蛋白质合成

蛋白质合成（精选十篇）

蛋白质合成 篇1

第4章《基因的表达》的核心内容是从分子水平上阐明遗传物质在生物体内是如何起作用的, 因此第1节《基因指导蛋白质的合成》是本章的重点。课程标准要求“概述遗传信息的转录和翻译”。“概述”是理解水平的要求, 要求学生能把握知识的内在逻辑联系, 能与已有的知识建立联系。在本节内容的教学设计中, 尝试以“猜测过程———认知事实———概述结论”为逻辑主线, 逐步引导学生构建转录和翻译两个概念。

本节内容需2课时完成。第1课时主要达成两个目标:一是学生利用已有知识, 对基因指导蛋白质合成的转录和翻译两个过程大胆猜测;二是针对有关转录的猜测, 罗列科学史上的实验证据, 结合对转录图解的识认, 学生概述转录的概念。第2课时完成对“翻译”这个概念的从猜测过程, 到认知事实, 再到概述结论的过程, 最后总结提炼基因表达的本质, 形成对“基因控制蛋白质合成”过程整体认识。

二、教学目标的确定

(一) 知识目标

1.根据学生已有的DNA、基因、蛋白质的知识, 猜测基因指导蛋白质的合成过程。

2.通过列举科学史上的经典实验, 引导学生认知遗传信息转录和翻译的事实。

3.在猜测过程、认知事实基础上, 辅助指导观察转录和翻译过程的图解, 说出转录和翻译的场所、条件、原则和产物, 描述转录和翻译的过程, 概述转录和翻译的定义。

(二) 能力目标

1.运用已有知识对未知生命过程进行猜测, 从而提高科学探究中的科学猜想能力。

2.提高对科学史实进行分析、解读的能力。

3.通过描述转录和翻译的生物图解, 提高对生物图的观察能力、语言描述能力, 进而提高生物学概念的概括能力。

(三) 情感态度价值观

认同科学家探索“基因指导蛋白质合成”过程的复杂、艰辛过程和科学实证过程。

三、教学设计思路 (第1课时)

四、教学反思

(一) 教学设计反思

在《基因指导蛋白质的合成》第1课时教学中, 按照课程标准的要求, 以探索学生概念构建的方式为基本目标, 尝试了以“提出问题———猜测过程———认知事实———概述结论”为逻辑主线的教学模式, 在引导学生构建概念方面做了有益的尝试。

(二) 教学过程反思

本节课完成了《基因指导蛋白质的合成》第1课时的教学内容。

1.本节课达成了课前预设的两个目标:学生利用已有知识, 对转录过程大胆猜测;针对有关转录的猜测, 罗列科学史上的实验证据, 结合对转录图解的认识, 学生概述转录的定义。

2.本节课的情景创设简洁、有趣、明了, 在激发学生学习兴趣的同时, 做到了新旧知识的联系, 并且在引导学生分析中产生新的问题“基因如何指导蛋白质合成?”, 直奔本节课的主题。

3.教师能充分调动学生已有的细胞学知识———基因主要分布在细胞核中, 蛋白质在核糖体合成, 通过画板图的方式, 直观地揭示“细胞核中的基因如何指导细胞质中蛋白质合成?”的问题。

4.在提出问题的基础上, 引导学生“猜想”———细胞核中的DNA与细胞质中的蛋白质间应该存在一个“媒介”, 什么物质适合做这个媒介?应该满足两个条件:能从细胞核出来;能携带DNA的信息。学生利用已有知识分析, 做出基本判断———RNA可以充当DNA与蛋白质间的“信使”。

5.在猜想与分析的基础上, 找到事实依据才能使猜想得以成为结论。本节课提供给学生科学史上的3个事实都是非常经典的实验, 学生通过分析资料, 逐步得到:“RNA可以从细胞核转移到细胞质”, “DNA以一条链为模板合成RNA”, “DNA的片段完成转录”等3个结论, 从而对“转录”有了初步的认识。

6.针对转录是分子水平的、动态的过程, 帮助学生构建“转录”的概念, 仅靠猜想和事实显然还不够, 教师较好地借助了教材上的转录过程图解和清华同方的转录过程动画。在指导学生识认图解时, 借鉴了语文学科“看图说话”常用的分析“地点、人物、事件及事件的发生、发展、结束”的做法, 指导学生尝试在生物图解中找到:“人物”———分子, “事件”———转录, “发生、发展、结束”———转录的解旋、配对、延伸、释放的过程。在识图基础上, 出示转录的动画过程, 帮助学生形成转录是个动态过程的认识。

7.学生在整个教学过程中, 一直能跟着教师紧张地思维, 包括对已有知识的提取比较, 对新信息的判断分析, 对图解动画的识认表述等, 对学生的思维能力起到了一定的锻炼作用。学生能用自己的语言描述转录的过程, 并概述转录的定义, 对学生的语言表达能力也有一定的帮助。

8.本节课设计的主板书是转录概念的内涵, 包括转录的场所、条件、产物、原则、定义等, 用彩色粉笔突出结论, 起到强化的作用;副板书是建立在细胞简图基础上的本节课的基本思路“猜想———事实———结论”, 有助于学生对本节内容形成整体认识。

(三) 教学不足之处

在得出“RNA适合做DNA的信使”这个结论的教学环节上, 提供给学生的资料不够充分, 应该再提供DNA、RNA的结构模式图以及两者的分子量比较, 这样学生对“RNA是个单链、小分子”的认识才会更清晰。

教师在教学过程中留给学生思考、表达的时间还很不够, 教学的节奏还可以再放慢些, 比如在概述转录定义前, 可以让学生根据黑板上罗列的有关转录的信息, 简单地讨论交流, 梳理一下自己的思路, 再组织语言表述转录的定义。

附:有关科学史资料

(1) 1955年拉斯特 (Laster Gold) 等人用变形虫进行核移植实验, 过程如下:

A组变形虫用同位素标记的尿嘧啶核苷培养液来培养, 发现标记的RNA分子首先在细胞核中合成;B组变形虫培养在未标记的尿嘧啶核苷培养液中, 变形虫的细胞核和细胞质中均未发现有标记的RNA。

在适当的时候, 用这两组变形虫进行核移植实验。将A组变形虫的细胞核移植到B组变形虫的细胞质中, 将B组变形虫的细胞核移植到A组变形虫的细胞质中, 分别进行培养观察。发现A组细胞质中没有标记的RNA分子, 而B组细胞质中有标记的RNA分子。

(2) 1958年, Julius Marmur和Paul Doty, SP8噬菌体DNA的两条链比重不同, 一条富含嘌呤称重链, 另一条富含嘧啶称轻链, 用热变性和密度梯度离心的方法可以将两条不同比重的链分开。用SP8噬菌体感染枯草杆菌细胞后, 从枯草杆菌中提取RNA, 分别与SP8噬菌体DNA的重链或轻链混合并缓慢冷却, 发现它只能与噬菌体DNA的重链互补配对形成DNA-RNA杂合分子, 而不会与轻链杂交。

生物基因指导蛋白质的合成知识点 篇2

一、RNA的结构：

1、组成元素：C、H、O、N、P

2、基本单位：核糖核苷酸(4种)

3、结构：一般为单链

二、基因：是具有遗传效应的DNA片段，主要在染色体上。

三、基因控制蛋白质合成：

1、转录：

(1)概念：在细胞核中，以DNA的一条链为模板，按照碱基互补配对原则，合成RNA的过程。

【注】叶绿体、线粒体也有转录

(2)过程：

①解旋

②配对

③连接

④释放

(3)模板：DNA的一条链(模板链)

原料：4种核糖核苷酸

能量：ATP

酶：RNA聚合酶等

(4)原则：碱基互补配对原则(A—U、T—A、G—C、C—G)

(5)产物：信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)

2、翻译：

(1)概念：游离在细胞质中的各种氨基酸，以mRNA为模板，合成具有一定氨基酸顺序的蛋白质的过程。

【注】叶绿体、线粒体也有翻译

(2)模板：mRNA

原料：氨基酸(20种)

