凝结芽孢杆菌研究

凝结芽孢杆菌研究（精选五篇）

凝结芽孢杆菌研究 篇1

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)是一类能形成芽孢的产乳酸细菌,它除了具有一般乳酸菌的维持肠道微生态平衡,刺激免疫,提高机体健康水平,提高人和动物消化功能等作用外,同时还具有普通乳酸菌所不具备的环境抗逆性强、抗胃酸、抗干燥、耐高温高压、易贮存等独特的生物特性[2],被美国食品与药物管理局(FDA)和美国饲料控制官员协会列入可用于饲料的安全微生物菌种名单[3]。凝结芽孢杆菌的芽孢较其营养体细胞易保藏,复活率高,因此,芽孢是制备凝结芽孢杆菌制剂的理想存在形式,获得高浓度高活性的芽孢是制备凝结芽孢杆菌制剂的首要关键。本实验室分离到一株产L-乳酸的凝结芽孢杆菌JSSW-LA,具有优良的益生素性能,为了使之应用于生产实际,对影响凝结芽孢杆菌液体培养形成芽孢的营养条件、pH、温度、接种量、溶氧水平方面进行了研究,为凝结芽孢杆菌芽孢制剂的产业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

菌种:凝结芽孢杆菌JSSW-LA为本研究室筛选保藏。

1.1.2 试剂

蔗糖、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米浆粉为国产生化试剂;葡萄糖、可溶性淀粉、NH4Cl、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、NaCl、CaCO3为国产分析纯试剂;玉米淀粉、小麦淀粉、马铃薯淀粉、麸皮、豆粕粉为市售。

1.1.3 仪器

TH-GB-403型超净工作台,江苏省无锡县空气净化设备厂;PYX-DHS-40X恒温培养箱,上海市跃进医疗器械一厂;123MB-1型光学显微镜,Nikon;Delta320 pH计,梅特勒-托利多;HYG-11a迥旋式恒温调速摇瓶柜,上海欣蕊自动化设备有限公司;B.BRAUN BIOSTAT C15-3自动发酵罐,B.BRAUN。

1.1.4 培养基

1.1.4.1 斜面培养基

麸皮营养琼脂培养基:蛋白胨10g/L,牛肉膏3g/L,NaCl 5g/L,麸皮10g/L,琼脂15~20g/L,蒸馏水1L,pH 7.0~7.2。

1.1.4.2 液体培养基

根据试验需要配制培养基或在基础培养基中添加C源、N源或无机盐配制培养基。

C源基础培养基:酵母膏5g/L,蛋白胨5g/L,NaCl 5g/L,pH 7.0~7.2。

N源基础培养基:葡萄糖5g/L,NaCl 5g/L,pH 7.0~7.2。

1.1.4.3 活菌及芽孢检测用培养基

番茄汁琼脂培养基:葡萄糖10g/L,酵母膏7.5g/L,蛋白胨7.5g/L,KH2PO4 2g/L,吐温80 0.5g/L,番茄汁100mL,蒸馏水900mL,琼脂15~20g/L,CaCO3 5g/L(单独灭菌),pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 培养方法

1.2.1.1 种子培养

用接种环从菌种斜面上蘸取少量菌泥,划线接种于上述斜面培养基,40℃培养24~48h,镜检以芽孢为主即为成熟。

1.2.1.2 摇瓶培养

将成熟的种子用无菌水从斜面上刮洗下来,放入内装无菌玻璃珠的灭菌三角瓶,振荡、制成均匀的菌悬液,80℃水浴10min,以2%(V/V)的接种量接入孢子悬液,摇瓶装量10%(V/V),40℃、180r/min的迥转摇床培养20~24h。

1.2.1.3 15L自动发酵罐培养

发酵罐装液量70%~80%(V/V),将成熟的斜面种子菌悬液经80℃水浴10min后,接入15L自动发酵罐,40℃、通气量5L/min,搅拌转速≥200r/min,控制溶氧在30%以上,培养20~24h。

1.2.2 测定方法

1.2.2.1 活菌总数的测定:

以倾注法进行活菌计数[4]。

1.2.2.2 芽孢浓度的测定:

菌液于80℃水浴加热10min,杀死营养体细胞,采用倾注法进行活菌计数。

1.2.2.3 芽孢率计算公式:

