病原微生物检测

病原微生物检测（精选十篇）

病原微生物检测 篇1

1 家蚕病原种类

1.1 微粒子

家蚕微粒子病(Pebrine disease)由家蚕微孢子虫(Nosema bombycis, N. b)寄生而引起,是一种古老的、分布很广的传染性蚕病,世界各养蚕国都有发生,是一种世界性的检疫病害,也被列入我国进境动物二类传染病。家蚕微孢子虫是专性寄生于家蚕的微孢子虫,也是Nosema属微孢子虫的代表种之一,现被归于真菌类的“古怪” 寄生虫(odd parasites)[2,3,4,5]。由于其特殊的经卵传染方式,对蚕业生产尤其是蚕种生产造成严重危害。

1.2 病毒病

家蚕病毒病分血液型脓病、中肠型脓病、病毒性软化病和浓核病四种,分别由核型多角体病毒(BmNPV)、质型多角体病毒(BmCPV)、病毒性软化病病毒(BmFV)和浓核病病毒(BmDNV)感染引起。病蚕排泄物、体液、尸体均可成为传染源,具有传染源广泛,发病迅速的特点,是蚕桑生产中发生率最高的病害,占整个蚕病发生率的60%~70%,是目前家蚕病害中继家蚕微粒子病之后,又一被列为动物疫病的病种。

1.3 细菌病

家蚕细菌病有败血病、卒倒病和细菌性胃肠病三种。

常见的败血病有黑胸败血病,是由芽孢杆菌属黑胸败血病菌(Bacillus sp.)引起而发病,尸体胸部及腹部1-3 环节出现墨绿色的尸斑;灵菌败血病,是由粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)引起发病,尸体为嫣红色;青头败血病,是由弧菌科气单孢菌属(Aerononns sp.)引起发病,尸体胸部背面出现绿色有气泡尸斑。

卒倒病即细菌性中毒病,是由于家蚕食下苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)及其变种产生的伴孢晶体δ-内毒素引起的,常见于5龄蚕,主要为急性。

细菌性肠道病也称细菌性软化病、细菌性胃肠病,俗称空头病或起缩病,是细菌性疾病中最慢性的蚕病。以肠球菌属(Enterococcus)的faecalis (Ent. faecalis),faecium ( Ent. faecium)和两者的中间型为主的多种细菌在蚕儿中肠内繁殖所致病[6]。

1.4 真菌病

家蚕真菌病主要是由半知菌类真菌分生孢子萌发,分泌蛋白酶水解家蚕体表几丁质,穿透蚕皮侵入蚕体,或经口感染幼蚕在消化管内萌发生长引发,根据其分生孢子颜色不同,分为白僵菌、黄僵菌、绿僵菌和曲霉病等。

白僵病主要致病菌是球孢白僵菌(Beauveria bassiana (Bals.) Vuill),其次是卵孢白僵菌(Beauveria tenella (Delacr.) Siem),黄僵病的病原菌与白僵病的相同,分属不同的血清型。绿僵病致病菌为莱氏野村菌(Nomuraea rileyi),Nomuraea也称为绿僵菌属,多为昆虫寄生菌。曲霉病的致病菌有黄曲霉(Aspergillus flavus Link)、米曲霉(A. oryzae Cohn)、寄生曲霉(A. parasiticus Speare)、溜曲霉(A. tamari Kita)、赭曲霉(A. ochraceus Wilhelm)等,黄曲霉和米曲霉病害较普遍。此外,黑僵菌由绿僵菌属金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)引起,灰僵菌由粉拟青霉菌(Paecilomyces farinosus)引起,赤僵菌由玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)引起,草僵病由多毛菌属草僵菌(Hirsutella patouillard)引起。

此外,由镰孢属(Fusarium)的F. semitectum,F. acridiorum,F. sp和F. spp.等非特异性致病菌引发的镰刀菌病,以及由子囊菌红酵菌属(Rhodotorula)引发的酵母菌病,在生产上也有零星发生。

2 检测诊断技术

2.1 镜检技术等表型观察

2.1.1 微粒子

光学显微镜检验家蚕微粒子孢子,是蚕业生产上的主要手段。家蚕微粒子孢子在光镜下一般为卵圆形,(2.9~4.1) um×(1.72~2.1) um,群体较整齐,表面光滑,呈上下摆动状,有强折光性。刘仁华等人经研究,认为样品中微粒子孢子数目低于3×103个时,镜检到孢子的概率接近于0;当样品中微粒子虫数目等于或大于4×104个时,镜检到孢子的概率为1[7]。唐顺明等采用铬变素2R法(Chromotrope 2R)染色,将家蚕微孢子虫孢子与绿僵(Nornuraea rileyi)孢子、曲霉(Asperillus flavus)孢子、花粉粒(Pollengranule)等与N. b孢子形状相似物区分开,能明显提高N. b的检出率与准确性[8]。张香琴、蔡健荣用计算机图像识别技术来检测微粒子病,对拍摄的原始图像进行对比处理,用快速Otsu自动阈值分割法进行二值化,将微粒子与背景和杂质分离,进行分层识别[9]。黄宏华、蔡健荣利用数学形态学的方法根据微粒子图像的形状特征来检测微粒子区域,实现微粒子和背景的分割,运用基于遗传算法的BP网络进行了识别和分类[10]。

2.1.2 病毒病

400~600倍显微镜观察病蚕血液或者中肠,可以观察到病毒粒子。BmNPV镜检时,取病蚕血经苏丹Ⅲ染色法,或加等量乙醇乙醚混合液,将BmNPV多角体与脂肪球相区别。BmCPV镜检病蚕中肠后部组织,滴加用4%稀盐酸消除干扰杂质后,可清晰检测到多角体。BmFV、BmDNV取病蚕中肠,用卡诺氏固定液固定,焦宁—甲基绿染色。BmFV病蚕镜检圆筒状细胞的细胞核处可见桃红色的A型球状体和单独存在的B型球状体;BmDNV病蚕镜检,可见大量双球菌和球菌,无多角体,圆筒状细胞的细胞核显著膨大,染色性较正常细胞核明显降低。

电镜负染技术、观察、诊断家蚕病毒病。方琦等应用电镜技术,从病蚕中肠上皮细胞检测到两种家蚕主要病毒CPV和NPV[11]。

2.1.3 细菌真菌病

细菌性败血病家蚕的血淋巴镜检,可见大量的细菌;卒倒病镜检病蚕消化道内容物,可见大量杆菌和芽孢,镜检到伴孢晶体时可确诊;细菌性肠道病病蚕消化液镜检,可见大量球菌,死前的病蚕消化液因二次感染还能检出杆菌等。

真菌病害症状不明显时,可取濒死病蚕,镜检血液或病灶处体壁,根据检出的孢子形态或菌丝体,确定病原菌。

将病蚕体内的细菌真菌分离得到纯培养物,进行传统的表型检测方法,使用菌体菌落形态观察及生化反应等技术,成本低,但需要较多的人力和多种辅助实验,难以区分到种以下,溯源性不够。

2.2 免疫学技术

2.2.1 微粒子

血清学检测特异性强、灵敏度高,已建立的免疫学检测法有:酶联免疫吸附法、荧光抗体法、凝聚法、单克隆抗体法、免疫过氧化酶染色法等。

梅玲玲等用SPA-协同凝集反应来快速鉴别微孢子虫孢子,在N.b孢子浓度为1.1×104个/ml时,即可产生肉眼可见的凝集现象,浓度超过4.4×104个/ml时,形成大块凝集体,借助显微镜观察时,检测灵敏度可到1.1×103个/ml,可将家蚕微孢子与桑尺蠖微孢子、柞蚕微孢子特异区别[12];万嘉群用酶标抗体间接法和酶标抗体PAP法检测家蚕微粒子孢子,并对两种方法进行对比研究[13];以上检测方法及陈租佩等人所研究的碳素凝集法[14]、黄自然等人做的荧光抗体检验技术初步研究[15],都是在多抗血清的基础上进行的,由于天然抗体系统的复杂性,存在交叉反应等的缺点。

随着单克隆抗体技术的广泛应用,在蚕种检测上也有了大量的研究。Shamim、三毛明人应用制备出来的单克隆抗体进行胶乳凝集实验的研究,并用单克隆抗体致敏胶乳和精制孢子研究了致敏条件和反应条件,但此单抗有交叉反应;陈建国等人制备出家蚕微粒子孢子单克隆抗体,用间接ELISA法对其在检测上的初步应用做了研究,建立了以完整的家蚕微孢子虫为抗原的ELISA检测方法,最低检测量为700个孢子,个别抗体与柞蚕微孢子虫有交叉反应[16];而万国富、卢铿明等用单克隆抗体直接ELISA法检测家蚕微孢子虫,经比较认为,直接法和间接法检测的灵敏度和特异性二者差异不大,但直接法操作简单。

一些化学荧光增亮剂可特异地快速结合到微孢子的含几丁质的孢子内壁,与微孢子结合的增亮剂在紫外光激发下,发出可见光。如刘吉平等用单抗免疫金银染色法诊断家蚕微孢子虫;徐兴耀等也建立了抗家蚕微孢子虫单抗细胞株,使用抗家蚕微孢子虫的单克隆抗体,结合免疫金银染色法(IGSS)进行检测,并寻找到了该细胞株单抗直接IGSS法最佳工作条件[17]。

万淼用纯化的家蚕微孢子虫抗兔多抗包被,作为捕获抗原,加入检测样品,然后用辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体作为检测抗原,建立双抗体夹心ELISA检测方法,并对各步实验条件进行优化。该法对纯化孢子的检测量为3.125×105个/ml,对“添毒”蚕卵的检测量为5×106个/ml。可以用于实际生产中的检测,灵敏度有待于进一步研究加以提高[18]。

