Abbey Church of SaintOuen，Rouen）内饰带窗上的彩绘玻璃就运用了这种新技法，表现出一种更加精致优雅的人像风格，高大修长的身材、精致的面部描绘与上方和下方明亮通透的灰彩饰玻璃相互辉映，体现了晚期哥特式彩绘玻璃那种细腻明快的视觉效果。埃夫勒大教堂（Evreux Cathedral）内的一扇饰带窗上描绘了圣母与其面前的一位捐赠窗户的主教的形象（图9）。运用银色着色剂绘制而成金黄色的丰富色调具有一种晶莹明快的效果，光线透过四周灰彩饰绘制的透明玻璃照进室内，显得十分敞亮。

此外，从创作角度来看，随着以描绘叙事题材为主的团花窗的逐渐减少以及以抽象化图案为主的灰彩饰玻璃的流行，彩绘玻璃已经不再是一个宣讲基督教义的艺术载体，它同时也要满足世俗人们不断发展的功能性和审美方面的需要。从此，彩绘玻璃艺术形式上的那种神秘气息逐渐减弱，让位给了人们的理性需求。而与此同时，彩绘玻璃开始追求对真实感的自然主义描绘，并逐渐向绘画艺术靠拢。正如柯耐尔指出的，在13世纪的哥特式美术中重新出现了对古典自然主义的肯定，这种情况反映了对自然的重新发现。这种试图表现三维空间的尝试在一定程度上扩大了彩绘玻璃的表现手法，但是同时也限制了对其自身材质魅力的传达与突出，逐渐沦为了绘画的附庸。

四、中世纪晚期彩绘玻璃风格转变后果分析

有因必有果，中世纪晚期彩绘玻璃的三大转变直接导向了彩绘玻璃艺术在此后逐渐衰落的后果。

其一，此时的彩绘玻璃在建筑师眼中成为单纯的建筑采光通道，其在建筑结构功能上的意义超出了其形式美学上的意义。而正是建筑上扩大室内采光效果的需要促进了灰彩饰窗户的大量运用以及饰带窗处理手法的发明。随着以描绘叙事题材为主的团花窗的逐渐减少，彩绘玻璃似乎已经不再是一个宣讲基督教义的艺术载体，它同时也要满足世俗人们不断发展的功能性需要。从此，彩绘玻璃艺术形式上的那种神秘气息逐渐减弱，而让位给了人们的理性需求。

其二，13世纪中叶之后，以特鲁瓦圣乌尔班教堂为代表的饰带窗形式彩绘玻璃作品表明，此时的玻璃工匠开始能够制作大面积的玻璃，窗户上的分格也逐渐趋向疏阔。但伴随着大面积玻璃而来的一个问题就是色调的统一性很难维持了，这在削弱了彩绘玻璃装饰性的同时，也削弱了它同建筑的协调，这也是中世纪晚期彩绘玻璃最突出的特点之一。这正如萨拉·柯耐尔指出的，盛期哥特式风格的统一来自一个建筑规划中所有工匠们的密切合作。到了晚期哥特式时期这种密切合作消失了，建筑师对建筑设计的控制是加强了，但是彩绘玻璃窗画和雕塑却不再当场制作，而是拿到行业工场里去制作，由此削弱了建筑与装饰之间的紧密关系。自此，玻璃工匠发展着更加写实的绘画技术，雕塑家学习石刻和木雕的新技法和传统，而建筑师则寻求更高的高度和没有重量感的错觉……所有这些都开始了独立的发展。

其三，彩绘玻璃向绘画艺术靠拢，力图通过画面的华丽感、真实感效果而非自身的色彩和透光性等特色来增强表现力，因为对这些特性的发挥必须依靠与建筑空间的相互配合才能得以完成。这种试图表现三维空间的尝试在一定程度上扩大了彩绘玻璃的表现手法，但是同时也限制了对其自身材质魅力的传达与突出，逐渐沦为了绘画的附庸。

