大鼠主动脉平滑肌细胞（精选七篇）
大鼠主动脉平滑肌细胞 篇1
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象
成年SD大鼠,雄性,体重180~200 g,购自成都达硕动物有限公司;实验动物使用许可证号:SCXKC川22008-23。
1.1.2 主要实验试剂
链脲佐菌素(Streptozotoxin,STZ),总RNA提取试剂TRIzol(美国Invitrogen公司),逆转录试剂盒Reverse Transcription System(成都博瑞克生物公司),小鼠抗人Actin单抗(美国Santa Cruz公司),兔抗人KCNMA1(BKCAα)多抗,批号:Lot#A1455,兔抗人KCNMB1(β1)(英国Abcam公司),荧光定量PCR试剂(日本Takara公司),批号:Lot No.1131801,膜蛋白提取试剂盒(上海碧云天生物研究所),聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid,BCA)蛋白测定试剂盒(上海碧云天生物研究所),Taq酶PCR试剂(北京TIANGEN生物公司),批号:K9104琼脂糖(美国进口分装公司),RIPA裂解液(上海碧云天生物研究所),蛋白预染Marker(美国Fermentas公司),增强化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)发光液(美国millipore公司)批号:Lot No.1131801。
1.1.3 主要实验仪器
BIORAD电泳仪、电转仪(美国BIORAD生物公司),ABI实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司),血糖监测仪,ND-100核酸蛋白检测仪(美国Nanodrop公司)。
1.2 方法
1.2.1 动物模型的建立[4]
将大鼠随机分成对照组10只、模型组40只,模型组大鼠喂养高糖高脂饲料(10%猪油、2.5%胆固醇、20%蔗糖、1%胆酸盐和66.5%的普通饲料)4周,腹腔注射STZ(25 mg/kg)1次,1周后以空腹血糖≥7.0 mmol/L,餐后2 h血糖≥11.0 mmol/L且伴有胰岛素敏感性降低者(P<0.05)为成模指标,筛选出成模鼠20只继续高脂高糖饲养至12周,对照组大鼠普通饲料喂养12周,腹腔注射同体积柠檬酸缓冲液。
1.2.2 标本的采集
于8周、12周对照组、模型组大鼠分批腹腔注射1%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉,开腹取肠系膜动脉,分离血管周围的结缔组织及脂肪,然后放入RNA保存液,-80℃冰箱保存。
1.2.3 免疫印迹法测定α和β1亚基蛋白表达量
取大鼠肠系膜动脉,RIPA法冰上匀浆、消化,12 000r/min离心1 min,收集上清液,BCA法蛋白定量。等量的蛋白(15 L)经SDSPAGE电泳分离后,电转印到硝酸纤维素膜上,用含50 g/L脱脂奶粉的三乙醇胺缓冲盐水溶液室温封闭1 h。然后分别用兔抗大鼠Kca1.1抗体、兔抗大鼠sol-1抗体、兔抗大鼠β-actin抗体4℃孵育过夜。过氧化物酶标记抗兔二抗,室温孵育1 h。ECL试剂盒化学荧光显像。以β-actin为内参,计算蛋白的相对表达量。
1.2.4 实时定量PCR测定α和β1亚单位m RNA的表达
取出冷冻保存于-80℃冰箱中大鼠肠系膜动脉,Trizol法提取总RNA,逆转录成c DNA,然后用SYB Rgreen法进行PCR反应,GAPDH为内参照。实时定量PCR扩增仪检测。扩增参数:95℃预变性10 s;95℃变性5 s、60℃退火15 s、72℃拉伸15 s,进45个循环。以GAPDH为参照基因,计算模型组与对照组的相对基因拷贝数。相对基因拷贝数用2-△△ct表达。采用软件Beacon Designer 7.0设计α和β1亚单位的PCR引物,保证相关引物的GC含量40%~60%,Tm值在55~65℃,且引物自身不存在连续4个碱基以上的互补序列以及正反向引物间尽量避免出现互补序列。见表1。
1.3 统计学方法
采用SPSS l9.0统计软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 T2DM大鼠空腹血糖、餐后2 h血糖、空腹血胰岛素测定结果
腹腔注射STZ8周、12周测定空腹血糖、餐后2 h血糖、血胰岛素,与对照组比较明显升高,血胰岛素敏感指数明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
2.2 T2DM大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCaα、β1亚基蛋白的表达
免疫印迹结果,在8周和12周模型组大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCaα蛋白相对表达量分别为(1.093±0.251)和(0.921±0.153),分别与对照组作两样本均数的t检验,t值分别为1.172和1.633,查t界值表P>0.1,与对照组比较差异无统计学意义;β1亚基蛋白相对表达量分别为(0.334±0.200)和(0.193±0.310),分别与对照组作两样本均数的t检验,t值分别为10.530和8.232,查t界值表P<0.01,与对照组比较差异有统计学意义。见图1~4。
2.3 T2DM大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCaα、β1亚基m RNA在血管中的表达
实时定量PCR结果显示,在8、12周模型组大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCaα亚基m RNA的表达分别为(1.15±0.13)和(0.92±0.14),分别与对照组作两样本均数的t检验,t值分别为1.9464和1.807,查t界值表P>0.05,与对照组比较差异无统计学意义;β1亚单位m RNA的表达分别为(0.47±0.10)和(0.37±0.12),分别与对照组作两样本均数的t检验,t值分别为16.772,16.623,查t界值表P<0.01,与对照组比较差异有统计学意义,见图5~6。
3 讨论
糖尿病是心脑血管疾病的独立危险因素,其血管病变主要累及心、脑和外周血管,导致动脉粥样硬化、高血压等疾病,糖尿病患者发生相关血管意外事件的风险是非糖尿病人群的2~4倍[5],可见2型糖尿病是一种以血管病变为主要致死致残病因的疾病。
血管平滑肌BKCa由孔道形成蛋白α亚基和辅助蛋白β亚基组成,现已鉴别的β亚基有β1-β4个家族成员,其中β1亚基主要分布于动脉平滑肌中。生理条件下,BKCa持续激活可以使细胞膜超极化,抑制电压依赖性钙离子通道的活性,从而导致钙内流减少,对抗平滑肌收缩,阻断BKCa可以使平滑肌收缩。所以BKCa通道是调控血管紧张度的主要离子通道,其通道活性的改变将影响血管的舒缩功能,血管的舒缩异常与通道功能缺陷有关。近年来有关糖尿病与BKCa通道的相关性研究已受到关注[6]。
WANG等[7]发现,T2DM大鼠脑血管平滑肌BKCa活性降低,与其β1亚基的表达下调有关。本研究主要运用免疫印迹法和实时定量PCR技术力图从分子水平阐明T2DM大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞上BKCa通道是否存在异常,实时定量PCR结果表明β1亚基m RNA在T2DM大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞中表达明显降低,而α亚基m RNA表达无明显变化;免疫印迹结果显示,在T2DM大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞上BKCa通道的β1亚基蛋白表这两种实验技术所得到的结果是一致,即在T2DM大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞上BKCa通道β1亚基发生基因和蛋白水平的明显下调(P<0.05),而α亚基在基因和蛋白水平无明显变化(P>0.05)。这提示作为血管平滑肌细胞舒缩功能的重要调节因素,BKCa通道的功能与β1亚基密切相关,β1亚基的低表达可能是导致T2DM血管并发症的一个重要基础。
总之,随着对糖尿病及其离子通道功能异常认识的深入,人们可能对糖尿病血管病变的机制有更新的认识,这将为预防糖尿病的心血管并发症提供新的策略和方法,为糖尿病的综合治疗提供新的靶点,为特异性针对此环节的药物研发提供实验依据。
参考文献
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[6]吴宾,陶凌,易甫.糖尿病对冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道的影响[J].国际心血管病杂志,2015,4:245-247.