能量：ATP

酶：多种酶

搬运工具：tRNA

装配机器：核糖体

(4)原则：碱基互补配对原则

(5)产物：多肽链

3、与基因表达有关的计算：

基因中碱基数：mRNA分子中碱基数：氨基酸数 = 6：3：1

4、密码子

①概念：mRNA上3个相邻的碱基决定1个氨基酸。每3个这样的碱基又称为1个密码子

②特点：专一性、简并性、通用性

③起始密码：AUG、GUG(64个)

终止密码：UAA、UAG、UGA

【注】决定氨基酸的密码子有61个，终止密码不编码氨基酸。

学习生物的方法

在记住了基本的名词、术语和概念之后，同学们就要把主要精力放在学习生物学规律上来了。这时大家要着重理解生物体各种结构、群体之间的联系，也就是注意知识体系中纵向和横向两个方面的线索。

如：关于DNA，我们会分别在“绪论”、“组成生物体的化合物”和“生物的遗传和变异”这三个地方学到，但教材中在三个地方的论述各有侧重，同学们要前后联系起来思考，既所谓“瞻前顾后”。又如：在学习细胞的结构时，我们会学习许多细胞器，那么这些细胞器的结构和功能有何异同呢?这需要大家做了比较才能知道，既所谓“左顾右盼”。

生物考试难点

消化酶、抗体等分泌蛋白合成需要四种细胞器：核糖体，内质网、高尔基体、线粒体。

细胞膜、核膜、细胞器膜共同构成细胞的生物膜系统，它们在结构和功能上紧密联系，协调。

维持细胞内环境相对稳定生物膜系统功能许多重要化学反应的位点把各种细胞器分开，提高生命活动效率

核膜：双层膜，其上有核孔，可供mRNA通过结构核仁

细胞核由DNA及蛋白质构成，与染色体是同种物质在不同时期的染色质两种状态容易被碱性染料染成深色

功能：是遗传信息库，是细胞代谢和遗传的控制中心

植物细胞内的液体环境，主要是指液泡中的细胞液。

原生质层指细胞膜，液泡膜及两层膜之间的细胞质

蛋白质合成 篇3

[关键词]说课；蛋白质的生物合成；医学概论

“说课”于上世纪90年代初逐渐规范，并作为一种行之有效的教学研究活动在我国逐步推广。说课是把自己的关于某一部分教学内容的具体教学设计及其理论依据进行讲解，听取其他同行或者专家的意见及建议，通过这种交流，达到准确把握专业人才培养目标和课程标准、提高教学水平和教学素质的目的[1]。医学概论是我校面向诸多非医学专业学生开设的一门医学课程，分系统讲授正常人体的基本结构特点、生理功能及一些常见疾病的症状和诊治方法等。其教学内容中与医学生物化学有关的主要包括细胞内生物大分子的结构与功能、物质代谢和基因信息的传递与表达三部分。本文以蛋白质的生物合成（翻译）为例，从课程、教法、学法及教学过程等四个方面进行说课设计。

1、说课程

蛋白质的生物合成（翻译）是本教研室目前所用教材《医学概论》第十二章第九节遗传信息的传递与表达的第三部分内容。这部分内容是在学生对DNA、RNA的分子结构、DNA的复制及转录过程已基本掌握的前提下来学习的，既是对前面所学知识的延伸，同时又为后面学习基因表达调控打下了基础。所以这部分内容可以起到承上启下的作用。

（1）知识目标和能力目标

在充分分析教材和教育对象的基础上，我们确定了这部分内容的教学目标：通过这次课的学习，要求学生能够掌握参与蛋白质生物合成的主要物质，熟悉蛋白质生物合成的具体过程；同时能够利用所学到的知识来解释核酸和蛋白质的关系，并能从生物化学的角度探讨抗生素的作用机理。

（2）教学重点、难点及依据

这部分内容的教学重点为蛋白质生物合成的体系组成及蛋白质合成的具体过程，而蛋白质生物合成过程中肽链合成的起始和延长阶段是学习的难点。教学重点的确立首先是从我校非医学各个专业的专业人才培养目标和掌握基因信息传递与表达基本过程的课程要求出发，同时考虑到这些重点内容可以为医学概论后续学习的相关药理学知识及某些疾病（如镰刀形红细胞贫血症）的学习打下基础。而教学难点的确立主要依赖于以往的课堂反馈。往届同学普遍反映蛋白质合成的具体过程较难理解、记忆和掌握，因此把合成过程中主要的肽链合成的起始和延长阶段作为教学难点。

2、说教法

（1）学情分析

对课程吃透以后，在选择具体的教学方法以前，先要对学生的具体情况进行分析。首先在知识方面，学生通过书籍、电视、电影等传播媒介及高中生物课相关内容的学习，已经形成了有关基因和蛋白质的基本概念，但对于基因是如何控制蛋白质合成的尚不清楚。在情感方面，学生在这个年龄阶段求知欲是比较强的，我们需要正确引导学生把求知欲转变为学习的主动性。

（2）教学方法

在选择以讲授法为主的教学方法的同时，辅助以启发式教学法。在讲授过程中层层设问，创设一个主动学习与探究的情境。同时，利用多媒体课件中的动画，通过演示和讲解结合的方法，把本部分内容中抽象难懂的知识形象化、具体化。另外，由于这部分内容比较抽象复杂，在讲授过程中注意将知识及时进行归纳和总结。

3、说学法

古人云：授人以鱼，不如授之以渔。要使学生从“愿意学—学会—会学”，并培养学生善于思考、分析解决问题、合作探究等方面的能力。为此，在教学过程中采用了渗透式指导法，着重从以下三个方面来指导学生：（1）使学生明确学习目标，能准确的从课本中提取有效信息；（2）要学会正确阅读和分析示意图或表，提高学生分析问题、解决问题的能力；（3）借助于多媒体课件认真观察分析，准确认识物质之间的相互联系和规律。

4、说教学过程

为了培养学生自主、合作、探究的学习方式和能力，教学过程分为了三步走。

（1）创设情境，激趣导入

首先，利用电影《风声》和《无间道》中的片段引出摩斯密码，然后请同学们根据PPT显示的摩斯密码表，在30秒钟的时间里翻译一组密码，随之以此为例引出蛋白质的生物合成，即翻译的过程。这种方式可提高学生的学习兴趣，激发学生的学习热情。同时向同学们提出一个问题—“mRNA分子的核苷酸排列顺序怎样解读成蛋白质分子中20种氨基酸的排列顺序？”，以此来创设主动学习和探究的情境。

（2）讲授演示，突破难点

教学过程中主要采用讲授法，辅以启发式教学法来讲述蛋白质生物合成的体系组成和蛋白质合成的具体过程。其中的难点部分通过播放PPT动画或者Flash动画把抽象难懂的知识形象化，使同学们有了直观的认识，从而易于理解和学习。

（3）总结巩固，拓展提升

通过小结的方式来帮助同学们巩固这次课的主要学习内容，知道需要掌握和熟悉哪些知识点。然后播放《侏罗纪公园》的电影片段，请同学们思考“如果和电影里设想的那样能利用恐龙的DNA使恐龙复活，你认为主要需要解决哪些问题”。同时，请同学们课后设计实验证明“mRNA上决定氨基酸的密码子是由三个碱基组成的”，并要求用简图或文字书面表达出实验设计思路，留待下节课讲解。最后，向学生推荐我校图书馆相关资源及网络资源，以扩展提升同学们的知识水平和能力。

参考文献

[1]刘重斌，闵顺琴，郭益民，等.高等医学院校教研室普及“说课”的实践探讨[J].医学教育探索，2010，9（10）：1335-1336.