此后，欧洲教堂的彩绘玻璃虽然在创作上仍然维持了一定数量，但是在艺术水平上已经难与同时期的绘画艺术相比肩，毕竟这是以自身的短处与其他艺术的长处相比。文艺复兴式建筑中大面积墙面的回归也令彩绘玻璃的阵地进一步退缩。直到19世纪末20世纪初，随着艺术与手工艺运动以及新艺术运动的兴起，以威廉·莫里斯、路易斯·康弗特·蒂凡尼、弗兰克·劳埃德·赖特以及马克·夏加尔等为代表的一批艺术家和建筑师才重新寻找到了彩绘玻璃艺术的自身表现语言，并重新令其焕发生机。

人卵巢组织玻璃化冷冻方案的研究 篇3

1材料与方法

1.1材料

1. 1. 1组织来源及处理2014年3 ~ 9月共收集天津市中心妇产科医院40例卵巢良性包块( 包括32例卵巢子宫内膜异位症、5例卵巢成熟畸胎瘤、2例卵巢浆液性瘤、1例卵巢黏液性瘤) 而行手术者,且卵巢包块直径均<10 mm,取其剥离的卵巢囊肿壁上残留卵巢组织共40片,利用患者手术切除的废弃组织进行研究。患者年龄均<35岁,既往月经正常,均有正常生育史。术后病理检查提示卵巢组织未见恶性肿瘤细胞转移。该研究通过医院伦理委员会审核,经患者签署知情同意书。

1. 1. 2主要试剂耗材由美国Sigma公司提供的二甲基亚砜( DMSO) 、乙二醇( EG) 、丙二醇( PROH) 、 蔗糖( S) 、磷酸盐缓冲液( PBS) 等,购于美国Gibco公司的胎牛血清( FBS) ,北京中杉生物有限公司提供的鼠抗人Ki-67单克隆抗体,美国BD公司提供的筛网。

1. 1. 3冷冻保护液的配备DMSO +EG低浓度配伍组( 即CPA1组) : 1平衡液: 7. 5% EG+7. 5% DMSO+ 20% FBS; 2冷冻液: 15% EG + 15% DMSO + 0. 5 mol / L蔗糖。PROH+EG配伍组( 即CPA2组) : 1平衡液: 10% EG+ 10% PROH + 20% FBS; 2冷冻液: 20% EG + 20% PROH+0. 5 mol / L蔗糖。DMSO +EG高浓度配伍组( 即CPA3组) : 1平衡液: 10% EG + 10% DMSO + 20% FBS; 2冷冻液: 20% EG +20% DMSO +0. 5 mol / L蔗糖。冷冻复苏液: 11. 0 mol/L蔗糖+PBS; 20. 5 mol/L蔗糖+PBS; 30. 25 mol/L蔗糖+PBS; 40. 125 mol/L蔗糖+ PBS。

1.2方法

1. 2. 1取材及分组获取卵巢组织片后编号,迅速移至实验室,室温下用PBS进行冲洗,并去除脂肪和髓质,将每块组织切割成大小1 mm×1 mm×5 mm的卵巢皮质块20块,共800块,卵巢组织随机分为10组,玻璃化冷冻组9组,另一组为对照组( 新鲜组) 。 玻璃化冷冻组根据使用不同的冷冻保护液分为CPA1组、CPA2组、CPA3组,再采用不同的冷冻载体( 微滴法、冻存管法、筛网法) 进行玻璃化冷冻,每组同一患者取2块卵巢皮质块,共80块。