制备抗N. b孢子表面抗原的抗血清和单克隆抗体,用乳胶凝集法、酶标抗体法、碳素凝集反应等检测N. b;新构建了用抗N. b的单克隆抗体结合免疫金银染色( IGSS) 的方法检测N. b[19]。

2.2.2 病毒病

应用双向免疫扩散(CIEP)检测家蚕病毒病,可在感病后27~39 h左右检出,室温或者37℃培养1天,即可读出结果。如果沉淀带不清晰,可将琼脂板表面紧贴一张湿滤纸,40-45℃烘干,1%氨基黑染色,再脱色,沉淀带被染成蓝色,易于识别。

应用对流免疫电泳(CIEP)检测家蚕病毒病。对流免疫电泳法(Counter immuno-electrophoresis),抗原与抗体“对流” 即作相对移动的状态。当抗原与抗体在琼脂薄板上相遇时,即产生特异的白色沉淀,以此可以检测抗原的存在。应用对流免疫电泳法,可迅速而且准确地诊断家蚕病毒病。

应用酶标抗体法检测家蚕病毒病。把抗原抗体的免疫反应原理和酶的高效催化作用相结合,大大提高免疫检测的灵敏度。酶标抗体在抗原形成免疫复合物后,经酶的底物显色,从而检出病毒抗原。有酶标电泳法(ELCIEP),酶标组化法(IEHC),可溶性酶—抗酶法(PAP),斑点免疫结合测定法(DIBA)。

应用生物素—亲和素系统(Avidin-Biotin system, ABS)检测家蚕病毒病,可在家蚕接种浓核型病毒8小时后检出。生物素(biontin,B)广泛分布于动、植物组织中,有两个环状结构,Ⅰ环与亲和素结合;II环结合抗体和其他生物大分子,经化学修饰后,生物素可成为带有多种活性基团的衍生物——活化生物素。每个亲和素(avidin,AV)能结合4个分子的生物素,二者之间的亲和力极强,结合特异性高和稳定性好。

应用乳胶凝集法(LAT)检测家蚕病毒病,检测时间短,检出阳性率较高,可检测的DNV最小量为1×10-1O.D。载体为聚苯乙烯乳胶,具有良好的吸附蛋白质的性能,与抗DNV免疫球蛋白混合后致敏,致敏乳胶悬液与带毒样品混合后,发生凝集反应。

钱元骏等1989年以上述五种方法,检测纯化的家蚕浓核病毒(DNV),灵敏度为1×10-1~1×10-4O.D,以DIBA法检测灵敏度最高,分别为LAT法、ELCIEP法、CIEP法的10倍、160倍、1000倍。检测蚕体内的DNV时,可以在经口接种DNV后8~40 h检出阴性反应,以ABS法检出阳性反应最早。在同样接种病毒的条件下, 要到感染后5~6天才表现出明显的外观症状,这些手段可作为有效手段诊断家蚕浓核病[20]。

李卫党等2000年建立家蚕核型多角体病毒蛋白的dot-ELISA检测方法,此法与人血清和兔血清无交叉反应,可检测微量多角体病毒蛋白,灵敏度达10ng,操作简便,可用于感染家蚕的血清检测[21]。

单克隆抗体用于许多病毒病的诊断,具有快速、灵敏和特异性强等优点,并可用于强毒、弱毒的鉴别。朱宏杰(2006)对从中国浙江桐乡蚕区分离的一株疑似家蚕病毒性软化病病毒(BmIFV)的非包含体病毒进行了研究,利用杂交瘤技术获得了2株仅对BmIFV有特异性反应的单抗,而与家蚕浓核病毒(BmDNV)无特异性反应,用于浙江省桐乡蚕区的病毒性软化病检测[22]。

NPV、CPV 和DNV 的兔抗血清以及抗DNV 的单克隆抗体,通过酶抗体间接(ⅡP法)诊断法、乳胶凝集反应、偶联单克隆抗体的乳胶蛋白A(PALMAL)、免疫双扩散、对流免疫电泳、免疫荧光技术、ABC-ELISA 法等可进行病毒鉴定、检测、定位、早期诊断等方面的研究;还制备了家蚕DNV 的诊断试剂盒,将单克隆抗体与双向免疫技术结合,诊断家蚕浓核病;将此单克隆抗体与免疫酶技术或荧光抗体技术结合,能在感染后16~18 h的家蚕中肠组织内检测到病毒抗原[23]。

2.2.3 细菌真菌病

家蚕白僵菌的分生孢子和芽生孢子都有良好的抗原性,芽生孢子比分生孢子抗原性好;不同株系的白僵菌芽生孢子之间既存在免疫交叉反应,也表现免疫特异性[24]。

2.3 分子检测技术

2.3.1 微粒子

随着分子生物学的快速发展,微粒子的分子生物学检测技术随之发展起来。利用多种PCR技术,通过扩增SSU、LSUrRNA等保守基因序列的不同区域、基因间隔区以及各种微孢子虫的核苷酸特异性序列,设计种属特异性引物和探针,再通过PCR技术和原位杂交技术等手段进行检测。

1996年,陈秀等首先在国内报道了用PCR技术,利用微粒子DNA的高度保守序列,设计了1对引物,对微粒子进行定性PCR检测,并取得了成功[25]。

蔡平钟等设计合成一对引物,对家蚕微孢子虫孢及其近缘种孢子的DNA进行PCR检测,结果表明只有家蚕微孢子虫孢子DNA获得特异性扩增区带,大小为317 bp,可区别于Nosema sp. MG1和MG2、柞蚕微孢子虫[26] 。

邱宝利等为了将家蚕微孢子虫(N.b)从蚕业生产中流行的10多种病原性微孢子虫中鉴定出来,并对其发病程度进行检测,用PCR技术合成了一段317bp的N.b特异性检测探针,灵敏度可达1ng DNA。经带毒蚕蛾和蚕卵的模拟检测证明,该DIG探针可将N.b发病初期的带毒蚕蛾和蚕卵检出,从而可以避免微粒子病的大发生[27]。

韦亚东等设计合成了l对PCR引物,从N.b的rDNA上扩增出1个112bp片段,用同位素标记作为检测N.b的特异性探针,对家蚕卵及感染N.b 4、6和10天的幼虫进行原位杂交检测。证明了该法诊断家蚕卵及幼虫体内N. b的可行性,为蚕种质量检测及家蚕微孢子虫病的早期诊断探索新的途径做了有意义的尝试[28]。

刘吉平等根据N. b孢子及其相近种属微孢子虫的SSU-rRNA保守区段设计的引物VIF/530R,从模拟感染不同浓度N. b孢子母蛾、蚕卵的角度,较系统地研究了PCR诊断技术的可检测灵敏度和对模拟感染家蚕微粒子病的诊断效果,为PCR分子诊断家蚕微粒子病的实用化研究提供参考。对N.b纯孢子DNA模板,PCR可检测灵敏度为3×104N.b/ ml(弱检测信号可到3×102~3×103N.b/ml),对模拟染毒N.b孢子的蚕蛾DNA 模板,PCR 可检测灵敏度为3×105N.b/ml,两者分别已超过或达到目前生产上用显微镜的检毒水平。对模拟染毒N.b孢子的蚕卵DNA 模板,则不能有效地检出[29]。该课题组还筛选出一对可以鉴定典型家蚕微孢子虫N. b的引物,经过比较六种不同昆虫微孢子虫表面蛋白的不同,通过SDS-PAGE电泳将家蚕微孢子虫和斜纹夜蛾微孢子虫(N. liturae)和小菜蛾微孢子虫(N. xylostella),但难以区别柞蚕微孢子虫(N. pernyi),蝗虫微孢子虫(N. locustae)和桑尺蠖微孢子虫(N. atrilineata)[30,31]。

Hatakeyama等及汪琳基于家蚕微孢子虫生长因子基因、近缘种属微孢子虫rDNA、hsp70基因设计多引物PCR实验,用N. b孢子接种5龄幼虫获得感病母蛾的蚕卵,抽样5 粒蚕卵可检出N. b孢子弱信号,抽样10粒蚕卵可检出强信号,可同时检测出蚕体感染的4种重要微孢子,简单快速灵敏性高。可见分子检测的DNA模板抽提、PCR引物设计、反应体系条件等因素,是分子检测法适用范围和灵敏度的关键[29]。

王见杨等利用60个随机引物构建了8种微孢子虫的DNA指纹图谱。结果表明:RAPD技术可以区分不同来源的微孢子虫,并可探求它们的亲缘关系[32]。

目前,分子生物学技术在微孢子虫检测上的应用还有所限制,一方面是因为用于进行引物和探针设计的基因序列还太少,另一方面对检测方法标准体系的建立还需进一步摸索。但分子生物学检测方法与其他检测方法相比,特异性和灵敏度都很高,且操作方便。今后,无论是对微孢子虫的检测还是对其他病原微生物的检测,分子生物技术将得到广泛的应用。

环介导等温扩增法( loop-mediated isothermal amplification , LAMP), 2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法,与常规PCR相比,不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程,扩增模板可达10拷贝或更少,简单、快速、特异性强。不依赖专门的仪器设备,实现现场高通量快速检测,检测成本远低于荧光定量PCR。华南农业大学蚕桑系将LAMP法应用于N. b的快速检测,设计一组特异性引物(FI2/BI2、F2/B2),选择N. b拟假基因rDNA序列(登陆号D14632)作为检测靶基因,建立了家蚕微孢子虫LAMP检测方法,开发出快速诊断试剂盒,具有鉴定、快捷、方便的优势。

2.3.2 病毒病

核酸分子杂交技术迅速灵敏,特异性强,对病毒装配前的核酸也能检测,可用于家蚕病毒病的早期诊断。糜克永等建立了家蚕质型多角体病毒(CPV)双链核糖核酸(dsRNA)分子杂交技术,可用于CPV的早期检测。