大鼠主动脉平滑肌细胞 篇2
胃肠道平滑肌层对于胃肠的蠕动功能和病理生理机制具有十分重要的作用。因此,获取大量高纯度的胃肠平滑肌细胞是胃肠组织工程学的必要条件。本研究在显微镜下分离大鼠胃平滑肌,采用酶消化法获取平滑肌细胞,建立稳定的胃平滑肌细胞体外扩增培养模型,并进一步探讨其三维复合培养的可行性,从而为开展相关的组织工程研究打下良好的基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料
150～200 g SD大鼠由浙江大学动物实验中心提供,PLGA支架材料由浙江工业大学冯杰教授提供,高糖DMEM培养液(Gibco公司),新生小牛血清(杭州四季青生物技术研究所),胰蛋白酶(Gibco公司),Ⅰ型胶原酶(Sigma公司),Tissucol凝血酶和纤维蛋白原(Baxter公司),兔抗鼠α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体(武汉博士德生物公司),碘化丙啶(PI)(Sigma公司),二乙酸萤光素(FDA)(Sigma公司),5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)(Sigma公司),恒温二氧化碳细胞培养箱(Heraeus公司),倒置显微镜(IX70,Olympus公司),荧光显微镜(PROVIS AX70,Olympus公司)。
1.2 大鼠胃平滑肌细胞的分离和培养方法
无菌条件下剪取大鼠胃底,将剪下后的组织立即置于含青、链霉素的无菌Hanks液中,移入超净工作台内反复漂洗2～3次,在体视显微镜下仔细去除食物残渣及内膜,翻转至外侧,小心地撕去肠系膜,再仔细地刮去浆膜层,直至余下的组织层在显微镜下观察到呈透明的一层为止。以无菌的Hanks液冲洗3～4次,用眼科剪细剪成1 mm3的小块后加入含0.2%Ⅰ型胶原酶的DMEM培养基3～5 ml,37℃振荡消化4 h后离心(1 000 r/min)1 min,弃上清再加入0.05%胰蛋白酶37℃消化1 h,待消化液浑浊、组织块呈絮状提示消化良好。混悬液经过100目细胞筛过滤后再离心(1 000 r/min)5 min,弃上清,将沉淀细胞轻轻吹打混匀后移入细胞培养瓶中,加入含15%胎牛血清的DMEM培养基,置于37℃、5%二氧化碳培养箱中半开放培养。一般24 h即可见细胞贴壁伸展,2～3 d换液1次,倒置显微镜下观察细胞长成单层和多层交错的致密细胞层时(7 d左右)即可传代培养。
1.3 平滑肌细胞的鉴定
1.3.1 细胞形态学观察
根据平滑肌细胞的形态特点,倒置相差显微镜观察细胞的形态、生长特点和生长方式。
1.3.2 免疫组化染色鉴定
在进行第3代细胞传代时,先将6孔培养皿底部放入盖玻片,然后接种细胞于培养皿内,使细胞在盖玻片上进行贴壁生长,当细胞进入对数生长期后,取出细胞爬片,PBS液清洗后用4℃的纯丙酮固定15～30 min,自然晾干。采用抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体进行免疫组化染色分析。根据SP免疫组化染色的常规方法,显微镜下计数每个视野中染色阳性的细胞占所有细胞的比例,大于98%的平滑肌细胞胞浆棕黄色细丝为阳性结果。
1.4 三维PLGA复合物培养模型的建立
扩增的第三代细胞消化分离前24 h,向培养液中加入14%的BrdU孵育,标记细胞。收集足量的细胞,离心后制成细胞悬液,加入纤维蛋白原(1∶2)混匀,调整细胞浓度至25×106/ml,无菌条件下将消毒的PLGA支架(圆柱型,直径8 mm,高2 mm)放入装有细胞悬液的离心管中,材料充分吸附细胞悬液后,在PLGA支架中形成200μl/cm3的细胞密度。分别在每个细胞-PLGA支架上滴上2滴凝血酶,37℃培养箱孵育30 min,使得细胞悬液在支架内聚合,构建成PC-PLGA复合物,该复合物转移入含15%胎牛血清DMEM培养基的6孔板中,置于37℃、5%CO2培养箱中,进行三维培养。每2天换液,7 d和14 d后取出复合物进行检测。
1.5 PI/FDA细胞活性检测
取出细胞-PLGA复合物,PBS洗2次,加FDA 3 ml,37℃培养箱中染色15 min。PBS清洗2次后,加PI避光条件下室温染色2 min。PBS清洗后立即于荧光显微镜下观察,不加染色剂的细胞作为对照。
2 结果
2.1 胃平滑肌细胞形态观察
实验发现,0.2%Ⅰ型胶原酶和0.05%胰酶混合裂解后,组织裂解充分均匀,细胞受损伤轻,接种成功率高。光学显微镜下观察,一般24 h就能发现细胞附壁伸展。以平滑肌细胞为主的纤维样细胞起始可有长短不一的数个细胞突起,呈短梭形,并相互接触,细胞质透明,核卵圆形,居中,多数1个,少数多个,最后细胞逐渐伸展为梭形;密度低时细胞排列常呈网格状排列,密度高时局部地方细胞重叠生长成多层,局部地方甚至没有细胞长入,成典型的“峰-谷”样生长(图1)。1周左右细胞就能生长到进行细胞传代的亚融合状态,此时进行细胞传代,传代后12 h细胞开始贴壁生长,细胞形态正常、生长迅速,5～6 d后可进行下一次传代。
2.2 免疫组织化学染色
特异的抗平滑肌α-SMA免疫组织化学染色后,胞质内可见与细胞长轴平行的纤维细丝,被染成棕黄色,即平滑肌α肌动蛋白丝,细胞平均阳性率≥98%。
2.3 三维PLGA复合物的观察
2.3.1 倒置显微镜观察
细胞接种24 h,细胞-PLGA复合物内可见均匀的细胞分布,周边光线强的部分可见细胞呈圆形黏附于材料上,显示了细胞与材料良好的相容性;中央部分光线较弱,仅见材料网状结构(图2)。
2.3.2 PI/FDA细胞活性检测
荧光显微镜显示,标记的扩增培养细胞均匀分布于材料中,14 d后细胞数目有所减少(图3A)。PI/FDA细胞活性检测显示,7 d时,PLGA支架内细胞均匀分布,90%以上的细胞显示绿色荧光,PLGA纤维仍保持完整,未显示荧光染色。14 d时,细胞形态变为长方形或多边形,存活率仍达90%左右,部分降解的PLGA被PI染成红色(图3B)。
3 讨论
组织工程学的进步为胃替代方法开启了新的希望,美国Vacanti研究组在2003年开始报道从新生的大鼠中分离出胃上皮类器官单位,接种于管状支架材料上,用于替代成年大鼠的胃[1],虽然组织学上观察到类似胃壁的上皮隐窝细胞构成的囊腔结构,但是这种方法很难在临床上实现。其原因是:一方面,上皮类器官单位在体外培养基中存活的时间很短,最多24～48 h,之后就会出现退化和死亡;另一方面,构建足量的胃复合物需要取得大量的黏膜组织,在大动物实验以及临床中这是极难达到的[3]。
随着对胃肠壁结构和功能的深入认识,人们发现哺乳动物肠黏膜上皮是机体代谢最为活跃的场所,体内肠黏膜上皮细胞的再生和适应能力非常强,终生进行着不间断的自我更新[4];但是,小肠黏膜上皮细胞以及隐窝干细胞的体外分离培养存在很大的困难。相反,成熟的平滑肌细胞在体内外可呈现出去分化的潜能,体外培养和扩增平滑肌细胞作为组织工程的种子细胞是切实可行的[5,6]。因此,建立简单可靠的平滑肌细胞模型成为胃组织工程研究的基本要求。目前大鼠原代细胞培养有贴块法和酶解离法。贴块法的细胞生长周期长,细胞纯化速度慢,且有一定的局限性。本文对酶解离法加以改进探索了一种比较简便的胶原酶联合胰酶的解离法,该方法成功地在体外培养了大鼠胃平滑肌细胞,且能在1～2周内获得原代平滑肌细胞,还能较快地获得较大量的种子细胞用于三维支架培养模型的建立,适合于临床应用研究。