1.2.2实验方法

1. 2. 2. 1对照组对照组的新鲜卵巢皮质块仅行10% 中性甲醛固定,进行脱水 、 包埋 、 切片 、HE染色等处理 。

1. 2. 2. 2玻璃化冷冻组玻璃化冷冻组的皮质块, 分别将其放于3种( CPA1、CPA2、CPA3 ) 不同玻璃化冷冻平衡液中室温下预平衡10分钟,再移入冷冻液中,室温下反复翻转5分钟 。 经CPA1的3组卵巢皮质块处理如下: 1微滴法: 用巴士德吸管吸取含有卵巢组织块的液滴,直接滴入液氮中,然后用已经在液氮中预冷的镊子收集含有卵巢组织块的颗粒小滴,将其装在冷冻管中投入液氮中 。2冻存管法: 将卵巢组织块装入1. 8 ml冷冻管内密封直接投入液氮中保存 。3筛网法: 将卵巢组织块置于筛网上,用滤纸从筛网背面吸干冷冻保护液,将筛网直接投入液氮中 。CPA2的3组及CPA3的3组处理同上 。 放入液氮罐中保存1周 。

1. 2. 2. 3复苏方法将取出的9组玻璃化冷冻组卵巢组织块依次经4组冷冻复苏液,室温下各平衡5分钟 。 将已编号的卵巢皮质块放入10% 的中性甲醛中备用 。

1.2.3人卵巢组织冷冻复苏效果判断

1. 2. 3. 1卵巢组织结构分析9组玻璃化冷冻组卵巢皮质块固定于10% 中性甲醛中,包埋后以4 μm厚切割样本,共切取20张切片,9组玻璃化冷冻组各选取第10张切片行HE染色,观察10个高倍视野卵巢组织形态和计数卵泡。剩余部分用于免疫组化研究,为避免重复计数,以观察到卵母细胞核为计数标准。通过颗粒细胞形态依卵泡发展阶段将其进行如下分类: 1始基卵泡: 单层扁平颗粒细胞包绕卵母细胞; 2初级卵泡: 单层立方颗粒细胞包绕卵母细胞; 3次级卵泡: 两层或以上立方颗粒细胞包绕卵母细胞[1]。

1. 2. 3. 2细胞凋亡检测应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记检测试剂盒( TUNEL) ,对照组与玻璃化冷冻组随机抽取15张切片,共150张, 计数每10个高倍视野下卵巢组织中出现凋亡细胞数,检测冻融前后卵巢组织内细胞凋亡情况。

1. 2. 3. 3细胞增殖活性检测免疫组化标记Ki-67 ( 呈棕褐色) 作为检测细胞增殖活性指标[2],10组各随机取1张切片浸泡在4℃ 鼠抗人Ki-67单克隆抗体中放置一夜,后在室温下加入二抗羊抗鼠单克隆抗体60分钟,加入染色剂显色。免疫组化结果由两位观察者观察分析得出,细胞增殖活力以增殖指标Ki-67的表达作为衡量标准( 计数每张切片中5个高倍视野Ki-67阳性细胞数量) 。

1. 3统计学处理采用SPSS 19. 0进行统计,计数资料采用 χ2检验,检验水准 α = 0. 05。计量资料采用独立样本t检验,检验水准 α=0. 05。

2结果

2.1对照组与玻璃化冷冻组HE染色结果比较CPA1微滴法、筛网法及CPA2微滴法与对照组比较各级卵泡数量,差异无统计学意义( P>0. 05) 。且CPA1微滴法、筛网法及CPA2微滴法3组间卵泡数量差异无统计学意义( χ2= 0. 401,P > 0. 05 ) 。余组各级卵泡数量与对照组比较差异均有统计学意义( P<0. 05) 。 见表1。显微镜下观察人新鲜卵巢组织,其卵巢间质细胞排列致密而规则,卵巢皮质中间质细胞紧密包裹各级卵泡。9组玻璃化冷冻组,无论哪种冷冻方法复苏后对卵巢始基卵泡影响均不明显,但可见卵巢组织内部分间质细胞排列紊乱,疏松甚至出现分离。