芽孢率%=(芽孢数/活菌总数)×100%。

2 结果与分析

2.1 培养基组成对芽孢形成的影响

2.1.1 碳源对芽孢形成的影响

在培养基成分中,碳源是影响芽孢形成的主要因素[5],在C源基础培养基中分别添加不同C源,即:葡萄糖5g/L,蔗糖5g/L,可溶性淀粉20g/L,玉米淀粉20g/L,马铃薯淀粉20g/L,小麦淀粉20g/L,麸皮20g/L,配制培养基,250mL三角瓶分装培养基25mL,40℃、180r/min摇瓶培养24h,测定活菌总数及芽孢数。结果如图1所示。

由图1可知,该凝结芽孢杆菌对各种碳源都能利用,从活菌总数来看,可溶性淀粉、葡萄糖、麸皮三种碳源活菌总数较高,且三者活菌总数较接近;从芽孢数量来看,葡萄糖碳源芽孢数量最高,麸皮碳源芽孢数量与葡萄糖碳源芽孢数量较接近,稍低于葡萄糖碳源的芽孢数量,但麸皮碳源中芽孢形成率最高,且考虑发酵成本及副产物的利用,麸皮碳源最经济,并可作为副产物利用,因此,选用麸皮作为凝结芽孢杆菌JSSW-LA的发酵培养基碳源为宜。

2.1.2 氮源对芽孢形成的影响

培养基中的氮源对芽孢的形成也有影响[6]。分别以蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米浆粉、豆粕粉、NH4Cl和(NH4)2SO4为发酵培养基中的氮源,添加量为10g/L,配制培养基,250mL三角瓶分装培养基25mL,40℃、180r/min摇瓶培养24h,测定活菌总数及芽孢数。结果如图2所示。

由图2可知,该凝结芽孢杆菌对有机氮源比无机氮源利用率高,所得活菌总数及芽孢数量均较高,在以无机氮为惟一氮源时,生长弱,芽孢难以形成。在有机氮源中,酵母膏培养基芽孢数量最高,但酵母膏成本高,不适合大规模发酵生产使用,因此考虑增加其它氮源减少酵母膏用量。豆粕粉芽孢数量较酵母膏略低些,但其价格较低廉,在芽孢的工业化大规模培养时,能较好地满足低成本的要求。故选择豆粕粉与酵母膏搭配使用以降低酵母膏用量。

由表1可以看出豆粕粉与酵母膏合用对芽孢形成起到了较好的效果,其产芽孢数量比单独使用酵母膏更高。确定氮源配比为酵母膏5g/L、豆粕粉10g/L。

2.1.3 无机盐对芽孢形成的影响

为了在提高菌体量的同时,提高芽孢数量,以麸皮20g/L,酵母膏5g/L,豆粕粉10g/L,NaCl 5g/L为对照,再分别添加无机盐:MgSO4·7H2O、CaCO3、KH2PO4、K2HPO4各3g/L,KH2PO4 1.5g/L+K2HPO4 1.5g/L,配制培养基,250mL三角瓶分装培养基25mL,40℃、180r/min摇瓶培养24h,考察不同无机盐对凝结芽孢杆菌JSSW-LA芽孢形成的影响,结果见表2。

实验结果表明:添加MgSO4·7H2O,菌体数量有所提高,但不利于芽孢形成,芽孢形成率较低;添加CaCO3,芽孢形成率尚可,但不利于营养菌体数量和芽孢数量的提高;分别添加KH2PO4和K2HPO4,对菌体生长和芽孢形成情况与NaCl相似;同时添加KH2PO4和K2HPO4虽然能促进菌体生长,使营养菌体数量有所提高,但却抑制了芽孢的形成。由于添加K2HPO4后菌体数量、芽孢数量和芽孢率均有所提高,因此后续实验用培养基中无机盐除NaCl外,添加K2HPO4。

Mn2+作为一种微生物生长所需的微量元素是超氧化物歧化酶、L-阿拉伯糖异构酶等许多酶的辅助因子,已有研究表明,金属离子Mn2+能促进芽孢产生[5,6,7]。因此,按上述实验获得的最适C源、N源及无机盐组成配制培养基,即麸皮20g/L,酵母膏5g/L,豆粕粉10g/L,NaCl 5g/L,K2HPO4 3g/L,添加不同浓度的MnSO4·H2O使Mn2+浓度分别为:0、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L,考察Mn2+浓度对芽孢形成的影响,结果如图3所示。

