乙型脑炎病毒

乙型脑炎病毒（精选十篇）

乙型脑炎病毒 篇1

乙型脑炎 (Janese Encephalitis, JE) , 简称乙脑, 是一种人与动物共患的蚊媒病毒性疾病。该病最早发现于日本。1871年对这种疾病在临床上才有初步认识。猪的乙型脑炎主要表现为:潜伏期3d~4d, 患病幼畜呈现稽留热, 精神沉郁, 最后身躯麻痹而死;育肥猪持续高热;妊娠母猪主要表现为流产, 产出大小不等的死胎, 畸形胎, 木乃伊胎及弱仔, 流产后一般不影响下次配种;公猪单侧或两侧性睾丸肿大, 局部发热, 有痛感, 数天后, 睾丸肿胀消退, 逐渐萎缩变硬。易感仔猪偶尔出现临床症状, 成年猪或怀孕猪感染乙脑后不一定表现临床症状。然而, 怀孕的易感母猪受感染后, 最终胎儿会出现不同程度的异常。JEV对猪的致死率不高, 但此病造成怀孕母猪发生繁殖障碍是主要的经济损失, 对作为畜牧业支柱产业的养猪业持续增产造成巨大的危害。

由于JEV通常在蚊→猪→蚊等动物间循环, 猪被认为是JEV最重要的自然增殖动物, 在给养猪业带来损失的同时, 也是人类公共卫生潜在的威胁, 全球约有30亿人居住在流行区, 这些地区每年新生儿数约3000万。JEV在人群中发病致死率高达25~40%。据估计, 每年有35000~50000病例, 其中10000例死亡, 约15000例有神经系统后遗症。我国除新疆、西藏、青海外均为乙脑疫区, 主要病例发生在儿童, 病死率高, 后遗症严重。广西是乙脑流行的高发区, 历年都有乙脑散发或流行。

2 乙型脑炎病毒的病原学特性

2.1 乙型脑炎病毒的分类

JEV的分离和鉴定最早报道于1935年, 日本学者从死者脑组织分离得到病毒, 并证明其抗原性不同于美国的圣路易脑炎病毒 (St.Louis Encephalitis Virus, s LEV) , 从而首次确定了本病的病原。我国1940年由死亡患者的脑组织中分离到病毒, 经鉴定与日本分离到的乙脑病毒相同。JEV属于黄病毒科, 黄病毒属。黄病毒科是从披膜病毒科中分离出来, 包括3个属:黄病毒属, 瘟病毒属和类丙肝病毒属。黄病毒属包括70多种病毒, 大多是人的致病菌, 主要有黄热病毒 (YFV) 、JEV、西尼罗病毒 (WNV) 和登革热病毒 (DV) 。从抗原性看, JEV与WNV, 墨累河谷脑炎 (Murray Valley Encephalitis Virus) 、圣路易脑炎病毒有一定的交叉关系, 由血凝抑制试验可知, 它们组成一个亚组, 有相似的基因组。黄病毒属内病毒在血清学上彼此有交叉反应, 不同属间无交叉反应。JEV分3个血清型:JaGAr、Nakayama和Mie (Intermediate Type) , 它们具有不同的生物学特性, 包括生长特性和毒力。

2.2 乙型脑炎病毒的生物学性状

JEV具有血凝特性, 电子显微镜观察可见JEV囊膜外表有穗状突起, 提纯的囊膜突起具有血凝活性, 而且只含糖蛋白。在用蛋白酶处理后, 囊膜突起消失, 血凝活性也丧失。现已证明其血凝素的主要成分是多肽。其血凝素有轻重两种, 血凝性与毒力相关, 朱家鸿等研究认为溶血性和血凝性都是JEV强毒株的共性。JEV的各个毒株在毒力和血凝特性上具有比较明显的差别, 但并没有明显的抗原性差异。JEV的抗原性较强, 自然或人工感染的动物一般都能产生较高效价的中和抗体、血凝抑制抗体和补体结合抗体。

3 乙型脑炎病毒的分子生物学

3.1 乙型脑炎病毒的基因组结构

JEV是一种单股正链的RNA病毒, 基因组长度为11kb, 沉降系数为42S, 具有感染性。JEV基因组的全部核苷酸序列已完全弄清, 整个基因组由5'端非编码区 (5'-UTR) 、一个几乎跨越整个基因组的单一开放阅读框 (ORF) 和3′端非编码区 (3'-UTR) 构成, 无亚基因组结构 (图1) 。

注: (A) 病毒分子结构; (B) JEV囊膜蛋白编码区; (C) JEV基因组只有一个开放阅读框 (ORF) , 在ORF两侧, 5’端有帽子结构m7Gppp Amp, 3'端为CUOH, 不含poly尾。开放阅读框包括三中结构基因 (C、pr M与E) 和七种非结构基因 (NS1-NS2-NS3-NS4-NS5) 。

5'-UTR由95个核苷酸组成, 有一个I型帽子结构 (m7GpppAmp) , 具有保护基因组5'端免受核酸酶或磷酸酶降解, 且有促进起始翻译的作用。ORF大小约10.3kb编码一个多聚蛋白前体, 经宿主、病毒蛋白酶切割加工, 产生3个结构蛋白:核心蛋白 (C) 、膜蛋白 (prM/M) , 囊膜糖蛋白 (E) ;7个非结构蛋白 (NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5) 和两个多肽切割片段 (Pr和Anch片段) 。3'-UTR长约0.6kb个核苷酸, 缺乏Poly A尾结构。3'端序列的分子结构与RNA复制有着密切的关系。

3.2 乙型脑炎病毒的结构蛋白

1975年, 北野等用PAGE分析JEV毒粒发现至少三种结构蛋白:核心蛋白 (Capsid, C) , 膜蛋白 (Membrane, M;Precursor M[prM]) 和囊膜蛋白 (Envelope, E) 。结构蛋白是JEV毒粒的主要成份, 是维持病毒粒子形态结构的主要物质。