1 与对照组比较, P<0. 05

2. 2对照组与玻璃化冷冻组免疫组化结果比较计数每5个高倍视野阳性细胞数( 呈棕褐色) 与对照组比较,仅CPA1微滴法和筛网法卵巢组织中各级卵泡卵母细胞及颗粒细胞中Ki-67表达与对照组比较,差异无统计学意义( P>0. 05) ,其余各组与对照组比较, 差异均有统计学意义( P<0. 05) 。见表2。

1 与对照组比较的 P 值

2. 3对照组与玻璃化冷冻组Tunel细胞凋亡检测结果对照组始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡内均未见凋亡细胞,仅部分间质细胞核内可见凋亡细胞; 玻璃化冷冻组始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡内均未见凋亡细胞,仅部分间质细胞、血管内皮细胞核内可见凋亡细胞,见图1。

3讨论

3. 1玻璃化冷冻液配伍及浓度目前经研究明确玻璃化冷冻液中DMSO的冷冻效果最好,而EG渗透作用最佳,通过联合DMSO和EG冻存卵巢组织效果最好[3]。本研究证实CPA1组结合DMSO和EG冻存卵巢组织块,分析解冻后各级卵泡形态数量及增殖活性、凋亡情况与对照组差异无统计学意义( P>0. 05) 。 此外,就玻璃化冷冻剂浓度而言,浓度越高对卵巢组织损伤越大,且闭锁卵泡数量越多[4]。蔗糖作为非渗透性冷冻保护剂,使细胞脱水降低细胞内冰晶形成, 改变细胞渗透压从而稳定细胞膜结构,缓解DMSO高渗透作用,中和EG毒性[5]。低浓度组15% EG+15% DMSO+0. 5 mol / L蔗糖在冻存小鼠卵巢组织已获成功的卵泡活力,移植后并获得妊娠[6]。这一浓度是目前研究冻存囊胚及卵母细胞使用的最低的浓度之一[7]。 本研究在低浓度组即CPA1组,基础上增加溶液浓度配制成CPA3,及配比应用同样比较广泛的PROH即CPA2,研究发现DMSO与EG低浓度配伍组 ( CPA1 ) 无论是光镜下卵泡形态、细胞增殖活性还是细胞凋亡程度均与对照组( 即新鲜组) 差异无统计学意义,明显优于高浓度组( CPA3) 及PROH组( CPA2) 。所以对卵巢组织最佳的冻存方案为低浓度DMSO和EG联合使用。

3. 2玻璃化冷冻载体选择适宜的冷冻载体可以提高热交换速率,有效减少玻璃化冷冻液体积,使组织块能迅速、均匀地降温以达到需要的冷冻温度,同时又能减少冷冻保护剂用量以减少组织细胞毒性。近年来各国学者为了改善玻璃化冷冻效果,提高降温速率尝试了多种新冷冻载体。包括固体表面( solid-surface vitrification,SSV) 玻璃化法[8]、微滴玻璃化法( microsphere method )[8]、直接覆盖 玻璃化方 法 ( direct cover vitrification,DCV)[9]、针浸润玻璃化冷冻法( needle immersed vitrification,NIV)[3],其均是将卵巢组织直接与液氮相接触,加快了降温速率,这些方法均优于传统玻璃化冷冻方法,但也存在着卵巢组织被微生物污染的风险,对卵巢组织的安全应用存在一定影响。本研究通过对比直接接触( 微滴法、筛网法) 与间接接触液氮( 冻存管法) 对卵巢组织的影响,采用微滴法、筛网法和冻存管法,发现微滴法及筛网法冻存卵巢组织块复苏后各级卵泡数量及增殖活性明显优于冻存管法,证实直接接触液氮的冷冻效果明显优于间接法。本研究采用新型冷冻载体筛网冻存卵巢组织, 推动了卵巢组织玻璃化冷冻的新进展。

3. 3冻融效果检测组织形态学观察发现,玻璃化冷冻组中9组冻融卵巢组织与对照组对比,正常卵泡数量均有所减少,卵巢结构也出现间质水肿、间质细胞连接疏松、细胞分离排列紊乱,说明无论何种冻存方法均会对卵巢组织造成损伤,仍需进一步改进。