通讯作者：曲洪林

《基因指导蛋白质的合成》教学设计 篇4

本节课选自人民教育出版社出版的全日制普通高中课程标准实验教科书《生物 (必修2) 遗传与进化》第4章第1节。本节内容是在前3章学习逐步阐明基因的位置和本质的基础上, 进一步研究基因在生物体内是如何起作用的, 具体学习基因是如何指导蛋白质的合成。本节是从本质上阐述生命现象的理论, 是分子遗传学的核心;是解决基因—蛋白质—性状关系的重要环节。它在教材中起着承上启下的作用, 一方面, 是在前3章的基础上完成的, 可以加深学生对基因及作用机理的认识;对于学生理解生物的遗传有着重要的意义;另一方面, 又为后面基因对性状的控制、生物的变异和进化进行了必要的知识铺垫, 下一定的基础。

2 教学目标

2.1 知识与技能目标

1) 识别DNA与RNA, 识记RNA的种类及功能;2) 描述遗传信息和密码子的概念;3) 概述遗传信息的转录和翻译过程;4) 培养和发展学生的读图能力及分析综合能力;5) 提高合作能力和自主学习能力。

2.2 过程与方法目标

1) 通过一些知识点的对照掌握类比归纳的方法;2) 利用课本插图和课件培养读图能力及从图中获取信息和分析信息能力;3) 通过学习基因控制蛋白质的合成过程培养学生分析综合能力和抽象思维能力;4) 通过分析碱基与氨基酸的对应关系过程, 掌握先逻辑推理再经实验验证的方法;5) 通过小组合作探究, 自主学习过程提高合作能力和自主学习能力。

2.3 情感态度与价值观目标

1) 培养学生主动探究的学习精神, 建立创新及勇于实践的科学精神和科学态度;2) 通过协作学习树立学生的协作意识和团队精神;3) 通过对遗传信息传递与表达的有序性、准确性和独特性的理解, 提升学生关爱生命、敬畏生命、珍惜生命的情感。

3 教学过程

3.1 导入———创设问题情境, 引入新课

展示一组美丽多彩的生物图片, 把学生引进多彩的生物世界, 提出生命为什么如此多姿多彩?引人新课。回顾基因、蛋白质、性状相关知识。性状的体现者是蛋白质, 基因是如何指导蛋白质的合成呢?引出课题──基因指导蛋白质的合成。

3.2 引导设疑、探究新知

提问引发思考:蛋白质是在细胞质中合成的, 而DNA在细胞核中, 那么DNA是如何指导蛋白质的合成?学生讨论, 提出假设:1) DNA从细胞核中进入细胞质中从而指导蛋白质合成;2) DNA和蛋白质分别存在于它们原来的位置只是中间有一个中介可以将DNA上的信息带到细胞质中的核糖体上来指导蛋白质合成。学生讨论完后老师给出材料:1955年Brachet曾用洋葱根尖和变形虫进行实验, 如果加入RNA酶分解细胞中的RNA, 蛋白质合成就停止, 而如果再加进从酵母中提取出来的RNA, 则又可重新合成一定数量的蛋白质。看完材料后学生思考答案:遗传信息的传递与RNA有关。细胞中RNA分子是从何而来?让学生分析比较DNA和RNA的结构。通过对两者的比较引导学生回答:为什么RNA适合做DNA的信使呢?教师出示材料:同年, 拉斯特 (Laster Gold) 等人将变形虫用同位素标记的尿嘧啶核苷培养液来培养, 发现标记的RNA分子首先在细胞核中合成。从而引导学生总结出遗传信息的传递途径是DNA-RNA-蛋白质。

3.3 任务驱动、自主学习、构建框架

提问:DNA上的遗传信息是如何传到RNA上的呢?然后在老师的引导下学生进行自主学习。阅读任务:同学们阅读课本63页这一过程的图解及相关内容。分组讨论找出转录的定义、场所、原料、模板、条件、原则、产物。同时特别注意碱基配对原则。每小组派代表上台通过白板展示转录过程。

提问:当遗传信息到达细胞质后, 细胞又是如何解读的?学生先对翻译的概念作出了解, 然后教师指出翻译实质上是将m RNA中碱基序列翻译为蛋白质的氨基酸序列。

提出问题:碱基与氨基酸之间的对应关系是怎样的?

探究:4种碱基是怎么决定这20中氨基酸的呢?教师引导学生探究, 总结出密码子的概念。解读密码子表, 提出密码子的简并性和通用性。

提出问题:游离在细胞质中的氨基酸, 是怎样运送到核糖体中的m RNA上的呢?课件演示t RNA (教师边演示边讲解并提出反密码子) 。

继续设疑:t RNA怎样把细胞质中游离的氨基酸运到蛋白质的“装配机器”──核糖体上呢?然后在老师的引导下学生进行自主学习。阅读任务:同学们阅读课本66页翻译过程的图解及相关内容。分组讨论找出翻译的定义、场所、过程、原料、模板、条件、原则、产物。同时特别注意m RNA、t RNA、氨基酸的对应关系。每小组派代表上台通过白板展示翻译过程, 重点在让学生弄清楚是m RNA决定氨基酸序列还是t RNA决定氨基酸序列。演示过程出现的问题和错误由其他组解决和修正 (利用电子白板的图形标注库的特点, 让学生自己选择工具和原料, 使学生真正理解翻译过程的对应关系) 。

3.4 归纳总结、完成建构、形成体系

播放基因指导蛋白质合成的flash动画全过程。让学生从整体上把握基因表达的全过程, 边播放边总结, 使学生构建完整知识体系。

4 结束

基因的多样性决定蛋白质的多样性, 从而使生命多姿多彩。生命如此美丽, 探索生命的奥秘会使我们的人生更美好, 也将使生命世界更美好!

摘要：本文详述了基因指导蛋白质的合成一节的教学设计过程。

关键词：基因,蛋白质,教学设计

参考文献

[1]孙伟民.谈多媒体教学环境下的教学设计与实施[J].嘉兴学院学报, 2002, 14 (1) :272-274.

[2]迟欣, 张焕香.多媒体计算机辅助大学英语教学设计[C]//全国大学英语教学改革暨网络环境下外语教学学术研讨会论文集.2005.

分泌蛋白的合成过程 篇5

分泌蛋白原理

信号肽在穿越膜后即被内质网腔内的信号肽酶水解切除。当核糖体与其受体蛋白结合后，SRP与停泊蛋白便解离，各自进入新的.识别、结合循环。当转译进行到mRNA的终止密码子时，蛋白质的合成结束，核糖体的大小亚基解聚，大亚基与核糖体受体的相互作用消失，核糖体受体解聚，内质网膜上的蛋白孔道消失，内质网恢复成完整的脂双层结构。进入内质网腔内的多肽链在信号肽被水解切除后即进行折叠及其他一系列修饰过程，最终形成成熟的分泌蛋白。

蛋白质合成 篇6

关键词：硬脂酰辅酶A去饱和酶；脂肪酸合成酶；脂蛋白酯酶；序列分析；阿勒泰羊

中图分类号： S811.3；Q785文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0043-03

新疆阿勒泰地区位于中国西北边陲，冬季长达半年，许多优良绵羊品种无法适应阿勒泰地区异常寒冷的气候条件，而阿勒泰羊以其全身肌肉丰满、体型肥硕、尾根附近沉积大量脂肪、耐粗饲、抗寒性强等特点，能够适应阿勒泰地区异常寒冷的气候条件，成为当地的优良类群[1]。脂肪酸的合成是由脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成甘油三脂（TAG）[2]，FAS表达水平的高低能够直接影响甘油三脂在体内的沉积[3]，因此FAS是脂肪酸合成代谢的关键酶。Hsu等分离得到人脂肪酸合成酶代谢调控基因，发现人的脂肪酸合成酶基因位于17q25[4]。Kameda等对鹅脂肪酸合成酶代谢调控基因作了研究，发现脂肪酸合成酶代谢调控基因全序列长度大约有 50 kb，同时现已知牛的基因位于19q22、鸡的基因位于18号染色体上[5]。脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase，LPL）是机体脂质和脂蛋白代谢的关键酶，是分解循环脂蛋白中乳糜微粒和极低密度脂蛋白中的甘油三酯，释放出脂肪酸和甘油的限速酶[6]，作为影响脂肪沉积的一个重要遗传标记，研究LPL表达水平对加快肉品质改进速度具有重要的意义。本研究对阿勒泰羊的FAS、LPL基因部分片段进行了克隆、测序，并与已报道的其他物种的相应基因进行序列分析，以期在分子水平的基础上为家畜的改良育种提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

选择新疆福海县5只健康成年的阿勒泰羊，采集阿勒泰羊颈部肌间脂肪、胸部肌间脂肪、腹部肌间脂肪、腿部肌间脂肪、尾部脂肪、肝脏等6个部位的组织，立即放入液氮罐速冻，转入-80 ℃冰箱中保存。