PCR技术可用于诊断家蚕核型多角体病毒。感染BmNPV 的家蚕血淋巴样品抽取DNA,通过PCR 扩增,能看到清晰的240bp 扩增片段,PCR 技术也适用于检测BmNPV,且具有微量、快速、灵敏、特异性强、样品处理简便等优点;还可通过PCR 法从蚕粪中检测NPV和DNV。姚勤等通过荧光定量PCR,研究家蚕核型多角体病毒BmNPV接种后9个时间点,在其宿主幼虫中肠、血淋巴和脂肪体中的增殖动态[33]。

2.3.3 细菌真菌病

随着分子生物学的飞速发展,对病原微生物的鉴定已不再局限于对他的外部形态结构及生理生化特性等一般检验上,而是从分子生物学水平上研究生物大分子,特别是核酸结构及其组成成分。在此基础上建立的众多技术中,PFGE (脉冲凝胶电泳)、RFLP(限制性酶切片断多态性)、Chip Technology(芯片技术)、16S SEQUENCING(16S 基因测序)、Ribotyping (rRNA 基因指纹技术)依据其不同的性能特点及实验室的具体情况等因素,业已逐步应用于细菌检验。

PFGE高辨别力,用于菌株同源性研究,但实验结果重复性差,操作技术要求高,耗时3-5 天,没有鉴定细菌的功能。

RFLP比PFGE 省时,用于菌株同源性研究,非标准化,非自动化,比PFGE 的识别力差,操作技术要求高,没有鉴定细菌的功能。

芯片技术可以揭示大量信息,具备自动化的优势,快速,但非常昂贵,非标准化,目前主要在科研、新药研究等领域使用。

16S SEQUENCING具备属、种的鉴定功能,但难于区分亲缘关系很近的菌种,不能进行种水平以下的分型、溯源,操作技术要求高,耗时4-6天。

全自动rRNA基因指纹(核糖体分型)技术Automated Ribotyping。全自动的rRNA基因指纹(核糖体分型)技术,RiboPrinter R系统,通过全自动地产生、分析rRNA基因指纹,对细菌进行快速鉴定、分型,以表现出不同菌株的分子特征。

3 展 望

新型免疫学技术的发展,也为建立新的家蚕病原菌的检测提供更多的技术支持。如荧光纳米标记与编码技术可用于几种重要病原菌的检测:基于硅壳荧光纳米颗粒的间接免疫荧光显微镜法,可用于结核杆菌的快速检测(FNP-IIFM);基于硅壳荧光纳米颗粒和SYBR Green I的双色流式细胞术(FSiNP@SG-FCM),对样品中病原菌的核酸进行染色,从而将病原菌与样品中的碎片杂质区分,通过多参数流式细胞术对样品中双染色的病原菌菌进行测定与分析。[34]

分子生物学技术因其灵敏度高、特异性强、可早期诊断等优势,将普遍运用于家蚕病原微生物的实验室检测诊断之中。但分子技术的试验条件要求较高,对操作人员专业素质要求较高,是该技术在生产上普及的瓶颈,有待突破。LAMP技术,因其快速、简便、特异性强、灵敏度高、成本低等优点,广泛应用于细菌或病毒的定性定量检测、临床疾病诊断、动植物致病微生物检测等相关领域,在家蚕病原微生物的检测中,将有广泛的应用前景。

蛋白质组学研究的日益完善成熟,也为家蚕病原菌的检测诊断提供另一新思路。开展健康家蚕与染病家蚕比较蛋白质组学研究,通过比较不同病原菌感染的家蚕血液的蛋白质组差异,发现新型分子靶标,作为不同病原菌检测诊断的依据。基于这些分子靶标可以应用于新型快速检测试剂盒的研制,为家蚕病原菌的快速准确检测与诊断提供有效的解决方案。

有待建立完善家蚕病原微生物资源库,有利于更好的寻找分子靶标,为家蚕病害检测提供有力支撑。家蚕病原菌检测诊断中,核心问题在于确定分子靶标。当分子靶标是特异性核酸序列时,作为特异引物或者分子探针运用于分子检测技术,当分子靶标是特异性蛋白时,可以作为特异抗原用于免疫学诊断。

自动快速微生物鉴定系统,利用细菌、真菌对不同碳源代谢率的差异,通过检测微生物生长过程的颜色变化(吸光度),以及浊度差异,与标准数据库比对,得出最终鉴定结果。能鉴定常见的细菌、酵母、丝状真菌等2152种,几乎覆盖所有与人类、动物、植物相关的重要微生物,可望用于家蚕真菌细菌病害的快速诊断检测。

病原微生物安全保管制度 篇2

一、指定的菌（毒）种（库）保管部门，应当依照国务院卫生主管部门的规定，储存实验室送交的病原微生物菌（毒）种，并向实验室提供病原微生物菌（毒）种；应制订相应的安全保管制度，作好病原微生物菌（毒）种进出、储存和销毁的记录，建立全档案制度，并指定专人负责。相关病原微生物实验室在相关实验活动结束后，应及时按规定程序将病原微生物菌（毒）种销毁或者送交菌（毒）种保管部门保管。菌（毒）种保管部门接受实验室送交的病原 微生物菌（毒）

种，应当予以登记，并开具接收证明。

二、运输高致病性病原微生物菌（毒）种或者样本，必须遵循卫生部《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》和《山东省疾病预防控制中心可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理办法》。高致病性病原微生物菌（毒）种或者样本在运输、储存中，发生被盗、被抢、丢失、泄漏的，护送人、保管部门应当采取必要的控制措施，并按照国务院《病原微生物实验室生物安全管理条例》的有关规定报告。

三、病原微生物实验室从事实验活动应当严格遵守有关国家标准和实验室技术规范、操作规程。实验室负责人应当指定经培训的专人监督检查实验室技术规范和操作规程的落实情况。

四、各病原微生物实验室应当建立实验档案，记录实验室及其设备使用情况和安全监督情况，生物安全工作小组应定期自查。

五、各病原微生物实验室应当指定专门人员承担实验室感染控制工作，定期检查实验室的生物安全防护、病原微生物菌（毒）种和样本保存与使用、安全操作、实验室排放的废水和废气以及其他废物处置等规章制度的实施情况。一旦发生实验室感染事件，相关业务处所及其工作人员应按照国家、省有关规定程序立即报告，并按应急预案进行处置。

六、各病原微生物实验室应当依照有关法律、法规和规定，对废水、废气以及其它废物进行处置。

病原微生物检测 篇3

[关键词]多重PCR；致病菌；病毒；真菌

[中图分类号]R372[文献标识码]A[文章编号]1009-6019一(2010)05-84-03

多重PCR是通过对PCR技术的改进而建立起来一种体外扩增技术，是在同一扩增体系中通过加入多对引物从而对多条目的DNA片段进行扩增。根据扩增模板的种类可以分为单一模板的多个基因位点扩增和多种DNA模板的不同基因扩增。前者在同一反应体系中通过加入单一DNA模板和多对引物进行扩增，后者在统一体系中加入多种DNA和引物进行扩增。与传统的PCR相比，具有扩增效率高，产物特异性高和经济简便特点，特别适合食品中病原微生物的快速测定。

1多重PCR在食品中致病菌的检测

目前多重PCR的方法主要建立在食品中病原菌的检测，这方面的研究最多，建立的方法也最多。

1.1多重PCR检测同一致病菌

食品中的某些致病菌由于具有较多的血清型，很多DNA片段都是某些细菌所共有的，很难通过单一的PCR扩增某条片段进行确定。极易造成测定结果的假阳性，影响样品检测的有效性。采用多重PCR针对目的基因的多个DNA片段设计引物进行扩增，根据多条扩增结果来判断结果可以减少假阳性，提高测定结果的特异性。

产毒素大肠杆菌是引起腹泻的重要致病菌，通常分为三种类型：ETEC(产肠毒素大肠杆菌)、SLTEC(产志贺样毒素大肠杆菌)和NTEC(产坏死性大肠杆菌)。其中SLTEC可产生三种毒素类型(sLTl、SLT2和SLT2v)，主要血清型是0157：H7 L2J。杨小鹃等采用大肠杆菌0157：H7rfeE和fliC基因的保守序列设计两对引物，通过对包括猪肉鸡肉牛肉羊肉在内的65份样品进行检测，同时采用传统分离培养鉴定和测序验证进行方法对比，结果显示阳性样品与标准鉴定方法的一致性达到98％，显示出测定结果的特异性好。

副溶血性弧菌主要存在于近海的海水、鱼类、贝类等海产品中的一种病原菌，可引起食物中毒、反应性关节炎和心脏疾病等。在我国副溶血性弧菌引起的食物中毒在人数和起数上都处于第一位。李晓虹等根据副溶血性弧菌的tl、tdh、trh基因设计3对引物，采用PCR多重扩增，并对扩增结果特异性和标准菌株进行验证，结果采用多重PCR能够特异性的扩增副溶血性弧菌的450、269、500bp片段，而对其他种类菌没有特异性扩增。可在增菌8h后快速、简单、准确的检测出食品中副溶血性弧菌。沙门氏菌(salmanella)是最常见食源性病原菌，所含细菌种类繁多。已发现超过2 500种以上的血清型。邵碧英等采用沙门氏菌属特异基因hut、hilA、invA、hns和hns 5个基因建立多重PCR检测方法，结果表明二重PCR检测灵敏度与单一PCR一致，三重PCR检测灵敏度有所下降。并未建立起同时检测4种基因的多重PCR方法。Soumet等根据沙门氏菌属随机克隆序列、伤寒沙门氏菌的fc基因和肠炎沙门氏菌的sefA基因设计了三对引物，应用多重PCR对1 078份家禽样品进行检测，敏感性可达95％，高于常规细菌学鉴定方法的92.5％。显示出方法建立的不稳定性和引物设计的重要性。