Ki-67是一种增殖细胞相关的核抗原,其功能与有丝分裂密切相关,被认为是有效评价细胞增殖活性的指标。其可表达于各级卵泡的卵母细胞、颗粒细胞及间质细胞的细胞核[2]。本研究发现,仅CPA1组中微滴法和筛网法冻融前后卵巢组织细胞核内Ki-67阳性表达率与对照组比 较,差异无统 计学意义 ( P > 0. 05) ,说明该两种方法玻璃化冻存卵巢组织对组织影响较小。

研究发现冻融过程中可诱发卵巢组织内细胞凋亡,细胞在发生凋亡时,会激活一些DNA内切酶,导致DNA断裂,进而暴露3'-OH。本实验利用DNA断裂的原位末端标记法观察各组冻融前后卵母细胞及颗粒细胞凋亡情况,进而评估卵巢组织的损伤程度。 观察发现,对照组始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡内均未见凋亡细胞,仅部分间质细胞可见凋亡细胞; 9组玻璃化冷冻组始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡内均未见凋亡细胞,仅部分间质细胞、血管内皮细胞可见凋亡细胞。得出结论,玻璃化冻存方法未诱发卵巢组织各级卵泡的明显凋亡,与文献研究结果一致。占总卵泡数70% ~ 90% 始基卵泡因其代谢速度慢,卵母细胞缺少透明带,冷冻敏感的细胞间质也很少,比成熟卵子更易耐受冷冻和复苏过程所造成的损伤。由于不同载体及操作过程造成卵巢组织结构本身的损伤,使卵泡数量减少,仍需进一步研究这些改变是否可逆转及是否影响卵泡功能。

综上所述,玻璃化冷冻能较好地冻存卵巢组织, 低浓度DMSO与EG联合冻存卵巢组织优于PROH组及高浓度组,就载体而言,直接接触液氮的冷冻效果明显优于间接法,新型冷冻载体筛网也取得良好的冻存效果。冻融前后形态学观察发现始基卵泡较其他卵泡对冷冻液的耐受性更好,采用免疫组化法及一步法TUNEL细胞凋亡检测评估卵巢组织内细胞增殖及凋亡程度,较好预测实验结果。但该实验玻璃化冻存均在室温下进行,对各溶液最佳温度、浓度及平衡时间仍需进一步探讨研究,以更进一步推动卵巢组织的玻璃化冻存。

摘要：目的:探讨适合人卵巢组织玻璃化冷冻的冷冻保护剂及合适载体。方法:收集40例因卵巢良性包块行手术者的卵巢皮质40片,将每片卵巢皮质切为20块卵巢组织块。将其随机分为10组,玻璃化冷冻组9组,另一组为对照组,9组玻璃化冷冻组再根据使用不同配伍浓度的冷冻保护剂(CPA1、CPA2、CPA3)及3种不同载体方法(微滴法、冻存管法、筛网法)进行细分。分析比较玻璃化冷冻组9个亚组与对照组冻融前后卵泡形态学变化、细胞增殖及凋亡程度。结果:1形态学HE染色示:仅CPA1组微滴法和筛网法、CPA2组微滴法与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2免疫组化示:仅CPA1组微滴法和筛网法卵巢组织卵泡的Ki-67表达与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3Tunel细胞凋亡检测示:各级卵泡中卵母细胞及颗粒细胞中均未见凋亡细胞。结论:低浓度冷冻保护剂DMSO联合EG(即CPA1液)使用微滴法或筛网为冷冻载体冻存卵巢组织,对卵巢组织的损伤最小。