TRIzol、DEPC、DNA marker、Taq PCR Master Mix，购自天根生物科技服务有限公司；PrimeScript@RT reagent kit反转录试剂盒（批号：RR047A），购自TaKaRa公司（批号：DRR420A）；DNA凝胶回收试剂盒（批号：DP209-02）、胰蛋白胨、琼脂粉、琼脂糖、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇，购自北京华美生物工程公司；感受态细胞E.coli DH5α由石河子大学动物科技学院传染病实验室保存。

1.2试验方法

1.2.1目的基因引物设计以GenBank中已发布的绵羊FAS基因（登录号：NM_001009254.1）、LPL基因（登录号：NM_001009394.1 ）为模版，用Primer Premier 5.0软件设计引物，由北京六合华大基因有限公司合成。FAS基因上游引物：5′-CCTCGGTGCCCGTTGTCTAC-3′；下游引物：5′-TGCTGCTCAAAGGATGTGTC-3′；目的片段长度为256 bp。LPL基因上游引物：5′-GATTAGCGATTCCTACTTCAGC-3′；下游引物：5′-AGACTTGTCATGGCATTTCAC-3′；目的片段长度为181 bp。

1.2.2RNA的提取利用TRIzol一步法提取试验样品的总RNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量，于-70 ℃保存备用。然后依次加入以下试剂：1 μg RNA、10× Reaction buffer、1 μL MgCl2、1 μL DNase Ⅰ（RNase-free），用DEPC处理水补足至10 μL，除去存在的少量基因组 DNA。于37 ℃反应 30 min，然后加入1 μL 50 mol/L EDTA，65 ℃孵化10 min，即可用此RNA作为反转录模板。以RNase-free水为对照，用紫外分光光度计测定D260 nm/D280 nm值、总RNA浓度。

1.2.3反转录向提取纯化好的各组织的总RNA中加入以下试剂：2 μL 5×gDNA Eraser bufferⅠ、1 μL 5 xgDNA EraserⅠ、1 μL总RNA，用无核酸酶水补足至10 μL。然后于42 ℃孵育混合物3 min，冷却后向下旋转混匀，将管子放回冰上。再向以上反应液中按指定顺序加入如下试剂：4 μL无核酸酶水Ⅰ、4 μL 5×PrimeScript buffer 2、1 μL RT Prime MixⅠ、1 μL Prime Script RT Enzyme MixⅠ，终体积为20 μL。加完样后轻柔混合，短暂离心，然后于37 ℃孵育混合物30 min，最后于85 ℃加热5 s终止反应。反转录产物可直接用于PCR扩增，或于-20 ℃保存（3个月以内），长期保存建议放于-70 ℃。

1.2.4目的基因PCR反应及克隆测序利用常规PCR反应对组织样品中FAS、LPL基因进行扩增，将目标片段分别从琼脂糖凝胶中切下，按照DNA回收试剂盒说明回收目的片段，在T4-DNA连接酶作用下，经16 ℃过夜连接PGEM-T Easy载体，用CaCl2法将连接产物转入大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选阳性菌落后，挑取单菌落进行培养，然后从菌液中提取质粒，菌液送往上海华大基因科技有限公司测序。

1.2.5基因序列分析采用DNAMAN软件对GenBank中绵羊、山羊、牛、猪、斑马鱼、褐家鼠、马等11个物种和测序后的阿勒泰羊FAS、LPL基因的编码区核苷酸序列进行同源比对分析。用MEGA5.1软件构建进化树，进行遗传进化分析。

2结果与分析

2.1提取总RNA

提取的总RNA经紫外分光光度计测定，D260 nm/D280 nm在1.8～2.0间，表明提取的总RNA无蛋白质和苯酚污染，纯度较高，可用于后续试验。

2.2FAS基因的RT-RCR扩增

以RNA反转录的cDNA为模板，以FAS、LPL的上、下游引物扩增，分别得到256、181 bp的条带（图1、图2）。

2.3FAS、LPL基因测序结果与序列分析

将阿勒泰羊的FAS基因核苷酸序列与已公布的绵羊的相应序列进行分析比对，结果显示序列同源性为99.61%；通过与GenBank数据库中绵羊、牛、小鼠等11个物种进行核苷酸序列比对发现，阿勒泰羊FAS基因与绵羊的序列同源性最高，与西农萨能奶山羊的序列同源性最低；与牛、马、人、猪、褐家鼠的序列同源性均在80%～95%之间；与鸽、鸡的序列同源性分别为72.66%、71.88%；与虎鲸的序列同源性最低，为46.24%（表1）。结果与传统分类相一致。

2.4系统发育树分析

采用MEGA 5.0软件构建了FAS基因系统发育树。从图3可以看出，大分支分为2类，虎鲸为1个分支；其余10个物种聚为一大类，首先禽类的鸽子和鸡成为一类，后与马、褐家鼠以及人、猪聚成的小类合成一类，最后与平行的哺乳纲偶蹄目的绵羊、阿勒泰羊、山羊以及西农萨能奶山羊以及牛聚为一大类。

从LPL的基因系统发育树中可以看出，主支分为2支，第1主支以阿勒泰羊、牛、马、人、鸡等11个物种组成，另1支为罗非鱼。其中第1主支又分为5个分支，第1分支为阿勒泰羊与绵羊；第2分支主要为山羊、牛、猫、马；第3分支为东非狒狒、人；第4分支为小家鼠、豚鼠；第5分支为鸡（图4）。

3讨论

脂肪的合成代谢与分解代谢始终处于一个平衡状态，主要是由甘油三酯的酯化、分解这2个过程主导，其相对速度决定了脂肪的分解或储存。FAS是脂肪合成的关键酶，LPL可以催化乳糜微粒、极低密度脂蛋白中的甘油三酯水解，因此对FAS、LPL基因的研究有助于深入了解脂肪代谢的分子机制。

有关人、鼠、猪、牛等哺乳动物 FAS 基因的结构、定位、表达研究已有报道[7-9]，从序列分析可以看出，阿勒泰羊FAS基因与羊亚科的西农萨能奶山羊的序列同源性较低，这可能与地理环境的差异有关。Krichgessner等从绵羊脂肪组织中克隆测序得到1 656 bp的部分LPL基因序列[10-11]；为获得绵羊全长LPL基因，Bonnet等通过3′-RACE方法获得了1 917 bp的绵羊LPL基因序列[12]，并与Edwards等获得的 LPL基因序列拼接后得到共3 529 bp的绵羊LPL全长cDNA序列，通过Southern Blotting方法定位在绵羊第2号染色体上。本试验克隆测序阿勒泰羊LPL基因的cDNA发现，与GenBank中收录的9种哺乳动物中LPL基因cDNA序列表现了较高的同源性及进化上的保守性。

采用MEGA5.0 软件构建了FAS与LPL基因的系统进化树，进化树上分支节点越近，说明基因序列间遗传距离也相对较近；11个物种构建的系统进化树表明FAS基因中阿勒泰羊和绵羊具有最近的遗传关系，而与虎鲸的亲缘关系最远，LPL基因与罗非鱼的亲缘关系较远，其结果均正确地反映了物种间的进化关系。

随着分子生物学技术的出现和不断成熟，人们从分子生物学水平对脂肪代谢的调控进行了一些探索性的研究，而本研究获得了阿勒泰羊FAS、LPL基因的部分序列，为人们进一步对阿勒泰羊脂肪相关的研究和肉质性状的研究以及育种提供了理论基础，同时也为今后研究阿勒泰羊与牛亚科等近缘物种间分子进化和遗传分化奠定了一定的理论基础。

参考文献：

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多肽的固相合成及载体蛋白修饰 篇7

多肽药物是目前新药开发领域非常具有良疗效和安全性的一类药物, 由于其内源性等特征, 其安全性是传统小分子化药所无法比拟的;但是由于其稳定性差、半衰期短等特性, 在成药性方面又具有一定的短板。

多肽的合成和修饰可以从很大程度上解决其稳定性差这一特点, 具有重要的开发价值;尤其近年来, 科学家们通过各种化学修饰可以有效的限制其分子的免疫原性和毒副反应, 使得多肽药化合的成药性有了很大的提升。

