氧化硫硫杆菌

氧化硫硫杆菌（精选八篇）

氧化硫硫杆菌 篇1

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

菌种:选取北京理工大学生物制造实验室中经过多次培养和刻蚀加工后的氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferroxidans,简称T.f菌)。

蒸馏水:1 000mL。

1.1.2 培养基

Leathen液体培养基:(NH4)2SO40.15g/L,K2HPO40.05g/L,KCl 0.05g/L,MgSO4·7H2O 0.50g/L,Ca(NO3)2·2H2O 0.01g/L,p H 2.0,最终Fe2+浓度在100g/L。

1.1.3 仪器

紫外-可见分光光度计(UV-2550型,北京瑞丽);酸度计(PHS-3C型)、全温振荡培养箱(HZQ-F160型)、洁净工作台(YXQ-SG-46-280)、手提灭菌器(YXQ-SG-46-280)、溶剂过滤器(上海博迅实业有限公司);电子天平(FA1104,上海民桥电子天平有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验前期准备

所有试剂瓶120℃下烘干15min,随后进行121℃高温0.1Mpa高压灭菌15~20min,然后进行15min以上紫外线照射灭菌。

为保持培养基成分的稳定,配制10倍浓度的培养基液,供以后每次稀释使用,调节培养液的p H值为1.8。

将30W的紫外灯打开,预热20min,备用。

1.2.2 菌种激活培养

按照锥形瓶100ml接种10ml T.f菌液进行培养,将装有T.f菌液的上述锥形瓶置于培养箱中,摇床速度160r/min,温度30℃,培养52h。T.f菌激活培养后,继续转代培养2到3代,每代用时(以后简称代时)24h,直至T.f菌完全被激活,备用。

1.2.3 实验方法

取4个直径为9cm的培养皿,分别编号为1-4,在每个培养皿中放入激活的5ml菌液,1号培养皿中的菌种为对照组,将编号为2-4的培养皿放在距离预热后的紫外灯30cm出的位置辐照,辐照时要防止光线的照射。按照编号顺序分别辐照120s、240s和300s。将对照组的菌种和经过不同时间辐照后的菌种按照编号分别进行培养,培养时间为72h。在培养过程中,每隔6h取样1次,测量菌种的浓度、p H值、氧化还原电势以及Fe2+的浓度。

1.2.4 测量方法

利用紫外-可见分光光度计(调整发射波长为420nm)测量菌种的浓度,测量前预热30min;利用酸度计测量菌液的p H值和氧化还原电势;利用重铬酸钾容量法测定菌液中的Fe2+浓度。

2 结果与分析

2.1 培养液中细菌浓度的变化

1~4组菌液中菌种浓度的随时间的变化曲线如图1所示。

由图1可知,经过120s、240s紫外线照射诱变后的T.f菌,经过一段时间的培育后,菌液中的细菌浓度大幅度提高,但经过300s的紫外线照射后,经过同样时间的培养,菌液中细菌的浓度仍十分低。其原因在于,由于紫外线的辐射非常强烈,长时间的辐射将使细菌细胞发生永久性变形并失去生理功能,造成大量的细菌死亡,活下来的细菌极少,因此培育时间更长。上述实验表明,在采用紫外线照射诱变T.f菌的情况下,最长的照射时间以不超过240s为宜,过长则造成转代培养的时间延长且效果不好。当用紫外线辐照240s后,在132h时,T.f菌浓度是对照组浓度的2.23倍。

2.2 培养液中p H值的变化

图2是1~4组培养液中p H值随时间的变化曲线。

图2表明,与对照组相比,经过240s的紫外线辐照后,培养54h时,第3组的培养液中的p H值与对照组p H值低0.28,更适合于T.f菌的生长繁殖。

2.3 培养液中氧化还原电位的变化

图3是1~4组培养液中氧化还原电位随时间的变化曲线。

氧化还原电位表示T.f菌生物刻蚀的能力,培养6h后,与对照组相比,经过240s紫外线辐照的培养液中的氧化还原电位绝对值为对照组的1.13倍,表明其活性更强,有利于生物刻蚀的进行。

2.4 培养液中Fe2+浓度的变化

图4是1~4组培养液中Fe2+的浓度随时间的变化曲线。

Fe2+是T.f菌的主要能量来源,溶液中Fe2+浓度的变化可用来表示T.f菌的氧化活性。在初始Fe2+浓度相同的情况下,溶液中Fe2+浓度愈低,表示T.f菌将Fe2+氧化为Fe3+的能力愈强,即氧化活性越好。由图4可看出,与对照组相比,经过紫外线照射后,T.f菌的浓度增加,氧化速度更快,消耗Fe2+的速度增加,24h到30h时曲线斜率分别为0.683和0.236,表明第3组的Fe2+浓度比对照组下降更快,而第4组由于辐照过量,T.f菌经过一段时间培养后,仍然很难恢复活性和足够的浓度,因此其Fe2+浓度下降缓慢。

3 结论

实验结果表明,在240s的时间范围内,随着紫外线辐照时间的延长,菌液中的p H值逐渐减少,达到T.f菌的最佳生长p H值,T.f菌中氧化还原电势的绝对值逐渐升高,说明氧化活性越来越强,选育菌种的生存能力得到增强,新陈代谢旺盛,消耗的Fe2+量很快,表明经过紫外线辐照后T.f菌的活性增强,经过240s紫外线辐照后,T.f菌的浓度为对照组的1.21倍。但紫外线辐照超过240s后,由于紫外线辐照过度,造成大量菌种死亡,能存留下来的菌种越来越少,致死率过高,T.f菌的浓度降低,造成培养繁殖非常困难。因此,在紫外线辐照菌种的诱变中,以不超过240s为宜。

参考文献

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[7]李曼.嗜酸氧化亚铁硫杆菌驯化条件的研究[J].武汉科技学院学报,2009,2(2):12-16.

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[9]肖雷,姚菁华,陶秀祥,等.氧化亚铁硫杆菌培养条件的优化[J].选煤技术,2008,(6):12-15.

氧化硫硫杆菌 篇2

硫杆菌和元素硫在治理重金属污染中的应用研究进展

摘要：硫杆菌和元素硫在治理土壤和沉积物中重金属已经有了较多的研究.本文论述了利用硫杆菌和元素硫治理土壤和沉积物中的.重金属污染的应用进展.主要包括了利用硫杆菌和元素硫去除重金属的优缺点及主要的影响因素,如温度、pH、细菌种类、元素硫浓度等.作 者：崔岩山    CUI Yan-shan  作者单位：中国科学院,研究生院,资源与环境学院,北京,100049 期 刊：土壤通报  ISTICPKU  Journal：CHINESE JOURNAL OF SOIL SCIENCE 年，卷(期)：2007, 38(2) 分类号：X131.3 X53 关键词：硫杆菌    元素硫    重金属    应用   

氧化硫硫杆菌 篇3

关键词：氧化硫硫杆菌,培养条件,生长,影响

硫杆菌是被人类认识比较充分的一种自养微生物,同时也是应用于实际生产最多的自养微生物,目前主要应用于湿法冶金、煤炭脱硫、重金属回收、有色金属采矿等行业[1,2,3,4,5,6],在废水治理方面也有研究报道[7]。以氧化硫硫杆菌为基础进行盐碱土壤治理方面的研究在国内刚刚起步,张静等[8]的研究结果表明:氧化硫硫杆菌和硫对降低吹填土pH值的作用效果较好。赵晓进等[9]直接向土壤中添加硫粉,对土壤及作物(棉花)的养分状况表现出一定的改善作用,降低了土壤pH值;吴曦,陈明昌[10]相对于施用石膏的处理,硫磺在降低土壤pH上有更明显的作用。笔者在前期研究的基础上[11,12],对分离得到的氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) TT03进行其基本性能的研究,为后续的工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源:

氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)TT03自行分离保存。

1.1.2 化学试剂:

试验中化学试剂为分析纯,用水为蒸馏水二氧化碳来自哈尔滨市特种气体供应站。

1.1.3 培养基:

史塔克培养基组成及制备方法[6]:组成2 g(NH4)2SO4、3 g KH2PO4、0.01 g FeSO4·7H2O、0.5 g MgSO4·7H2O、0.25 g CaCl2、10 g S、水1 000 ml、pH4.0;制备除硫粉外,其他成分溶解水中,在0.8 Kgf/cm2下灭菌30 min;硫磺粉隔水常压灭菌,使用前加入培养基中。固体史塔克培养基补加20 g水洗琼脂,以10 gNa2S2O3替代硫磺粉,过滤方式除菌,使用前加入培养基中。

1.1.4 实验仪器:

奥林帕斯显微成像系统、生物培养摇床、恒温培养箱、低温高速离心机等。

1.2 方法

1.2.1 液态种子制备:

在史塔克液体培养基中培养的TT03菌液,在低温高速离心机中离心,收集菌体,再以无菌生理盐水洗涤1～2次,至pH到中性为止,再用无菌生理盐水稀释至原体积,4 ℃冰箱中保存备用,种子液在一周内使用。

1.2.2 基础培养条件:

液体史塔克培养基分装到250 mL三角瓶中,每瓶100 mL培养基,在1.0 kgf/cm2下高温蒸汽灭菌,冷却后以2.0 %的接种量接种种子液,培养在28 ℃、80 r/min条件下摇动培养,在一定时间后取样测定硫酸含量。

1.2.3 具体操作方法:

各组试验在基础培养条件的前提下进行。温度条件试验通过改变具体的培养温度完成;初始pH条件通过改变史塔克培养基的初始pH值完成;氮源利用通过使用试验氮源替代史塔克培养基中硫酸铵的方式进行;接种量试验通过改变液体种子的毫升数进行;通风条件通过改变摇床转数进行;二氧化碳浓度条件试验是在一个有良好密封性能的医用点滴瓶中进行,以医用注射器向密封的瓶中注入定量的二氧化碳气体,调整瓶内空气的二氧化碳浓度。

1.2.4 硫酸测定方法:

联苯胺滴定法。

2 结果与分析

2.1 TT03的适宜环境条件

TT03在普通显微镜下呈短杆状,在史塔克液体培养基中运动,革兰氏染色阴性。在史塔克固体培养基上生长时,生长缓慢,菌落细小,前期透明水滴状后期转为淡黄色,菌落周围呈云雾状(图1、图2)。氧化硫硫杆菌通过对硫的氧化获取的能量同化环境中的二氧化碳,以维持自身生长繁殖的需要。在这个过程中发生的各种生化反应会受到温度及pH的影响。本研究采用单因子试验的方法,在不同的环境温度、不同的初始pH下,研究了适合其生长的条件,结果表明:TT03的适宜生长范围是温度25 ℃～35 ℃,超出此范围,生长减慢,适宜的初始pH2.0～6.0,超出此范围生长几乎被完全抑制(图3)。研究结果与郑士民先生论述及其他研究结果是一致的。

2.2 TT03对氮源的利用

作为化能自养微生物,氧化硫硫杆菌主要利用无机氮源,对有机氮是不利用的。本研究中使用各种其他种类的含氮物质代替史塔克培养基中的硫酸铵,进行了TT03的氮源利用试验,结果表明(图4):TT03对不同氮源的利用有次序性,其第一利用的氮源是硫酸铵,其次是尿素,随后是硝酸钠;而对有机氮源蛋白胨及亚硝酸盐不能利用。与硫酸铵相比,使用尿素或硝酸钠时TT03生长调整期明显延长,说明需要更长的时间调节其体内的酶系以适应新的氮源。利用无氮源的史塔克培养基培养TT03时,并无生长迹象,说明其无自身固氮能力。

2.3 通风强度对TT03生长的影响

氧化硫硫杆菌是严格的好氧微生物,氧分子是呼吸过程中电子的最终受体,充足的氧气供给是其良好生长的必须条件。在试验中使用不同的转数的摇床培养TT03,结果表明(图5),所有的摇动培养中TT03的生长速度远大于静止培养,转数低于200 r/min时,随转速的提高,生长速度加快,在转数超过200 r/min以后,对TT03生长影响不大,说明了适量供给氧气对TT03生长是必要的,而过多的氧气供给对生长不会产生明显影响。

2.4 接种量的影响

与异养微生物相比,自养微生物代谢缓慢,生长速率低,同时限于气液间物质传输障碍造成底物供给不足,使得一些在异养微生物工作中的经验在培养氧化硫硫杆菌时并不完全适用。在接种量较小时,培养变得不稳定,培养时间时长时短,甚至有时会培养失败,在加大接种量以后培养情况得到改善。接种量对TT03的生长的影响列于图6中,接种量低时前期生长速度较慢,但对后期生长影响不大,在培养到第10天时产酸基本一致。

2.5 驯化对TT03生长的影响

驯化作为微生物技术手段之一在各种研究中经常使用,通过驯化提高了目的菌株对特定环境的适应能力。在对TT03的研究过程中,前期新分离的菌株,即使加大接种量,其生长仍是缓慢的,一般达到产酸高峰需要12～15 d,有时更长。随工作的延续,通过多批次的、持续的转接培养,产酸高峰明显提前,后期缩短到5～7 d。表明了TT03对试验环境的逐渐适应,生产性能得到提高。

2.6 二氧化碳浓度对TT03生长的影响

氧化硫硫杆菌是典型的自养微生物,以二氧化碳作为唯一的碳源生长,因此其生长过程中必须供给二氧化碳。在自然环境中,硫杆菌生长所需的二氧化碳来自空气,而空气中二氧化碳的浓度仅0.03 %(V/V)。本试验中通过向密闭的培养系统定量通入纯二氧化碳气体,调整系统中的二氧化碳浓度,以研究二氧化碳浓度对TT03生长的影响,结果表明(图7):在二氧化碳的浓度达6 %以上时产生底物抑制,生长和产酸变慢;而在6 %以下时,对TT03的生长有促进作用,提示我们在条件允许的情况下,适量增加二氧化碳供给有利于TT03的生长。

3 讨 论

通过对氧化硫硫杆菌TT03的研究,表明TT03适合在酸性环境及25 ℃～35 ℃下生长,培养过程中通风有利于TT03的生长,二氧化碳浓度在6.0 %以下时对生长有促进作用,随浓度的提高,产酸高峰期提前;但超过此浓度时生长受到抑制,产酸高峰期后延。TT03的生物学特性与前人的研究结果是基本一致的。

参考文献

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[11]郭立姝,殷博,曹亚彬,等.用于盐碱土壤处理的氧化硫硫杆菌的选育及鉴定[J].生物技术,2010,20(6):61-64.

氧化硫硫杆菌 篇4

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料:

嗜酸性氧化硫硫杆菌TT03(Acidithiobacillus thiooxidans)为研制单位自行分离鉴定。碱斑土壤取自肇东市西4公里的公路收费站附近;碱性耕作土壤取自肇东市宋站镇附近农田。

1.1.2 培养基:

史塔克培养基[13]组成:2g(NH4)2SO4、3gKH2PO4、0.01gFeSO4·7H2O、0.5gMgSO4·7H2O、0.25gCaCl2、10gS、水1 000mL、pH4.0;制备:除硫粉外,其他成分溶解水中,在0.8kgf/cm2下灭菌30min;硫磺粉隔水常压灭菌,使用前加入培养基中。固体史塔克培养基补加20g水洗琼脂,以10gNa2S2O3替代硫磺粉,过滤方式除菌,使用前加入培养基中。

培养条件:在保湿培养箱放置,室温在28℃,处理期间视水分情况补充水分,以保证土壤的潮湿状态(水分控制在15%～25%)。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液制备:在史塔克液体培养基中培养的TT03菌液,在低温高速离心机中离心,收集菌体,再以无菌生理盐水洗涤1～2次至pH到中性为止,再用无菌生理盐水稀释至原体积,4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 氧化硫硫杆菌TT03对碱斑土壤作用的试验方法:土壤风干细化后与硫粉混合均匀,再加入菌液及水,使土壤潮湿而不渗水为止,待处理的土样分别装入小花盆中,每盆500g。至培养室中培养,白天升温至25℃以上,夜间自然温度,过程中定期补充水以保持土壤湿润。具体的处理方法见表1。