玻璃化转变 篇4

1 材料

卵母细胞,采集自北京市昌平屠宰场屠宰母猪卵巢,置于37℃添加双抗的生理盐水的不锈钢保温桶内运送回实验室。试验所用精液,均为全国畜牧兽医总站畜禽牧草种质资源保存利用中心实验室制做的颗粒冷冻精液;一次性培养用具,CORNING公司生产;TCM-199,GIBCO公司生产;孕马血清促性腺激素(PMSG),天津市浮华高新生物技术公司生产;特级胎牛血清,天津TBD公司生产;如未标明均为Sigma公司产品。

2 方法

卵母细胞成熟(IVM)方法参考杨喜等[2]的体外成熟方法,选取包裹至少2层卵丘细胞、胞质均一的卵母细胞,卵母细胞成熟培养液以NCSU-23(北卡罗林那州大学23培养液)为基础,添加10 IU/m L PMSG,10 IU/m L人绒毛膜促性腺激素(h CG),25 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)以及0.1μg/m L 17β-雌二醇(17β-E2)。卵母细胞在39℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养48 h后,以排出第一极体为成熟判定标准。OPS的制作方法参照戴志俊等[1]的方法。

TCM-199+20%特级胎牛血清(FCS)并梯度添加蔗糖浓度分别为0.1 mol/L、0.25 mol/L、0.5 mol/L、0.75 mol/L配制成梯度解冻液,置于培养箱内平衡,备用。解冻时将卵母细胞从液氮中取出在空气中停留1~3 s,再依次经过含0.75 mol/L、0.5 mol/L、0.25 mol/L、0.1 mol/L蔗糖的解冻液脱去冷冻保护剂,解冻液处理时间分别为5 min、2 min、2 min、5 min,然后将解冻的卵母细胞移入平衡好的成熟液中,备用。解冻后未成熟的卵母细胞继续培养至成熟。

二乙酰荧光素(FDA)染色是鉴定卵母细胞是否存活的方法之一[3]。FDA可以检测冷冻对细胞膜及细胞内酯酶系统完整性和活性的影响。卵母细胞解冻后经FDA处理,在荧光显微镜下发出强绿色荧光判定为细胞存活,反之则细胞死亡。

采用罗丹明123(R123)检测线粒体损伤:将解冻后的卵母细胞置于39℃含0.11μg/μL R123的染液中染色10 min,洗脱染液观察,发强荧光的为存活卵母细胞。

2.1 冷冻保护剂[4]、卵母细胞成熟阶段对冷冻保存效果的影响

玻璃化冷冻液1:TCM-199+20%FCS分别添加1 mol/L、4 mol/L、6 mol/L甘油,处理时间分别为5 min、2 min、30 s,虹吸入OPS管内直接置于液氮中保存。

玻璃化冷冻液2:TCM-199+20%FCS分别添加10%、20%、30%、40%乙二醇,处理时间分别为5 min、2 min、1 min、30 s,虹吸入OPS管内直接置于液氮中保存。

玻璃化冷冻液3:TCM-199+20%FCS+5%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)分别添加10%、20%、30%、40%乙二醇,处理时间分别为5 min、2 min、1 min、30 s,虹吸入OPS管内直接置于液氮中保存。

分别选择卵母细胞体外成熟0 h、12 h、48 h 3个时期,解冻后继续成熟培养至48 h,观察成熟率、形态完整率、FDA阳性率、R123阳性率、卵裂率,对所得数据进行差异显著性分析。

2.2 程序化冷冻和OPS玻璃化冷冻的比较

用玻璃化冷冻液3作为OPS冷冻保护剂,选择体外成熟12 h和48 h的卵母细胞,比较程序化冷冻和OPS玻璃化冷冻的效果。其余方法同2.1。

2.3 数据的统计分析

所有试验均独立重复3次,并采用SPSS软件对数据进行统计分析。

3 结果与分析

3.1 冷冻保护剂、卵母细胞成熟阶段对冷冻保存效果的影响(结果见表1、表2)

%

注:同列同项数据肩标小写字母不同表示差异显著(P<0.05),小写字母相同表示差异不显著(P>0.05);同行数据肩标大写字母不同表示差异显著(P<0.05),大写字母相同表示差异不显著(P>0.05)。