C蛋白, 核衣壳蛋白。首先由氨肽酶切除多聚蛋白前体的第一个Met形成C蛋白, 分子量13.9kDa, 由120个氨基酸组成, 其39-54位氨基酸序列在黄病毒属中具有保护性。C端疏水性氨基酸将其暂时固定在宿主细胞的粗面内质网膜上, 以便装配成包裹基因组的核衣壳, 使之免受核酸酶的破坏。M蛋白, 膜蛋白。是第二个被编码的蛋白, 分子量约8.3kDa, 由75个氨基酸残基组成, 前体蛋白PrM对E蛋白的正确折叠、定位于膜上和最后的装配至关重要。Mandal等研究表明prM带有N-连接的糖侧链, 具有Asn-X-Thr序列的糖基化位点, 在病毒粒子释放同时或释放之前一瞬间, PrM切割形成M蛋白。PrM切割不完全就成为中和抗体的靶子。Feng等对其生物学功能进行了研究, 认为M蛋白参与病毒的感染过程, prM是病毒诱发保护性免疫的重要协同成份, M能诱生具有轻度中和作用的抗体。

E蛋白, 主要结构蛋白, 是毒粒表面最重要的成分, 它与病毒的吸附、穿入、致病和诱导宿主的免疫应答等作用紧密相关。其分子量为53kDa, 含500个氨基酸残基, 甘氨酸和丙氨酸含量相对较高。E蛋白也是体外中和作用的主要靶位点、JEV特异性抗体的作用位点;具有血凝活性和中和活性, 能和血凝抑制抗体结合, 能刺激机体产生中和抗体, 启动机体的免疫防御。由于E蛋白在诱发机体免疫防御中的重要性, 研究其高级结构, 寻找其抗原决定簇, 都是在乙型脑炎病毒研究中的热点领域。相关研究将为发展JEV重组DNA或亚单位疫苗提供分子水平的依据, 1987年, Yasui等用单克隆抗体 (McAb) 研究了JEV蛋白的抗原决定簇, 并将E蛋白抗原决定簇归为10组 (见表1) 。

3.3 乙型脑炎病毒的非结构蛋白

紧接着结构蛋白的是非结构蛋白NS1-NS2a-NS2bNS3-NS4a-NS4b-NS5。作为病毒合成的酶或调节蛋白, 与病毒复制和生物合成密切相关。

NS1是一种分泌型糖蛋白, 其分子量为40kDa, 但由于在130位和207位存在N2连接糖链, 在感染细胞内其实际分子量为46 kDa左右。NS2a分子量约为17 kDa, NS2b约为13kDa, 均为疏水性蛋白, 在所有黄病毒中其同源性最低。NS2蛋白可能与膜功能有关。NS3分子量64kDa, 其C末端和N末端的氨基酸组成已研究清楚, 具有亲水性基团。Takegami等认为NS3蛋白是一个具有激酶。和解旋酶特性的多功能蛋白, NS4a和NS4b均为疏水蛋白, 分子量分别约为28kDa和14kDa。有关其结构与功能方面的研究未见报道。NS5分子量为105kDa, 在黄病毒中其氨基酸序列同源性最高, Yu等在2007年运用重组的NS5蛋白证实了Rice等在1985年提出的论断, 即NS5参与病毒RNA聚合酶的组成。

近年来, 各种病毒的非结构蛋白的研究深入发现, 非结构蛋白也有很好的免疫原性与反应原性, 非结构蛋白也成为了JEV的重组免疫靶蛋白。Lin等用大肠杆菌原核表达系统表达出的NS1重组蛋白能诱发产生很高的免疫保护力。Qi等以NS5基因为靶基因运用iRNA干扰技术成功的抑制了JEV于动物体内进行的复制。

4 乙型脑炎诊断方法研究进展

根据乙脑流行病学资料和临床表现诊断并不困难, 但确诊需要进行实验室诊断, 传统的病原分离鉴定工作量大, 影响因素多, 确诊时间长, 临床上运用受到限制。适宜的样品中进行病毒分离对确诊至关重要, 但检测感染组织脑、胎盘、木乃伊化的胎儿及体液中病毒抗原也具有重要的诊断意义。陈伯权用JEV单克隆抗体 (McAb14) 致敏的羊血球 (M-RBC) 作RPHA实验检查JEV抗原, 结果发现该法有较高的特异性, 只与JEV发生反应而不和有共同抗原的WNV和DENV发生反应。M-RBC制剂保存1年仍保持稳定, 标本不用处理, RPHA操作简便, 可作快速诊断用。宋大伟等建立了新型SPA协同凝集试验, 相比前者更为简便实用。邓艳青等应用单克隆抗体免疫金银染色法检测经ELISA确诊的乙脑人类患者外周血和脑脊液中的JEV抗原阳性细胞及表达的白细胞介素2受体 (IL-2) , 结果提示该法对JEV抗原阳性细胞的检测具有较好的特异性和敏感性。Kurata等采用荧光抗体染色法检测用胰蛋白酶或其它蛋白消化酶处理并经福尔马林固定的组织中的JEV抗原获得成功。Lanciotti首先将RT-PCR的方法运用到了乙型脑炎病毒的检测中, 该法特异性强、敏感性高。在国内, 车勇良等建立了RT-PCR方法检测猪乙型脑炎病毒。考虑到引起母猪流产的病毒性疾病很多, 刘辉等建立了多重RT-PCR方法检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和乙型脑炎病毒, 以区别确诊基层中常见的三种引发母猪流产疾病。当然, 也可根据乙脑流行病学特点, 临床和病理学变化做出初步诊断。如要确诊, 就必须进行病原学检查和血清学试验等特异性诊断, 在实际操作中, 应根据实际情况来选择上述诊断方法。

5 猪乙型脑炎的预防

用重组干扰素-αA治疗人的乙型脑炎在临床上已经取得了很好的效果。但用这种治疗方法来治疗猪的乙型脑炎还是不可能的。破坏这种虫媒传播疾病的感染循环, 通常都是有利管理的很好方法, 但JEV可以在多种蚊体内繁殖, 并且感染形式随地方生态而变化。想控制这种昆虫很不实际, 因此, 用JEV疫苗进行免疫还是广泛应用的控制和预防。多种用来预防猪的乙型脑炎弱毒苗已经研制出来, 并且成功地用于田间试验。目前大部分应用的疫苗有鼠脑灭活疫苗, 来自中山株或北京株病毒, 亚洲部分国家有生产;细胞培养灭活疫苗, 来自北京P-3株病毒;细胞培养减毒活疫苗, 来自SA14-14-2株病毒。冯云等在三代喙库蚊胸腔接种乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2株病毒, 发现该减毒活疫苗通过蚊虫体内繁殖后不会造成传播, 进一步评价了该疫苗的安全性。于JEV在培养中增殖速度慢, 要获得高效价疫苗尤其是灭活苗, 通常要经过浓缩, 所以组织培养疫苗价格比较昂贵, 而且鼠脑灭活苗有较多的脑组织成分, 接种后易发生严重的变态反应性脑脊髓炎;同时有注射剂量大, 效力不持久, 为此, 1997年WHO将研究和发展JE疫苗作为主要目标。随着分子免疫学、分子生物学的迅猛发展和生物技术的进步, 人们寄希望于发展既安全有效又价廉易得的新型JE疫苗。因此, 作为新一代的JE疫苗——重组活疫苗和核酸疫苗的研究也就应运而生。