生物支架是构建组织工程替代物的另一个关键因素,本研究采用的组织工程复合物三维构建技术,已在在成骨组织工程的构建中被证明切实可行[7]。体外三维支架复合培养模型是将高浓度细胞接种在具有一定的支架材料上,在模拟体内的化学、物理和生物条件下进行培养,通过模拟在体细胞的生长、分化及代谢,直接观察细胞与生物材料复合生长的情况,并能有效地检测细胞的生理功能的变化,有利于了解细胞与材料的相互作用,有助于组织工程支架材料以及组织工程复合物的筛选。本文所采用的方法将细胞包埋于纤维蛋白胶作为细胞外基质,再同支架材料结合,使得细胞在支架中均匀分布和黏附[8]。纤维蛋白胶同时提供一种网状立体支架,对细胞的生长起到支撑作用,使细胞能从三维方向与培养液充分接触,有利于物质交换且可以进行物质和营养交换,亦有利于细胞沿纤维蛋白支架游走和聚集,从而形成特定的组织结构,构建的三维复合具有细胞分布均匀、提供细胞外基质、塑性容易的优点,因而适合在组织工程研究中推广应用。
PI/FDA细胞活性是检测三维复合物中细胞活性的可靠方法,细胞损伤的特征是失去浆膜的完整性。FDA可进入活细胞并被水解成游离荧光和醋酸盐,游离荧光不可透过细胞膜,因而在有活力的细胞里获得绿色荧光,而受损的细胞不显示绿色荧光。相反,PI可跨越不完整的细胞膜,使得死亡或凋亡的细胞获得红色荧光。荧光标记和PI/FDA检测方法可用于体外静态培养和体内植入时观察三维复合物中细胞的生理和代谢特征,有助于下一步用于研究三维平滑肌细胞复合物替代胃肠功能的评价。
参考文献
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大鼠主动脉平滑肌细胞 篇3
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
脂联素基因敲除(adiponectin gene knockout,Adiponectin-/-)小鼠[3]由上海南方模式生物研究中心以合作形式提供;人重组脂联素蛋白购自R&D公司(Minneapolis,MN,USA);DMEM培养基、胎牛血清购自Gibico公司(Grand Island,NY,USA);碱性磷酸酶试剂盒购自Sigma公司(St.Louis,MO,US-A);骨钙素放射免疫分析试剂盒购自Dia Sorin公司,(Stillwater,MN,USA);抗Runx2抗体购自Santa Cruz生物工程公司(Waltham,MA,USA)。
1.2 试验方法
1.2.1 Adiponectin-/-小鼠ASMCs体外培养
在无菌条件下,分离6周雄性Adiponectin-/-小鼠主动脉,汉克平衡盐液中漂洗数次,去除动脉外膜后,切成碎片,置于37℃、消化液(0.125 mg/m L弹性蛋白酶、0.25 mg/m L胰蛋白酶抑制剂、10 mg/m L胶原酶Ⅰ、2.0 mg/m L牛血清蛋白结晶和15 mmol/L羟乙基哌嗪乙磺酸)中45 min,离心10 min,转速1 000转/min,并滤过无菌微孔滤膜,含10%胎牛血清DMEM培养基冲洗2次,分离平滑肌细胞,通过α-肌动蛋白单克隆抗体染色阳性[4]、高水平碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)及其具有形成钙化结节能力3方面来证实ASMCs处于钙化过程中。
1.2.2 脂联素干预细胞
ASMCs用DMEM培养基(含去脂联素的10%胎牛血清)培养于24孔板(2×104细胞/孔),培养4 d,用0(无血清培养基)、3、10和30μg/m L脂联素干预ASMCs 48 h。
1.2.3 碱性磷酸酶活性测定
取上述ASMCs,磷酸盐缓冲液冲洗2次,细胞裂解液[50 mmol/L Tris-Cl(p H8.0)、150 mmol/L Na Cl、1%Triton X-100、0.02%Na N3、10 mmol/L EDTA、10 g/m L aprotinin和100μg/m L PMSF]裂解,超声粉碎裂解细胞,离心后取上清液,以α-磷酸奈酚法为底物,全自动生化分析仪测定细胞内碱性磷酸酶活性。Bradford方法测细胞内总蛋白含量,校正碱性磷酸酶活性。
1.2.4 骨钙素测定
取上述ASMCs培养上清液,用放射免疫法检测上清液中骨钙素含量。Bradford方法测细胞内总蛋白量,校正骨钙素。
1.2.5 Runx2蛋白检测
上述细胞裂解液裂解ASMCs,超声粉碎裂解细胞,离心后取上清液,Bradford方法测细胞内总蛋白质。取50μg细胞总蛋白,与等量2×SDS加样缓冲液混匀,99.9℃加热蛋白变性5 min,7.5%SDS-PAGE胶中电泳,电转移至硝酸纤维膜上,含2.5%脱脂奶粉的PBS液封闭1 h,加鼠抗Runx2抗体,温育2 h,PBS-吐温漂洗滤膜30min,用含辣根过氧化物酶标记抗鼠二抗,温育1 h,洗膜后,化学发光增强试剂自显影1 min,洗片显带。同一张硝酸纤维膜洗脱后,再予抗β-actin抗体,洗片显带作为内对照。
1.2.6 钙化结节形成的检测
ASMCs用DMEM培养液培养于24孔板,其中含去脂联素的10%胎牛血清和10 m Mβ-甘油磷酸,干预组加入30μg/m L脂联素,连续培养20 d,对ASMCs进行矿化结节染色。细胞用70%酒精、室温下固定10 min,1%茜素红染色10 min,蒸馏水洗3次,显微镜下观察矿化结节并成像。用氯化十六烷基嘧啶提取细胞基质中染色茜素红,540 nm分光光度测定法测定提取液,量化矿化结节染色。
1.3 统计学分析
各实验独立重复3次以上,重复性好。所有数据采用SPSS 13.0软件包进行分析。计量资料以均数±标准差表示,组间比较用单向方差分析。检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 脂联素对ALP活性的影响
脂联素能降低Adiponectin-/-小鼠ASMCs ALP活性。脂联素浓度范围在10~30μg/m L能显著抑制ALP活性,见图1。
2.2 脂联素对骨钙素分泌的影响
脂联素能抑制Adiponectin-/-小鼠ASMCs骨钙素分泌。脂联素浓度范围在10~30μg/m L能显著抑制骨钙素分泌,见图2。
2.3 脂联素对Runx2表达的影响
脂联素能抑制Adiponectin-/-小鼠ASMCs Runx2表达。脂联素浓度范围在10~30μg/m L能显著抑制Runx2表达,见图3。
A:脂联素不同浓度干预对Runx2表达影响,β-actin作内对照;B:Runx2/β-actin光密度测定;覮与对照组相比,P<0.01
2.4 脂联素对细胞基质钙化能力的影响