1.2多重PCR检测不同致病菌

针对不同病原菌高度保守基因、特异性基因和毒素基因，设计相应的引物从而在同一反应体系中实现对多种病原菌的检测。可以大大缩短检测时间和降低成本。相对于检测同一致病菌，检测多种菌更有实际意义。由于食品中病原菌的数量较少，一般在检测前进行10～24h的增菌过程，可以显著提高样品检出率。陈伟等对金黄葡萄球菌(sA)的ntlc、单增李斯特菌(LM)的hly和蜡样芽孢杆菌(BC)的hemolysin基因，设计合成三对引物，结果显示方法检测结果与单基因PCR检测的灵敏度相同，结果稳定。具有推广应用价值。整个检测过程在16h完成，监测灵敏度可达1cfu／mL。李博等以金黄色葡萄球菌，志贺氏菌和沙门氏菌建立多重PCR获得相同的稳定结果。体现出在监测多重致病菌方面的优越性。杨平等对食品中主要存在的4种致病微生物沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌，根据其主要特异性基因产物设计引物，建立起4种致病菌的多重PCR检测体系，体系中4种病原菌随机混合扩增均可成功，具有很强特异性，包括增菌时间10h即可检测完毕，在食品卫生检验中具有较强使用价值。焦豫良等对6种食品致病菌建立起的多重PCR灵敏度与单独PCR相同，所需时间更短，整个过程只需3-4h。显示出快速监测的优势。

2多重PCR在食品中病毒的检测

病毒只能在活的宿主细胞内才可以生存，一般在食品中并不能繁殖和复制，但很多资料证明，多种病毒性疾病确实由食品传播的。如甲肝病毒，脊髓病毒，轮状病毒和诺沃克病毒等。由于能够引起食品中毒的病毒种类较少，而且血清型亦不是很多，所以采用多重PCR测定多种病毒意义不大，但在确定食品中是否存在某种病毒方面具有一定的优势，即用多重PCR检测某一病毒，2003年SARS期间，我国出口的食品和动植物产品被迫要求进行SARS病原检测要求。单一PCR必须进行两次PCR才能确定是否为SARS。陈文炳等采用人工合成的特异的SARS病毒DNA片段作为可以病毒添加到牛肉等食品中，然后采用公开发表合成的引物进行二重PCR扩增，并采用单重PCR对照分析，得到相同的灵敏度，获得和单重PCR相同的扩增片段。给食品中病毒的多重PCR检测提供了一个研究方向。

3多重PCR在食品中真菌污染的监测

真菌在谷物和其他食品中生长繁殖时会产生真菌毒素，真菌毒素会引起人畜严重的食物中毒，如何能够快速检测食品中真菌及其毒素对于食品卫生具有重大意义。对于真菌的检测，目前多采用化学色谱法、现代免疫学和毒理学试验等，大部分是针对其产生的毒素进行鉴定，而对于未开始产毒或产毒量小的真菌检测可能出现假阴性。多重PCR通过检测真菌的基因序列判断食品被真菌污染的程度，具有更高的检出率，检测食品更加安全。秦文彦等t13J根据黄曲霉毒素生化途径中的关键调控基因an、Romt—1和ver－1的序列以及真菌共有的5.8SrDNA的ITS序列分别设计ApaF／ApaR、OmtF／OmtR、VerF／VerR及ITSl／ITS4 4对引物，研究建立起产黄曲霉毒索真菌及在食品中的快速灵敏监测体系，扩增出的对应基因序列与基因库中对应的DNA序列同源性达99％以上，监测特异性较好，提示多重PCR可作为真菌及其毒素检测的潜在方法进行研究。

4存在的问题与展望

多重PCR作为一种快速、准确、灵敏的检测方法，但高灵敏往往伴随着稳定性低重复性差的问题，PCR技术本身对操作者和试剂要求较高，多重PCR的要求则更加苛刻。微量的外源DNA即可对结果产生巨大的影响，甚至产生假阳性，导致测定结果错误。同时多重PCR对引物的浓度，Mg2’离子的浓度、dNTPS浓度和扩增退火温度的要求更加严格，任何一种条件控制不当，都很容易造成非特异性扩增，甚至扩增失败。在建立方法时必须进行优化各个反应条件，使得测定结果更加稳定和清晰。

食源性病原微生物快速分析与检测 篇4

食源性疾病是食品安全的主要问题, 近年来, 国内外食源性疾病时间频频发生, 据WHO (世界卫生组织) 统计, 各国食源性疾病的漏报率在90%以上, 每年公布细菌性食源疾病事件对于实际发生率来说只是冰山一角。因此, 对食源性疾病的预防与控制已引起了世界各国的关注。

食源性病原微生物的检测技术是预防和控制的关键技术环节, 与传统的检查方法相比较, 新型的微生物检测技术正逐渐从传统的培养和生理化, 向快速的分子生物技术、免疫学技术、代谢技术、蛋白质指纹图谱技术、自动化仪器、生物传感器等方向发展。本期“分析与检测”策划“食源性微生物快速检测”专题, 邀请业内专家及相关企业将其食源性病原微生物的先进检测技术及经验, 同大家分享。

病原微生物实验室简介 篇5

病原微生物实验室的检测项目和检测方案根据临床需要综合设计，做到结果稳定可靠、效率高、检测周期短，从而为临床诊断和治疗提供及时和可靠的依据。

血液系统恶性疾病患者常伴免疫功能低下，尤其造血干细胞移植或长期的放化疗后，患者的免疫功能更低，易继发各种病原微生物感染，甚至机会性致病菌爆发感染，部分患者还可因感染继发恶性淋巴细胞增殖性疾病，常常危及生命危险。

目前常用的病原微生物检测方法有：病原微生物培养、免疫血清学检测、抗原检测和基因检测。由于血液系统恶性疾病患者多免疫功能低下，产生抗体困难;病原微生物培养检测周期长，而且受多种因素影响阳性率很低，不能满足临床需要。故检测病原基因或抗原更能反应感染的状态。

病原微生物实验室现已开展了多种血液病患者中常见的致病和机会性致病的病原微生物定量和定性检测项目。主要应用PCR基因扩增检测的方法对病原微生物进分型鉴定，具有检测灵敏度高、分型准确、窗口期短、报告速度快的优势。所配备的仪器主要有AB 3500实时荧光定量PCR仪、AB 9700和AB Verity型普通PCR仪。

本实验室的检测项目和检测方案根据临床需要综合设计，做到结果稳定可靠、效率高、检测周期短，从而为临床诊断和治疗提供及时和可靠的依据。

病原微生物实验室现有人员5人，其中特聘教授1人、硕士学历2人、本科1人，专科1人。

项目介绍：

1。病原微生物PCR定性检测项目：

1)人类疱疹病毒筛查(HHV1-HHV8)

同时筛查8种人类疱疹病毒

2)出血性膀胱炎病毒(BKV、JCV、SV40)

3)人类T淋巴细胞白血病病毒1型(HTLV1-RNA)

4)真菌PCR

2。病原微生物PCR定量检测项目：

人类疱疹病毒

1)单纯疱疹病毒(HSV-

1、HSV-2)

2)水痘-带状疱疹病毒(VZV)

3)EB病毒(EBV)

4)巨细胞病毒(CMV)

5)人类疱疹病毒6型(HHV-6)

6)人类疱疹病毒7型(HHV-7)

7)人类疱疹病毒8型(HHV-8)

呼吸道病毒：

1)呼吸道合胞病毒

2)腺病毒(ADV)

肠道病毒：

1)柯萨奇病毒

2)轮状病毒

其他特殊病原微生物：

1)微小病毒B19

2)结核杆菌 3)卡氏肺囊虫 4)支原体

3。其它病原微生物检测项目： 1)内毒素

病原微生物检测 篇6

【摘要】目的 根据细菌性腹泻患儿病原微生物检验结果，探讨儿童细菌性腹泻的主要危险因素。方法 随机抽取我院2013年5月——2014年9月300例儿童细菌性腹泻患者，并对其临床资料进行回顾性分析，总结导致细菌性腹泻的主要的原因。结果 300例患儿粪便标本病原微生物检测结果显示，共检出病原菌222株，检出率为74.0%，其中志贺菌所占比例最高，为54.0%，其次为弧菌属、气单胞菌等。经过药敏试验证实，上述菌株对头孢哌酮、头孢噻肟、头孢三嗪等抗生素均具有较强耐药性。结论 儿童细菌性腹泻的主要病原菌为志贺菌，且耐药性较强，为减少其损害性，应积极采取有效措施进行预防和治疗。

【关键词】细菌性腹泻；病原微生物检验；志贺菌；抗生素

【中图分类号】R446.5 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）02-0229-01

及时对导致儿童细菌性腹泻的主要病原微生物进行检测，并根据疾病特点探讨儿童腹泻流行病学特征，能够显著减少有效减少儿童腹泻发生率，进而降低疾病对患儿的危害性。本文选择我院2013年5月——2014年9月300例儿童细菌性腹泻患者作为观察对象，现报告如下。

1.资料与方法

1.1一般资料

随机抽取我院2013年5月——2014年9月300例儿童细菌性腹泻患者，并对其临床资料进行回顾性分析，其中男161例，女139例，年龄1～7岁，平均年龄（4.6±0.8）岁，病程8h～7d，平均病程为（2.1±0.5）d，所有患儿均符合细菌性腹泻相关诊断和治疗标准[1]。其中143例患儿合并呕吐，例39严重脱水，67例患儿伴随发热症状。