1.2.3 氧化硫硫杆菌TT03对碱性耕作土壤作用的试验方法:称取5kg的碱性耕作土壤,其原始pH为8.27,加入单质硫粉0.5g,液体菌剂15mL,混合均匀后,平铺到带孔塑料板上,土层厚度为30cm,均匀喷水,在保湿培养箱放置,室温在28℃,处理期间视水分情况补充水分,以保证土壤的潮湿状态(水分控制在15%～25%)。在此条件下处理,定期取样测定。试验以不加菌剂为对照处理。

1.2.4 采用酸碱滴定法测定酸度,以硫酸含量表示;采用沉淀法测定硫酸根含量;采用碱解扩散法测定碱解氮;采用碳酸氢钠法测定速效磷;采用醋酸铵浸提法测定速效钾;pH采用电位仪法测定;重碳酸盐采用双指示剂滴定法测定[12,13]。固氮作用强度、硝化作用强度、氨化作用强度、磷转化强度、酚降解强度、土壤呼吸强度的测定参考“土壤酶及其研究法”[14]进行。

1.2.5 计算方法:液体中单质硫粉的转化率以实际培养TT03后产生的硫酸量与加入单质硫粉按理论被完全转化产生的硫酸量的百分比表示。土壤中单质硫粉的转化率以实际培养TT03后产生的硫酸根含量与加入单质硫粉按理论被完全转化产生的硫酸根的百分比表示。

2 结果

2.1 TT03及硫粉对碱斑土壤的作用

利用TT03及硫粉处理碱斑土壤过程中,空白处理(对照2)与菌悬液处理(对照1)的pH变化不明显,代表了土壤的自然状态。外源的菌悬液与硫粉进入土壤后,土壤的性状发生改变。随菌悬液与硫粉用量的提高,pH的下降幅度与速度皆有显著的提高(图1),以处理3的效果最为明显,处理结束时pH由初始的10.03下降到8.78,pH下降幅度为1.25。除了pH的变化以外,碱斑土壤的内部性状也发生改变,重碳酸盐有较大幅度的下降,硫酸根含量猛增,速效磷含量显著增加(表3)。综合表中的结果,可以判定硫酸根上升、重碳酸盐下降与速效磷增加三者之间是紧密相关的。TT03及硫粉处理碱斑土壤也引起土壤微生物活动的变化(表4),除固氮强度没有明显的变化以外,其他的生化指标皆向着有利于农作物生长的方向改变,体现出了TT03及硫粉处理碱斑土壤的效果。

注:前5项测定的处理1与处理2为平行样品;试验是通过在碱斑土壤中添加硫粉与TT03菌悬液完成。培养时间15～45d。后项的处理2、处理3与对照与原处理相同。

2.2 TT03对碱性耕作土壤的作用

以碱性耕作土壤、硫粉、TT03菌液及水组成基本培养物料(表2),在相同的条件下培养,其试验的结果列于图2中。在试验期内,对照1的硫酸根含量微有上升,基本与未处理前相同;对照2的硫酸根含量逐渐而缓慢的升高,培养到第63d时pH下降到8.11,硫酸根含量由原始样品的18.2mg/kg上升到64.6mg/kg,提高了3.55倍,表明即使在碱性土壤中,仍然有土著的硫杆菌存在;处理样品的硫酸根含量在7d后开始迅猛增长,28d时pH为7.94,硫酸根含量达到187.4mg/kg,单质硫转化率达56.4%,随后增长趋于缓慢,在培养至63d时,pH为7.73,硫酸根含量上升到232.3mg/kg,是初始含量的12.76倍,单质硫转化率达71.4%。在同等条件下,添加TT03菌剂处理相比于不添加TT03菌剂的对照2,在培养到63d时,转化单质硫生成硫酸根的量提高了3.59倍,试验结果表明外源添加氧化硫硫杆菌对碱性土壤中单质硫转化有显著促进作用。

碱性土壤中外源加入TT03菌剂与硫粉,经过一段时间的培养处理,生成的硫酸改变了土壤的性状(表5)。

注:土样采用对角线法取样,数据为五点样品的平均值。

首先土壤的pH明显下降,经过28d与63d的处理,pH分别下降到7.94与7.73;同时由于土壤pH下降,使得土壤中营养物质被更有效地溶出,土壤的速效养分明显提高,水解性氮由培养前的20.13 mg/kg分别提高到21.22 mg/kg与22.65 mg/kg,分别增加到原值的105.36%与112.51%;速效磷由培养前的12.11 mg/kg分别提高到18.18 mg/kg、32.45 mg/kg,分别增加到原值的为150.12%、178.49%;速效钾由培养前的79.6mg/kg分别提高到132.45 mg/kg、178.24 mg/kg,分别增加到原值的166.39%、223.91%;相比较而言,有效磷、有效钾的增幅效果远高于水解氮,这是由于土壤中氮磷钾的存在形式不同及硫酸对它们的溶出效果不同而造成的结果。由于单质硫被氧化成硫酸,土壤中硫酸根的含量大幅度上升,与完全空白对照与单施硫粉对照相比,处理28d时硫酸根含量分别提高4.5倍与9.9倍,处理63d时,硫酸根含量分别提高3.6倍与10.4倍;同时由于酸碱中和作用,土壤中的部分重碳酸盐被转化为二氧化碳而排放,其含量下降,在培养到28d与63d时,由初始的766.5 mg/kg分别下降到650.4 mg/kg与605.3 mg/kg(表6)。

注:每kg土壤含硫粉100mg,理论转化产生硫酸根300mg。土壤中原始硫酸根含量18.2mg/kg。

3 讨论

氧化硫硫杆菌TT03对硫的氧化取于其生存的环境与硫的供给,在其能耐受的pH环境下,对硫的氧化能够持续进行。在碱性土壤中,环境土壤呈碱性,TT03仍能生长,可能是由于碱性土壤的总体环境与微环境之间的差异造成,在微观环境下,某些土壤颗粒的环境条件及外源加入的硫粉颗粒会满足TT03的生长要求,并且随TT03生长产酸,微观环境的改变会进一步有利于其生长。TT03对土壤速效营养的影响是明显的,速效磷、速效钾的大幅度提高是土壤向酸性变化的具体体现,酸性条件更有利于一些难溶性磷或钾化合物的溶解。研究对TT03用于碱性土壤改良仅进行了初步的探索,结果表明了TT03在此方面的效果与潜力,更多的问题将在今后的工作中深入研究。

摘要：针对前期研究中选育出的氧化硫硫杆菌TT03,为了解其对单质硫的转化作用而进行了试验。试验的结果表明,TT03与硫粉的加入,使得碱斑土壤与碱性耕作土壤的pH及性状发生改变,土壤向有利于耕作的方向发展;在碱性土壤中,培养到28d时pH下降到7.94,硫酸根含量达到187.4mg/kg,单质硫转化率达56.4%;在培养至63d时,pH下降到7.73,硫酸根含量上升到232.3mg/kg,单质硫转化率达71.4%。

氧化硫硫杆菌 篇5

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)ATCC23270由本室保存;pSV-β-galactosidase 质粒购自Promega公司。

1.1.2 试剂

限制性内切酶、pfuDNA聚合酶、T4 DNA连接酶等均购自Fermentas公司,Taq DNA聚合酶、dNTPs购自上海生工公司;氨苄青霉素(Amp)、DNA提取试剂盒(Bacterial Genome DNA Extract Kit)、X-gal和IPTG购自Bio Basic Inc.公司。其余试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器

Bio-Rad Gradient Cycler PCR仪(美国伯乐公司);DYY-6C型电泳仪、DYCP-31D型电泳槽(北京六一仪器厂);台式离心机(深圳黑马科学仪器);空气浴恒温振荡器(哈尔滨东联电子科技有限公司);紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);隔水式电热恒温培养箱(黄石恒丰医疗器械有限公司)。

1.1.4 培养基

①LB液体培养基:

蛋白胨10g/L;酵母粉5g/L;NaCl 10g/L,pH 7.2。

②LB固体培养基:

蛋白胨10g/L;酵母粉5g/L;NaCl 10g/L;琼脂粉15g/L,pH 7.2。

③9K培养基:

(NH4)2SO4 3g,KCl 0.1g,K2HPO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.5g,Ca(NO3)2 0.01g,蒸馏水1 000mL,pH 2.0。灭菌冷却后按44.7g/L的量加入FeSO4·7H2O。

1.2 实验方法

1.2.1 启动子探针载体的构建

作者以pSV-β-galactosidase质粒的lacZ基因为报告基因,lacZ基因编码区上游含有启动其转录表达的gpt启动子[4]。在gpt启动子上游有SfiⅠ单酶切位点而启动子与编码起始位点之间没有合适的酶切位点。通过分析后发现在495～500bp处,靠近lacZ基因起始密码子序列为“TTCACA",类似于限制性内切酶BstBⅠ的识别位点“TTCGAA",且pSV-β-galactosidase质粒无BstBⅠ识别位点。如果将此处序列突变为BstBⅠ的酶切位点则可利用SfiⅠ和BstBⅠ酶切位点将gpt启动子切除,从而可以进行后续的基因操作。为将495～500bp突变为BstBⅠ酶切位点,利用三条突变引物对pSV-β-galactosidase质粒进行定点突变。正向引物psvF:5'-TAGGTACCTTCTGAGGCGGAAAGAAC CAGC-3',划线部分为KpnⅠ识别位点;突变引物psvM:5'-CTGGGACACTTCgaATGAGC GAAAAATA-3',小写字母为突变位点;反向引物psvMR:5'-ACCGGTACCAGACCG-3'。突变程序按照Ke S.H.等描述的定点突变方法进行[5]。即以pSV-β-galactosidase质粒为模板,先用突变引物和反向引物通过PCR的方法合成含突变位点的“巨引物”,紧接着利用此“巨引物”与正向引物扩增全长片段。PCR产物两端含有KpnⅠ限制性内切酶位点,经KpnⅠ酶切后与同样经KpnⅠ酶切线性化的pSV-β-galactosidase质粒连接,转化E.coli DH5α之后涂布含Amp、X-gal/IPTG的平板,挑选转化子测序以筛选含有目的突变、突变片段正向插入的重组质粒即为所需的启动子探针载体。启动子探针载体pSVB的结构如图1所示。

1.1.3 启动子的筛选

A. ferrooxidans ATCC23270菌株在液体9K培养基中于30℃振荡培养约4d后,10 000r/min离心10min收集处于对数生长后期的菌体,利用Bacterial Genome DNA Extract Kit 抽提菌体染色体DNA。根据已发表的A. ferrooxidans 23270基因组序列和相关参考文献[6],其cycA2基因编码区上游序列可能是petⅡ操纵子的启动子区。设计引物用以扩增A. ferrooxidans 23270 petⅡ操纵子可能的启动子区:正向引物cisF:5'-AAGGCCGCCTCGGCCACGTAGAGCATGGA CTG-3',含SfiⅠ识别位点;反向引物cisR:5'-CCGTTCGAACCATTGCCATAGA GAATAGTGGG-3',含BstBⅠ识别位点。PCR扩增等分子生物学操作按文献[7]进行,PCR产物为701bp通过1.5%的琼脂糖凝胶进行回收,经SfiⅠ和BstBⅠ分步酶切之后,与经SfiⅠ和BstBⅠ双酶切,去掉gpt启动子的pSVB载体连接。连接产物转化E.coli DH5α,在含X-gal/IPTG/Amp的固体琼脂平板上于37℃培养过夜。通过菌落PCR以及DNA序列测定挑选含有petⅡ启动子区的阳性转化子,并进一步检测报告基因的β-半乳糖苷酶表达水平。

1.1.4 β-半乳糖苷酶活性检测

选取经测序鉴定的阳性转化子和含有pSVB质粒的E.coli DH5α转接到含Amp的液体LB培养基中,37℃培养过夜,然后按1 %接种量接入三角瓶中,培养至对数生长中期,测定其β-半乳糖苷酶活性,测定方法参照文献[8]进行。每组设3个平行,按以下公式计算β-半乳糖苷酶的活性(单位U):

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公式中,t=显色反应时间;v=用作检测活性的菌悬液体积(mL);OD600=细胞密度;OD420=邻-硝基苯酚的光吸收值和细胞碎片的光散射之和;OD550=细胞碎片的光散射值。

2 结果与分析

2.1 启动子探针载体的构建

启动子探针质粒pSVB依据图1所示流程构建。DNA序列测定结果(图2)表明pSV-β-galactosidase质粒的495～500处碱基序列“TTCACA”已成功突变为“TTCGAA”。构建的启动子探针载体pSVB能在E.coli中正常复制和增殖。且携带pSVB质粒的E.coli DH5α菌株在含X-gal/IPTG的Amp固体平板上呈蓝色菌落。新构建的质粒pSVB含SfiⅠ、BstBⅠ等单酶切位点,可利用这些单酶切位点去除gpt启动子,克隆外源基因片段分离鉴定启动子。

2.2 启动子的筛选

A. ferrooxidans ATCC23270基因组PCR扩增产物(图3)经SfiⅠ和BstBⅠ双酶切、回收纯化后,与同样经SfiⅠ和BstBⅠ双酶切线性化处理的pSVB载体连接,转化E.coli DH5α细胞,构建成启动子筛选文库。从文库中随机挑选转化子进行测序以挑选含petⅡ启动子区的阳性克隆,测序结果表明在阳性转化子中来源于A. ferrooxidans的petⅡ启动子区已成功插入pSVB载体的lacZ基因上游,所有阳性克隆在含Amp的X-gal平板上均为蓝色菌落。重组质粒命名为pAP2。

2.3 β-半乳糖苷酶表达水平分析

含有pAP2质粒的E.coli DH5α菌落,其β-半乳糖苷酶活性见图4。在petⅡ启动子驱动下的转化子酶活约为pSVB载体中gpt启动子活性的70%(酶活见表1)。这表明在cycA2基因上游701bp区域有明显的启动子活性,且petⅡ启动子相对于gpt启动子来说是一个较弱的启动子。

3 讨论

启动子是一段供RNA聚合酶定位用的DNA序列,通常位于基因的上游。启动子作为RNA聚合酶结合的靶序列,对转录起始有调节和控制作用,决定着基因表达过程是否开始以及在什么条件下开始,因此分离出具有高效启动活性的启动子是基因工程研究不可缺少的工作[9,10]。分离启动子的方法较多,其中比较常用的是构建启动子探针载体[11,12]和利用PCR技术克隆启动子[13],构建启动子探针载体是一种高效分离启动子的方法,被广泛用于原核启动子分离鉴定[14]。

本研究中,作为启动子探针载体骨架的pSV-β-galactosidase质粒,gpt启动子区必须通过酶切去除,再将我们感兴趣的外源启动子片段克隆到去除启动子的lacZ基因上游,以检测其是否有启动子活性以及活性强弱。在没有合适的酶切位点的情况下,通过分析比较选择定点突变的方法产生新的单酶切位点,实验证明这种方法简单高效。本研究中构建的启动子探针载体pSVB能在大肠杆菌中正常复制表达,且对其单位点的突变不会影响lacZ基因的表达。质粒以β-半乳糖苷酶为报告基因,待筛选检测的DNA片段易于插入报告基因上游,通过检测β-半乳糖苷酶的表达水平,可以分析DNA片段是否具有启动子及其活性,具备了启动子探针载体的主要功能。相对于其他报告基因(如荧光素酶基因、氯霉素抗性基因等),β-半乳糖苷酶基因不仅容易获得,而且可以很方便地通过底物显色来进行筛选和酶活测定。启动子探针载体的优点在于其随机性和高通量,但也存在一些不足,如构建载体、建库、筛选鉴定等过程比较繁琐。

本研究还利用此探针载体,鉴定了petⅡ启动子区,为进一步研究嗜酸氧化亚铁硫杆菌表达调控机制打下基础。此外,我们还可以利用此探针载体筛选嗜酸氧化亚铁硫杆菌具有高效活性的启动子。