1%茜素红进行钙化结节染色结果显示,脂联素可明显抑制Adiponectin-/-小鼠ASMCs钙化结节生成,见图4A。用氯化十六烷基嘧啶提取染色茜素红,540 nm分光光度测定法检测提取液,量化钙化结节染色结果有显著性差异,见图4B。
30μg/m L脂联素干预显著抑制钙化结节形成;A:1%茜素红染色,×200;B:氯化十六烷基嘧啶量化钙化结节染色;覮与对照组相比,P<0.01
3 讨论
动脉钙化是常见的一种异位钙化,与心肌梗死、脑卒中、猝死等临床病患息息相关,是导致心、脑血管事件的危险因子[5]。以往认为动脉钙化是一个被动过程,近期研究发现动脉钙化是一种类似于骨基质矿化的主动、可调控的过程[6,7,8]。随着动脉钙化的进展,钙化的平滑肌细胞不再具有平滑肌细胞表型特征,而具备成骨细胞的特征和功能,能合成多种骨特异性蛋白,这在动脉钙化形成中有重要作用[1,9]。近期BERNER等[10]研究表明,成骨细胞表达脂联素受体(adiponectin receptor,Adipo R),脂联素促进大鼠成骨细胞增殖。LUO等[11]研究显示,脂联素促进人成骨细胞增殖和分化,并通过刺激成骨细胞RAN-KL、抑制护骨素生成,间接增加破骨细胞[12]。以上提示脂联素可能参与动脉钙化的调控过程。
脂联素,亦称ap M1、Acrp30、Adipo Q或GBP28,是脂肪细胞特异性分泌的一种生物活性多肽,相对分子质量为30 k D,在脂肪细胞高表达,可分泌至血浆,包含4个结构域:氨基端的信号序列、可变结构域、胶原蛋白样结构域和羧基末端球形结构域[13,14,15],具有抗糖尿病、抗炎、保护血管生理效应[16,17]。MAAHS等[18]研究发现血清脂联素水平与冠状动脉钙化程度负相关,血清脂联素降低预示冠状动脉钙化程度恶化。糖尿病患者脂联素水平越低,患冠心病风险越高[19]。脂联素水平升高可减缓血管病变进一步发生,脂联素的血管保护作用已证实。本研究体外培养Adiponectin-/-小鼠ASMCs,由于脂联素缺失,ASMCs处于钙化过程中,钙化的ASMCs可以形成明显细胞矿化结节,予脂联素干预后,显著减少细胞矿化结节形成,阻止ASMCs钙化。
在动脉钙化过程中,正常的ASMCs转化为成骨细胞样表型。钙化的平滑肌细胞具备成骨细胞的特征和功能,能合成并分泌骨特异性的基质蛋白,并出现成骨细胞特征性的基因表达[20]。ALP、骨钙素是成骨细胞的表型特征,研究证实ALP、骨钙素在ASM-Cs钙化中起重要作用[21,22]。Runx2是影响成骨细胞分化的重要因子[23,24],可促进脂源性干细胞钙化[25]。因此,本研究对ALP、骨钙素和Runx2进行检测,发现脂联素呈浓度依赖性地降低Adiponectin-/-小鼠ASMCs中的ALP活性、骨钙素分泌及Runx2表达,提示脂联素通过降低ALP活性、骨钙素分泌及Runx2表达,抑制Adiponectin-/-小鼠ASMCs分化为成骨细胞样表型,阻止ASMCs体外钙化。
大鼠主动脉平滑肌细胞 篇4
1实验对象
SPF(Specific Pathogen Free,无特定病原体)级SD大鼠雄性3只、雌性6只,2月龄,体重:雄性:(191±2.5)g,雌性:(207±1.9)g,购自大连医科大学动物实验中心,质量合格证0003546。
2实验方法
2.1大鼠造模
糖尿病大鼠模型建立:雄性SD大鼠幼鼠50只,随机抽取10只为正常对照组(CON组),其余40只为糖尿病组(DM组)。CON组一次性腹腔注射0.1m L/100g无菌柠檬酸缓冲液(0.1mmol/L,p H4.4);DM组按45mg/kg一次性腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)。每日观察幼鼠情况并给予脂肪乳高糖混合液喂养。分别于造模后7d、14d、21d检测各幼鼠血糖变化情况,3次测量血糖值均≥16.7mmol/L列为糖尿病模型。
2.2糖尿病SD大鼠主动脉血管平滑肌细胞原代培养[4]
(1)8周龄时,分别于CON组和DM组各组中随机取出一只SD大鼠,钝性分离暴露心脏至主动脉段血管,取出主动脉,迅速移至无菌D-Hank’s液的培养皿中。(2)在体式解剖显微镜下,剥脱血管外膜,纵向剪开血管壁,刮除内膜后剩余血管中膜,除去残留中膜外组织杂质。(3)放入胎牛血清的DMEM培养液中并将其剪碎,离心5min,弃上清,取沉淀,往沉淀物中加入0.5%EDTA·4Na消化30 s。(4)加入等体积DMEM培养基终止消化并1500 r/min(r=13.5cm)离心5min,弃上清液,离心管中加入2m L新鲜培养基重悬。(5)用吸管将其移入细胞培养瓶贴附于底面,轻轻将培养瓶翻转,培养箱内孵育2~3 h后,组织块贴壁后将培养瓶翻转,加入适量含20%胎牛血清的DMEM培养液,使组织块完全浸没于培养液之中,继续静置培养。(6)培养至8~12d时倒置相差显微镜下观察见80%细胞已融合,即可进行细胞传代及检测。
2.3流式细胞术检测
2.3.1细胞周期及增值测定
(1)取对数期的DM大鼠VSMCs,常规消化制成单细胞悬液,以2.0×105/m L密度接种于6孔培养板中,培养24h。(2)加入工作液浓度为0.15、1.25、2.50、7.50、10.00μmol/Lγ-分泌酶抑制剂DAPT,Control组不加,继续培养72h。(3)收集所有细胞,简单细胞计数,将约1×106个细胞移入离心管中,1000r/min(r=13.5cm)离心5min,弃去上清后。用PBS溶液清洗×1次,在离心管中留约0.5m L PBS,加70%冰乙醇5m L混匀固定,4℃放置48h以上,离心弃上清。PBS清洗×1次,在离心管中留1m L PBS,轻轻吹打均匀细胞,加入10mg/m L的RNAse5μL,37℃放置1h。加入100μg/m L的PI工作液10μL,室温避光染色30min,计数20000~30000个细胞,流式细胞仪检测细胞周期时相。细胞DNA合成期和分裂期,既G2+M期是细胞增殖的两个重要指标,两者之合称为增殖指数,而增殖指数的大小则反映细胞增殖水平的高低。
2.3.2细胞凋亡测定
步骤与周期测定一致,在乙醇固定后上机检测:(1)上机检测前离心去除乙醇。(2)冷I,Bs(p H7.4)洗5min后离心,重复2次,调整细胞数为106个/L。(3)加入pl工作液0.5m L,终浓度为10m叭,室温避光30min后上机流式细胞仪检测。
2.4统计学方法
采用SPSS19.0统计软件。以P<0.05有显著性差异。
3结果
3.1细胞周期结果
各组72h后行流式细胞仪分析,G0/G1期细胞比例由Control组的39.97%上升为72.32%,S期的细胞比例从Control组的41.10%下降为19.87%见表1,差异有显著统计学意义(P<0.05)。
3.2细胞增殖与凋亡
细胞DNA合成期和分裂期,既G2+M期是细胞增殖的两个重要指标,两者之合称为增殖指数,而增殖指数的大小则反映细胞增殖水平的高低。各组经不同浓度γ-分泌酶抑制剂DAPT干预后,其增值与凋亡见表2。Control组的细胞增殖指数从35.65降到15.42(P<0.05),凋亡数却从3.1升高至15.4(P<0.05)。