1.2研究方法

所有患儿均进行病原微生物检测，针对细菌培养结果、药敏试验结果进行回顾性分析。其中患儿粪便标本取样后，及时送达细菌室培养，同时进行常规检查：（1）细菌检验： 细菌检测方法参考英国 Sensititre（ 先德） 荧光法微生物鉴定分析系统提供的方法，试剂由先德提供微生物鉴定板，并对弯曲菌、沙门菌、致病性大肠埃希菌等细菌进行分离和鉴定；（2）药敏试验：通过K-B方法对常用3种抗生素开展药敏实验，包括头孢哌酮、头孢噻肟、头孢三嗪。在35℃环境下连续培养20～24h后，测量抑菌圈直径。根据全国临床检验相关操作标准对药物敏感性进行判断。

1.3统计学方法

将数据录入到SPSS 18.0统计软件中，数据均采用%表示，资料采用x2检验，计量资料采用t值检验，检验标准为α=0.05，当P<0.05时，认为具有统计学意义。

2.结果

2.1病原微生物检验

本研究300例患儿粪便标本经过上述病原微生物细菌分离试验，共检出菌株222株，检出率为74.0%。其中包括志贺菌120株，占比为54.0%。其次为弧菌属46株，占比为20.7%。同时检出气单胞菌、致病性大肠杆菌分别为21、18株，占比分别为9.5%、8.1%%，其他菌株17株，占7.7%。经过统计学分析认为，志贺菌检出率与其他菌株比较，差异具有统计学意义（P<0.05），结果详见表1。

3.討论

细菌性腹泻是儿科常见病和多发病，属于多种病原体引起的消化道综合征，主要临床特征为大便性状改变、次数增多。流行病学调查表明，在我国及很多发展中国家，急性细菌性腹泻是导致新生儿和儿童死亡的重要原因[2]。目前，临床医学工作者已经将急性腹泻病原微生物种类列为重点研究对象。相关领域最新研究结果显示，引发儿童急性细菌性腹泻的主要病原微生物包括细菌、病毒、原虫、真菌。诱发细菌性腹泻的原因比较多，包括感染因素和非感染因素，其中非感染因素包括解剖性、代谢性、酶性及炎性因素，而感染性因素是最主要的致病因素[3]。若不及时采取正确措施开展临床诊疗，可造成患儿出现严重营养不良症状，给患儿身体健康和生长发育带来比较大的影响。

本研究结果显示，致病菌株中以志贺菌所占比例最高，达到50%以上，与其他菌株类型相比，差异具有统计学意义（P<0.05），与权威文献报道结果相符[4]。其次为弧菌属，所占比例与权威文献报道结果存在一定差异性，考虑原因可能是本研究样本容量较小。同时，药敏试验结果证实，上述几种菌株对头孢哌酮、头孢噻肟、头孢三嗪等抗生素均具有较强耐药性。

针对导致儿童细菌性腹泻主要病原微生物——志贺菌，建议将作为儿童细菌性腹泻病原微生物常规检查项目，有效防止临床误诊和抗生素滥用现象，并在第一时间为患儿开展临床诊疗，避免耽误最佳治疗时机。现阶段，针对由志贺菌导致的儿童急性细菌性腹泻，可通过预防性措施和方法阻断感染途径：（1）应告知来院就诊患儿的家长，养成良好卫生习惯，进一步阻断细菌感染途径；（2）不给患儿食用未经过消毒的蔬菜和水果；（3）口服具有依赖链霉素株的多价活疫苗，能够发挥一定保护作用。

参考文献

[1]李敏，邱庭刚.儿童细菌性腹泻的病原微生物检验[J].中国药物经济学，2014，16（32）：425～426.

[2]纪金玲，廖华芳，崔恩博，等.儿童腹泻病原菌1004株构成及药敏试验结果分析[J].中华临床医师杂志（电子版），2012，11（21）：539～540.

[3]韩晶.儿童细菌性腹泻的210例病原微生物检验结果分析[J].中国社区医师（医学专业），2013，04（08）：832～835.

病原微生物检测 篇7

常规PCR检测技术是一种特异、敏感的分子检测技术,在病原微生物的快速诊断方面发挥出了重要作用。但是普通PCR技术在实际工作中问题较多,尤其是机械化程度比较低,在PCR后处理方面基本需要依靠人工操作来实现。另外,普通PCR技术还有不能实现定量、PCR扩增产物易受污染等不足。荧光定量PCR技术是在普通PCR技术基础上发展起来的核酸定量新技术,其基本原理相同,仅在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号进行实时监控定量,因此实现了PCR技术从定性到定量的飞跃,目前已成为分子生物学研究领域,尤其是病原微生物诊断不可缺少的重要工具。荧光定量PCR技术1996年美国Applied Biosytems公司首先推出,其特点是用产生荧光信号的指示剂扩增产物的量,荧光信号可通过荧光染色剂嵌入双链DNA或通过标记的序列特异性荧光探针信号将探针转移以进行实时动态监测,实验过程中消除样本和产物的污染,与普通PCR相比,无需扩增后的产物后续处理[1,2]因此极大地减少了实验过程中可能存在污染的隐患。实时荧光定量PCR在扩增产物过程中根据指数扩增期产物的量推算初始模板核酸拷贝数,在PCR反应早期,产生的荧光水平比较低,很难与背景区分,当PCR完成一定数量循环后荧光的产生依次进入指数增长期,采用标准曲线计算被测样品的初始浓度进行定量分析[3]。笔者就近年来荧光定量PCR技术在病原微生物诊断方面的研究近况作一简述。

1 普通PCR原理及应用

普通PCR反应是将处于同一反应管中的一对寡核苷酸DNA、模板、及DNA聚合酶通过热变性使双链DNA打开变成单链,再通过退火使引物与DNA模板结合,在耐热DNA聚合酶的作用下通过延伸合成与模板互补的DNA链,如此反复上述反应过程,使模板DNA通过无限放大以几何级数获得大量扩增产物。在病原微生物检测中,普通PCR技术目前已经得到广泛应用。李业鹏等[4]选取沙门菌属侵袭性抗原保守基因invA基因上的靶序列设计一对引物,对经过传统方法鉴定过的22种77株沙门菌和24株非沙门菌进行非特异性检测,并对人工污染的食品进行检测条件研究,采用普通PCR技术在19 h内可检出含有沙门菌102 CFU/g的食品,与传统方法相比既缩短了检测时间,又可对大量样品同时进行检测。丁建清等[5],利用霍乱弧菌外膜蛋白和毒素基因合成两对引物开展了双重引物PCR检测霍乱弧菌,同时区分霍乱弧菌产毒株和非产毒株,研究结果阐明了PCR技术与常规分离培养的优点,为霍乱防治提供了一种有用的诊断工具。由于普通PCR技术具有高度的敏感性,同时又能直接扩增无需增菌的样品,因此,在病原微生物快速检测,尤其是突发公共卫生事件快速检测方面大有用武之地。

2 荧光定量PCR原理

常规PCR只能作为定性,实验过程中产物扩增后需进行凝胶电泳后对扩增片段进行分析。定量PCR在反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时进行监控,完成初始模板数的精确定量,对未知模板进行分析[6]。在定量PCR反应体系中有荧光染料标记物和荧光探针标记物,分别利用PCR延伸和退火等反应过程产生荧光物质,在每个循环中荧光信号放大,在这些荧光物质中均有其一定的波长随后通过仪器自动检测,软件分析系统通过计算机计算出初始模板量。荧光定量PCR最初应用的就是DNA结合荧光染料如EB等,但这些染料具有一定的毒性,在操作过程中需做好个人安全防护,操作台要严格区分以防交叉污染。随着研究的深入,最近研究者们推出了无毒不污染环境的SYBR Greenl等高强信号的新一代荧光染料,为定量PCR的研究开拓了应用前景[7]。SYBR Greenl可以嵌入到DNA双链结构的空隙中,如果在游离状态下不发出荧光信号,而一旦与dsDNA结合此时荧光强度明显增加,而发出的荧光信号可通过荧光检测系统检测,当然荧光强度增加与反应体系中的初始模板量有直接关系[8,9]。SYBR Greenl优势主要是检测方法简便,成本低廉,但由于SYBR Green染料可以结合任何的dsDNA分子,因此,其特异性方面有一定的问题。在实验过程中可以通过反应条件的优化以去除或减少非特异性产物和引物二聚体的产生解决特异性不足的问题。定量PCR的定量方法有绝对定量和相对定量之别,绝对定量既检测样本与已知的标准曲线进行比较估算检测样本的靶DNA量。绝对定量的标准品一般以质粒DNA或是PCR扩增产物进行制备,由于检测样本中的浓度一般都是通过标准曲线来确定,因此,实验过程中标准品是定量的关键。相对定量在一定检测样本中靶序列相对于另一参照物序列的量的变化。相对定量依据PCR反应原理,在PCR反应的过程中反应的指数期得到扩增产物的ct值来反应起始模板的量,可以通过数学公式计算相对量。PCR反应过程中所产生的DNA拷贝数是以指数式增加,在传统的PCR反应中通常是以凝胶电泳进行分离并用荧光染料(EB)通过显色后在紫外检测仪下进行观察,因此PCR扩增的产物有时出现假阳性或阴性结果。在荧光定量PCR中,对整个反应是通过实时连续检测,因此定量PCR反应在指数期的某一点上检测产物的量,由此推断模板最初的量[10]。