%

注:同列同项数据肩标小写字母不同表示差异显著(P<0.05),小写字母相同表示差异不显著(P>0.05);同行数据肩标小写字母不同表示差异显著(P<0.05),小写字母相同表示差异不显著(P>0.05)。

由表1、表2可知,体外成熟培养12 h的猪卵母细胞用乙二醇添加PVP进行玻璃化冷冻,解冻后体外成熟率、细胞的形态完整率与未经体外成熟的卵母细胞相比差异显著(P<0.05),与成熟培养48 h卵母细胞相比差异不显著(P>0.05)。但体外成熟培养12 h的猪卵母细胞用乙二醇添加PVP作为冷冻保护剂组的卵裂率和桑椹胚率要显著好于48 h组(P<0.05)。

3.2 程序化冷冻和OPS玻璃化冷冻效果的比较(结果见表3)

由表3可知,OPS玻璃化组与程序化组相比,体外成熟率、FDA阳性率、R123阳性率、细胞的形态完整率差异显著(P<0.05)。

4 讨论

%

注:同列数据肩标小写字母不同表示差异显著(P<0.05),小写字母相同表示差异不显著(P>0.05);同行数据肩标大写字母不同表示差异显著(P<0.05),大写字母相同表示差异不显著(P>0.05)。

冷冻保存中最常用的冷冻保护剂是甘油、乙二醇、1,2-丙二醇和二甲基亚砜。玻璃化冷冻液是将一种或多种冷冻保护剂结合使用。将卵母细胞置于冷冻保护剂中,随着平衡时间的延长,卵母细胞的发育率降低。造成这种结果的主要原因是冷冻液中保护剂的化学毒性[5]。朱捷等人研究了乙二醇、甘油、1,2-丙二醇的化学毒性,结果表明,乙二醇对细胞的保护效果最好,化学毒性最小。化学毒性与温度有关,还与保护剂的种类有关。4种渗透性冷冻保护剂化学毒性由小到大依次为乙二醇、1,2-丙二醇、二甲亚砜、甘油[6,7]。

冷冻保护剂浓度的选择十分重要,而且冷冻保护剂渗透性和毒性随着温度的升高而增大,因此在冷冻过程中常用不同浓度组合的玻璃溶液在不同温度下分2~3步对卵母细胞进行处理,来完成对卵母细胞的玻璃化过程。因此,卵母细胞玻璃化冷冻,既要使冷冻保护剂渗透充分,又不能使平衡时间过长,防止化学毒性对卵母细胞的损伤。

乙二醇作为冷冻剂,其特点是分子质量小、渗透性强、对细胞的化学毒性小。已经被证实乙二醇对鼠卵母细胞是无毒性的,并且还可以提高冷冻解冻后牛卵母细胞的存活率[8]。试验也证实乙二醇作为冷冻保护剂冷冻效果要优于甘油,这可能是由于乙二醇的化学毒性小于甘油。试验中添加5%非渗透性冷冻保护剂PVP,进一步提高了冷冻液的玻璃化程度,同时也可能进一步降低乙二醇的化学毒性。

不同发育阶段的卵母细胞对冷冻的耐受能力和冷冻损伤的修复能力也不尽相同,许多研究都已证明,未经体外培养的卵母细胞对冷冻的耐受能力和冷冻损伤的修复能力最差,与本试验结果一致。经过12 h的培养,卵母细胞恢复进一步发育的能力,但纺锤体等大的细胞骨架还没有形成,此时冷冻造成的损伤最小,解冻后进一步进行体外培养,有足够的时间修复冷冻造成的损伤。试验中,经体外成熟培养12 h后进行冷冻保存的效果也是最好的。