4讨论
糖尿病足的发病率国外报道为5.3%~10.5%,我国国内报道是8.57%,2-DM患者的截肢率比非DM患者高17~40倍[5],且正逐年增加,不但严重威胁DM患者的健康和生活质量,而且也造成了巨大的医疗、社会、经济问题。近年来已引起国内外医生对DF的关注与重视,并积极研究其治疗方法。
相关实验性研究表明,Notch信号通路能促进非糖尿病动物缺血区的血管新生、动静脉分化等[3]。本实验对DM大鼠模型冻存细胞复苏开始,采用不同梯度浓度的DAPT进行干预,应用流式细胞技术检测DM大鼠VSMCs细胞周期情况并计算出其增殖指数及细胞凋亡数分析探讨Notch信号途径对体外培养的DM大鼠VSMCs的影响,为进一步研究糖尿病患者缺血区血管增值提供实验依据,为糖尿病足及糖尿病血管病变的治疗提供新的思路。
γ-分泌酶在Notch信号通路激活的连锁反应中其重要作用,γ-分泌酶抑制剂(DAPT)可有效阻断Notch信号通路中NICD的产生。DAPT是人工合成的Notch信号通路抑制剂,可特异性抑制γ-分泌酶活性,进而抑制Notch受体的在S3位点的酶切,而有效的抑制Notch信号通路的激活,从而抑制细胞生长[6,7]。
本实验结果显示不同梯度浓度的DAPT作用DM大鼠VSMCs72h后行流式细胞仪分析,G0/G1期细胞比例由Control组的39.97%上升为72.32%,S期的细胞比例从Control组的41.10%下降为19.87%,结果证明与Control组相比DAPT明显抑制DM大鼠VSMCs进入S期和G2/M期,且有浓度依赖性,,差异有统计学意义(P<0.05),细胞DNA合成期和分裂期,既G2+M期是细胞增殖的两个重要指标,两者之合称为增殖指数,而增殖指数的大小则反映细胞增殖水平的高低[8]。各组经不同浓度γ-分泌酶抑制剂DAPT干预后,Control组的细胞增殖指数从35.65降到15.42(P<0.05),凋亡数却从3.1升高至15.4(P<0.05)。证明DAPT能影响DM大鼠VSMCs的细胞周期,减少DM大鼠VSMCs的有丝分裂,抑制细胞增殖,反向增加细胞凋亡数,这二者作用均具有依赖性且呈正相关。这阐明了Notch信号通路潜在的药物治疗靶点,可能成为DF、DM血管病变及缺血性疾病的治疗提供新的手段和新方向。
参考文献
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大鼠主动脉平滑肌细胞 篇5
1 材料与方法
1.1 试剂
高糖DMEM、胎牛血清为Gibco公司产品，异硫酸氢荧光素-鬼笔环肽（FITC-phallodin）、RNA酶、牛血清清蛋白均为Sigma公司产品，碘化丙啶（prodidium iodide,PI）为Coulter公司产品。FA购于广东省药品检验所。
1.2 实验仪器
SP型激光共聚焦显微镜（Leika）,ELITE ESP型流式细胞仪。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养
兔主动脉平滑肌细胞（SMC）购于中国医学科学院细胞中心。SMC细胞培养于含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，置37℃、5%CO2培养箱中培养。每周更换2次培养液，用0.25%-0.02%EDTA的胰酶消化传代培养。
1.3.2 倒置显微镜观察
阿魏酸作用24 h后，在倒置显微镜下观察细胞。
1.3.3 激光共聚焦样品制备
取出培养细胞爬片，用磷酸缓冲液（PBS）洗2遍，4%多聚甲醛溶液4℃固定过夜，用PBS轻洗2遍，0.2%Triton X-100室温下渗透10 min，再用PBS轻洗2遍，加入2μg/ml RNA酶37℃作用30 min，用PBS轻洗2遍，1%牛血清清蛋白覆盖，室温作用20 min（不洗），5μg/ml(PBS稀释）FITC-phallodin室温下避光染色35 min,PBS洗2遍后加入200μl PI染液，室温避光染色30 min，甘油封片，上机观察。
1.3.4 流式样品制备
取出24孔培养板，吸去上清，用PBS洗2遍，同激光共聚焦标本一样固定、渗透、洗涤、FITC-phallodin及PI染色，染色完毕后，吹打并吸出细胞悬液，加入PBS离心洗涤，弃上清，加入300μl PBS重悬细胞，上机分析。
1.4 统计学处理
数据以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 10.0统计软件进行单因素方差分析，P<0.05表示有显著性差异。
2 结果
2.1 阿魏酸对VSMCs细胞形态的影响
从倒置显微镜下观察，对照组的细胞呈多角形或短梭形，细胞多有板状突起。在加入阿魏酸24 h后，与对照组比较，阿魏酸0.1 mg/ml组与对照组接近；0.5 mg/ml组细胞多细长，呈梭形，少见分裂象细胞；1.0 mg/ml组细胞形态细长，未见分裂象细胞。见图1。
2.2 阿魏酸对VSMCs细胞骨架的影响
2.2.1 流式细胞仪检测阿魏酸对VSMCs细胞骨架F-actin含量的影响
在阿魏酸作用24 h后，与对照组比较，阿魏酸0.5 mg/ml和1.0 mg/ml组VSMCs细胞内F-actin的荧光强度明显减低，与对照组比较，有显著性差异（P<0.05）,0.1 mg/ml组无明显改变。
与对照组比较，*P<0.05
2.2.2 激光共聚焦观察阿魏酸对VSMCs细胞骨架F-actin的影响
对照组可见较明显的F-actin存在，纵向平行排列，可见整齐的应力纤维丝，贯穿细胞长轴。在阿魏酸作用24 h后，0.1 mg/ml组细胞内F-actin未见明显变化；0.5 mg/ml组细胞内F-actin减少，应力纤维丝排列较散在；1.0 mg/ml组细胞内F-actin明显减少，或仅存在少许无规则、散在分布的F-actin。见图2。
3 讨论
真核细胞骨架由微丝、微管和中间丝组成。肌动蛋白（actin）是构成微丝的基本成分，以单体（G-actin）或聚合体（F-actin）形式存在，不仅出现在具有收缩能力的骨骼肌原纤维中，而且也出现在平滑肌细胞中。肌动蛋白具有收缩、保持细胞的形状、运动、细胞间黏附等多种功能，同时参与细胞增殖过程[7]。血管平滑肌细胞是血管壁的主要成分，其增殖及向内膜下迁移在动脉粥样硬化、高血压、血管成形术后再狭窄等多种心血管疾病的病理过程中有重要作用[8,9]，在此过程中依赖于细胞骨架蛋白的改变。研究证明，阿魏酸钠具有拮抗VSMCs增殖的效应，可直接抑制VSMCs的黏附、迁移和游离Ca2+浓度升高，抑制其迁移[10]，但目前仍少见其对血管平滑肌骨架蛋白的研究。本试验观察阿魏酸对动脉血管平滑肌骨架蛋白F-actin的影响。通过对阿魏酸作用的VSMCs的直接观察和对其F-actin染色后的流式细胞术和激光共聚焦的观察，发现阿魏酸对VSMCs的形态有明显的影响，能使细胞形态变狭长、处于较稳定的分化形态，同时使肌动蛋白聚合体F-actin的形成和荧光强度明显降低，这些结果提示阿魏酸能抑制VSMCs F-actin的形成，这可能是阿魏酸抑制VSMCs增殖和迁移的途径之一。