3 荧光定量PCR在病原微生物中的应用

荧光定量PCR自1996年开始推出以来已在临床微生物、卫生微生物及生命科学研究等领域得到广泛应用[11,12,13],尤其是在病原微生物快速检测方面已发挥出了重要的作用。在诸多的病原微生物中高度的变异是一个重要的特点,因此许多的检验检测技术可能会严重影响对病原微生物的分析结果。而定量PCR技术其基础是一种分子信标技术,检测结果可以进行定量,所获得的结果就更加正确可靠。Schmidt等对输血人员采用荧光定量PCR进行HBV筛选检测很大程度上减少了假阴性结果,将定量PCR技术与自动化的核酸提取技术相结合可以实现对病毒的快速高通量检测,通过一次扩增可完成上百个反应,并可直接得到病毒的拷贝数,而采用常规病毒检测技术很难实现[14]。霍乱弧菌检验检测过去基本以常规分离技术进行,费时费力,而且经常出现误诊或漏诊现象,近年将分子生物学技术导入的霍乱弧菌的快速检测中尤其是定量PCR的应用解决了许多难点问题。随着生态环境的改变及抗生素的滥用,使许多病原微生物产生了耐药,菌株之间发生了变异或分离不出细菌,抗体检测技术需要用双份血清,很难快速控制霍乱疫情。定量PCR技术由于不需要活菌的情况下也可检测出,因此对于快速查明原因,控制疫情蔓延有重要意义。黄世旺等建立了定量PCR技术,设计一对引物对其特异性及敏感性等进行了研究,并用副溶血性弧菌、志贺菌等10余种其他肠道细菌进行比对实验,其检测灵敏度高达10 CFU/ml,明显高于常规PCR的检出限90 CFU/ml,整个实验过程只需2 h[15]。彭雁忠等设计了用于检测空肠弯曲菌的CJ、出血性大肠O157:H7的RFBE、副溶血性弧菌的toxR和李斯特菌的iap四对基因引物采用荧光定量PCR在实验室开展了研究,建立的多联实时定量PCR方法检测结果与权威检验机构的结果符合率达100%,实验菌株未出现任何假阳性或假阴性现象,实现了在一个反应管中检测多靶基因的目的[15]。SARS病毒、其他呼吸道病毒在实验室中最原始及经典的方法是病毒分离,但要求条件严格耗时长,且分离的阳性率较低,ELISA方法可检测患者血清中的IgM或IgG,但抗体检测技术一般要在患者发病后7～10 d才出现,很不适用快速检测。RT-PCR技术虽然敏感、特异,且在5～6 h既可出结果,但检测过程中有可能造成污染假阳性率高,而定量PCR能够满足上述不足。经过实验室的大量研究,优化实验条件对研究的SARS病毒具有高度特异性,并与甲、乙流感病毒、禽流感病毒、麻疹及其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度高达0.1 TCID50,从病毒样本提取核酸到完成检测仅需3 h,解决了病毒早期快速检测的难题[17,18]。王振国等,应用定量PCR技术建立了一种特异、敏感的空肠弯曲菌检测技术,通过设计一条空肠弯曲菌保守基因引物及Taqman探针,实现了空肠菌的检测难点,研究结果显示出了空肠弯曲菌的增菌液中最低检出限为5 CFU/ml,而对实际的检测样本检出限为10 CFU/g,研究结果表明了空肠弯曲菌在检测时无需进行增菌培养可直接对样品进行检测有重要的实际应用价值[20]。Fitzmaurice等[21]应用定量PCR和RT-PCR检测和定量出血性大肠O157:H7的vtll、vt2毒素基因,检出限100 fg基因组DNA,有望该方法可替代传统方法。

4 问题及展望

荧光定量PCR相对定量或标准曲线定量方法不同程度存在一些有待解决的问题。在标准曲线定量中,标准品制备十分关键,目前为止没有一个统一的标准,实验室所用标准品亦不相同,缺乏实验室间的可比性。另外荧光定量PCR由于是在封闭状态下进行,因此扩增产物大小不能监测,而常规PCR产物扩增后通过凝胶电泳等观察片段大小。目前荧光定量PCR成本相对较高,真正应用现场受到一定影响。

病原微生物检测 篇8

食品安全已成为世界各国共同面临和关注的问题, 由病原微生物引起的食源性疾病是影响食品安全最主要的因素之一。快速而准确地检测出被称为“头号杀手”的食品致病菌, 是确保食品安全的首要任务, 因此建立一种快速、准确、便捷的检测技术, 对于从源头制止食源性致病菌污染, 预防中毒事件的发生具有重要意义。食源性致病菌的传统检测方法主要有微生物培养法、电阻电导测定法、细菌直接计数法、分子生物学法、免疫学方法等。但传统微生物检验方法, 不仅步骤复杂, 而且耗时费力、灵敏度也不高, 难以适应飞速发展的现代食品生产要求。上转发光技术是一种新的检测方法, 具有简便、快速、廉价、适应性广等优点, 可用于基层单位中各种食源致病菌的快速筛查检测。

食品中病原微生物快速检测技术常用方法及其优缺点

食品微生物快速检验方法的研究始于上世纪80年代早期, 随着食源性疾病发病人数显著增加, 即使在发达国家, 食源性疾病也呈上升趋势, 各国也越来越重视此项工作。近年来, 人们采用免疫学、生物化学和分子生物学等先进技术进行快速检验方法的研究, 使其发展更为迅速。传统的食源性病原微生物的检测、鉴定仍停留在分离培养、形态观察、生化鉴定和血清学分型等水平, 存在操作烦琐、检测周期较长、检测结果往往存在不同程度滞后等缺点, 这不仅不利于食品安全管理体系及时验证控制措施实施效果, 也不利于对潜在不安全产品迅速采取纠正措施。对食源性致病菌进行准确、灵敏、省时、省力和省成本的快速检验方法已经成为保证食品安全的迫切需求, 从长远发展趋势来说, 快速方法是微生物检测的一大方向。上世纪50年代以来, 国内外学者进行了大量的研究, 从以传统方法为基础发展到以免疫学 (如ELISA及免疫层析试纸条法) 为基础或以分子生物学法 (如常规PCR及荧光定量PCR方法) 为基础的快速检验方法, 并在实践检验中不断取得新进展。ATP法、免疫法、和显色培养基法在国外应用相当成功, 国内的许多检测机构也在使用或正在考虑使用国外先进的快速检测技术, 如纸片法、生物化学技术 (如PCR技术和基因探针技术等) 、选择鉴定用培养基法、免疫学技术、细菌直接计数法、全自动微生物分析系统 (AMS) 等。但这些方法中有些要求配备特殊的仪器, 有些需要操作人员具有较高的技术水平, 还有些财政和人力投入较大, 因此绝大部分微生物快检方法在基层单位暂时无法推广应用。目前应用于微生物检测的常用方法及其优缺点见表1。

上转发光技术

上转发光技术 (up-converting phosphor technology, UPT) 是基于上转发光材料 (up-converting phosphor, UCP) 而发展起来的一种新型标记技术, UCP是由几种稀土金属元素掺杂于某些晶体的晶格中构成的纳米级颗粒。由于独特的结构, UCP可由红外光激发而发射可见光——上转发光 (up-converting) 。这种绝无仅有的性质使UCP作为标记物在生物分析中, 以无本底干扰、无焠灭、适于多重分析和定量分析等具有显著优势, 从本质上有别于传统标记物。因此一种叫做上转换发光颗粒免疫层析 (UPT-LF) 的检测技术应运而生, 因其具有对样品种类的耐受程度高, 不受操作环境、技术人员及设备的限制, 操作过程简单快速的同时能够得到多重定量结果等诸多优点逐渐发展起来。

上转发光技术检测原理

UCP包括3种主要成分:主基质、吸收子和发射子, 由于其独特的结构, 可以出现反Stokes现象, 即这种材料可在红外光区 (波长>780nm) 被激发, 却发射波长远短于激发光的可见光 (波长为475~670nm) , 这一现象在自然界中并不存在, 其基本原理是双光子或多光子荧光, 即能量上转。选择不同的吸收子、发射子和主基质可使UCP具有不同的光学性质, 成为其使用灵活的基础。

上转发光技术与经典的免疫层析技术相结合, 采用新型标记物——UCP上转发光材料, 通过扫描分析光电信号, 实现对目标抗原或抗体的现场快速检测。上转发光技术试纸条是由UPT与免疫层析共同组成, 主要由试纸条以下5个部分组成:样品垫、结合垫又称结合物稀释垫、分析膜、吸水垫、粘性底衬。叠合顺序如图1所示, 通过粘胶固定于粘性底衬上。

各部分的作用分别为:样品垫是滴加被检样品的部位;结合垫中含有标记物-生物活性分子结合物, 在加入被检样品后, 其可在试纸条上发生免疫反应;分析膜是免疫反应发生的部位, 因此是层析试纸的核心结构, 抗原、抗体等生物活性分子均固定其上作为检测带和质控带;吸水垫的虹吸作用为整个反应过程中的液流提供动力。为保证液体在试纸条上流动的连续性, 各个部分之间需要有一定的重叠区。

检测时, 首先将待检样品滴加到样品垫上, 样品通过渗透与虹吸作用进入结合垫, 使其中固定的标记物——生物活性分子结合物重新解离, 并在吸水垫的虹吸作用下, 离开结合垫流入分析膜, 向吸水垫的方向流动。此过程中标记物——生物活性分子结合物、目标被检物与检测带、质控带之间将发生一定的特异性免疫反应, 并通过具有指示性的标记物产生反应信号。依据所发生的免疫反应方式的不同, 可分为夹心模式与竞争模式。

上转发光技术发展的历程

UCP作为生物标记物所具有的独特优势在1995年便已引起了美国军方的重视, 在国防部下属DARPA (Defense Advanced Research Projects Agency) 的大力支持之下, 开发了基于上转换发光技术的手持式传感器以及流式细胞仪 (如图2) , 用于对战场上可能使用的多种生物战剂进行快速的预警与鉴定。