摘要：目的:为了研究嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)启动子结构与功能。方法:以pSV-β-galactosidase质 粒为骨架,通过定点突变的方法引入一个新的BstBⅠ单酶切位点,构建能在大肠杆菌(Escherichia coli)中正常复制的启动子探针 载体。利用PCR的方法将A.ferrooxidans菌cycA2基因上游5'段上游DNA片段克隆到探针载体β-半乳糖苷酶基因上游以替代 其原有启动子(gpt启动子),并将重组的质粒转化E.coliDH5α菌株。通过检测宿主细胞的β-半乳糖苷酶活性,来鉴定启动子 片段,并分析了启动子探针质粒载体的功能及启动子的强度。结果:pSV-β-galactosidase质粒被正确突变,成功构建了启动子探 针载体pSVB。来源于A. ferrooxidans菌的启动子片段可驱动β-半乳糖苷酶基因在E.coli细胞中表达,转化子酶活性约为gpt 启动子驱动下活性的70 %。结论:启动子探针载体(pSVB)可用于A. ferrooxidans菌或者其它原核生物启动子的分离及进一步的 分析研究。酶活性分析结果表明,来源于A. ferrooxidans菌cycA2基因上游5'段上游DNA片段具有显著启动子活性。

氧化硫硫杆菌 篇6

关键词：细菌,黄钾铁矾,生物氧化

1. 前言

本研究证明A.ferrooxidans对酸性矿井废水中Fe2+的氧化有效。影响A.ferrooxidans Fe2+氧化速率的因素包括:[Fe2+/Fe3+]、菌体浓度、氧气浓度、pH、温度和反应器类型。

1.1 黄钾铁矾的形成

A.ferrooxidans一般生长在Silverman和Lundgren提出的9K培养基上。F与水解反应相竞争的是Fe3+碱性氢氧硫化物的生成, 化学通式为MFe3 (SO4) 2 (OH) 6, M=K+、Na+、NH4+、Ag+、H3O+。这些氢氧硫化物沉淀被称为黄钾铁矾。

1.1.1 黄钾铁矾的作用

黄钾铁矾的形成在A.ferrooxidans应用中具有副作用, 在煤炭脱硫过程中, 形成的黄钾铁矾附着在待氧化的金属硫化物颗粒表面, 使其表面失活, 显著降低生物浸取的速率。

1.1.2 黄钾铁矾的化学性质

如上所述, 9K培养基内含有大量NH4+, 本试验主要通过改变pH和温度, 研究不同培养状况下的黄钾铁矾, 从而确定生成最少的沉淀量所需的培养条件。

2. 材料和方法

2.1 试验材料

2.1.1 试验设备

250ml锥形瓶, 420A型pH计测量, Varian Cary 50型分光光度计, 25μm的滤纸分离锥形瓶。

2.1.2 试验试剂

所有试验药品均为分析纯, 包括100%H2SO4, 9K培养基成分, 磺基水杨酸和氨水。

2.2 试验方法

2.2.1 pH

第一部分试验主要测试不同pH对黄钾铁矾形成的影响, 采用11个锥形瓶, 各瓶pH值从1.0-3.0以0.2间隔递增。各加入100ml 9K培养基。通过滴入100%H2SO4调整各瓶pH值。然后接种20ml初始浓度为108个/ml的A.ferrooxidans菌液, 将11个锥形瓶在室温下放入摇床内, 转速260rpm。分别在实验开始时、22h和46h测定瓶内Fe3+和Fetotal含量。

当90%以上的Fe2+氧化完毕后, 依次取出摇床内的锥形瓶进行真空过滤, 然后用10ml 50%的H2SO4冲洗沉淀使其溶解, 最后用磺基水杨酸测定全铁浓度。用量筒测量以得到产生的黄钾铁矾总质量。

2.2.2 温度

根据第一部分中黄钾铁矾产生量最少对应的pH值, 确定250ml锥形瓶的数量, 按照如第一部分的方法, 确定培养温度依次为25℃、30℃、35℃和40℃。Fe2+的平均氧化速率采用下法计算:初始溶液内的[Fe2+]减去22h时的[Fe3+], 再除以22, 单位是g/ (L·h) 。

2.分析方法

不同时间的[Fe2+]和[Fe3+]通过精确方法测定, 且不受铁离子的形式和溶液中A.ferrooxidans的影响。利用分光光度计的比色方法, 根据红颜色的Fe3+—磺基水杨酸络合物确定溶液中Fe3+浓度。加入氨水后, 5-磺基水杨酸与铁离子络合形成黄色物质, 从而可以确定溶液中全铁浓度。

3. 结果与讨论

试验包含两部分内容, 分别根据试验数据与现象讨论pH和温度对黄钾铁矾沉淀的影响。

3.1 pH的影响

生物氧化过程中不同pH随时间变化的现象如表1所示。

由上表可知, 黄钾铁矾沉淀只在46h的培养时间观察到, 颜色为黄褐色, 或悬浮在培养液里, 或黏附在瓶壁与瓶底。pH=2.96时沉淀量最多, 在pH=1.0-1.6范围内没有发现黄钾铁矾的产生。

在22℃室温情况下, 试验结束时A.ferrooxidans的氧化率达到100%, 即说明在46h测定的黄钾铁矾沉淀时, 细菌已经把Fe2+最大限度地转化成了Fe3+。

进一步分析了培养46h后黄钾铁矾产生量与A.ferrooxidans氧化速率的关系。22℃, pH=1.6—2.0时, Fe2+氧化速率维持在较高水平0.127g/ (L·h) , 而黄钾铁矾数量极低, 在0—0.025 g/ (L·h) 之间。

3.2 温度的影响

室温下确定的最佳pH=1.6—2.0。pH以0.1为间隔, 改变培养温度依次为25℃、30℃、35℃和40℃, 依据黄钾铁矾沉淀量最少确定pH和温度的最佳组合。

4. 结论

本试验的目的是确定A.ferrooxidans氧化Fe2+的合适pH和温度条件, 在此条件下黄钾铁矾沉淀量最少, 而Fe2+氧化率较高。试验得出的最适条件为实验温度35℃, pH1.6—1.7。在此情况下, Fe2+氧化速率高达0.181—0.194g/L, 黄钾铁矾沉淀量低至0.0125—0.0209g/L。

参考文献

[1]胡岳华, 康自珍.氧化亚铁硫杆菌的细菌学描述, 湿法冶金, 1996, 4:36-40.

[2]张在海, 王淀佐, 胡岳华.氧化亚铁硫杆菌遗传选育方法探讨.湿法冶金, 1999, 72 (4) :28-31.

[3]刘晶, 张灼, 韩秀芳.硫杆菌的分离培养及其生长特性的研究, 云南大学学报, 1996, 18 (2) :118～121

[4]邱冠周, 柳建设, 王淀佐.氧化亚铁硫杆菌生长过程铁的行为, 中南工业大学学报, 1998, 29 (3) ;226～228.

氧化硫硫杆菌 篇7

细菌胞外多聚物(Extracellular polymeric substance,EPS)是指附着在细菌表面或围绕在细菌周围,水道、孔隙穿通其间,形成蘑菇状膜结构, 用于自我保护和相互粘附的天然有机物[2]。 At.f的EPS主要由多糖类、脂类、蛋白质和铁离子构成,其中蛋白质主要包含5~6种多肽,分子量低于60 000,具有增强菌体吸附作用、加快氧化还原反应速度及保护At.f生长等重要作用。

由于生物氧化浸出工艺生产周期长,浸出速率低,限制了其扩大应用。而浸矿微生物营养学的研究可能有效解决生物冶金效率低的问题[3]。 现阶段国内的研究较少从微生物生长所需营养条件角度进行。微生物中的很多活性物质化学本质往往是蛋白质,作为蛋白质的前体物质,氨基酸消耗量极为巨大。因此,氨基酸的供应情况决定菌类特定物质的表达及活性表现。张文超等研究了添加6种氨基酸对目标蛋白的影响,结果表明,除胱氨酸对目标蛋白的表达影响不明显外,其它5种氨基酸对菌体生长和目标蛋白表达都有一定促进作用,且氨基酸添加量在一定范围内与菌体生长情况呈正相关[4]。