参考文献
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大鼠主动脉平滑肌细胞 篇6
1 材料与方法
1.1 实验动物和试剂
SD大鼠由山西医科大学动物实验中心提供, miRNA- (P) RR重组质粒 (前期实验合成) , Lipofectamine TM 2000购自Invitrogen公司, 肾素[renin (rat recombinant) ]购自AnaSpec公司, DMEM高糖型培养基购自Gibco公司, 胎牛血清购自杭州四季青公司。抗大鼠核心结合因子α1 (Cbfα1) 抗体购自Santa公司, 特异性小鼠抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白 (SMα-actin) 抗体、SP免疫组化试剂盒购自北京博奥森公司, DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司, 余为市售分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 血管平滑肌细胞培养及鉴定
无菌取150g左右SD雄性大鼠胸主动脉中膜, 剪成约1mm×1mm小块, 置于含20%胎牛血清的DMEM培养基中, 放入37℃、5%CO2的孵箱中进行原代培养, 用特异的SMα-actin免疫细胞化学染色进行鉴定。实验采用第5代~8代细胞, 按2×104个/L将VSMCs接种于6孔培养板, 分别进行下述实验。
1.2.2 大鼠血管平滑肌细胞转染
将生长良好的细胞接种于6孔板中, 当细胞贴壁覆盖率为70%~80%时, 按Lipofectamine TM 2000转染说明书进行转染, 转染48h后倒置荧光显微镜下观察转染情况。
1.2.3 实验分组
将大鼠血管平滑肌细胞随机分为5组。空白组给予普通培养基。对照组给予转染试剂。 (P) RR干扰组予转染试剂和miRNA干扰 (P) RR48h。肾素组先予转染试剂, 再予肾素2×10-8mol/L刺激80min。肾素+ (P) RR干扰组先予转染试剂和siRNA干扰 (P) RR 48h, 再予肾素2×10-8mol/L刺激80min。
1.2.4 RT-PCR分析
应用反转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 检测各组细胞Cbfα1、TGFβ及 (P) RR mRNA的表达。细胞总RNA提取采用Trizol一步法。引物序列参考文献设计, 由上海Sangon生物技术公司合成 (见表1) 。目的基因扩增条件分别为Cbfα1:94℃、30s, 55℃、30s, 72℃、30s, 共30个循环, 最后延伸72℃5min;TGFβ1:94℃、30s, 55℃、30s, 72℃、30s, 共30个循环, 最后延伸72℃5min; (P) RR:94℃、30s, 56℃、30s, 72℃、30s, 共30个循环, 最后延伸72℃5min;β-actin:94℃、30s, 56℃、30s, 72℃、30s, 共30个循环, 最后延伸72℃5min;实验重复3次, 以β-肌动蛋白 (β-actin) 作为内对照, 计算相对含量。
1.2.5 Western blotting分析
收集细胞, 提取总蛋白, 取各样本蛋白50μg进行SDS-PAGE电泳分离蛋白, 电转移法将蛋白转移至PVDF膜, 封闭后分别加入一抗孵育;洗膜后加入HRP标记的二抗孵育, 充分洗涤后加入增强发光剂, 即刻与底片曝光, 洗片后扫描电泳条带并进行光密度分析。
1.3 统计学处理
数据用均数±标准差 (±s) 表示, 采用SPSS13.0统计软件进行处理, 组间比较采用单方差分析, 多重比较采用LSD法。
2 结果
2.1 血管平滑肌细胞的鉴定
形态学:贴壁的大鼠胸主动脉组织块在培养的第5天左右可见边缘有少量细胞爬出, 呈长梭形或多边形, 胞质丰富, 均质透明, 核卵圆居中, 以后逐渐生长融合, 于10d~14d长满。倒置显微镜下观察, 细胞呈典型的“峰谷样”。第5代血管平滑肌细胞免疫组化SMα-actin染色:可见细胞胞浆内SMα-actin丰富表达, 细丝状沿细胞纵轴排列, 95%为阳性, 纯度符合实验要求。
2.2 细胞转染效率显微镜观察结果
细胞转染48h后, 倒置荧光显微镜下可见转染成功的细胞会发出绿色荧光, 表明细胞中有转染的外源基因表达, 转染率约为60%。
2.3 RT-PCR分析
收集各组细胞, Real-time PCR检测 (P) RR、TGFβ1、Cbfα1mRNA表达量。与对照组比较, (P) RR干扰组 (P) RR表达明显降低 (P<0.01) , TGFβ1、Cbfα1表达降低 (P<0.05) 。与对照组比较, 肾素组TGFβ1、Cbfα1表达增高 (P<0.05) ;与肾素组比较, 肾素+ (P) RR干扰组 (P) RR、TGFβ1、Cbfα1表达明显降低 (P<0.01) 。详见表2、图1。
2.4 Western blotting分析
Western blotting检测各组细胞Cbfα1蛋白表达量。同对照组比较 (P) RR干扰组Cbfα1蛋白表达降低 (P<0.05) ;同对照组比较, 肾素组Cbfα1蛋白表达增高 (P<0.05) ;同肾素组比较, 肾素+ (P) RR干扰组Cbfα1蛋白表达明显降低 (P<0.01) 。详见表3、图2。
3 讨论
肾素不仅可以催化血管紧张素原转化为血管紧张素Ⅰ, 最后通过血管紧张素Ⅱ产生生物学效应, 还能与肾素 (原) 受体结合直接激活细胞内信号通路发挥作用。研究证明, 肾素通过肾素 (原) 受体作用可以引起血管收缩、纤维化、血管平滑肌细胞凋亡、肥大[2,3], 但肾素通过结合肾素 (原) 受体对血管钙化的作用尚无报道。
目前研究显示TGFβ1-Smads-Cbfα1信号转导通路参与了血管平滑肌细胞成骨样分化及血管钙化的调节[4]。研究发现:TGFβ1可增加体外钙化模型中钙的沉积、碱性磷酸酶的活性及骨钙素的分泌, 该作用呈明显的时间依赖性, 并持续整个钙化过程[5,7]。Cbfα1是成骨细胞表型标志物, 调节骨细胞外基质蛋白表达, 是成骨细胞分化和骨发育的关键基因之一[6,8]。有研究显示肾素通过肾素 (原) 受体起作用可激活转化生长因子β1 (TGFβ1) 而产物学效应[3,4], Melnyk等[3]报道肾素通过结合肾素 (原) 受体 (TGFβ) 依赖和非依赖途径促进动脉粥样硬化, 既然肾素通过肾素 (原) 受体可影响TGFβ1, 由此我们设想肾素通过肾素原 (受) 体激活细胞内TGFβ1, 进而可能激活Cbfα1而促进血管平滑肌细胞钙化。