国内得益于我国稀土资源丰富, 研究单位包括军事医学科学院微生物流行病研究所杨瑞馥实验室、北京热景生物技术公司, 在2000年已经完成了UCP颗粒的制备, 而且在颗粒上有了一定的突破;2002年创造了以UCP为基础的自主研制PCT;2003年, 研制出了第一代UPT免疫分析仪;2005年研制出了第三代便携式系统, 应用于国家安全、部队、疾控生物战剂检测, 在生物应急领域, 研制完成的UPT快速检测系统 (UPT生物传感器及UPT免疫层析试纸) 可检测鼠疫菌、炭疽芽孢、布鲁氏菌、抗鼠疫菌抗体、抗SARS-Co V抗体、霍乱O1菌、霍乱O139菌等多种病原体, 已推广多个地方疾控系统——北京市卫生局、中国检验检疫科学研究院、防化研究院、鼠疫防治系统等职能单位;2008年, UPT系统已经实现了产业化;2011年获得国内第一个自主知识产权现场检测技术生产文号, 并获得了完整的工艺流程与系统产品, 已经开发出了面向临床、生物反恐、食品安全快速检测仪器及试剂, 总共获得12个产品批准文号, 该系列产品打破了国外技术的垄断, 项目产品已经用于临床检测、军队和地方生物反恐、食源性致病菌检测等;2014年该项目获得中华医学会二等奖、北京市科技进步二等奖。

上转发光技术在微生物领域的应用

UCP独有的上转发光现象决定了它不存在背景干扰, Niedbala等 (2001) 报道了上转磷光技术已被应用于免疫标记分析, UCP作为标记物的免疫层析技术, 它不仅克服了胶体金免疫层析只能定性而不能定量的缺陷, 更以其适用于多重分析、无背景吸收、无焠灭等特点, 赋予了免疫层析技术新的特性。2001年有学者报道, 用上转换荧光横向流检测特定核酸氨基酸序列是一种快速, 灵敏的检测DNA方法, 可以识别人类乳头状瘤病毒16种类型的感染。Zuiderwijk M等 (2003) 报道了用双抗体夹心免疫层析法, 在上转换荧光免疫技术和横向流动技术的基础上, 可检测病原体链球菌, 检测结果显示, 只需要1ng DNA即可检测出肺炎链球菌, 表明了UPT技术在传染病领域的应用潜力。Zhongqiang Y, Lei Z等在2006年研究开发了基于侧向流免疫上转换UPT技术的生物传感器, 这种生物传感器已经被开发并用于快速定量检测鼠疫耶尔森氏菌, 研究原理是用纳米级的UCP颗粒作为标记物, 采用夹心免疫层析法, 在UPT——LF免疫分析系统的平台上进行检测, 从样品处理到数据结果分析不到30分钟。Vijaya等 (2007) , 应用上转发光法快速检测呼吸道合胞病毒感染, 此检测设备运用新型上转磷光技术, 也是上转磷光技术第一次用于传染性疾病的检测, 此设备设计便携, 可以直观的判定呼吸道合胞病毒 (RSV) 感染检测, 此种方法的临床检测灵敏度为90%, 特异性为98.3%, 与经过RT-PCR验证的病毒培养相比较, 相关系数达到96.2%。Corstjens等 (2008) , 用UCP作为标记的层析流技术检测T细胞分泌的γ-干扰素, 其分析灵敏度>2pg/m L。

上转发光技术在食品中病原微生物检测的应用

据W H O估计, 由于全球性食品贸易的快速增长以及人口的流动, 饮食习惯的改变, 新食源性致病菌不断出现, 全世界每年发生食源性疾病数10亿人, 每年约有200万儿童死于腹泻, 其中6 6%以上是由细菌性致病菌所致。

食源性致病菌导致的疾病是食品安全的关键问题, 其中动物源性食品中沙门氏菌、大肠杆菌O157、霍乱弧菌、副溶血弧菌等引起的食源性疾病是食品安全的主要问题。UCP作为标记物的免疫层析技术, 它不仅克服了胶体金免疫层析只能定性而不能定量的缺陷, 更以它适用于多重分析、无背景吸收、无焠灭等特点, 赋予了免疫层析技术新的特性。传统的横向流方法通常用有色颗粒标记, 像胶体金或着色, 通过颜色识别结果, 然而, 定性以及较低的灵敏度限制了其检测应用, 而UCP颗粒在最低检测线下仍然可以检测, 用基于横向流的上转发光技术分析, 可以在109CFU/m L的微生物环境下检测到103CFU/m L的大肠杆菌O157:H7, 浓度变异系数在0~107organism/m L之间均<10%, 对于较小的微生物, 最低检测线在5ng/m L以下。而且, 此技术可以进行多重检测, 可同时进行多靶标检测。研究发现, 使用上转发光免疫层析试纸盒可对包括乙型副伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌O1、O139群、大肠杆菌O157、甲型副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、副溶血弧菌、伤寒沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌在内的10种食源性致病菌进行检测, 不增菌检测敏感性为109~105CFU/m L, 增菌敏感性<10CFU/m L。均可满足食物样本增菌检测和腹泻样本直接检测的灵敏度需求。线性拟合系数R2介于0.9~0.98之间, 均具有良好的定量能力。每种试纸与其它9种菌之间无明显交叉反应, 特异性良好。

上转发光技术在食品中病原微生物检测的应用前景

病原微生物检测 篇9

支原体是引起泌尿生殖道感染常见的病原体之一, 常引起非淋菌性尿道 (宫颈) 炎、慢性前列腺炎、男女性不孕、子宫内膜炎、输卵管炎以及盆腔炎等疾病[1]。为了解泌尿生殖道支原体的感染状况, 以及解脲脲原体对不同药物的体外耐药性, 作者对198例患者样本进行了解脲脲原体 (Uu) 、人型支原体 (Mh) 检测, 并对部分解脲脲原体进行了体外药敏试验, 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2006年1月至2009年10月采自本院门诊患者198例, 男96例, 女102例;年龄17~62岁。所有患者均有不同程度泌尿生殖道炎性症状, 采样前至少1周内未应用过任何抗生素。

1.2 标本采集

男性患者清洁尿道口, 用无菌棉拭子插入尿道2~3 cm处取分泌物;女性患者用无菌棉拭子拭取宫颈口分泌物, 所有标本均立即送检。

1.3 药敏试验

支原体培养、药敏一体化试剂盒为珠海浪峰生物技术有限公司产品。药敏试验药物为四环素 (TET) 、乙酰螺旋霉素 (ASP) 、红霉素 (ERY) 、罗红霉素 (ROX) 、强力霉素 (DOX) 、克拉霉素 (CLA) 、氧氟沙星 (OFL) 、美满霉素 (MIN) 、交沙霉素 (JOS) 、阿奇霉素 (AZI) 。具体试验操作方法及检测结果判定根据试剂盒说明书进行。

2 结果

198例支原体培养标本中, 支原体阳性56例, 总阳性率28.3%。其中解脲脲原体阳性53例, 阳性率26.77%;人型支原体阳性11例, 阳性率5.6%。

3 讨论

目前认为, 解脲脲原体和人型支原体均为非淋菌性尿道炎重要的病原体之一, 因此, 在对支原体感染的诊治中, 应同时检测Uu和Mh。本资料显示, 支原体总阳性率为29.1%, 解脲脲原体阳性率显著高于人型支原体 (χ2=94.6, P<0.01) 。支原体阳性患者中, 女性显著高于男性 (χ2=24.5, P<0.01) , 这可能与支原体寄居于女性生殖道的机会高于男性有关。由于女性症状不明显, 因此在疑为性病的女性患者就诊时, 应尽量进行支原体培养。

支原体缺乏细胞壁, 影响细胞壁合成的药物对其无效, 因而临床上常用抑制蛋白合成的喹诺酮类、大环内脂类、四环素类三大类抗生素治疗。流行病学调查表明, 支原体对各种抗生素敏感性在不同地区差异明显[2], 主要与不同地区临床医生治疗用药习惯及各地区不同耐药菌株有关。探讨本地区支原体感染及耐药情况有非常重要的意义。从耐药情况看, 解脲脲原体对氧氟沙星等喹诺酮类药物耐药性较高, 强力霉素、乙酰螺旋霉素、交沙霉素、克拉霉素、美满霉素、阿奇霉素耐药性较低, 四环素显示对解脲脲原体有较好的抑制作用。喹诺酮类抗菌机制为抑制DNA消旋酶和拓扑异构酶IV活性, 有研究表明上述酶的基因极易发生变异从而导致菌株产生耐药性[3], 因而受临床用药是否规范的影响更大, 在耐药流行病学调查中该类药物的耐药性也较为明显。所以建议在临床上尽量不用这类抗生素治疗支原体感染。四环素类药物由于固有不良反应较多, 目前很少作为首先药物, 故支原体对四环素类药物的耐药性最低。这应引起临床用药的关注。

由检查群体可以看出, 随着性的成熟和性活动的增加, 支原体感染率呈上升趋势。在198例患者中, 以性活跃年龄组 (20~49岁) 的人群为主, 这个年龄组是性病的高危人群, 其支原体的感染率也较高。此外, 50岁以上年龄组受检人数较少, 但同样具有一定感染率, 应引起重视。由于本次调查时间较短、样本较少等原因, 未发现小年龄组人群的感染者, 各年龄组间也无统计学差异。但研究仍表明各年龄组的人群均可感染支原体, 所以对人群的支原体感染应普遍重视。

在对受检对象及感染者的职业分布进行的分析显示, 性病门诊的就诊者以及支原体的感染者均以文化水平偏低、流动性较大的人群为主。

本次检测还发现, 支原体合并其他病原体感染的情况较为严重, 其中尤以支原体合并感染淋球菌为多。支原体和其他病原体的混合感染给性病的彻底治疗带来了相当大的难度, 因为各种病原体对抗生素的敏感性不同, 而临床上并不常规地对多种病原体同时进行检测, 因此造成性病的经久不愈或反复发作, 增加了患者的经济负担和精神负担, 同时也不利于性病的控制。