我国娄元梅等采用JEV重组痘苗病毒J1和J3株对其抗原表达和免疫保护性进行了研究, 经免疫荧光法 (IFA) 检测证明J1, J3两者都含JEV的E、NS1和NS2a基因) 均可诱生抗JEV抗体, 其中J3 (还含p rM基因) 免疫鼠不产生中和抗体和血凝抑制抗体, 且抗JEV攻击能力显著提高。

Lin和Konishi等用能编码prM和E的质粒pcDNA 3JEME, 构成核酸疫苗即基因疫苗。用其免疫小鼠可使小鼠达到70%的保护力, 而用编码NS1的质粒免疫小鼠可获得90%的保护。而作为对照的空白质粒载体免疫组也有40%的保护, 说明质粒也有非特异性佐剂作用。

郑浩等对猪源乙型脑炎病毒SH0601株进行全序列测定与分析, 构建了全长的cDNA克隆。以便于单个核苷酸突变来引起氨基酸替换研究病毒的生物学性状改变, 寻找新的重组片段, 为JEV基因疫苗的研制打下了良好基础。

6 小结

乙型肝炎病毒耐药基因及分型检测 篇2

乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病，主要存在于肝细胞内，可引起肝细胞炎症、坏死和纤维化。

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性分布，全球约有3.6亿感染者，每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病。我国属于感染的高发区，现有的慢性HBV感染者约9300万例。

乙型肝炎病毒（HBV）基因分型的临床意义

HBV根据DNA差异可分为A、B、C、D、E、F、G、H八种类型，不同型别在流行特征，致病性，对药物治疗反应等方面存在差异，其中，我国以B型和C型为主，感染HBV基因型B的患者发生肝纤维化及肝细胞癌的平均年龄要比感染HBV基因型C的患者的年龄大。

通过分型检测，可判断病毒复制活跃程度及突变发生率情况。研究表明，与HBV-B型相比，C型复制较活跃，不易发生HBeAg血清转换；HBV-B型易产生前C区突变，C型核心启动子区变异发生率更高，与重型肝炎发病机制密切相关，可作为肝癌高危指标之一。同时，HBV-B、C型患者易产生拉米夫定耐药突变，通过分型检测，可指导临床治疗方案制定，有针对性进行临床治疗，更大程度上提高患者的生活质量。

乙肝的治疗方式有哪些？

HBV感染主要的治疗方法是抗病毒治疗，国内外普遍使用的药物有干扰素和核苷（酸）类。由于干扰素需要反复注射，且副作用较多，近年来，核苷(酸)类似物(NA)已成为抗HBV感染的主要方法之一，NA因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者，是长期治疗的合理选择。但随着治疗时间的延长，往往会出现病毒耐药株，从而需要监测乙型肝炎病毒耐药基因型，指导临床用药。

乙肝病毒产生耐药的机理是什么？

HBV对某种药物的耐药性一般是指由HBV基因组上某些位点的变异导致这种药物对HBV的抑制作用减弱或无作用。通常分为以下几种：

（1）原发性耐药变异：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异，导致变异病毒株对治疗药物的敏感度下降；

（2）继发性耐药变异(又称补偿性耐药变异)：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降，在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异，这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感度的进一步下降；

（3）基因型耐药：指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV变异；（4）表型耐药：通过体外复制系统证实检测到的HBV变异会降低其对抗病毒药物的敏感度。

HBV属于嗜肝DNA病毒科，基因组长约3.2kb，是部分双链环状DNA结构。HBV基因组含有4个部分重叠的开放读框(open reading frame，ORF)，分别为S基因区、C基因区、P基因区和x基因区。产物为含末端蛋白、间隔区、逆转录酶区和RNA酶H区4部分的HBV聚合酶。

HBV虽然属于DNA病毒，但其复制过程并非DNA—DNA的直接复制过程，而是经过前基因组RNA的中间过程，即DNA—RNA—DNA的复制过程。在前基因组RNA逆转录为负链DNA的过程中，HBV逆转录酶由于缺乏严格的校正机制，导致HBV复制过程中核苷酸错配率较高，发生变异的频率为每年(1.4～3.2)X105核苷酸替换／位点。HBV复制的这种过程和特点，决定了同一患者体内不同的HBV株基因序列之间也存在差别。

核苷（酸）类药物主要通过抑制HBV聚合酶的逆转录酶区活性，阻止HBV复制过程中以HBV的前基因组RNA为模板逆转录生成新的病毒DNA，从而发挥抑制病毒复制的作用，HBV前基因组RNA是以HBV的cccDNA为模板合成的，即NA的药效靶点在cccDNA的下游，所以NA不能直接清除已经存在的cccDNA。为了持续抑制HBV的复制，NA抗HBV治疗的疗程往往需要数年。但在长期应用某一抗病毒药物的情况下，产生选择压力，野生株被抑制。生存下来的突变株占主导，此种药物便失去了疗效，从而导致耐药的发生。

HBV对NA的耐药分析

1.拉米夫定(LAM)

LAM属于L-构型核苷，是目前用于临床最广、时间最长的药物，其产生的耐药也是最多的。在LAM初次治疗时，1、2、3、4和5年YMDD突变的发生率约为23％、46％、55％、65％和7l％。LAM主要的耐药突变位点是rtM204V／I(YMDD变异)，rtM204V变异通常与其补偿突变rtL180M联合出现，rtM204V／I株较野生株复制能力低，而rtL180M的出现使突变株HBV的复制接近野生株的水平圈。目前报道发现的与LAM相关的主要耐药突变有rtM204V、rtM204I和rtL180M，其他的突变位点有rtL80V／I、rtI169T、rtV173L、rtTI84S和rtQ215S这些突变通常以下面不同的组合方式出：(1)trM204I／V+rtIJ80M；(2)rtM204I：(3)rtM204V+rtL1810M+rtV173L；(4)rtM204I+rtI80I：(5)rtM204I／V4+rtQ215S±rtL180M：(6)rtM204V+rtL180M+rtV173L+rtl169T；(7)rtA181T：(8)rtM204I／V+rtT184S±rtL180M：(9)rtM204S+rtLl80M。这些HBV耐药突变株常以准种的形式存在，当使用LAM治疗后，突变株便可成为主要病毒侏。