该试验从微生物营养学的角度出发,研究直接添加异亮氨酸对氧化亚铁硫杆菌的生长及活性的影响,以期缩短浸矿时间,降低研究成本和生产耗能。同时探究该种氨基酸对EPS主要组分含量的影响,以探究该种氨基酸改善其生物活性的实质作用,对生物浸矿的进一步工业化应用起到促进作用。

1材料与方法

1.1材料

供试菌种为嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Thioba- cillus ferrooxidans)(简称At.f);供试矿石为难浸含硫矿石。菌种及矿石均购于中国科学院工程研究院;供试氨基酸为异亮氨酸。

试验仪器及设备为PHS-3C型pH计(上海雷磁仪器厂)、XSZ-4G型光学显微镜(上海精密科学仪器有限公司)、THZ-92型气浴恒温震荡器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)及UV- 752型紫外可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司)。所用试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1培养基配制9K培养基[1],其主要成分为: FeSO4·7H2O 44.3g、KCl 0.1g、MgSO4·7H2O 0.5g、(NH4)2SO43.0g、K2HPO40.5g、Ca(NO3)20.01g,蒸馏水1 000mL。用于培养氧化亚铁硫杆菌。

浸矿培养基的配制:氧化亚铁硫杆菌所使用的浸矿培养基为不添加FeSO4·7H2O的9K培养基,矿石添加量为2%。

1.2.2测定项目及方法亚铁离子测定采用邻菲罗啉分光光度计法[5];pH测定采用pHS-3C型精密酸度计法;菌体浓度测定采用血球计数板法[6]。EPS提取采用NaOH法[7];蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法[8],多糖含量测定采用苯酚- 硫酸法[9]。

2结果与分析

2.1异亮氨酸对At.f菌液浓度的影响

从图1可以看出,添加异亮氨酸后,At.f生长各阶段均较对照在时间上有所提前,调整周期比对照组调整周期缩短了10h,对数周期缩短了5h,稳定期提前了约15h。表明异亮氨酸能够明显缩短At.f的生长各阶段所需时间,促进氧化亚铁硫杆菌的生长。

添加异亮氨酸后,At.f菌在对数生长期阶段的生长曲线斜率显著增加,表明异亮氨酸对于At.f在对数生长期的生长速率有促进作用;对照样菌种浓度在60h时达到最大值,为1.82×109个。异亮氨酸添加样的菌种浓度在45h时达到最大值,为2.13×109个,菌种浓度比对照样提升了17%,说明添加氨基酸能够增加菌种数量。

2.2异亮氨酸对亚铁离子剩余量的影响

从图2可以看出,培养初期培养液中的Fe2+含量变化不明显,此时At.f菌处于调整期,Fe2+消耗较少;进入对数期At.f菌对Fe2+消耗增加, 培养液中的Fe2+含量开始明显减少。添加异亮氨酸,At.f菌调整期明显缩短,且培养相同时间培养液中Fe2+含量明显少于对照组。说明添加异亮氨酸可以提升Fe2+的氧化速率,缩短氧化进程,进而缩短预氧化进程。

2.3异亮氨酸对环境pH的影响

从图3可以看出,0~16h为At.f菌种生长的停滞期,pH均无明显变化,在16~48h,At.f菌种进入对数生长期后,此阶段是At.f菌种大量生成新生原生质以满足自身的新陈代谢所需的酶等,因此消耗大量的H+,使环境的pH迅速升高,同时环境中的Fe2+被菌氧化为Fe3+,Fe3+又发生连续的水解反应,进而产生大量的H+,而在此阶段Fe2+的氧化速率也逐渐升高,因而出现pH达到最大点后回落的现象。

添加异亮氨酸的培养基pH上升曲线比未添加的对照组平缓,对照组的最高pH达到2.28,而添加异亮氨酸的培养基最高pH仅为2.16,比对照样低了5.26%,表明添加异亮氨酸的At.f菌培养基的pH较早地出现了下降的趋势,其消耗H+的速率较快,并且与Fe3+的水解速率达到平衡,说明添加异亮氨酸能够有效缩短菌种生长周期。48h后,两组pH均明显下降,此阶段中, Fe2+氧化速率达到最大值,pH持续下降,而后Fe2+氧化速率开始逐渐下降。未添加氨基酸的对照组在95h的pH为1.76,而添加异亮氨酸的At.f菌培养基pH为1.40,比对照组低了20.45%,其较对照组pH的下降速率要快,而且更早达到pH最低点,反映出添加氨基酸能够增加菌种氧化Fe2+的速率。

2.4异亮氨酸对EPS中多糖含量的影响

从图4可以看出,在整个培养过程中,EPS中的多糖含量变化不大,呈现出的波动性较小,说明添加异亮氨酸对EPS中多糖含量并没有明显影响。培养至后期,添加异亮氨酸的At.f菌培养基多糖含量较对照增加5.05%。

2.5异亮氨酸对At.f菌EPS蛋白质含量的影响

从图5可以看出,整个培养过程中EPS蛋白质含量呈上升趋势,而添加异亮氨酸可明显提高EPS中蛋白质含量。培养至16h时,添加异亮氨酸的培养基中EPS蛋白质含量比对照样提高8.45%,培养至结束时,添加异亮氨酸的At.f培养基的EPS蛋白质含量比对照提高16.84%。说明添加异亮氨酸能够促进EPS中蛋白质的表达, 分析原因可能由于氨基酸添加到培养基中后可被细菌直接吸收利用,作为蛋白质合成的单体物质来源,从而省略了由无机二氧化碳逐步合成氨基酸的漫长全合成过程,使其更容易合成蛋白质类产物。

2.6异亮氨酸对At.f EPS吸附量与游离量的影响

从图6可以看出,金矿石表面EPS的吸附量随着培养时间的延长而增加;游离量在培养前、中期变化不大,在培养后期略有增加。

在培养前期(0~28h)添加异亮氨酸对EPS吸附量影响不大。在培养的中后期,添加异亮氨酸的At.f菌液EPS的吸附量明显高于对照,培养至48h时,添加异亮氨酸的At.f菌EPS吸附量为47.072 6μg·mL-1,较对照提高了40.42%; 培养至72h时,添加异亮氨酸的At.f菌EPS吸附量为54.520 8μg·mL-1,较对照提高了44.05%。整个生长周期中,菌液中的EPS游离量变化不大。

3结论

异亮氨酸对At.f生长有促进作用。添加异亮氨酸后,At.f的生长周期较对照缩短了13h, 生长周期的各个阶段分别不同程度地缩短或提前。胞外多聚物中蛋白质组分提高幅度较大,多糖组分变化较小。

培养液中与矿石结合的EPS量大幅增加,但游离EPS量相差不大,说明异亮氨酸对EPS与金矿石粉的结合有促进作用。

摘要：为提高生物冶金效率,研究了添加异亮氨酸对嗜酸氧化亚铁硫杆菌胞外多聚物组分、嗜酸氧化亚铁硫杆菌生长和吸附能力的影响。结果表明:与对照相比,添加异亮氨酸的嗜酸氧化亚铁硫杆菌生长周期明显缩短,Fe2+的耗尽时间缩短,培养后期Fe2+剩余量明显降低。最高菌密度提高17%,环境pH降低20.45%,胞外多聚物中蛋白质组分提高16.84%,多糖组分提高5.05%。培养时间为72h时,添加异亮氨酸的嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌液EPS吸附量为54.520 8μg·mL-1,比对照提高了44.05%。整个生长周期中,异亮氨酸对菌液中游离EPS含量影响不大。