此外, 本院在采用法国梅里埃试剂盒进行支原体检测的同时, 也采用国内临床上常用的培养基进行了同步检测。对比分析表明, 梅里埃试剂盒检出率高于国内培养基。Uu的梅里埃试剂盒检出率为55%。国内培养基51%, Mh的梅里埃试剂盒检出率48%, 国内培养基33%。梅里埃试剂盒可以进行半定量检测, 具有在检出率的基础上进一步确定感染率的优点。因为在人群中, 尤其女性中存在支原体的正常携带状态, 只有定植部位的支原体达到一定数量后才会致病, 因此梅里埃试剂盒已成为国内外公认的诊断标准, 同时其药敏试验结果还可为医生提供抗生素治疗依据。在对感染率/检出率的分析表明, Uu检出阳性者中, 只有大约一半的人为感染状态而需要进行临床治疗, 另一部分可认为是Uu健康携带者。但Mh一旦检测阳性, 多为感染状态, 一般很少存在健康携带者。

总之, 支原体已成为引起性病的主要病原体之一, 在今后的工作中, 应对支原体的检测、诊断、治疗等各方面更加重视, 从而有效地降低和控制这类疾病。对泌尿生殖道支原体 (Uu和Mh) 感染可首选原始霉素、交沙霉素和强力霉素, 不宜选用环丙沙星和氧氟沙星治疗。

参考文献

[1]唐孝粮, 雷兰芳, 刘筱玲.泌尿生殖系统五种病原体情况分析.航空航天医药, 2006, 17 (3) :139-140.

[2]徐斌, 孙晶, 于海滨, 等.不同人群解脲支原体和人型支原体感染状况分析.吉林大学学报, 2003, 29 (2) :210-211.

病原微生物检测 篇10

国以民为本,民以食为天,食以安为先。食品安全关系到国计民生,加强食品安全管理和监督是社会各界的重要任务之一。其中,食品中的病原菌是威胁食品安全的重要因素,因此检测食品中的病原菌对保障食品安全具有重大意义。

传统的检测方法有色谱法[1]和质谱法[2]。这些方法测定结果准确可靠,是当前的主流技术;但存在着仪器昂贵、操作复杂、分析费用高等不足[3],无法满足食品现场检测准确、快速的要求,很难在实际检测中广泛应用。近几年来,通过综合引用微生物学、化学、生物化学、生物物理学、免疫学以及血清学试验技术,实现了对微生物进行分离、检测、鉴定和计数。与传统方法比较,其具有更快、更方便、更灵敏的优势。目前,已有的检测方法如电阻抗法、流式细胞术、免疫检测技术、生物荧光法等新的快速检测方法中,生物阻抗法是最易实现快速检测食品病原菌含量,具有操作简单、灵敏度高、特异性好、无需标记等优点[4]。为此,设计了一种可以快速、定量、即时地检测食品中多种病原菌含量的阻抗生物传感器系统装置。

1 基本结构和工作原理

1. 1 工作原理

本研究以病原菌为检测对象,通过蛋白A将病原菌抗体固定于金叉指阵列微电极表面,制备了一种阻抗型传感器[5]。以Fe(CN)36 - /4 作为氧化还原对,经过化学电阻抗谱表征电极表面修饰及抗原捕获过程,采用等效电路阐述其阻抗谱的变化。实验结果表明,待测溶液中病原菌浓度的对数值与叉指阵列微电极的电子传递阻抗的变化值呈线性关系[6]。传感器系统将上面的输出信号进行电压放大、A/D转换等处理,然后由已知的定量检测模型得出表征被测物含量的数值,并通过LCD装置进行显示,且可在超过安全值时进行报警。

1. 2 基本结构

实现定量检测和自动报警等功能,单片机是核心部件。本设计选用STC89C52单片机,它是一种低功耗、高性能CMOS8位微控制器,可满足系统工作的要求。该系统以STC89C52单片机为核心,包括阻抗测试模块、阻抗电压转换模块、电压放大电路模块、A/D转换模块和显示及报警模块,结构框图如图1所示。

此系统采用模块化设计不仅便于扩充不同测量单元,而且可防止各模块间相互干扰,利于仪器稳定。

2 硬件选型及电路设计

2. 1 集成放大器选择

A / D转换电路所需的电压幅值一般为2V,而叉指微电极输出的电压信号比较小,所以需要对叉指微电极输出的电压信号进行放大[7]。主放大电路采用放大器ICL7650,其电路具有电源电压范围宽、静态功耗小、可单电源使用及价格低廉等优点,广泛应用在各种电路中[8]。主放大电路如图2所示。

图2 主放大电路Fig. 2 Main amplifying circuit

为了后续电路的正常工作,合理设置R1、R2值,以便得到所需幅值的输出电压。输出电压为

2. 2 A /D 转换模块设计

经放大电路输出的电压值是模拟信号,不能直接送入单片机进行处理,还必须进行A/D转换后送入单片机进行处理。本设计选择ADC0809芯片作为AD转换装置,此芯片功能简单,能稳定实现本设计的要求。其电路图如图3所示。

2. 3 显示及报警模块设计

2. 3. 1 显示电路设计

传感器需要输出液晶显示结果,主要包括检测物名及物质浓度等。本系统选用LCD1602液晶显示屏,它是一种专门用来显示字母、数字、符号等的点阵型液晶模块,能够同时显示16×2( 16列2行,即32个)字符,可满足显示检测物名称和浓度的要求。其显示电路如图4所示。

2. 3. 2 报警电路设计

为了实现超限自动报警的功能,需要蜂鸣器接受单片机发出的超限报警信号发出警报,警示微生物的数量已经超标。要实现自动报警的功能,可采用实现单频音报警。其接口电路较简单,发音元件为压电蜂鸣器,当在蜂鸣器两引脚上加3 ~15V直流工作电压时,可产生3kHz左右的蜂鸣振荡音响。压电式蜂鸣器结构简单、耗电少,更适于在单片机系统中应用。压电式蜂鸣器约需10mA的驱动电流,可在单片机一端口接一只三极管和电阻组成的驱动电路来驱动,电路图如图5所示。

图5 蜂鸣器报警电路Fig. 5 Alarm circuit

单片机计算被测物含量,并与限定值比较:当被测物浓度超标时,单片机P3. 6输出高电平,驱动蜂鸣器报警[9],提醒检测者被测物超标,并做相应处理。

3 软件设计

为了便于程序修改和升级,软件系统采用模块化设计方法,主要程序包括:主程序、键盘处理子程序、数据处理子程序、液晶显示子程序及报警子程序[10,11]。软件设计使用C51语言编程,在KeilμVision环境下编译调试,程序流程图如图6所示。

系统工作流程为:检测人员通过键盘输入被测物种类,MCU通过判断处理之后,阻抗测试仪测量获得多个阻抗值,经阻抗电压转换电路和放大电路,A/D转换器处理,将得到的数字信号送入MCU;MCU对数字进行计算、比较等处理,得到被测物浓度,判断出浓度是否超限;接着,MCU将浓度送入LCD进行显示,判断比较结果是否需要进行报警,需要时则控制报警器报警。

4 结论

本文设计的阻抗传感器系统是以STC89C52单片机为核心,键盘输入被测物种类,叉指微电极测量获得阻抗值,经电阻电压转换电路和电压放大电路、A/D转换处理,数字信号由已知的定量检测模型得出表征被测物的含量,并进行LCD显示和超限报警功能。该系统满足国家对食品安全检测标准的要求,且装置结构紧凑、成本低、分析速度快、灵敏度高,应用前景好。

摘要：为了快速、准确地检测食品中有害病原菌的含量,设计了一种能够快速、定量、即时地检测出食品中多种病原菌的阻抗生物传感器系统。系统以STC89C52单片机为核心,使用键盘输入被测物种类,蛋白A修饰叉指微电极,应用电化学阻抗分析测量病原菌在不同浓度下的阻抗值,经过阻抗电压转换电路、电压放大电路、A/D转换等信号处理,最终通过LCD显示出病原菌浓度含量,若病原菌含量超限则报警。该系统能定量检测出多种病原菌的含量,并可实现含量的LCD显示和超限报警。该系统采用软、硬件模块化设计方法,结构紧凑、成本低、分析速度快、灵敏度高。

关键词：病原菌,传感器,叉指微电极,模块化

参考文献

[1]陈林鹃.仪器设备在食品检测中的应用及发展[J].食品安全质量检测学报,2011,2(5):239-247.

[2]宋莹,张耀海,黄霞,等.气相色谱一串联质谱法快速检测水果中的多效唑残留[J].分析化学,2011,39(8):1270-1273.

[3]蒋雪松,应义斌,王剑平.生物传感器在农药残留检测中的应用[J].农业工程学报,2005,21(4):118-122.

[4]Nunes GS,Barcelo D.Electrochenlical biosensors for pesticide determin-ation in food samples[J].Pest Canal,1998,26:156-159.

[5]叶尊忠,王婷,王一娴,等.阻抗生物传感器连续叠加法检测毒死蜱研究[J].食品安全质量检测学报,2012,3(6):676-680.

[6]颜小飞,李运涛,王蓉晖,等.检测禽流感H5亚型病毒的阻抗型免疫研究[J].分析化学研究报告,2012,10(40):1507-1513.

[7]柳利军.光模块模拟量的监测电路设计[J].自动化与仪器仪表,2005(4):13-15.

[8]孙成正,尹文庆,赵建平,等.植物电信号前置放大电路的设计与仿真[J].电子测量技术,2007,30(7):168-171.

[9]刘翔.基于单片机的自动温度测量报警系统设计[J].电子设计工程,2011,19(1):125-128.

[10]万江中,陈骥.一种温度可控的便携式食品安全检测仪的设计[J].传感器与微系统,2011,30(12):87-90.