实验结果表明:Mn2+对菌体生长有促进作用,营养菌体数量随着Mn2+浓度的提高而提高,但芽孢形成率则在Mn2+浓度为0mg/L~100mg/L(即MnSO4·H2O浓度0.15~0.3g/L)时达95%以上,随后呈下降趋势,当Mn2+浓度达250mg/L时对芽孢的形成产生显著抑制。因此,在获得较高菌体量同时,还要求保持理想的芽孢形成率,则Mn2+浓度为100mg/L(即MnSO4·H2O 0.3g/L)时最适宜。

2.2 培养条件对芽孢形成的影响

2.2.1 初始pH对芽孢形成的影响

各种微生物都有生长的最适pH范围,在此范围内,细胞生长繁殖快,制得的干剂存活率高[8]。将初始pH设为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,考察pH对芽孢形成的影响,结果如图4所示。

由图4可知,初始pH过低或过高,都不利于菌株JSSW-LA生长及芽孢形成,培养基的初始pH 为7.0时菌体生长最为旺盛,芽孢数量及芽孢率均为最高,因此,确定7.0为最佳初始pH值。

2.2.2 培养温度对芽孢形成的影响

将培养温度设为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃,250mL三角瓶分装培养基25mL,180r/min摇瓶培养24h,考察培养温度对芽孢形成的影响[9,10]。试验结果见图5。

由图5可知,凝结芽孢杆菌JSSW-LA温度生长范围广,在25℃~65℃范围内均能生长。在25℃~35℃范围内,菌体数量及芽孢数量均随温度升高而递增,但主要以营养体形式存在,芽孢数量及芽孢率均不高;在40℃~45℃范围内,菌体数量、芽孢数量均较高,芽孢形成率均达到95%以上;当温度达45℃以上时,菌体数量、芽孢数量及芽孢率均随温度升高呈下降趋势,当温度高达65℃时,菌株仍能生长,但生长较弱,菌体数量、芽孢数量明显降低。当培养温度为40℃时,收获的菌体数量、芽孢数量均最高,且芽孢形成率最高,因此,40℃为最适培养温度。

2.2.3 接种量对芽孢形成的影响

接种量大小对菌株生长及芽孢形成有一定影响,接种量过大会带入较多的种子培养期的代谢产物,并使菌体前期生长过快,而使最终菌体数量及芽孢数量下降;接种量过小则使菌体增殖缓慢,芽孢形成缓慢,培养时间延长[11]。试验在250mL三角瓶分装培养基25mL,接种JSSW-LA孢子悬液,使摇瓶中芽孢数量分别达104、105、106、107数量级,40℃、180r/min摇瓶培养24h,考察接种量对芽孢形成的影响,结果如表3所示。

表3实验结果表明:收获的芽孢数量随着接种量的提高而提高,低接种量表现出很高的孢子增长倍率,但获得的芽孢数量不高,最高接种量能收获最大芽孢数量,但增长倍率最低,106级接种量的菌体增长倍率及收获的芽孢数量均较高,且芽孢形成率最高,因此,芽孢接种量在106级最适宜。

2.2.4 溶氧水平对芽孢形成的影响

溶氧对芽孢的形成也有较大影响,有些在有氧条件下形成芽孢,有些却在无氧条件下才形成芽孢,有些芽孢形成率随溶氧浓度升高而升高,有些却又相反。凝结芽孢杆菌为兼性好(厌)氧菌,由于有氧和无氧条件产能方式不同,最终获得的菌体数量、芽孢数量不同。氧气是影响芽孢形成的一个重要因素,在以芽孢为目标的生产中,采用通风发酵,溶氧是发酵的关键环节之一。通常以不同的装液量控制溶氧量。试验采用250mL三角瓶,装液量分别为15mL、25mL、35mL、50mL、75mL、100mL,40℃、180r/min摇瓶培养24h,考察装液量对芽孢形成的影响。

由表4结果分析:不同的装液量对凝结芽孢杆菌JSSW-LA的生长及芽孢的形成影响很大,溶氧增加促进了细胞的生长及芽孢的形成,装液量低,则通气量大,溶氧水平高,有利于菌体的生长和芽孢的形成,装液量为15ml/250ml三角瓶芽孢数量及芽孢形成率均最高,因此为最合适的装液量。