氧化硫硫杆菌 篇8

关键词：喜温嗜酸硫杆菌,氧化亚铁嗜酸硫杆菌,比较基因组学,生物冶金,硫氧化还原酶

0 引言

生物冶金具有流程短、成本低、能耗少、污染低和环境友好等优点, 在贫矿、废矿、表外矿等低品位矿、复杂矿的浸出方面有独到的优势[1]。生物冶金离不开冶金微生物的作用, 氧化亚铁嗜酸硫杆菌 (Acidithiobacillus ferrooxidans) 是重要的铁氧化冶金微生物之一, 也是生物冶金工业中广泛使用的一种冶金微生物, 通过氧化Fe (Ⅱ) 离子和多种还原性无机硫化合物或者氢气获得能量进行生长[2]。喜温嗜酸硫杆菌 (Acidithiobacillus caldus) 是生物冶金中最常用的硫氧化冶金微生物之一, 通过氧化还原型无机硫化合物获得能量[3,4], 当其和铁氧化冶金微生物 (如氧化亚铁嗜酸硫杆菌、嗜铁钩端螺旋菌等) 混合培养时, 可以有效地促进金属离子的溶出, 从而提高冶金效率[5]。2000年, Kelly DP和Wood AP将其与氧化亚铁嗜酸硫杆菌和氧化硫嗜酸硫杆菌共同划分至新属—嗜酸硫杆菌属 (Acidithiobacillus) 中[6]。

基因组学的发展极大地促进了生物冶金的研究进展, 目前, 已经超过56株冶金微生物的全基因组序列完成测定或正在测定中, 包括30株细菌、26株古菌。此外, 还有8个冶金微生物元基因组计划正在开展[7]。作为重要的生物冶金微生物[8,9], 喜温嗜酸硫杆菌和氧化亚铁嗜酸硫杆菌目前共有4株菌株完成全基因组测序, 基因组序列的获得使得研究人员可以从全基因组水平研究冶金微生物重要代谢途径及其调控机制[10]、重金属抗性机制[11,12]、菌体与矿物之间的相互作用机制[13], 同时也为遗传操作系统的构建提供了指导[14,15]。然而, 对于喜温嗜酸硫杆菌和氧化亚铁嗜酸硫杆菌之间基因组水平的比较分析和数据挖掘目前还较少开展, 一些重要冶金性状的遗传机制尚不清楚, 因此, 本文采用比较基因组学的方法, 分析了喜温嗜酸硫杆菌和氧化亚铁嗜酸硫杆的核心基因组、非必须基因组以及菌株的特异基因, 以揭示两者基因组结构、重要代谢途径和冶金性状的差异, 为深入挖掘两者基因组的数据信息提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

SM-1菌株由中国科学院微生物研究所资源前期开发国家重点实验室刘双江研究员课题组提供。

1.1.2 试剂

Trizol和反转录酶购自美国Invitrogen公司;DNA M-marker (天根生化, 北京) ;实验中用到的其它试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器设备

GeneAmp9700 PCR仪 (美国生命技术公司) ;D-37520型高速离心机 (美国Sigma公司) ;Chemi Doc XRS凝胶成像系统 (美国伯乐公司) ;SW-CJ-2D洁净工作台 (苏州苏洁净化设备有限公司) 。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取

收集新鲜的SM-1菌体, 约0.1 g, 加入1.25 m L裂解缓冲液及35μL DEPC悬浮菌体, 37℃保温10 min, 然后冰浴10min。加入625μL饱和Na Cl溶液, 轻轻混匀数次, 冰浴15 min后, 在12 000 r/min离心30 min以沉淀SDS-DNA-蛋白质混合物。吸取上清至干净EP管, 加等体积异丙醇, -20℃保存30 min。然后12 000 r/min离心5 min, 用75%乙醇 (DEPC水配制) 洗沉淀, 12 000 r/min离心5 min, 小心吸出剩余液体, 空气中干燥5 min后溶解于含有RNA酶抑制剂的纯水中。

1.2.2 基因组数据的获取

喜温嗜酸硫杆菌菌株SM-1的基因组序列由中国科学院微生物研究所刘双江研究员课题组提供, Gen Bank收录号为CP002573。其它基因组序列:At.ferrooxidans ATCC 23270 (Gen Bank收录号CP001219) 、At.ferrooxidans ATCC 53993 (Gen Bank收录号CP001132) 和At.caldus ATCC 51756 (GenBank收录号 (ACVD00000000.1) 从Gen Bank数据库中下载得到。

1.2.3 基因注释与比较基因组学分析

喜温嗜酸硫杆菌SM-1全基因组序列功能注释按照参考文献[8]所述方法进行, 其余菌株注释结果下载自Gen Bank数据库;比较基因组采用Blast、MUMmer软件 (http://www.tigr.org/software/mummer/) 以及Artemis比对软件 (ACT, http://www.sanger.ac.uk/resources/software/act/) 进行。采用Blast P程序进行同源基因的预测 (阈值, 1e-5) , 核心基因组由4株嗜酸硫杆菌所共有的同源基因组成;非必须基因组由部分 (至少2株) 菌株中共有、但并非全部嗜酸硫杆菌所共有的基因构成;菌株特异基因为菌株个体独有的基因。

1.2.4 RT-PCR

引物选自菌株SM-1的硫氧化还原酶 (SOR) 基因保守区域长度为385 bp的片段。正、反向引物分别为Fsor:5′ -GCT-GCTTAGGTATGGTGGTTG-3′ 和Rsor:5′ -TCTTTGTTCTTAG-GTGGGTTGTCT-3′ 。RT-PCR总体系为20μL:总RNA 1μL, 引物1μL, 反转录酶1μL (200U/μL) , d NTP (2.5 mmol/L) 4μL, RNA酶抑制剂 (40U/μL) 0.5μL, 5×缓冲液4μL, dd H2O 8.5μL, 上覆石蜡油, 42℃温育1h, 72℃保温15 min, 然后进行PCR扩增, 35个循环。

2 结果与分析

2.1 4株嗜酸硫杆菌基因组的基本特征

4株嗜酸硫杆菌的基因组均由一条环状的染色体构成, GC含量与基因编码密度相近, 均含有2套核糖体操纵子 (表1) 。At.ferrooxidans ATCC 23270是第一株完成全基因组测序的冶金微生物, 也是迄今为止研究最为集中的一株冶金微生物, 基因组长度为2 982 397 bp, 编码3 147个CDSs[13]。与ATCC 23270相比, At.ferrooxidans ATCC 53993的基因组略小 (2 885 038 bp) , 编码的CDS和tRNA也相对较少, 两者基因组之间存在约16%的差异。At.caldus ATCC 51756的基因组是由139个contig构成的草图序列, 全长2 946 159 bp, 编码2 821个CDSs, 基因组编码两套核糖体操纵子和47个tRNA基因。2011年, 中科院微生物研究所公布了At.caldus SM-1的全基因组序列, 菌株SM-1含有一条环状基因组, 全长2 932 225 bp, 编码2 880个CDSs。

Note:ATC-At.caldus SM-1;ACA-At.caldus ATCC 51756;AFE-At.ferrooxidans ATCC 23270;AFR-At.ferrooxidans ATCC 53993.

2.2 喜温嗜酸硫杆菌与氧化亚铁嗜酸硫杆菌比较基因组学分析

基因组比较结果显示, 同种的菌株基因组序列共线性较好, 但是种与种之间的共线性较差, 表明喜温嗜酸硫杆菌与氧化亚铁嗜酸硫杆菌处于不同的进化阶段, 并在早期产生了分化, 菌株蛋白质组的比对同样显示出类似的结果 (图1) 。1 744个同源基因为4株嗜酸硫杆菌共有, 这构成了嗜酸硫杆菌属的核心基因组。其中包括了许多重要的持家基因, 如:细胞分裂和染色体分离、DNA及RNA代谢、蛋白质合成与分泌以及CO2固定和中间产物代谢相关基因。核心基因组含有的基因可能在嗜酸硫杆菌分化之前就已获得, 核心基因组之外的基因, 除去非必须基因组所含有的基因, 即为4株嗜酸硫杆菌的菌株特有基因, 其中包含着不同嗜酸硫杆菌对应于其各自特有的遗传性状的基因, 研究重点比对分析了喜温嗜酸硫杆菌与氧化亚铁嗜酸硫杆菌的菌株特有基因。