LAM耐药的分子机制目前推断可能是rtM204位点参与形成了LAM与聚合酶的结合部位，rtM204位点发生突变后主要产生了两方面影响：(1)使dNTP结合位点甲基化，从而产生空间位阻降低了LAM与dNTP底物的亲和力；(2)降低使LAM三磷酸根结合到正在复制的病毒DNA的催化活性，这些原导因致rtM204位点突变株的复制力减低，且与LAM的结合力低于野生侏，从而降低了LAM的抗病毒作用。

2.恩曲他滨（FTC）

FTC属低耐药基因屏障药物，在临床应用中应密切关注其耐药情况。体内与体外研究均表明FTC耐药位点与LAM相同，即rtM204V/I ± rtL180 M变异，FTC治疗1年的基因型耐药发生率为13%～16%，但缺乏长期的耐药数据。

在开始FTC治疗前应充分评估患者的治疗指征，详细了解患者既往治疗史。免疫耐受期的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者除非需接受免疫抑制剂治疗等特殊情况，一般不建议进行抗病毒治疗。首次出现ALT升高的CHB患者，应分析其可能的诱因，慎重开始抗病毒治疗。FTC治疗期间应督促患者规范服药、定期随访，尽可能提高患者依从性。如随访发现患者病毒学应答不佳或出现病毒学突破，应及时明确患者是否存在依从性问题。排除依从性问题后，应及时进行HBV基因型耐药检测以明确FTC耐药情况，相应调整治疗方案。

目前对于FTC耐药挽救治疗证据尚不充分。参照LAM耐药挽救治疗情况，可考虑加用ADV或TDF抗病毒治疗，亦可考虑换用TDF抗病毒治疗。

3.阿德福韦酯(ADV)

ADV属于无环嘌呤类核苷酸类似物。与LAM相比，在使用ADV初次治疗时，1～5年基因耐药变异的概率分别为0％、3％、6％、18％、29％，耐药发生的时间和机率都远低于LAM。然而，在已产生了LAM耐药的患者中，单独改用ADV治疗1年和2年，基因耐药变异率分别升高为6.4％和25.4％，ADV联合LAM治疗可降低耐药突变发生率，对于产生LAM耐药的患者，加用ADV为首选。

与LAM单点突变不同，ADV相关的耐药突变多为多点突变，目前得到学界公认的主要耐药位点有rtA181T、rtA181V和rtN236T，组合方式主要有四种：(1)rtA181V；(2)rtN236T；(3)rtAl81V+rtN236T；(4)rtA181T+rtN236T。另外rtA181T突变也在长期使用LAM患者的HBV基因中检测到，但是，该突变并未合并rtM204I／V的突变。有认为这是因为rtAl81V／T突变能改变rtM204密码子的位置，导致一个间接的催化位点空间位阻，从而使LAM的敏感性下降。有进一步研究表明A181V／T突变株对LAM、LdT和ETV的敏感性都下降，但对TDF仍然敏感。4.恩替卡韦(ETV)

ETV是一种脱氧嘌呤核苷酸类似物，ETV对初治患者很少发生耐药，1-5年的累积耐药发生率分别为0.2％、0.5％、1.2％、1.2％与1.2％。但对原有LAM耐药的患者，改用ETV，治疗1-5年后的临床耐药率分别为6％～7％、15％～16％、36％、46％和51％。因此，ETV在LAM失效患者中的耐药发生率明显增加，产生LAM耐药的患者不推荐首选ETV。这是因为ETV的耐药变异需要在rtM204+rtL180位突变的基础上，再联合rtT184、rtS202、rtM250和rtI169位点上一个或多个的氨基酸突变。

其耐药变异主要有两种模式：(1)rtM250v+rtIl69T+M204v+L18OM；(2)rtT184G+rtS202I+rtM204V+rtL180M。有体外试验证实，rtM250位点突变可引起ETV的敏感性下降，单独rtI169位点的突变对ETV只低度耐药，但rtI169联合rtM250位点突变则可阻止DNA链延伸，从而降低ETV敏感性；rtT184和rtS202位点的突变可以改变YMDD附近的核苷酸聚合酶结合袋的几何构像，影响C区的两个催化性天门冬氨酸残基的编码，从而导致对药物的敏感性下降。ETV需多个位点的突变才能出现耐药，表明它的高基因屏障。由于ETV抗病毒治疗的有效性及低耐药性，被推荐为乙肝肝硬化失代偿期的一线用药。

5.替比夫定(LdT)

LdT与LAM同属于L-构型核苷，与LAM耐药基序相似，都发生在YMDD区，但其耐药发生率低于LAM，对初治患者的第l与第2年累积耐药发生率分别为4％与22％。而且LdT出现的耐药突变位点仅有rtM204I，尚未发现rtM204V变异。原因尚不清楚，有研究认为可能与其抗病毒复制的高效能有关。也有文献报道LdT相关的耐药突变还可发生在rtL80、rtL180、rtL181、rtL229等位点，其意义还有待进一步明确。

6.替诺福韦(TDF)

TDF是一种新型核苷酸类逆转录酶抑制剂，国外已批准该药用于治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)和成人的慢性乙型肝炎。在Ⅲ期临床实验中，替诺福韦治疗2年以上还未被证实有基因型耐药发生，但是此临床实验在治疗72周时对血清仍能检测到病毒者都增加使用了恩曲他滨，所以不能确定72周后单一使用替诺福韦治疗的耐药发生率。有报道称rtA194T变异与TDF耐药相关，能够改变DNA模板与dNTP底物的结合位点，从而影响DNA合成。体外实验发现，rtA181／T或rtN236T突变的ADV耐药株对TDF的敏感性下降34倍；若此位点与rtL180M+rtM204V联合出现，则能增加TDF半数抑制浓度10倍以上。