2.3 15L自动发酵罐中的培养过程

依照上述摇瓶试验优化获得的最佳培养条件在15L自动发酵罐中进行扩大培养,观察菌体生长和芽孢形成过程,为进一步的大规模工业化生产提供基础。按上述试验获得的最适营养条件配制培养基,即培养基组成为:麸皮20g/L,酵母膏5g/L,豆粕粉10g/L,K2HPO4 3g/L,NaCl 5g/L,MnSO4·H2O 0.3g/L,pH 7.0,培养温度为40℃,通气量5L/min,起始搅拌转速200r/min,通过调节转速以控制发酵过程溶氧水平在30%以上,对培养过程进行观察,结果如图6所示。

从图6可以看出,菌株JSSW-LA的芽孢接入培养基后,2h内迅速萌发成生长旺盛的营养菌体;当菌体结束迟滞期时,芽孢率几乎降至0%;随后,菌体生长进入指数期,生长旺盛,9h左右就已结束对数生长期,进入平衡期,菌体浓度达到最高值6.0×109 CFU/mL;在平衡期的中后期,菌体开始形成芽孢,芽孢率逐渐上升,培养20h后镜检可见芽孢成熟脱落,芽孢计数达峰值5.8×109CFU/mL,芽孢率96.7%;22h后菌体进入衰亡期,菌体开始自溶,芽孢有失活迹象,芽孢数、芽孢率均有所下降,培养结束。因此,应在培养20h后镜检观察芽孢成熟情况,及时判断培养终点。试验结果表明,凝结芽孢杆菌JSSW-LA在15L自动发酵罐中扩大培养效果良好,可将上述试验获得的最佳培养条件进一步应用于工业化大规模生产。

3 讨论

芽孢是产芽孢细菌在生长过程中形成的一种抗逆休眠体,并非细菌生活史中的一个不可缺少的部分, 但由于芽孢具有极强的抗热、抗辐射、抗化学药物和抗静水压等一些特殊的性质,因此对芽孢形成条件的研究是极具意义的,它的形成受营养物质和环境因素的影响。目前报道的凝结芽孢杆菌发酵的活菌数可达109~1010CFU/mL,但芽孢形成率不高,如Ramkrishna Sen等通过优化凝结芽孢杆菌的发酵条件[12],活菌数量达3.9×109CFU/mL,崔东良等通过优化凝结芽孢杆菌的发酵培养基[13],活菌数量达到9.3×109CFU/mL,但均未提及对芽孢数量的提高;葛风清等对凝结芽孢杆菌AHU1366的发酵培养基和培养条件进行了研究[7],摇瓶培养56h,芽孢形成率为80%;刘馨磊、戚薇等分别用补料分批法和中空纤维膜过滤法高密度培养凝结芽孢杆菌[14,15],芽孢率为26.7%和75%,最终芽孢浓度为1.2×109CFU/mL和1.2×1010CFU/mL,上述方法使凝结芽孢杆菌芽孢浓度得以有效提高,但发酵培养基的主要原料是葡萄糖、蛋白胨等精细原料,发酵生产成本较高,且发酵装置、发酵工艺较复杂。本试验对凝结芽孢杆菌JSSW-LA在液体培养条件下形成芽孢的培养基及培养条件进行了优化,得出最佳培养基组成为:麸皮20g/L,酵母膏5g/L,豆粕粉10g/L,NaCl 5g/L,K2HPO4 3g/L,MnSO4·H2O 0.3g/L;最佳培养条件为:初始pH 7.0,接种后起始芽孢浓度控制在106级,培养温度为40℃,250mL三角瓶中最适装液量15mL。依照摇瓶试验优化获得的最佳培养条件,在15L自动发酵罐中进行扩大培养,并控制溶氧水平不低于30%,培养20h后菌体数量达6.0×109CFU/mL,芽孢数量达5.8×109CFU/mL,芽孢率为96.7%,扩大培养效果良好。本试验中凝结芽孢杆菌的发酵培养以价廉易得的农副产品为主要原料,发酵生产成本较低,且发酵工艺较简单,发酵条件易控制,发酵周期较短,芽孢形成率可达90%以上,因此,该试验获得的最佳培养条件可应用于生产实际,但应继续探索可进一步提高芽孢产量的方法。