2 固相合成的基本原理

2.1 固相合成原理

固相法首先区分于液相法的不同是, 其反应载体不是在溶液中, 是通过一些共价键结构与一定规格的高分子树脂相连接, 然后在此共价键的结构上通过酰胺键的形式逐个链接一个个氨基酸, 最终将按照序列要求连接的肽链从树脂上切割下来, 经过精制纯化等处理, 可得到需要的序列的多肽。本论文提到的序列主要就是采用此固相法进行合成和精制的。

2.2偶联反应

偶联反应的原理是经典的酰胺反应, 通常指将一个氨基酸的羧基与一个氨基酸的氨基进行缩合、脱去一分子水即可形成肽键;可以采用各种缩合试剂促使该反应的进行, 常用的有DIC、HOBT活化酯法接肽。

2.3 裂解及合成肽链的纯化

FMOC法可以直接采用酸解法进行切割, 根据工艺不同, 也可选取其他脱保护和切割的方法, 如:碱、光解、氟离子和氢解等。由于反应步骤较多, 对纯化的要求较高, 常用的有反相HPLC、离子交换色谱等。

3 实验部分

3.1实验器材

玻璃反应柱, 圆底烧瓶, 移液枪, 移液管, 干燥管, 电子天平, 磁力搅拌器, 离心机 (带离心管) , 锥行瓶, 摇床

3.2 原料及试剂

苯丙氨酸王树脂 (产地:上海吉尔) , Fmoc-Gly-OH (甘氨酸, 产地:苏州天马) , Fmoc-His (Trt) -OH (组氨酸, 产地:苏州天马) , Fmoc-Arg (Pbf) -OH (精氨酸, 产地:苏州天马) , Fmoc-Thr (t Bu) -OH (苏氨酸, 产地:苏州天马) , Fmoc-Ala-OH (丙氨酸, 产地:苏州天马) , Fmoc-Ser (t Bu) -OH (丝氨酸, 产地:苏州天马) , Fmoc-Lys (Boc) -OH (赖氨酸, 产地:苏州天马) , Fmoc-Cys (Trt) -OH (半胱氨酸, 产地:苏州天马) , Fmoc-Phe-OH (苯丙氨酸, 产地:苏州天马) , Ho Bt (1-羟基苯并三唑, 产地:苏州天马) 、DMF (N、N-二甲基甲酰胺, 产地:苏州天马) 、DCM (二氯甲烷, 产地:苏州天马) 、DIPCDI (N, N-二异丙基碳二亚胺, 产地:苏州天马) 等。DIPEA (N, N-乙基二异丙胺, 产地:西安美联) , TFA (三氟乙酸) , TIS (三异丙基硅烷) , EDT (1, 2-乙二硫醇) , TFA (三氟乙酸) , Na H2PO4 (产地:山头光华) , KLH (产地:SIGMA) , MBS (产地:SIGMA)

3.3 HF-13 线性肽树脂的偶联

HF-13 肽序:H-His-Gly-Arg-Thr-Ala-Ser-Arg-Thr-LysCys-Arg-Lys-Phe-OH

3.3.1 取1.268g苯丙氨酸王树脂 (0.8mmol) , 置于玻璃反应柱中, 加5ml DMF, 溶胀15分钟, 抽干。

3.3.2 树脂中加入约5ml 20%六氢吡啶的DMF溶液, 进行去保护, 反应5分钟后抽干, 再次加入约5ml20%六氢吡啶的DMF溶液, 反应7分钟后抽干。用玻璃棒取少许树脂做茚三酮检测, 肽树脂为蓝黑色。然后用DMF和DCM洗涤7-8遍, 抽干。

3.3.3 称取1.874g Fmoc-Lys-OH (Fmoc-赖氨酸) 置于柱中, 用约5ml DMF溶解, 加入DIC 0.81ml, 同时调节氮气搅拌使树脂完全搅拌均匀, 反应2个小时。

3.3.4 2小时侯, 用玻璃棒取少许树脂, 进行茚三酮检测, 肽树脂完全透明。

3.3.5 将反应柱抽干, 用DMF洗涤4遍。

3.3.6 重复以上偶联过程3.3.2 到3.3.5 至所有氨基酸偶联完全。

3.3.7 树脂中加入约5ml甲醇使树脂充分收缩, 抽干树脂, 称重得肽树脂2.534g。

3.4 HF-13线性肽树脂的裂解

3.4.1把以上反应好的树脂置于50ml的圆底烧瓶中, 并放入一个搅拌子。

3.4.2 按以下配比配制25ml裂解液:三氟乙酸 (TFA) :三异丙基硅烷 (TIS) :水 (H2O) = 95:2.5:2.5

3.4.3 将裂解液按照每克树脂10ml裂解液的比例, 加入25ml至圆底烧瓶中, 并将圆底烧瓶置于磁力搅拌搅拌器上, 打开电源开关, 并缓慢调节调速旋钮到合适的速度, 搅拌反应2个小时。

3.4.4将裂解液过滤到1L的广口瓶中, 并加入250ml冰冻乙醚, 沉降半个小时, 倒掉上清夜, 将沉淀均分在四个离心管中, 于离心机中离心, 转速3000r/分钟。离心时间3分钟, 取出离心杯, 倾去上清液, 得到粗肽。

3.4.5将以上离心所得粗肽放入真空泵中抽干, 取出, 称重, 1.304g。

3.4.6粗肽送HPLC检测

3.5 HF-13线性肽粗品的纯化

交由公司纯化人员完成, 得到精肽764mg, 并送HPLC检测

3.6 KLH的偶联

3.6.1 buffer B:0.01mol/L Na H2PO4 PH=6 500ml 0.781g

buffer C:0.01mol/L Na H2PO4 PH=7 200ml 0.312g

3.6.2 称取20g MBS溶解于1.6ml DMF中, 另称取200mg KLH (磷酸盐冻干粉) 溶解于6ml H2O中;把MBS溶液加入KLH溶液中, 搅拌反应30min, 溶液总体积7.6ml. (KLH:10mg/ml)

3.6.3 取2g G-25葡聚糖凝胶, 水浴加热煮沸30min, 冷却后装入层析柱, 用蓝色葡聚糖确定柱子前体积约4.5ml。 用buf⁃fer B冲洗柱子约10 个柱体积后, 把3.6.2 中的反应液过柱, 用buffer B作淋洗液, 收取约16ml溶液 (。约2倍原反应液体积)

3.6.4 将精肽20mg加入3.6.3 步收取的反应液, 此时送HPLC检测

用三乙胺调节反应液PH至7.3, 搅拌反应约5个小时。

3.6.5将反应液送HPLC检测, 反应底物吸收峰消失,

反应到达终点, 停止反应。

3.6.6 取3.6.4 中反应液过柱, 用H2O作淋洗液, 收取40m溶液 (约2.5倍原反液体积) 。冻干, 称重的成品85mg。

3.7 结果讨论

1) 固相多肽合成工艺快捷有效, 能克服传统液相合成路线的许多弊端。

2) 用HPLC系统对多肽-蛋白在缓冲体系的在线监测, 经过数小时的反应, 新的物质 (载体蛋白-多肽) 已经生成, 并反应完全。

3) 载体蛋白KLH对多肽的修饰可以在适当的缓冲体系中有效地完成。

参考文献

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[7]Egan, S.E.;Weinberg, R.A.Nature 1993, 365, 781.