乙型肝炎病毒耐药基因检测的临床意义

（1）在初始治疗前检测，有助于判断是否感染耐药突变株，可以帮助选择初治药物；

（2）在治疗过程中检测，有助于及时发现基因型耐药，从而采取预防措施，避免发生病毒反弹；

（3）耐药发生后检测，可根据耐药情况及时换药加药或更改治疗方案，使患者获得更好的治疗效果。

我们可以提供的乙型肝炎病毒耐药基因和分型检测项目有哪些？

1.2.检测血液中乙肝病毒的DNA浓度（被称为乙肝病毒载量）。这项检测用于监测乙肝病毒在体内复制水平，从而衡量病人的受感染情况以及监测治疗情况。

检测乙型肝炎病毒耐药基因，与六种用于乙肝抗病毒治疗的核苷（酸）类药物相关的11个耐药位点的基因变异情况。

3.检测乙型肝炎病毒A、B、C、D、E、F、G、H八种基因型。

HBV耐药检测建议

    在使用核苷（类）药物治疗前，先做一次耐药检测，以确定用药种类 在治疗的最初两年，对于轻微肝病患者，推荐每6个月检测一次 两年后建议每3个月检测一次，因为这个时候耐药出现的可能性更高

对病情较重的患者来说，耐药的后果会迅速表现出来，并可能威胁生命，因此建议每3个月检测一次

检测的技术

1.即时定量PCR检测： 用于检测血液中乙肝病毒的DNA水平。

可以使用的试剂盒：GeneProof Hepatitis B Virus(HBV)PCR Kit

2.HBV基因分型检测

采用测序法，对HBV基因S区进行扩增及测序，获得病毒的型别信息。

3.HBV耐药基因检测

秋季谨防小儿病毒性脑炎 篇3

病毒性脑炎是小儿神经内科常见多发病，主要发生于夏秋季，约70%发生于6-11月。病毒性脑炎是由各种病毒引起的一组以精神和意识障碍为突出表现的中枢神经系统感染性疾病。引起脑炎的病毒有百余种，常见有乙型脑炎病毒、腮腺炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、肠道病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、流感病毒和巨细胞病毒等。病毒性脑炎的传播途径多样，可通过粪口传播、呼吸道传播、密切接触传播和虫媒传播等。

各种病毒引起病毒性脑炎的临床表现差异较大，病情轻重不等，轻者可自行缓解，危重者呈急进性过程，可导致死亡及后遗症。典型的病毒性脑炎早期大多表现为上呼吸道或消化道的症状，病情进展则表现为神经精神症状，如意识障碍（对外界反应淡漠、迟钝、嗜睡、烦躁、谵妄和昏迷等），颅内压增高（头晕、头痛、呕吐，甚至出现脑疝），抽搐，运动功能障碍（一侧或单肢的瘫痪、舞蹈样动作、肌强直、面瘫、斜视或吞咽障碍）等。

小儿病毒性脑炎的早期症状与感冒差不多，患儿高热不退，经常是体温高达39℃持续4小时以上，而且反复用退热药效果很差。同时，患儿出现精神行为异常，如烦躁、哭闹不安、精神萎靡淡漠、嗜睡，尤其是热退后精神仍差；食欲差，频繁呕吐、头痛；小婴儿拒奶、不吃、不哭、不动，或伴有前囟¨隆起。突出的表现是惊厥、震颤、肢体抖动、走路不稳。家长如果忽视这些表现，通常会延误诊断和治疗时间，甚至造成难以弥补的后果。

病毒性脑炎的关键在于预防。家长要按要求给孩子接种针对各种病毒的疫苗（麻疹、流行性腮腺炎、风疹、乙脑疫苗等），这是预防病毒性脑炎的根本途径。要养成良好的生活习惯，饭前便后要洗手，勤开窗通气，保持室内空气新鲜，均衡饮食，不吃生冷、变质的食物，远离猫、狗等小动物，锻炼身体，增强机体抵抗力。要注意做好环境卫生，减少病毒滋生，如防蚊灭蚊、农村厕所改造、粪便和垃圾清理等。在疾病流行季节，尽可能少去人员密集的场所，适当增加户外活动。必要时对空气、水、日常用品、厕所、垃圾等开展消毒工作，减少病毒传播机会。

乙型脑炎病毒 篇4

笔者从采自陕西的猪脑组织样品中分离、鉴定出新的JEV毒株,命名为SXBJ07株,并对其生物学和分子特征进行了分析和研究[2]。本试验采用RT-PCR法扩增SXBJ07株的E基因,将其插入连接载体筛选出重组质粒,并在大肠杆菌系统中进行表达和纯化,旨在获得纯度较高的E蛋白抗原,并对其抗原性和免疫原性进行初步评价,利用纯化得到重组蛋白,建立JEV E的酶联免疫吸附试验法(ELISA法),以期为JEV血清抗体的检测、免疫接种日期的预测以及疫苗接种后人群免疫状态的评价等提供有力的工具。

1 材料

1.1 质粒和载体

JEV SXBJ株全长cDNA质粒,西北农林科技大学预防兽医学实验室构建并保存;pGEM-T、pET32α载体,购自Promega公司。

1.2 主要工具酶与试剂

TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶和限制性内切酶BamHⅠ、NotⅠ,均购自Promega公司;DNA回收试剂盒,购自Q-BIO gene公司;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),购自Sigma公司;B-PER®Reagent 试剂盒,购自Pierce公司;鼠抗乙型脑炎单克隆抗体,购自第四军医大学微生物研究室;荧光素标记羊抗鼠抗体(FITC-IgG),Sigma公司产品。其他化学试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 引物的设计与合成

根据JEVE基因序列,利用DNAStar分析软件设计了1对引物(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成),分别在5′端和3′端引入BamHⅠ和NotⅠ酶切位点(下画线部分),序列为上游引物E-P1 5′-GCGGATCCATGGGGAATCGGGATTTCATA-3′(994～1 014 bp);下游引物E-P2 5′-GCGCGGCCGCGGCATGCACATTGGTCGCTA-3′(2 459～2 478 bp),扩增出的E片段长度为1 500 bp。