摘要：目的:提高凝结芽孢杆菌芽孢形成率及芽孢数量,为凝结芽孢杆菌芽孢制剂的产业化生产提供理论依据。方法:在摇瓶1、5L自动发酵罐中考察了碳源、氮源、无机盐、微量元素Mn2+、pH、温度、接种量、溶氧水平对凝结芽孢杆菌液体培养形成芽孢的影响。结果:芽孢形成的最适培养基组成为:麸皮20g/L,酵母膏5g/L,豆粕粉10g/L,NaCl 5g/L,K2HPO43g/L,MnSO4.H2O 0.3g/L;最适培养条件为:初始pH7.0,接种后最适起始芽孢浓度为106CFU/mL,培养温度为40℃,180r/min摇瓶培养,250mL三角瓶中最适装液体积为15mL。在15L自动发酵罐中扩大培养,控制溶氧在30%以上,培养20h,芽孢数量可达5.8×109CFU/mL,芽孢率达96.7%。结论:试验获得的最佳培养条件可进一步应用于生产。

凝结芽孢杆菌研究 篇2

芽孢杆菌HBS-4产生的表面活性剂及其与原油相互作用研究

菌株HBS-4是从油藏分离的1株芽孢杆菌,该菌株在其代谢过程中产生脂肽和糖脂类生物表面活性物质.可将发酵液的表面张力降低到25.6 mN/m.在细菌与原油相互作用的过程中,生物表面活性剂不仅具有分散、乳化原油的作用,而且有协助细菌代谢原油的.作用.实验结果表明,生物表面活性剂在pH值5～12之间保持稳定,当pH值小于5时,会逐渐失活,所以控制发酵液的pH值,有利于细菌对原油的降解.原油与细菌作用12 d后,原油的沥青质和芳烃组分被转化和降解, 相对含量分别降低了2.89%和17.39%,原油的饱和烃∑C21/∑C22+比值由开始的0.39升为1.36, 长链的饱和烃被降解为短链的饱和烃.

作 者：马黠静 郝瑞霞 李瑞平吕明 MA Xiajing HAO Ruixia LI Ruiping L(U) Ming  作者单位：北京大学造山带与地壳演化重点实验室,北京,100871 刊 名：北京大学学报（自然科学版）  ISTIC PKU英文刊名：ACTA SCIENTIARUM NATURALIUM UNIVERSITATIS PEKINENSIS 年，卷(期)： 42(6) 分类号：Q93 关键词：芽孢杆菌   生物表面活性剂   原油   生物转化   降解  

凝结芽孢杆菌研究 篇3

[关键词] 凝结芽孢杆菌活菌片；莫沙必利；便秘

[中图分类号] R574.4   [文献标识码] B   [文章編号] 2095-0616（2011）21-69-01

功能性便秘（FC）是消化科常见病，缺乏令人满意的治疗方案，笔者所在医院通过凝结芽孢杆菌活菌片联合莫沙必利治疗慢性功能性便秘，取得良好疗效，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择笔者所在医院门诊患者60例，男32例，女28例；年龄17~75岁，平均（46.0±5.6）岁；病程6个月~12年，平均（6.0±2.4）年。60例患者随机分为两组，治疗组32例，对照组28例。所有患者均符合FC的罗马Ⅱ诊断标准[1]。排除有严重肝病、胃肠疾病、便秘型肠易激综合征者和腹部手术史者；严重的心血管疾病、呼吸系统疾病、结缔组织或内分泌疾病；结肠镜或消化道造影检查除外结肠器质性疾病。两组患者年龄、性别、病程、伴发疾病等一般资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

治疗组予凝结芽孢杆菌活菌片（爽舒宝，青岛东海药业有限公司，S20050032）首剂6片，以后3片/次，3次/d，餐后服用；莫沙必利片（鲁南贝特制药有限公司，H19990317）5 mg/次，3次/d，餐前服用。对照组予莫沙必利片5 mg/次，3次/d，餐前服用。

1.3 疗效判断

显效：排便次数恢复正常（1次/1~2 d），排便通畅，排便时无不适感，大便性状改变，为成形软便。有效：达到上述指标1~2项。无效：各项指标无改善。

1.4 统计学处理

采用SPSS10.0统计软件包进行统计学处理，采用x2检验对总有效率进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两组总有效率比较，差异有统计学意义（x2=14.6，P＜0.05）。2周后肝、肾功能测定均正常。