在本研究中通过miRNA干扰沉默 (P) RR的表达, 来观察是否肾素通过肾素 (原) 受体作用对血管平滑肌细胞TGFβ1、Cbfα1的影响, 进而对VSMCs成骨样分化发挥作用。同对照组比较, (P) RR干扰组 (P) RRmRNA表达显著降低 (P<0.01) , 证实前期构建的质粒可有效干扰 (P) RR的表达。同对照组比较, 肾素组TGFβ1、Cbfα1mRNA及Cbfα1蛋白表达增高 (P<0.05) , 提示了肾素可以使血管平滑肌细胞TGFβ1、Cbfα1表达增加。同肾素组比较, 肾素+ (P) RR干扰组TGFβ1、Cbfα1mRNA及Cbfα1蛋白表达降低 (P<0.01) 。提示抑制 (P) RR的表达可以使血管平滑肌细胞TGFβ1、Cbfα1表达减少, 表明 (P) RR很可能是肾素发挥作用的调控因素, 也就是肾素通过肾素 (原) 受体调控TGFβ1、Cbfα1信号通路。以上结果表明肾素可能通过肾素 (原) 受体使血管平滑肌细胞成骨细胞表型标志物Cbfα1表达增加, TGFβ1表达增加。肾素通过肾素 (原) 受体作用可能是血管平滑肌细胞成骨样分化及血管钙化的促进因子, 其作用可能与增加TGFβ1、Cbfα1表达上调有关。特异性miRNA沉默 (P) RR, 可能通过抑制TGFβ1、Cbfα1的表达, 在一定程度上抑制细胞钙化。但可能还有其他因子的参与, 仍需要进一步的研究和探讨。
摘要：目的 观察肾素是否通过肾素 (原) 受体诱导转化生长因子β1 (TGFβ1) 、核结合因子1 (Cbfα1) 表达上调, 促进大鼠血管平滑肌细胞钙化。方法 利用Lipofectamine TM 2000将 (P) RR微小RNA (miRNA) 干扰质粒瞬时转染入大鼠血管平滑肌细胞 (VSMCs) , 然后予肾素刺激。倒置荧光显微镜下观察转染情况, RT-PCR检测各组细胞中肾素 (原) 受体[ (P) RR]、TGFβ1、Cbfα1mRNA的表达, 用Western blotting法检测Cbfα1蛋白的表达情况。结果 肾素可使血管平滑肌细胞TGFβ1、Cbfα1mRNA及Cbfα1蛋白表达显著增多 (P<0.05) 。沉默 (P) RR基因后再予肾素刺激, (P) RR、TGFβ1、Cbfα1mRNA及Cbfα1蛋白表达显著减少 (P<0.01) 。结论 肾素可能通过肾素 (原) 受体诱导TGFβ1、Cbfα1的表达上调, 促进大鼠血管平滑肌细胞钙化;特异性miRNA沉默 (P) RR, 可以抑制肾素诱导的TGFβ1、Cbfα1的表达, 在一定程度上抑制细胞钙化。
关键词：肾素 (原) 受体,RNA干扰,血管平滑肌细胞,转化生长因子β1,核结合因子1
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大鼠主动脉平滑肌细胞 篇7
高血压是最常见的心血管病,是全球范围内的重大公共卫生问题。高血压发病的原因很多,可分为遗传和环境两个方面,但其具体机制还不清楚。内质网应激( endoplasmic reticulum stress, ERS) 是发生在细胞中的最初反应,是线粒体应激、核应激的最终通路。在内质网中蛋白质折叠和钙离子稳态发生变化时,触发UPR 级联信号,从而引发细胞凋亡[1]。GRP94是ERS得标志蛋白,其作为ERS分子伴侣的重要成员,在维持内质网蛋白质合成及正确折叠和细胞钙稳态方面起重要作用[2,3,4]。研究表明CHOP介导的ER应激凋亡通路参与了心力衰竭过程中的细胞凋亡[5],并且在压力负荷高血压模型的早期即发生了ERS[6]。替米沙坦是一种新型的降血压药物,是一种特异性血管紧张素Ⅱ受体(ATⅠ型)拮抗剂。替米沙坦替代血管紧张素Ⅱ受体与ATⅠ受体亚型(已知的血管紧张素Ⅱ作用位点)高亲和性结合,其在平稳降压的同时可有效地保护靶器官,但高血压的发生发展中血管平滑肌和内质网应激有何关系,替米沙坦保护心血管的作用机制是否与内质网应激有关,目前还不是十分清楚。本研究通过腹主动脉狭窄术建立大鼠高血压模型观察动脉血管平滑肌细胞内质网应激相关因子葡萄糖调节蛋白94(glucose-regulated protein of94kD,GRP94)和C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(CAAT/enhancer binding protein homologous protein,CHOP)表达的变化,并探讨替米沙坦对腹主动脉狭窄高血压大鼠动脉血管平滑肌细胞的保护作用,旨在为高血压所致血管平滑肌细胞损害的发生机制提供理论依据,同时对其防治提供新的治疗策略。
1 材料和方法
1.1 材料
成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠48只,鼠龄(8～10)周,质量(180～220)g(第四军医大学动物实验中心提供) 兔抗大鼠GRP94抗体(美国Bioword公司);兔抗大鼠CHOP多克隆抗体(美国Bioworld公司);碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物试剂公司);浓缩型二氨联苯胺(DAB)试剂盒(北京中杉金桥生物试剂公司);Bx41型光学显微镜(日本奥林巴斯株式会社);DP71型显微摄像系统(日本奥林巴斯株式会社);图像分析软件(Image Proplus 6.0美国Media Cybemetics公司);RM-6280型多道智能生理记录及分析处理系统(成都仪器厂)。
1.2 方法
1.2.1 高血压大鼠模型的建立及实验分组
将48只大鼠随机等分为三个组,一组采用主动脉缩窄术(transverse aortic constriction,TAC)建立高血压模型,并于术后每天给予每只老鼠替米沙坦1.5 mg/kg,称替米沙坦组;一组采用主动脉缩窄术(transverse aortic constriction,TAC)建立高血压模型,称模型组;另一组只进行相应的假手术,称为假手术对照(Sham)组;手术步骤如下:大鼠术前禁食12 h,自由饮水,用60 g/L水合氯醛(200 mg/kg～300 mg/kg)腹腔注射麻醉后,使其仰卧,并固定四肢。在无菌条件下,于大鼠左肋弓下缘0.5 cm、腹正中线旁0.5 cm处行(2.0～2.5) cm 的纵切口,逐层分离皮下组织进入腹腔,钝性分离腹主动脉鞘,剥离腹主动脉,在左右肾动脉分支的下方穿入1.0号手术缝线,沿血管走行方向放置针尖磨钝的7号注射针头与腹主动脉一起结扎,然后抽出针头,造成腹主动脉部分狭窄(Sham组仅分离腹主动脉不行缩窄术)。
1.2.2 大鼠平均动脉压(MAP)及心率(次/分)的测量
在第6 w,用颈动脉插管法测量各大组大鼠的血压值。测压前先称大鼠体重,然后以1%戊巴比妥钠0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠,仰卧位同定于鼠台后,颈部剪毛,从外上到内下斜行切开(1—1.5) cm,分离出右侧颈总动脉,结扎颈总动脉远端,在动脉管壁上向心做“V”型切口,插入内充1%肝素生理盐水的测压导管到升主动脉,稳定20 min后用多道生理记录仪描记心率,动脉收缩压 (SBP),舒张压(DBP)和平均动脉压(MBP)MBP=[DBP+1/3(SBP×DBP)]。