2.2 目的基因的扩增和回收

以JEV全长cDNA质粒(0.5 μL)为模板,加入10×PCR缓冲液5 μL,dNTP(25 mmol/ μL)4 μL,E-P1和E-P2(50 pmol/μL)各1 μL,灭菌双蒸水38 μL,98 ℃变性4 min,加入Taq DNA聚合酶(5 U/mL)0.5 μL,反应总体积50 μL;然后94 ℃变性40 s,58 ℃退火30 s,72 ℃ 延伸2 min,共35个循环;最后72 ℃延伸10 min。取上述PCR产物5 μL于10 g/L TAE琼脂糖凝胶中电泳,经紫外凝胶成像系统鉴定、拍照。然后切取目的条带,用DNA回收试剂盒回收,-20 ℃保存,备用。

2.3 目的基因的克隆与鉴定

将回收的PCR 产物与pGEM-T载体进行连接,16 ℃连接12 h,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,构建重组质粒pGEM-T-E,蓝白斑筛选阳性克隆,加入LB液体培养基摇床培养12～15 h,提取质粒,分别用BamHⅠ、NotⅠ进行双酶切鉴定,取酶切鉴定正确的质粒进行序列测定。

2.4 原核重组表达载体的构建与鉴定

纯化、回收重组质粒pGEM-T-E酶切的目的片段,将原核表达载体pET32α用BamHⅠ、NotⅠ酶切;取回收的E基因片段和酶切的表达质粒用T4 DNA连接酶连接,再转化感受态细胞,涂布于含氨苄西林钠的LB琼脂平板,12～24 h后用碱裂解法小量提取质粒,利用PCR、限制性内切酶酶切鉴定出阳性质粒,送上海生工生物工程技术服务有限公司测序,以确定E基因插入的位置、大小和读码框是否正确,将含正确插入目的基因的原核表达质粒命名为pET32α-E。

2.5 JEV E基因在BL21中的诱导表达

含正确插入目的基因的原核表达质粒pET32α-E再次转化感受态细胞BL21,挑取单个的含pET-32α-E的转化菌于3 mL含100 μg/mL氨苄西林钠的LB培养基中,于37 ℃振荡培养过夜后以1%的比例接种于50 mL的2×YT培养基中,在37 ℃摇床中以220 r/min振荡培养至OD600值达到0.6～1.0,加入IPTG至终浓度为1 mmol/L,继续培养,并每隔1 h收菌1次。对不同的阳性克隆分别进行诱导表达,筛选出表达量高的克隆,同时收集未诱导的菌液和诱导含空载体pET32α的受体菌作为阴性对照,进行SDS-PAGE电泳,并以 1∶100倍稀释的鼠抗乙型脑炎阳性血清和1∶5 000倍稀释的荧光素标记羊抗鼠抗体(FITC-IgG)酶标二抗做Western-blot检测。

3 结果

3.1 JEV SXBJ07株E基因PCR扩增结果

以2对特异性引物对JEV SXBJ07株E基因进行PCR扩增,扩增出的片段和预期大小相符(1 500 bp),琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

M.DL-2 000 Marker;1.E基因扩增产物。

3.2 重组原核表达载体pET32α-E的鉴定结果

对重组原核表达质粒进行PCR扩增,扩增出与E基因大小相符的片段;酶切鉴定结果表明,酶切出与预期片段大小相符的片段(见图2和图3)。阳性重组质粒测序结果证明插入的目的基因全长为1 500 bp,共编码500个氨基酸,与JEV SXBJ07株E基因的序列完全一致。

1.E-pET32α 质粒 PCR产物;M.DL-2 000 Marker。

M.DL-2 000 Marker;1.E-pET32α质粒酶切鉴定; 2.原核表达载体pET32α。

3.3 表达蛋白的SDS-PAGE和Western-blot检测结果(见图4和图5)

M.蛋白质分子质量标准;1.IPTG诱导前的E-pET32α转化BL21; 2～4.IPTG诱导后2,3,4 h的E-pET32α转化BL21。

M.蛋白质分子质量标准;1.IPTG诱导后4 h的E-pET32α转 化的BL21;2.IPTG诱导前E-pET32α转化的BL21。

SDS-PAGE检测结果表明,诱导后与诱导前比较,在66～43 ku之间新增1条染色较深的蛋白带,其分子质量大小与理论值相符,表明E 蛋白已被成功诱导表达。Western-blot检测结果表明,在约53 ku处有1条杂交带出现,说明原核系统表达的E蛋白可以与猪乙脑阳性血清抗体特异性结合。

4 讨论

JEV的基因组为单股正链RNA,全长约为11 kb,编码3种结构蛋白和4种非结构蛋白,其中囊膜蛋白(E蛋白)是病毒颗粒表面最重要的成分,是决定乙型脑炎病毒毒力的主要区域,由它形成的表面抗原决定簇具有血凝活性和中和活性,能与血凝抑制抗体结合,刺激机体产生中和抗体,保护机体免受病毒攻击[3]。在乙型脑炎实验室诊断中,血清学抗体检查是最常用的方法,其中乳胶凝集试验(LAT)、补体结合试验(CT)、血凝抑制试验(HI)、中和试验(NT)等方法费时、费力,且会出现一定的假阳性结果,不能达到早期诊断的目的。而酶联免疫吸附法(ELISA法)具有较高的灵敏性和特异性,可望用于JEV早期抗体的快速检测[4]。

以往的研究表明,JEV E蛋白的E304与E335位点上由2个半胱氨酸所形成的二硫键是抗原抗体结合的必要结构[5]。SXBJ07株在E304和E335这2个位点的半胱氨酸都未发生变异,但它们存在E138位由谷氨酸到赖氨酸的变异,而且从乳鼠的毒性试验以及细胞致病性试验来看,SXBJ07株具有较强的毒力。SXBJ07株的基因组全序列分子特征分析结果表明,该毒株属于基因Ⅰ型,与我国现行的减毒活疫苗株SA14-14-2株E蛋白的3个活性结构域中有13个氨基酸的差异,但两者氨基酸的同源性为97.0%,提示使用乙型脑炎灭活疫苗在理论上可以覆盖包括SXBJ07株在内的毒株,但免疫减毒疫苗后对Ⅰ型乙型脑炎病毒的保护力和抗体水平还有待于更深入的探讨[2]。