表1  两组患者治疗2周后的疗效比较

组别 n显效+有效无效有效率（%）

治疗组 3230 293.75

对照组 28141450.00

合计 60441673.33

3 讨论

慢性功能性便秘，包括持续性排便困难、粪质硬结、排便次数减少或排不尽感等症状。近年来，随着社会发展，膳食结构、生活方式的改变，便秘发病率高，多见于老年人，但中青年人发病率也逐渐增高，据统计患病率高达9%~20%[1-2]，长期便秘严重影响生活质量，泻药产生依赖性，存在腹痛、水电解质紊乱、结肠黑便病和损伤肠神经等副作用[3]。

凝结芽孢杆菌活菌片是新一代肠道通便药，治疗便秘疗效显著，它的有效成份是凝结芽孢杆菌TBC169菌株，进入肠道产生大量乳酸[4]，促进肠蠕动，增加肠动力，同时分泌抗菌凝固素，抑制肠道有害菌，排除肠道毒素，解除肠道毒素的麻痹作用[4-7]；同时TBC169能产生40多种酶，表层蛋白可以在空气/水界表上及磷脂肪上重结晶为大的连续的单层膜，达到保水、润肠的作用[4]，使大便不干燥，排便顺畅。研究表明，凝结芽孢杆菌TBC169能分解多糖为低聚糖，提供肠道有益菌生长所需营养物质，能快速恢复肠道菌群失调[8]。凝结芽孢杆菌活菌片的有效成分TBC169从多方面发挥作用，改善肠道，促进排便。

莫沙必利片是一种全胃肠动力药，通过刺激肠壁的肌间神经丛释放乙酰胆碱改善结肠转运时间，促进便秘患者的肠蠕动，从而促进排便。总之，凝结芽孢杆菌活菌片与莫沙必利从不同的作用机制上调理肠道恢复肠动力，从根本上治疗便秘。同时便秘患者要改善生活方式，适当的运动加合理膳食，养成定时排便习惯，对治疗慢性习惯性便秘大有益处。

[参考文献]

[1] 郭晓峰，柯美云.北京地区成年人慢性便秘流行病调查及相关因素分析[J].基础医学与临床，2011，21（增刊）：106-107.

[2] 戴菲，龚均.慢性便秘患者精神心理因素的研究[J].中国肛肠病杂志，2000，1：13-14.

[3] 彭显亮，盂浦，孙金枝.金双歧片在培养便秘婴幼儿排便习惯中的作用[J].中国儿童保健杂志，2004，12（6）：526-527.

[4] 王霖，王文杰，刘洋，等.凝结芽孢杆菌TBC-169菌株治疗抗原诱导大鼠结肠炎的实验研究[J].胃肠病学，2008，13（6）：349-353.

[5] 崔云龙，闰述翠，万阜昌.凝结芽孢杆菌TBC-169菌株对肠道致病菌的抑菌作用[J].中国微生态学杂志，2005，5：333-334.

[6] 王文杰，刘洋，彭珊瑛，等.凝结芽孢杆菌TBC-169菌株对小鼠免疫功能和粪便胺含量及肠道中氨含量的影响[J].中国微生态学杂志，2006，18（1）：6-8.

[7] 李雄彪，马庆英，崔云龙.凝结芽孢杆菌抗菌作用机制[J].中国微生态学杂志，2006，18（1）：78-79.

凝结芽孢杆菌研究 篇4

凝结芽孢杆菌是一种高效的益生菌,为农业部批准准予生产、经营和使用的新型饲料添加剂菌种。该菌活菌能降低肠道p H值,减少臭气,同时能够显著增加肠道内双歧杆菌的数量和减少产气荚膜梭菌的数量[1,2]。目前,凝结芽孢杆菌广泛应用于生猪养殖工业中,对猪有较好的防腹泻的作用,并能显著地提高猪平均日增重和降低饲料成本[3]。本研究利用凝结芽孢杆菌的芽孢具有耐热、耐胃酸和产品保存性好等优点[4],将芽孢灌服小鼠,统计凝结芽孢杆菌对小鼠肠道菌群细菌易位的影响,并与致病菌灌服组及其混合菌灌服组对小鼠的生长性能及肠道菌群细菌易位情况作比较,分析凝结芽孢杆菌在体内拮抗致病菌导致的易位作用,丰富了凝结芽孢菌的益生作用的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

益生芽孢菌(凝结芽孢杆菌重庆分离株1,B.coagulans CQ1),病原指示菌即常见肠道病原菌(沙门氏菌S.mutant)和大肠杆菌(E.coli K88),均由重庆市畜牧科学院兽医研究所保存。