蛋白质合成 篇8

水凝胶是介于液体和固体之间、由亲水性高分子组成、能在水中溶胀并保持大量水分而又不溶解的亲水性聚合物, 由于其结构、性质等功能化特性而具有很大的开发和应用价值。丝胶蛋白 (简称ss) 是一种水溶性的球状胶体蛋白, 由18种氨基酸组成, 其中含极性侧链基团的氨基酸比例较高, 约占72%, 这些极性氨基酸侧链上的羟基、氨基等活性基团比较活泼, 使丝胶蛋白具有高亲水性质、两性性质和胶体、变性、膨润、溶解等性质及生物相容性和生物活性等特性, 可形成凝胶、膜、泡沫、纤维等应用性材料[1]。单独用ss凝胶风干所得薄膜的力学性能很差, 薄膜很脆且拉伸强度低, 在水中的溶失率高, 限制了ss的应用领域, 有研究人员试图将ss溶液与其他物质共混或发生共聚、交联反应, 得到新产物的凝胶, 再风干制膜, 以此改善ss薄膜的力学性能和水溶性, 使薄膜具有良好的透水性、透气性和良好的力学性能[2]。为此, 课题以ss为基体, 通过对合成ss基水凝胶膜工艺路线的研究, 探索合成具有良好使用性能, 既可保持ss的生物功能, 又可改善ss成膜性的ss基水凝胶膜的最佳方法, 初步探讨ss基水凝胶膜的性能, 为ss在生物材料领域的应用提供一定的基础数据。

1 实验

1.1 主要原料

1.1.1 丝胶蛋白

丝胶蛋白是蚕丝中包覆在丝素外围, 性状与动物胶相似, 对丝素起保护和胶粘作用的一种球状蛋白, 相对分子量为1.4~31.4万。试验所用丝胶蛋白原料由本所根据试验要求分别制备。

1.1.2 化学试剂

聚乙二醇二缩水甘油醚 (PEGO) :一级品, 上海如发化工科技有限公司提供;戊二醛 (GA) :生化试剂, 上海市五联化工厂生产;甲基丙烯酸 (MAA) :分析纯, 上海市五联化工厂生产;过硫酸铵 (APS) :分析纯, 上海市爱建试剂厂生产;N, N-亚甲基双丙烯酰胺 (MBA) :分析纯, 上海市化学试剂公司提供;柠檬酸 (C6H807) :分析纯, 中国医药集团上海化学试剂公司;磷酸氢二钠 (Na2HPO4) :分析纯, 成都科龙化工厂;磷酸二氢钠 (Na H2PO4) :分析纯, 成都科龙化工厂;无水碳酸钠 (Na2CO3) :分析纯, 成都科龙化工厂;碳酸氢钠 (Na HCO3) :分析纯, 上海虹光化工厂。

1.2 丝胶蛋白基水凝胶膜的制备

将ss与另一成膜组分的单体按1∶1质量分数比同时溶于去离子水中, 然后加入各自的交联剂和引发剂等, 充分搅拌, 于60℃温度静置反应24h, 将制得的ss基水凝胶常温浸泡于去离子水中5h, 每隔4h换一次水以去除未反应的单体、交联剂和引发剂, 最后将水凝胶切割成片, 烘干, 制得ss基水凝胶膜。

试验中选取另一成膜组分为聚甲基丙烯酸 (PMAA) 高分子聚合物, 其单体为甲基丙烯酸 (MAA) ;交联剂为N, N-亚甲基双丙烯酰胺 (MBA) , 其加入量为MAA质量的2.7%;引发剂为过硫酸铵 (APS) , 其加入量为MAA质量的1.0%。

1.3 ss基水凝胶膜性能的检测

1.3.1 含水率

经充分平衡后的ss基水凝胶膜, 称重后于105℃烘箱中烘至恒重, 按下式计算含水率 (C) 。

式中:Md、Ms分别为丝胶膜的干重和经充分平衡后的重量。

1.3.2 断裂强度和断裂伸长率

将ss基水凝胶膜裁成长宽为60mm×50mm的样品, 测定试样五个不同位置的厚度后得到平均厚度, 平衡24h后, 使用织物强力仪, 夹持长度40mm, 拉伸速度100mm/min匀速进行拉伸试验。ss基水凝胶膜在被拉伸至断开时受到的力为断裂强力, 与此相应的伸长量与夹持长度之比为断裂伸长率。通过下式计算得断裂强度。

式中:P为试样的断裂强度, MPa;F为断裂强力, N;S为式样的断裂面积, mm2。

1.3.3 溶失率

ss基水凝胶膜试样按1∶120的浴比浸渍于去离子水中, 于37℃恒温振荡24h, 然后滤出未溶解的试样, 于105℃烘干至恒重, 按下式计算凝胶膜的热水溶失率。

1.3.4 溶胀度

将充分干燥的试样精确称重后, 放入指定温度的不同p H缓冲溶液中, 每隔一定的时间取出, 用滤纸吸干表面的液体, 迅速称量湿胶质量。按下列公式计算溶胀度 (SR) 。

式中:Wt为t时刻溶胀湿胶重量 (g) , Wa为干胶重量 (g) 。

2 结果与讨论

2.1 ss交联剂的选择

可作ss交联剂的品种较多, 常用的有GA、PEGO、聚乙二醇 (PEG) 、二羟甲基脲 (DMU) 等, 经过条件对比试验和综合各项因素, 实验选择PEGO作为ss交联剂。

PEGO是一种柔性的高分子长链脂肪族双环氧基树脂, 与其它高分子结合后可以改变高分子的结构而使其变得柔软、有弹性和韧性。试验中发现加入PEGO后, ss基水凝胶膜的溶失率、断裂强力和断裂伸长率等力学性能发生了变化, PEGO对ss基水凝胶膜内丝胶蛋白质大分子有一定的交联作用。

2.2 ss交联剂含量对ss基水凝胶膜含水率的影响

采用不同PEGO交联剂含量 (相对ss的质量分数, 以下相同) 制备出一系列ss基水凝胶膜, 分别测出ss基水凝胶膜的含水率, 其结果如表1所示。

由表1可见, 本试验工艺条件下制备得到的ss基水凝胶膜, 随着交联剂比例的增加, ss基水凝胶膜的含水率逐渐增大, 当ss交联剂含量达到50%时ss基水凝胶膜的含水率最大, 但随着ss交联剂含量的增加, 含水率有趋于平稳稍有下降的倾向。

2.3 ss交联剂含量对ss基水凝胶膜力学性能的影响

断裂强度和断裂伸长率常用来检测膜材料交联程度和机械性能, 它代表膜材料的柔韧性、抗拉力和抗撕裂能力, 能够为复合膜材料的应用范围提供依据, 如用于组织工程材料时, 要求较高的力学性能, 而用作烧伤敷料等, 则要求不高[3]。本试验通过化学交联法以PEGO为交联剂, 用不同PEGO含量制备ss基水凝胶膜, 测其断裂强力和断裂伸长率, 结果见表2。

由表2可以看出, 随着交联剂含量的增加, ss基水凝胶膜的断裂强度缓慢增大, 当加入量增至30%时断裂强度最大, 继续增大交联剂含量断裂强度反而降低;而ss基水凝胶膜的断裂伸长率, 则随着交联剂含量的增加逐渐增大。这是因为未交联的ss, 大分子间或大分子链段间主要依靠氢键和范德瓦尔引力结合, ss的氨基酸中具有极性侧基的氨基酸占到74%左右, 如丝氨酸、组氨酸、赖氨酸等, 本试验使用的交联剂PEGO除分子的两端都有双环氧基团外, 中间还含有柔性链段, 能与ss大分子的某些极性侧基发生反应和将蛋白质分子链段间相互隔离, 使链段间可以相互滑移, 从而将这些极性基团屏蔽, 在一定程度上减小了大分子链段间的相互作用力。因此, 添加适量的PEGO交联剂, 能一定程度上改善ss基水凝胶膜力学性能。

2.4 ss交联剂含量对ss基水凝胶膜溶失率的影响

丝胶蛋白是一种高分子物质, 它和适当的液体接触时会自动地吸收液体而膨胀变软, 经无限膨润后就溶解于液体, 这是丝胶最重要的性质, 也是人们能用水来制丝、精练脱胶的根据[4]。不添加交联剂的纯丝胶蛋白膜, 成膜性差, 易溶于热水。试验中我们添加不同含量的PEGO交联剂制备出ss基水凝胶膜, 分别测出ss基水凝胶膜的溶失率, 其结果如表3所示。

由表3可看出, 随着交联剂含量的逐渐增加, ss基水凝胶膜的溶失率逐渐降低, 当交联剂含量为30%时, ss基水凝胶膜的溶失率为20.1%达到最低值, 说明ss基水凝胶膜得到了较大程度的交联, 但是继续提高交联剂含量, ss基水凝胶膜的溶失率反而逐渐加大, 这可能因为PEGO交联剂与丝胶的反应并未完全, 添加得越多, 未反应的PEGO交联剂就越多, 未参加反应的过量PEGO交联剂溶出造成了溶失率的增大。以上结果表明, 添加适量的交联剂可以提高ss基水凝胶膜的耐水性, 从而降低ss基水凝胶膜的溶失率。