因此,研究JEV SXBJ07株E蛋白的免疫反应性,研制血清学诊断试剂盒便十分必要,而其中获得纯度较高的E蛋白抗原是建立ELISA检测方法的基础。试验利用RT-PCR技术以病毒RNA为模板进行JEV SXBJ07株的E 蛋白基因片段扩增,将其克隆至原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达,所表达的E 蛋白经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,提示表达的蛋白具有免疫反应性,可作为一种有效的诊断抗原,为下一步研制血清学诊断试剂盒提供了材料。

试验采用原核表达载体pET32α以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达JEV E蛋白。融合蛋白不易被细菌蛋白酶破坏,同时采用融合表达方式具有易纯化、可大量生产的优点,且外源氨基酸序列与载体蛋白的融合常使该产物较天然蛋白更稳定。另外,采用原核细胞系统进行表达,在不同诱导条件下目的蛋白的表达量差异性较大,为尽可能获得高效表达,下一步还需对诱导物浓度、诱导时间、诱导温度等条件进行选择性优化。

参考文献

[1]张丹,金扩世,金宁一,等.乙型脑炎病毒分子生物学特性及检测方法研究进展[J].中国动物检疫,2009,26(12):70-72.

[2]王韦华,张旭,张彦明,等.乙型脑炎病毒SXBJ07株的分离鉴定及分子特征[J].西北农林科技大学学报:自然科学版,2009,37(4):1-6.

[3]REY F A,HEINZ F X,MANDL C W,et al.The envelope glycopro-tein from tick-borne encephalitis virus at 2resolution[J].Na-ture,1995,375:291-298.

[4]TIROUMOUROUGANE S V,RAGHAVA P,SRINIVASAN S.Japa-nese viral encephalitis[J].Postgrad Med J,2002,78:205-215.

乙型脑炎病毒 篇5

样本要求

1.适用标本类型：血清或血浆 2.标本采集

1）血清：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温放置30—60min，血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500 rpm离心5分钟，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管

2）血浆：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入含EDTA-2K或枸橼酸钠的玻璃管，立即颠倒玻璃管混合5—10次，使抗凝剂和静脉血充分混匀，5—10分钟后即可分离血浆，转移至1.5 ml灭菌离心管

3.标本保存与运送：所采集的标本可立即用于测试，也可以保存在—20℃待测，保存期为6个月，标本运送采用0℃冰壶。检验方法

1.DNA提取（样品制备区）

将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV 强阳性质控品、HBV临界阳性质控品进行同步处理。1）取200μl样品，加入450μlDNA提取液I和4μl的内标溶液，用振荡器剧烈混匀15秒，瞬时离心数秒。100℃恒温处理10±1分钟 2）12000rpm离心5分钟，备用 2.PCR试剂准备（试剂准备区）直接使用HBV-PCR反应管 3.加样（样品制备区）

往上述HBV反应管中用带滤芯吸嘴分别加入待测样本、阴性质控品、HBV 强阳性质控品、HBV临界阳性质控品和阳性定量参考品的上清液各20μl。盖紧管盖，8000rpm离心数秒后转移至扩增检测区。

4.PCR扩增（扩增和产物分析区）5.结果分析

反应结束后自动保存结果，根据分析后的图像调节baseline值得Start值、End值以及Threshold值，点击Analysis自动获取分析结果，在Repoet界面查看结果，记录未知样本数值（C）6.质量控制

(1)阴性质控品：FAM通道无对数增长期或Ct值等于30，VIC检测通道扩增曲线为明显对数增长期

乙型脑炎病毒 篇6

目前，对于慢性病毒性乙型肝炎/肝硬化的疗抗病毒治疗得到了学术界的广泛认可和一致贊同，在临床实践中也被广泛临床应用。但作为临床一线肝病科医生，究竟是采用优化抗病毒治疗还是联合抗病毒治疗，由于缺乏前瞻性研究及循证医学证据，目前学术界缺乏权威的一致意见。作为一线肝病科医生，曾一致专注于抗病毒治疗的进展，对此曾作了深刻的思考，结合学术发展动态，现归纳总结如下。

优化抗病毒治疗是临床实践中一直沿续至今的临床抗病毒方法和策略。1996年以来随着国内第一支干扰素广泛临床应用，为我国大量的慢性乙型肝炎患者得到了标准化规范化的治疗，取得了长期满意稳定的治疗效果，取得了里程碑式的作用，为后期的抗病毒治疗提供了大量的循证医学证据和临床数据，为抗病毒治疗打下了良好的思想基础。部分患者经过规范治疗取得长期满意稳定的治疗效果；但是大量的患者不能获得免疫应答或仅部分免疫应答，部分患者由于不能耐受干扰素不良反应，有些患者在治疗过程中产生干扰素抗体，限制了干扰素的广泛临床应用。同时，在艾滋病的临床应用方面，产生了第1代核苷类抗病毒药物拉米夫定，对抑制病毒复制取得了突破性进展，对抑制乙型肝炎病毒复制同样有较好的临床效果，2002年开始广泛应用临床，开创了口服药物抑制乙型肝炎病毒复的时代，为我们现在抗病毒起到了第二个里程碑似的作用。大量患者通过口服核苷类抗病毒药物抑制乙型肝炎病毒复制，持续维持肝脏生化学指标正常，病情明显改善。为大量患者看到了希望和曙光。众多干扰素治疗失败或干扰素禁忌证患者经过口服核苷类抗病毒药物抑制乙型肝炎病毒复制，持续维持肝脏生化学指标正常，同时，核苷类抗病毒药物由于不能停药，其缺点逐渐显现出来，个体在治疗过和中逐渐出现大量耐药病例，部分患者治疗过程中无应答或部分应答，在临床应用方面受到了局限。2005年，第2代核苷类抗病毒药物阿德福韦酯在国内开始上市并开始应用临床应用，为众多拉米夫定耐药患者及治疗过程中无应答或部分应答提供了更多可选择的机会，此时干扰素的抗病毒治疗渐渐地淡出临床应用方面，口服抗病毒药物由于给药方便，便于携带，临床应用更广泛，且适用于广大肝硬化的患者，为众多患者接受和认可，同样，在治疗过程治疗过程中无应答或部分应答及临床应用过程出现耐药病毒学突破情况亦显现出来。2007年以来，恩替卡韦替比夫定替诺福韦相继在国内上市，且逐渐应用临床，为众多阿德福韦酯治疗过程治疗过程中无应答或部分应答及临床应用过程出现耐药患者更多可选择的机会，为我们治疗乙型肝炎及肝硬化提供了大量的药物保证。联合抗病毒广泛临床应用于广大乙肝患者，取得了令人满意的治疗效果。开启了联合抗病毒新时代。达到了令人鼓舞的治疗效果，为广大的临床医生所推崇。