1.1.2 培养基

(1)普通营养培养基[5],蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化钠5 g、蒸馏水1 000 m L,p H 7.4,121℃高压灭菌15 min。(2)葡萄糖酵母蛋白胨(GYP)培养基[6],葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、酵母提取物5 g、水1 000 m L,p H 6.8~7.0,115℃高压蒸汽灭菌20 min。(3)麦康凯培养基,购自上海生工。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养与计数

平板划线接种,挑选单克隆菌落,用普通营养培养基培养前述致病菌,当其达到对数期,计数菌种的数目,调整到浓度109个/m L。凝结芽孢杆菌的培养参考赵国辉等方法[7]执行,当完全形成芽孢时,采用赵树苗等方法[8]进行芽孢计数。

1.2.2 动物试验及饲养管理

1.2.2. 1 分组与预试验

购买36只昆明系雄性小鼠(三医大小动物中心),体重大致相等,空腹称重。根据体重随机分为6组,每个处理组饲喂基础日粮(SPF级大小鼠维持饲料,饲料生产企业审查合格证号:京饲审(2009)06170;试验动物饲料生产许可证号:SCXK(京)2009-0008)。连续饲喂7 d,使小鼠尽快适应到基础日粮饲料。

1.2.2. 2 正式试验

预试验结束后,开始正式试验。要求对照组每日灌胃无菌生理盐水200μL;试验组分别灌胃生理盐水配制的凝结芽孢杆菌(简称芽孢)、致病菌(大肠杆菌、沙门氏菌)及其的混菌组合,灌胃小鼠的菌种、编号及其的用量见表1。试验期间小鼠同室分笼饲养,自然光照,自由采食和饮水。环境温度控制在23±2℃,湿度60%,试验前后分别称重1次。

1.2.3 组织样处理

1.2.3. 1 制备组织匀浆

经连续试验6 d后,小鼠禁食12 h,摘取眼球取血。将血液放入预先用EDTA钠处理的离心管内。断颈椎处死小鼠,迅速取出脾脏、肝脏,并称量其重量,加入等质量预冷的生理盐水,制成50%组织匀浆液。

1.2.3. 2 细菌易位测定

取脾脏、肝脏的匀浆组织液,稀释成10-1、10-2、10-3、10-4的浓度。血液稀释梯度为血原液、10-1、10-2、10-3等浓度,涂板到麦康凯、MRS培养基上。培养24 h后,进行菌落计数。检测组织和血液中的乳酸菌和肠杆菌科的细菌数目。

1.2.4 数据处理

采用Excel对试验数据进行统计和整理,并采用SPSS 11.5统计分析软件中的ANOVA方法对试验数据进行多重比较和差异显著性检验分析,以P<0.05为相差显著,文中数据标识均为平均值±标准差(mean±SD)。

2 结果与分析

2.1 各组对小鼠增重的影响

不同组别的小鼠,经过持续6 d的灌服处理,对小鼠的增重都产生了一定程度的影响,试验结束时小鼠体重的统计结果见表2。

注:数据为平均数±标准偏差,肩号小写字母的不同者表示差异显著(P<0.05)。

根据芽孢组、E.coli K88和S.mutant及混合组对小鼠体重的影响,统计分析表明,所有组小鼠增重变化差异不显著(P<0.05)。但是深入分析发现,与对照组相比较,芽孢灌服组使小鼠体重增重明显,细菌芽孢混合组的小鼠增重次之,单一致病菌组(E.coli K88和S.mutant)的小鼠增重最差。

2.2 小鼠肠道细菌易位的检测

通过24 h的平板培养,进行计数检测,获得各灌服组小鼠肠道菌群的细菌易位的试验数据,结果见表3。

由表3可知:对照组(control)、芽孢组(B.coagulans)均不能够使小鼠肠道菌群的细菌易位到血液、肝脏和脾脏中;然而致病性组(S.mutant,E.coli K88)中,血液、肝脏和脾脏中都有肠道菌群存在,其中致病菌沙门氏菌灌服组使肝脏、脾脏和血液中的肠杆菌易位数增多;在混合组中除血液外,脾脏和肝脏里均检测到了肠道细菌,只是E.coli K88+B.coagulans灌服组检测到的细菌数目偏多。这些结果表明,凝结芽孢杆菌具有保护肠道黏膜,具有防治肠道致病性菌感染而导致细菌易位的作用。