测定指标并记录后,立即开胸分离并切取胸主动脉,长度约1 cm,PBS清洗,以40 g/L多聚甲醛固定,石蜡包埋。
1.2.3 主动脉中层厚度的测量
每个亚组的胸主动脉石蜡切片各选取6 张切片,每张切片随机选取3个视野,利用Image—proplus 6.0医学图像分析系统测量大鼠主动脉中层的厚度,取平均值为动脉中层(media,M)壁的厚度。
1.2.4 主动脉血管平滑肌细胞GRP94和CHOP
表达的免疫组化染色检测留取标本切片(片厚5 μm),进行免疫组化染色检测。(1)GRP94检测的主要步骤如下:石蜡切片常规脱蜡;加3%H2O2处理10 min;在微波炉中用0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)热修复组织抗原15 min,冷却后PBS洗涤1—2次;滴加5%BSA封闭液室温20 min封闭后;依次滴加1:100兔抗大鼠GRP94抗体(4 ℃过夜,PBS洗涤)、生物素化羊抗兔IgG(37 ℃孵育30 min,PBS洗涤)、SABC(37 ℃孵育20 min,PBS洗涤);DAB显色后,苏木素轻度复染,脱水,透明,封片,显微镜观察。(2)CHOP的检测步骤同GRP94。
1.2.5 Western blot检测GRP94和CHOP表达
采用GRP94、CHOP特异性的抗体进行Western blot检测,分别以β-actin校准后的蛋白条带的积分光密度(integrated optical density,IOD)值反映其蛋白表达水平。(1)提取心肌组织蛋白,Bradford方法测定蛋白质浓度。(2)等量蛋白质采用12%SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离,电转至PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭,孵育相应的一抗(GRP94 1∶1 000稀释,CHOP 1∶500 稀释, β-actin 1∶2 000稀释) 和二抗( 1∶8 000 稀释) , 然后E C L 试剂显色曝光。采用密度扫描软件分析蛋白条带的IOD值( IOD值=平均光密度× 面积) ,以靶蛋白IOD值/β-actin IOD值的比值反映靶蛋白的相对水平。
1.3 统计学处理
统计学处理所有数据均以均数±标准差
2 结果
2.1 不同组大鼠MAP的比较
腹主动脉狭窄术后6 w,手术组和替米沙坦组的MBP与相应假手术组比较有统计学意义 (p<0.05);腹主动脉狭窄组与替米沙坦组比较替米沙坦组的MBP低于腹主动脉狭窄组,有统计学意义(p<0.05)。见表1。
2.2 腹主动脉狭窄术后主动脉中层厚度的变化
腹主动脉狭窄6周后,手术组主动脉中层厚度与假手术组和替米沙坦组比较有统计学意义(p<0.05)替米沙坦组和假手术组比较没有统计学意义。见表2。
2.3 大鼠血管平滑肌中GRP94表达的免疫组化法检测
高血压大鼠血管平滑肌组织中GRP94的表达主要定位于血管平滑肌细胞的胞浆中。免疫组化结果显示,模型组(TAC组)GRP94呈强阳性表达,胞浆内充满棕黄色颗粒,替米沙坦组表达明显少于TAC组,对照组(假手术组)微量表达。见图1。
A—对照组,B—模型组,C—替米沙坦干预组
2.4 大鼠血管平滑肌中CHOP表达的免疫组化法检测
高血压大鼠血管平滑肌组织中CHOP的表达主要定位于血管平滑肌细胞的胞浆中。免疫组化结果显示,模型组(TAC组)CHOP呈强阳性表达,胞浆内充满棕黄色颗粒,替米沙坦组表达明显少于TAC组,对照组(假手术组)微量表达。见图2。
D—对照组,E—模型组,F—替米沙坦干预组
2.5 大鼠血管平滑肌细胞中GRP94和CHOP表达的western blot检测
采用GRP94和CHOP特异性的抗体进行western blot检测,分别以β-actin校准后的蛋白条带IOD值反映其蛋白表达水平。模型组血管平滑肌细胞的GRP94和CHOP表达高于对照组( RGRP94/β-actin:0.102±0.006与0.357±0.009,RCHOP/β-actin0.396±0.017与0.752±0.033,p<0.01)替米沙坦组血管平滑肌细胞的GRP94和CHOP表达低于模型组(RGRP94/β-actin0.154±0.007与0.357±0.011,RCHOP/β-actin0.387±0.012与0.752±0.033,p<0.01)。见图3。
1—对照组,2—模型组,3—替米沙坦组
3 讨论
高血压的发病率高,治疗周期长,并发症严重,是严重威胁国民健康的隐性杀手。目前对高血压引起的心血管的病理改变的机制尚不十分清楚。
研究表明,ERS作为一种亚细胞器上的应激,能够在细胞层面上反应多种疾病的病理过程[7],其是细胞的一种自我保护机制,适度的应激可以恢复内质网的稳态,但是过长和过强时间的应激则会引起细胞凋亡。ERS相关因子GRP94是启动ERS和内质网稳态调节的关键因子之一,另外作为内质网伴侣分子GRP94和GADD153分别是抗凋亡和促凋亡的两大效应分子[8,9]。本研究通过腹主动脉狭窄术建立高血压模型,结果表明模型组GRP94蛋白的表达高于Sham组,说明高血压的形成引起了内质网应激稳态调节反应;模型组GRP94蛋白和CHOP蛋白的表达高于替米沙坦组,说明替米沙坦可以抑制内质网伴侣分子GRP94及凋亡相关分子CHOP蛋白的过表达。
ERS时引起未折叠或错误折叠蛋白在内质网内聚集,这一过程称为未折叠蛋白质反应UPR 是细胞发生ERS时所形成的自我保护信号传导通路,包括诱导产生分子伴侣和减少蛋白质翻译等细胞通过UPR有利于维持正常功能,但是时间过长的应激则会引起细胞凋亡[10,11,12]。在早期阶段ERS通过减缓蛋白质合成,激活ERS反应蛋白GRP94等的转录以及上调蛋白降解基因的表达,来促进内质网功能的恢复,随着时间的延长,过强的ERS像一把双刃剑一样通过诱导凋亡相关分子CHOP的表达和casepase-12的活化而导致细胞凋亡。
血液中的压力变化影响血管壁的张力,血管壁张力增加促使分裂因子产生, 诱导VSMCs 增殖, 并导致局部AngⅡ生成增多, 从而诱导血管局部生长因子的自分泌增加, 促进VSMCs的增生、肥大及迁移。AngII 受体拮抗剂主要通过阻断AngII的AT1受体和保护血管内皮, 从而降低血压和逆转血管重构。本研究中发现替米沙坦组内置网应激标志蛋白GRP94和Chop蛋白低于模型组,说明内质网应激可能参与了替米沙坦降低血压和逆转血管重构的过程。
综上所述,腹主动脉狭窄术所致的大鼠血压升高引起了内质网分子伴侣GRP94和代表凋亡分子的CHOP蛋白的超表达,说明内质网应激可能参与了高血压时动脉血管的重构;而替米沙坦可降低高血压时GRP94和CHOP蛋白的表达,减轻主动脉中层厚度的增厚,说明高血压时,替米沙坦可能通过下调内质网应激水平来保护血管平滑肌细胞,但是否还有其他途径有待进一步的实验证实。