2.5 ss基水凝胶膜的pH敏感性

ss是一种两性的弱电解质, 具有相对较弱的p H敏感性, 为了增强ss基水凝胶膜对p H敏感性, 试验中我们选用pH敏感性物质甲基丙烯酸 (MAA) 作为另一成膜组分的单体合成了ss基PMMA水凝胶膜。根据《GB/T603-2002化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备》要求, 用柠檬酸、磷酸二氢钠配制成pH为2.6, 4.0和6.0的缓冲溶液, 磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配制成p H为7.4的缓冲溶液, 无水碳酸钠和碳酸氢钠配制成pH为9.2和10.8的缓冲溶液, 将试验样品分别放入配制好的p H缓冲溶液中, 浸泡24h后测量其溶胀度, 以考察ss基水凝胶膜的pH敏感性, 结果如表4。

由表4可看出, pH在2.6~4.0的溶胀度比较接近, 溶胀度相对较低, 而p H为6.0时其溶胀度比pH为4.0时飞速增加近10倍, pH在6.0~7.4之间溶胀度变化不大, pH在7.4~9.2之间溶胀度又迅速增加达到最高峰值, 随后增大p H值至10.8, 其溶胀度减少, 呈下降趋势, 这些现象疑与试验样品在酸性条件下ss中的-NH, -OH等极性侧基和PMAA中的-COOH基团形成分子之间氢键作用, 导致凝胶膜网络收缩、溶胀度较低, 而在碱性条件时, ss和PMAA中的-COOH电离, 凝胶膜网络中的物理交联点被破坏, 凝胶膜网络结构变得较为疏松, 因此产生较高的溶胀度有关[5]。试验结果表明, PMAA中羧基的离子化程度和ss的等电点对凝胶溶胀度的增加有直接的影响, 以ss和PMMA为组分的水凝胶膜具有显著的pH敏感性, 是一种潜在的药物控释的高分子载体。

3 结语

3.1 聚乙二醇二缩水甘油醚 (PEGO) 对ss基水凝胶膜有显著的交联作用。

3.2适量加入聚乙二醇二缩水甘油醚 (PEGO) 能提高ss基水凝胶膜的断裂强度和断裂伸长率, 改善了ss基水凝胶膜的柔韧性和成膜性。

3.3 适量加入聚乙二醇二缩水甘油醚 (PEGO) 能降低ss基水凝胶膜溶失率。

3.4 本试验制备的ss基水凝胶膜具有明显的p H刺激响应性。

摘要：以丝胶蛋白为研究主体, 与另一成膜组分聚甲基丙烯酸的单体按1∶1质量分数比合成丝胶蛋白基水凝胶膜, 探讨交联剂种类、用量对丝胶蛋白基水凝胶膜性能的影响。试验结果表明, 聚乙二醇二缩水甘油醚 (PEGO) 交联剂对丝胶蛋白基水凝胶膜的交联作用明显, 改善了丝胶蛋白膜的物理性能;研制出的产品具有一定的柔韧性和pH刺激响应性。

关键词：丝胶蛋白基,水凝胶膜,交联剂,合成,性能

参考文献

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蛋白质合成 篇9

再生家蚕丝素蛋白(SF)是从废弃茧壳、废丝中提取的一种天然蛋白质纤维,其作为纯天然生物高分子材料应用于医用领域已经有很长历史[1]。近年来蚕丝性能及应用的研究和蛋白质工程学不断发展,科学工作者对其在生物整体、细胞、分子生物学3个水平的研究结果都表明,蚕丝蛋白具有与活体组织良好的细胞亲和性、生物相容性、透气性、可降解性等,其在生物材料、精细化工等方面引起了人们的广泛关注,有关蚕丝蛋白性质和应用的研究层出不穷[2]。再生丝素蛋白存在成型差、持水性差等缺点,对其的改性研究成为必然。在诸多的改性方法中,聚乙二醇(PEG)化合物由于其优良的生物相容性、化学稳定性和致孔性,已成为丝素蛋白修饰改性的一大选择[3]。卢神州等[4]以PEG缩水甘油醚对丝素蛋白膜进行改性,大大降低了丝素大分子的溶出率,改性后的丝素膜具有较好的拉伸强度和较大的断裂伸长率。刘宇清等[5]将不同相对分子质量的PEG以不同比例混入SF中形成共混丝素膜,该膜具有良好的拉伸性、透水性、透气性、透光性和一定的生物降解与溶解性,但同时也发现二者相容性不良而导致力学性能差。

本研究拟通过将SF纳米化形成NanoSF片段后,采用高分子反应法,将NanoSF片段接枝到PEG分子上,制备NanoSF/PEG接枝化合物,通过正交试验法筛选工艺条件,以获得最优转化率。

1 实验

1.1 试剂和器材

蚕茧壳由重庆纤维检测中心提供;乙醚、丁二酸酐、二甲基亚砜、二氯亚砜、苦味酸、胭脂红、Na2HPO4·2H2O、KH2PO4、NaHCO3、DMSO等药品均为市售分析纯;N,N-二甲基甲酰胺(DMF)经蒸馏除去水分后备用;聚乙二醇400为进口分装;透析袋购自上海绿鸟科技发展有限公司,进口分装,标定截留分子量14000。中性蛋白酶购自南宁庞博生物工程有限公司,酶活力20×104 u/g。

1.2 实验方法

1.2.1 再生纳米丝素蛋白NanoSF粉末的制备

参照文献[6]的方法制备纳米丝素蛋白粉末。

将废弃茧壳置于异丙醚中浸泡2 d以去除茧壳表面的蜡质物,蒸馏水洗净干燥后用无水乙醇浸泡2 d,以去除茧壳中碳水化合物,再用蒸馏水煮沸6 h脱去丝胶,洗净干燥,用苦味酸胭脂红溶液检验丝胶脱除情况,得到纤维状丝素蛋白。

将丝素纤维溶解在质量分数为60%的NaSCN溶液中,过滤,将滤液装入透析袋内,在纯水中透析3 d后取出浓缩,按照丝素与蛋白酶为10∶1(质量比)的比例加入中性蛋白酶,调节pH值为6.0～7.0,控制温度在50～55 ℃, 磁力搅拌水解2 h, 在-40 ℃冻库中让酶失活停止反应。过滤后用蒸馏水洗涤,在50 ℃真空干燥24 h得到NanoSF粉末。

1.2.2 NanoSF和PEG的接枝合成

NanoSF和PEG的合成步骤为:

(1)PEG的酯化

将PEG 400和丁二酸酐以物质的量比1∶1.2加入装载一定量N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂的三口烧瓶中,油浴温度80 ℃,电动搅拌反应5 h。反应结束后,于60 ℃用环己烷将所得溶液萃取3次,以除掉溶液中多余的丁二酸酐,从而得到较纯的聚乙二醇酯化物,备用。

(2)PEG-丁二酸酯酰氯的合成

使用分液漏斗将SOCl2缓慢滴入聚乙二醇酯化物DMF溶液中(SOCl2与丁二酸酐物质的量比为1.2∶1),75 ℃冷凝回流,直至冷凝管出口处无酸性气体放出时结束反应,然后减压蒸馏出多余的SOCl2。

(3)NanoSF/PEG接枝化合物的合成

依照表1所示反应时间、温度、投料配料比进行合成实验。具体步骤为:在NanoSF的DMF溶液中,加入制备好的聚乙二醇酰化物,控温条件下进行反应。将反应产物抽滤后取滤饼,再用蒸馏水清洗3次。将滤饼于50 ℃干燥24 h得到粉末,将该粉末浸入CaCl2/C2H5OH/ H2O(物质的量比为1∶2∶8)的有机无机混合溶剂中,70 ℃搅拌15 min以溶解未反应的NanoSF。抽滤,取滤饼多次水洗后干燥,即得到NanoSF/PEG接枝物。

本实验还以最高转化率为目标进行了反应时间、温度、投料配料比的三因素三水平的正交实验,筛选最优工艺。

1.2.3 仪器表征

在全自动氨基酸分析仪(日立L-8800型)上进行氨基酸组成分析,测定SF以及NanoSF的氨基酸组成。采用KBr压片法,使用Perkin-Elmer BX 型傅里叶红外光谱仪对NanoSF粉末和NanoSF/PEG复合物进行红外光谱表征。