3 讨论

试验表明,不论是益生菌、病原菌还是其混合物灌服组,小鼠的体重都有所增加,只是芽孢菌灌服组小鼠增重十分明显,意味着凝结芽孢菌的芽孢在肠道内可能大量发芽、定植及增值,促进了动物小鼠的生长,产生了良好的益生作用。同时,也证明该株凝结芽孢杆菌是一株良好的益生菌,该结果与李国建[3]等人的研究结果相符。

研究还发现,对照组和芽孢灌服组没有引起肠道菌群易位的发生,这可能与本试验选择的试验动物为正常、健康的动物模型有关系。Berg等[9]报道,口服Salmonella会引起肠黏膜屏障功能受损,致使肠道内细菌进入肝、脾、淋巴结乃至全身血液循环中,出现肠道细菌易位。本试验用致病性沙门氏菌S.mutant灌服证实了这一现象。此外,在口服致病性大肠杆菌E.coli K88后,也出现了肠道菌群细菌易位的类似情况,只不过由其导致的肠道菌群易位程度比致病性沙门氏菌S.mutant组引起的易位程度低。

值得强调的是在混合组试验中发现E.coli K88+B.coagulans灌服组肠道菌群细菌易位呈现更加明显的特点,说明B.coagulans有利于防控S.mutant,不利于控制E.coli K88引起的肠道疾病。相比单独的致病菌灌服组,混合组易位细菌的数量少很多,也证明凝结芽孢菌的活菌及其代谢产物能够抑制致病菌活性,降低细菌的易位能力,该结果与Liong报道的乳酸菌能够降低肠道感染引起的细菌易位特点相符[10]。因此,这株益生芽孢菌抗感染方面的作用是下一步研究的重点。

参考文献

[1]崔云龙,万阜吕,李长龄,等.凝结芽孢杆菌(TBCl69)片治疗便秘的实验研究和临床疗效[J].中国微生态学杂志,2006,18(4):264-269.

[2]Katsutoshia,Shinichim,Tadasih,et a1.Effect spore-bearing lacti-cacid-forming bacteria(B.coag ulans SANK70258)administrationon the intestinal en vironment,defecation frequency,fecal characteristics and dermal characteristics in humans and rats[J].Mi crob Ecol in Health Dis,2003,14(1):4-13.

[3]李国建.凝结芽孢杆菌替代抗生素对猪生产性能的影响[J].河南农业科学,2004(10):72-74.

[4]王艳萍,陈莹,赵虑山,等.一株芽孢乳酸杆菌TQ33产芽孢特性及抗性的研究[J].中国乳品工业,1996,24(3):9-12.

[5]凌代文.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京:中国轻工业出版社,1999.

[6]潘俊福.有益乳酸芽孢杆菌的选育及其培养条件的优化[D].广东海洋大学硕士学位论文.

[7]赵国辉,戴新羽,周盛琦,等.芽孢形成促进培养基的自制与初步应用[J].中国公共卫生.2001,17(2):129.

[8]Shumiao Zhao,Nan Hu,Jun Huang,et al.High-yield spore production from bacillus licheniformis by solid state formention[J].biotechnol lett,2008,30:295-297.

[9]Berg R D,Garfiugton A W.Translocation of certain in digenous bacteria from the gastrointestinal tract to the mesenteric lymph nodes and other organs in a gnotobi otic mouse model[J].Infect Imillun,1979,23(2):403-411.

枯草芽孢杆菌在养猪生产上的应用 篇5

枯草芽孢杆菌在养猪生产上的应用

1 研究背景及作用机理 枯草芽孢杆菌是具有典型芽孢杆菌特征的革兰氏阳性菌,最早于1835年被Ehrenberg发现,被描述为“Vebrio subtilis”,于1872年由Cohn正式命名为“Bacillus subtilis”,并作为芽孢杆菌的`模式菌株.枯草芽孢杆菌为嗜温、好氧、产芽孢的杆状细胞,分布广泛,易培养,且不会产生对人和动植物有害或污染环境的产物,抗逆性能强.

作 者：彭霞 PENG XIA 作者单位：广东希普生物科技股份有限公司,广州,510897刊 名：广东饲料英文刊名：GUANGDONG FEED年，卷(期)：19(2)分类号：S816.7关键词：