2.2.1 还原型无机硫化合物 (RISCs) 氧化

与氧化亚铁嗜酸硫杆菌相比, 喜温嗜酸硫杆菌采用细菌中普遍使用的SOX系统进行还原型无机硫化合物 (RISCs) 的氧化, 两个SOX基因簇 (clusterⅠ, sox YZB-hyp-res B-hyphyp-sox A和clusterⅡ, sox XYZA-hyp-Sox B) 分布于喜温嗜酸硫杆菌SM-1和ATCC 51756保守的基因座位上。而在氧化亚铁嗜酸硫杆菌ATCC 23270和53993中, 硫化物-醌氧化还原酶 (SQR, AFE_0267和AFE_1792;Lferr_0195和Lferr_1469) 、亚硫酸还原酶 (AFE_3121和AFE_3122;Lferr_2720和Lferr_2721) 、硫代硫酸-醌氧化还原酶 (TQO, AFE_0044和AFE_0048;Lferr_0045和Lferr_0049) 、连四硫酸水解酶 (Tet H, AFE_0029;Lferr_0030) 、腺苷硫酸还原酶 (APS, AFE_3123;Lferr_2722) 和腺苷硫酸转移酶 (SAT, AFE_0539、AFE_2970-71和AFE_3124-25;Lferr_0696、Lferr_2723和Lferr_2724) 构成了其RISCs氧化系统。

2.2.2 氮源获取方式

喜温嗜酸硫杆菌通过还原外界环境中的硝酸盐和亚硝酸盐为菌体生长提供氮源, 菌株SM-1负责硝酸盐和亚硝酸盐还原的相关基因位于一个由6个基因组成的基因簇内 (图2) , 包括1个硝酸盐还原酶编码基因 (Nas, atc_1124) 、2个编码亚硝酸盐还原酶的大小亚基的基因 (Nir D和Nir B, atc_1125和1126) 、1个假想蛋白编码基因 (Hyp, atc_1127) 、1个亚硝酸盐外排蛋白编码基因 (Nar K, atc_1128) 以及1个硝酸盐转运蛋白编码基因 (Tau A, atc_1129) 。与喜温嗜酸硫杆菌相比, 氧化亚铁嗜酸硫杆菌除了可以通过还原硝酸盐获得氮源外, 还可以通过固定氮气获得氮源。在氧化亚铁嗜酸硫杆菌ATCC23270和菌株ATCC 53993中编码有1个固氮酶基因簇 (nif H-D-K-fer1-fer2-EN-X;AFE1522-1515和Lferr_1240-1233) , 推测氧化亚铁嗜酸硫杆菌可能为整个冶金微生物群落在需要氮源的情况下提供氮源。

A-基因组核酸水平比对结果;B-蛋白质组水平比对结果。A-Results of genome alignment;B-Results of proteome alignment.

2.2.3 鞭毛编码基因

与喜温嗜酸硫杆菌相比, 而氧化亚铁嗜酸硫杆菌的鞭毛编码基因完全缺失。喜温嗜酸硫杆菌SM-1的鞭毛基因位于一个基因簇内 (Atc_1445-1557) , 而ATCC 51756则主要集中在两个contig上 (C78和C81) 。在SM-1中, 鞭毛操纵子被4个相同的IS元件 (ISAtc1) 所包围, 两个位于两侧 (Atc_1436和Atc_1563) 、另外两个位于内部 (Atc_1473和Atc_1553) ;与之类似, 在ATCC 51756中, contig81的两侧含有两个截短的转座酶所包围 (ACA_0826和ACA_0864) 。氧化亚铁嗜酸硫杆菌鞭毛编码基因的缺失可能与其营养类型相关, 既可以利用无机硫化合物化合物获得能量外, 还可以通过氧化2价铁离子获得能量进行生长, 因而在实验室营养丰富的培养条件下鞭毛基因可能作为负担而被切除。

2.2.4 转座酶

与氧化亚铁嗜酸硫杆菌相比, 喜温嗜酸硫杆菌基因组中编码有大量的转座酶编码基因, 特别是喜温嗜酸硫杆菌SM-1 (图3) 。SM-1因组中含有144个编码转座酶的相关基因, 根据IS家族分类可以将其分为10个IS家族。此外, SM-1基因组中还含有一个完整的Tn7转座子。通过对喜温嗜酸硫杆菌和氧化亚铁嗜酸硫杆菌的比较发现, 在可以界定到家族的元件中, 喜温嗜酸硫杆菌专有的家族有ISL3和IS5, 而氧化亚铁嗜酸硫杆菌没有专属的IS家族的转座酶。此外, 6个家族的转座酶为两个类群的嗜酸硫杆菌所共有, 表明这些转座元件在整个类群中较为保守, 为该属保守的转座酶。

2.2.5 嗜酸硫杆菌基因组的不稳定性

研究在对喜温嗜酸硫杆菌SM-1与ATCC 51756的基因组比较中发现, ISAtc1类型的插入序列可能造成喜温嗜酸硫杆菌基因组的不稳定。ISAtc1在SM-1基因组中有37个拷贝 (含1个截短的拷贝) , 而菌株ATCC 51756基因组中则没有该类型的插入序列。通过比较两者的基因组序列发现ISAtc1类型的插入序列可能对SM-1的基因组造成以下影响:

Note:ATC-At.caldus SM-1;ACA-At.caldus ATCC 51756;AFE-At.ferrooxidans ATCC 23270;AFR-At.ferrooxidans ATCC 53993.

(a) SM-1菌株与51756菌株SOR基因的位置比对; (b) RT-PCR检测结果。样品1-阳性对照 (p ET21a-SBsor) ;样品2-阳性对照 (16s r DNA) ;样品3-阴性对照 (不加模板) ;样品4, 5-采用sor c DNA作为模板;M-DNA marker。 (a) Alignment of sor position between strain SM-1 and 51756. (b) Results of RT-PC.Lane 1-positive control (p ET21a-SBsor template) ;Lane 2-positive control (16S r DNA template) ;Lane 3-negative control (no template) ;Lane 4, 5-sor c DNA template;M-DNA marker.

(1) 基因的失活。在SM-1中有7个编码基因由于ISAtc1的插入造成断裂, 其中5个编码基因具有功能注释, 分别为纤维素合成酶催化亚基 (UDP-forming, Atc_0492/0495) , Ton B-依赖的受体蛋白 (Atc_0680/0682) , UDP-葡萄糖/GDP-甘露糖脱氢酶 (Atc_0776/778) , 脂酰转移酶 (Atc_1562/1564) 和Ton B-依赖的外膜受体蛋白Fec A6 (p LAtcm_0189/0191) , 其余两个为未知功能蛋白 (Atc_0509/0511和Atc_0994/0994) ;而在菌株ATCC 51756中相应的基因则是完整的。

(2) 硫氧化还原酶基因的缺失。与喜温嗜酸硫杆菌ATCC 51756相比, 发现之前报道的sor基因在菌株SM-1的在基因组中缺失[16], 而在菌株ATCC 51756的基因组草图中存在SOR编码基因 (aca_0302) , 该基因位于硫醌氧化还原酶 (SQR, ACA_0303) 基因的上游, 比对结果显示菌株ATCC51756与SM-1的SOR氨基酸相似性达48%。在菌株SM-1中, 在与菌株ATCC 51756的SOR基因的对应位置, 为一个ISAtc1 (Atc_1436) 插入序列, 而非SOR编码基因 (图4.a) 。在该插入序列两侧, 其它基因及相互顺序与ATCC 51756完全一致。是否喜温嗜酸硫杆菌SM-1含有sor基因, 试验通过PCR以及PT-PCR的方法从DNA或RNA水平上进行了验证 (图4.b) , 均没有目的片段扩增, 表明sor基因可能由于ISAtc1的转座而缺失。

3 讨论

基因组学的发展极大地促进了生物冶金的研究, 一些具有代表性的冶金微生物的基因组已经相继完成测定并对其重要代谢途径开展了相应的研究。但是, 对于现有的微生物基因组的数据挖掘工作目前还不够深入, 一些冶金微生物的重要的代谢途径和冶金性状的遗传物质基础还处于未知状态[7]。此外, 生物冶金堆浸反应器中复杂多变的冶金微生物的多样性也远超预期, 这使得现有的基因组学数据还不足以完整地反映生物冶金过程中微生物群落结构的动态变化。因此, 这就要求在进行大规模基因组测序的同时, 还要加强对于现有数据的比较、分析等数据挖掘工作, 从而为实现生物冶金过程的精确控制提供助力。