2 结果与讨论

2.1 氨基酸分析检测结果

再生丝素是一种纤维蛋白质,含有18种氨基酸。采用文献[6]的方法,丝素经过盐溶、透析、中性蛋白酶酶解,制备了纳米级丝素蛋白(NanoSF)。SF成为NanoSF后,其氨基酸组成的变化情况如表2所示。

分析结果显示,带有反应性侧基的氨基酸中,酪氨酸、赖氨酸和组氨酸酶解前后含量均未发生明显变化;天门冬氨酸、谷氨酸、精氨酸在NanoSF中含量有所下降,但变化幅度不大。因此可以认为SF经中性蛋白酶酶解成为NanoSF后,其整体的活性反应氨基酸未受到太大影响,但其结晶度有所增加。

2.2 NanoSF/PEG接枝化合物的红外光谱

图1为NanoSF/PEG的红外光谱图,在2934 cm-1和1446 cm-1处出现了较为明显的CH2不对称伸缩振动峰和弯曲振动峰;1166 cm-1处出现了C-O-C的伸缩振动峰;1233.12 cm-1处代表C-O的伸缩振动峰增强。接枝后的产物中出现了较为明显的-CH2和C-O-C基团的吸收峰,而这2个基团是PEG的特征基团,说明丝素分子上成功接枝上了PEG。而C-O峰变得更为尖锐且强度增强,是因为引入的丁二酸酐与PEG形成酯化物后使C-O的吸收峰增强。对比NanoSF红外图谱[7],结果显示:通过丁二酸酐的“搭桥”将PEG接枝到了丝素分子上,得到了目标产物。

2.3 NanoSF/PEG接枝物的制备条件筛选

表3为NanoSF/PEG接枝化合物反应时间、温度、投料配料比的三因素三水平正交试验结果与分析。从试验直观来看,在9组试验结果中以第9组的转化率最好,达到90%,其相对应的水平组合为温度80 ℃、时间3 h、SF与PEG物质的量比1∶10。

通过正交试验数据计算诸个因素在每个水平下的平均转化率,如在60 ℃下3次实验的转化率之和为T1=62+89+72=223,其平均值为M1=223/3≈74;在70 ℃下平均值为78;80 ℃下平均值为87。这3个平均值的极差R=87-74=13。同理,作用因素为反应时间时,其平均转化率为76、85、78,极差为9;作用因素为反应配比时,平均转化率为74、87、78,极差为13。

由数据得出温度越高,转化率越高,反应时间以2 h最佳,SF与PEG反应配比(物质的量比)为1∶10时转化率最高。配比(物质的量比)为1∶5时,产物的收率相对较低,推测在该配比下,PEG接枝物的含量不足以使丝素反应完全。当配比(物质的量比)为1∶10时产物收率达到最大,说明此时的反应原料足以使丝素充分反应。但随着反应物中PEG含量的进一步提高,收率反而有所下降,这可能是由于反应物粘度变大后,不利于反应的进行,使丝素反应不充分所致。在本实验中,3个因素对转化率的影响从大到小为:温度、反应配比、时间。

3 结论

通过对PEG的酯化反应和酰氯化反应,使PEG接上了反应活性基团,再通过与纳米丝素蛋白的高分子反应,获得了SF/PEG接枝化合物。红外表征发现PEG接枝SF后其红外图谱中出现了SF及PEG相关基团的特征吸收峰,显示出在丁二酸酐“搭桥”作用下吸收峰的变化,说明丁二酸酐对SF和PEG进行的“搭桥”反应成功,确认了目的化合物。

以最大转化率为目标对接枝反应进行三因素三水平正交实验,确定温度为80 ℃、时间为3 h、SF与PEG配比(物质的量比)为1∶10是最优工艺组合,且温度与反应物粘度对反应的转化率影响较大。

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蛋白质合成 篇10

黄酮类化合物是一类植物中普遍存在的苯并色酮类衍生物,大量数据表明其在癌症的预防以及治疗中发挥重要作用[5]。Flavopiridol是一种可人工合成的黄酮,作为第一个进入临床试验的CDK抑制剂[6],研究发现它对多种肿瘤细胞系,如肺癌、乳腺癌等均具有抗肿瘤活性,而且可以抑制异种嫁接模型中肿瘤的生长[7]。本研究以Flavopiridol作为参照,设计合成了7个新的查尔酮类似物,对这些化合物进行了结构确证,并测定了他们对CDK1的抑制活性以及对HCT116的体外抗肿瘤活性。

1 材料与方法

1.1 仪器

RY-1熔点测定仪(温度计未校正),VERTEX 70 Brucker红外光谱仪,API 4000型质谱仪,Advance Brucker 400型核磁共振仪,所使用的溶剂为氘代试剂,以TMS为内标。

1.2 目标化合物的合成

合成路线见图1。

R:分别为4-CH3;4-OCH3;4-Cl;4-Br;3-CH3; 3-OCH3;3-Cl七种取代基。1.2.1 化合物2、3的合成 方法与文献研究[8]相同。1.2.2 1-(2-羟基-4,6-二甲氧基苯基)-3-对甲基苯基-丙-2-烯-1-酮的合成(化合物4a) 氢氧化钾10.0 g溶于80 mL乙醇和20 mL水的混合液中,再投入4.0 g化合物3(0.02 mol)和对甲基苯甲醛3.6 mL(0.03 mol),于室温搅拌3 h后,用2 N盐酸溶液调 pH至8～9,析出大量固体,抽滤,固体用水洗至中性,干燥得黄色粉末5.5 g,回收率92 %。1.2.3 化合物4b-4g的合成 方法同化合物4a的合成。1.2.4 (E)-1-[2-羟基-4,6-二甲氧基苯基-3-(哌啶甲基)苯基]-3-(4-甲基苯基)-丙-2-烯-1酮的合成(化合物5a) 化合物4a 1.6 g(5.0 mmol)、多聚甲醛0.5 g(15.0 mmol)、哌啶1.0 mL(11 mmol)、甲醇20 mL投入反应瓶中,搅拌后加入盐酸数滴,回流2 h,冷却,减压回收溶剂,加水稀释,用5 %氢氧化钠溶液碱化,二氯甲烷40 mL,提取3次,饱和氯化钠溶液30 mL,洗涤3次,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压回收后,用无水乙醚浸泡,抽滤得黄色粉末1.2 g,硅胶柱层析,洗脱剂为石油醚 ∶乙酸乙酯 ∶三乙胺。1.2.5 化合物5b-5g的合成 方法同化合物5a的合成。1.3 目标化合物的结构确证 目标化合物结构分别用IR、1H-NMR、ESI-MS确证。1.4 目标化合物的活性测定1.4.1 目标化合物对CDK1抑制活性的测定 方法与文献研究[9]相同。1.4.2 目标化合物对HCT116的体外抑制作用 采用MTT法,由美国佐治亚州立大学化学系完成。

2 结果与讨论

本研究合成了7个化合物,经过IR、1H-NMR、ESI-MS证实,所合成的化合物与预期结构一致,详见表1(由于化合物5f所余量很少,所以没有做IR)。对合成的7个化合物进行活性测定的结果表明,化合物5b、5c和5d对CDK1的抑制活性高于对照Flavopiridol,所有化合物对HCT116的体外抑制活性都低于Flavopiridol,但IC50值也都在微摩尔数量级,其中5c、5d、5e、5f的IC50在2～3 μM,显示出较强的抑制活性,详见表2。上述结果表明Flavopiridol中的哌啶环被一个连有亚甲基的哌啶环代替后,有可能得到活性更好的类黄酮,这为我们今后寻找此类CDK抑制剂提供了参考。

摘要：目的:寻找活性更好的类黄酮CDK s抑制剂。方法:利用M ann ich反应制备7个查尔酮类类黄酮。结果:目标化合物的结构经过IR、1H-NMR、ESI-MS确证,并测定了化合物对CDK1的抑制活性以及对HCT116的体外抗肿瘤活性。结论:其中有3个化合物对CDK1的抑制活性高于对照F lavop iridol,所有化合物对HCT116显示较强的抑制活性。

关键词：查尔酮,CDK1抑制活性,体外抗肿瘤活性

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