由于OPS玻璃化冷冻法使用管壁极薄的OPS管,最后装管是靠虹吸作用完成的,玻璃化液只有几十微升,其降温速率可达20 000℃/min,因其快速的冷冻速率可有效克服程序化冷冻中低温对卵母细胞的负面影响,使卵母细胞快速通过危险温区和冰晶形成的温区,有效避免了降温对卵母细胞的损伤,并且由于降温十分迅速不能形成冰晶,也将冷冻过程中的机械损伤降到最低[9,10]。试验中,用OPS玻璃化冷冻12 h猪卵母细胞解冻后成熟率达到(44.85±2.77)%,显著高于程序化冷冻组(P<0.05)。但在冷冻过程中所用高浓度抗冻剂对卵母细胞也可能造成毒性和渗透压损伤,因此今后研究的重点将是如何降低冷冻保护剂的化学毒性和渗透压损伤。

摘要：为了研究猪卵母细胞的开放性拉长脉管(OPS)玻璃化冷冻保存,试验采用不同的冷冻保护剂对比生发泡期(GV期)(体外成熟12 h)和成熟期(MⅡ期)(体外成熟48 h)猪卵母细胞的冷冻保存效果。结果表明:GV期猪卵母细胞的冷冻保存效果要优于MⅡ期和未经体外培养的猪卵母细胞;不同的冷冻保护剂相比,5%PVP+梯度乙二醇的冷冻保存效果最好。

玻璃化转变 篇5

1 资料与方法

1.1 病例选择

选择我院门诊236例患者, 深龋磨牙, 均无牙髓炎症状, 牙髓活力正常。随机将236例分为试验组120例, 对照组116例。

1.2 材料

采用FUJI-IX玻璃离子水门汀, Dycal氢氧化钙, 登士柏瓷化树脂及NT粘结剂, 聚羧酸水门汀。

1.3 治疗方法

试验组:在磨牙近髓Dycal氢氧化钙覆盖近髓处, FUJI-IX玻璃离子水门汀覆盖牙本质, 登士柏瓷化树脂充填窝洞。方法:清洁洞壁, 磨除牙体缺损面一薄层, 用75%酒精消毒缺损面, 如近髓用Dycal氢氧化钙垫底。FUJI-IX玻璃离子水门汀用3.6 g∶1粉液比例调拌, 调好后送入窝洞, 厚度0.5 mm, 硬固后酸蚀水门汀表面和临近牙釉质15 s, 涂NT粘结剂, 光照20 s, 填充瓷化树脂, 1.5 mm~2.0 mm厚照40 s, 完全固化后打磨抛光, 涂氟保护漆。

对照组:Dycal氢氧化钙覆盖近髓处, 聚羧酸水门汀垫底, 瓷化树脂充填。

1.4 疗效评定标准

成功:充填体完好, 边缘密合, 无脱落, 无牙髓炎、无继发龋。失败:充填体松动, 边缘不密合, 充填体脱落, 患牙出现牙髓炎、继发龋。

1.5 统计学方法

采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果见表1.

由表1可见, 试验组各阶段疗效均明显优于对照组, P<0.05, 说明瓷化树脂-FUJI-IX玻璃离子夹层修复技术修复活髓磨牙疗效较好。

3 讨论

光固化瓷化树脂具有高耐磨性[1], 但有树脂聚合收缩性和牙髓刺激性。FUJI-IX玻璃离子水门汀可通过化学作用与牙齿产生牢固的结合, 形成非传导的类似牙釉质的人工保护层。玻璃离子水门汀长期释放氟离子增强牙齿的防龋作用[2], FUJI-IX玻璃离子水门汀具有良好的生物相容性, 其热膨胀系数接近牙体硬组织, 可获得很好的边缘封闭效果[3]。FUJI-IX玻璃离子水门汀作光固化瓷化树脂夹层材料修复活髓磨牙可获得良好的效果。

参考文献

[1]于秦曦.粘结材料的发展和现状[J].广东牙病防治, 2001, 9 (1) :77.

[2]樊明文.牙体牙髓病学[M].北京:人民卫生出版社, 2000:104.