作为临床一线的医生，结合近20年抗病毒治疗过程及抗病毒治疗疗效观察：大量的慢性乙型肝炎患者在以干扰素为主体早期单药优化抗病毒治疗仍然取得了长期稳定的治疗效果，且疗程较短，疗效确切稳定。虽然有部分患者出现不能获得免疫应答或仅部分免疫应答，大部分患者抗病毒治疗过程中生化学应答正常，达到了临床治疗目的。且为我们担供了大量的循证医学证据和临床数据。伴随时代的进步，多种口服核苷类抗病毒药物相继投入临床，乙型肝炎病毒在个体体内正在选择性复制，联合抗病毒治疗近3年来开始了广泛临床应用，且得到了学术界的一致推崇和认可。由于缺乏历史经验的总结和循证医学证据，联合抗病毒治疗是否该成为我们早期抗病毒治疗的首选是当今要面对的问题。

在比较2005年《慢性乙型肝炎防治指南》及2010年《慢性乙型肝炎防治指南》中关于联合抗病毒治疗描述时分别表述如下：2010年《慢性乙型肝炎防治指南》。谨慎选择核苷（酸）类药物：如条件允许，开始治疗时宜选用抗病毒作用强和耐药发生率低的药。治疗中密切监测、及时联合治疗：定期检测HBV　DNA，以及时发现原发性无应答或病毒学突破。对合并HIV感染、肝硬化及高病毒载量等早期应答不佳者，宜尽早采用无交叉耐药位点的核苷（酸）类药物联合治疗一旦发现耐药，尽早给予救援治疗；对于接受拉米夫定治疗的患者，一旦检出基因型耐药或HBV-DNA开始升高时就加用阿德福韦酯联合治疗，抑制病毒更快、耐药发生较少、临床结局较好。关于其他药物耐药患者的治疗临床研究相对较少，有关的治疗推荐意见主要根据体外研究结果。对于替比夫定、恩替卡韦发生耐药者，亦可加用阿德福韦酯联合治疗。对于阿德福韦酯耐药者，可加拉米夫定、替比夫定联合治疗；对于未应用过其他核苷类似物者，亦可换用恩替卡韦。对于核苷（酸）类发生耐药者，亦可考虑改用或加用干扰素类联合治疗，但应避免替比夫定和PEG-IFN联合应用，因为可导致外周神经肌肉疾病。尽量避免单药优化治疗。有临床研究显示，因对某一核苷（酸）类发生耐药而先后改用其他苷（酸）类药物治疗，可筛选出对多种苷（酸）类耐药的变异株。因此，应避免单药优化治疗。2005年《慢性乙型肝炎防治指南》：不推荐干扰素联合拉米夫定治疗HBeAg阳性或阴性慢性乙型肝炎。对IFN　α、拉米夫定优化治疗的效果尚需进一步研究。不推荐拉米夫定联合阿德福韦酯用于初治或未发生拉米夫定耐药突变的慢性乙型肝炎患者。干扰素或拉米夫定与其他药物（包括中草药）联合治疗慢性乙型肝炎的疗效也需进一步证实。比较以上两版本，不难发现，2010年版本更加强调两种抗病毒药物联合抗病毒治疗会取得更加满意的临床效果，并逐渐为临床一线的医生推崇。2005年版本强调单药优化抗病毒治疗，也是抗病毒的基础。单药优化抗病毒治疗治疗效果不满意时再考虑联合抗病毒治疗。联合抗病毒治疗应是单药优化抗病毒治疗无效时更好的补救措施并非首选。

笔者欣喜地看到联合抗病毒治疗取得临床效果的同时，也同时再思考：联合抗病毒治疗的治疗终点在哪里，年龄较小的慢性乙型肝炎是否适合，是否会产生多重耐药病毒的出现，联合抗病毒治疗是否该成为我们早期抗病毒治疗的首选，联合抗病毒治疗是否该取代单药优化抗病毒，联合抗病毒治疗是否一定会取得比单药优化抗病毒更好的治疗效果，是否会为后期耐药病毒治疗带来更大的治疗难度，优化抗病毒治疗是否该成为我们早期抗病毒治疗的首选，联合抗病毒治疗是否比单一优化抗病毒治疗好。

乙型脑炎病毒 篇7

1 对象与方法

1.1 调查对象

本组241例乙型肝炎患者均为本社区内2007～2008年在中国疾病预防控制系统中报告的人员。诊断符合2000年中华医学会传染病与寄生虫病学分会肝病学分会联合修订的《病毒性肝炎防治方案》中的病毒性肝炎诊断, 并经临床及实验室检查多方面排除甲、丙、丁、戊型肝炎、药物性肝炎及自身免疫性肝炎[2]。

1.2 方法

利用对社区内新农合健康体检的机会, 随机抽取本社区内2007～2008年在中国疾病预防控制系统中报告的241例乙肝患者家庭为对象和从社区户籍管理档案中随机抽取260例未发生HBV阳性报告的家庭为参照对象。对筛选中的家庭所有成员进行以检测HBsAg为主要目的的活动。对HBV阳性的患者病情做到选择性的保密, 同时对其进行健康教育宣传, 鼓励患者树立正确的“疾病观”。以平常的心态防病治病, 乐观的心情对待生活。

1.3 统计学处理

采用SAS 10.0统计软件对调查资料与没有发生HBV感染报告的家庭进行HBV检出率差异比较进行χ2检验, 均以P>0.05为差异有统计学意义。

2 结果 (表1)

3 讨论

乙肝的传染源是患者和病毒携带者, 尤其是血液中表面抗原及乙肝病毒DNA阳性, HBV-DNA载量较高者其传染性最强。乙肝的传播途径[2～3]: (1) 母婴垂直性传播; (2) 血源性 (或医源性) 传播; (3) 接触性传播。本组数据显示:乙肝患者的家庭成员感染HBV的几率明显高于未发生HBV感染报告的家庭, 209个家庭, 平均每个家庭中有2.24个HBV感染者。尤其是母亲HBV阳性的家庭感染HBV的患者数据明显较多。说明乙肝病毒通过母婴垂直性传播危险因素占很大的比例。所以应加强对这一人群的宣教和防控。我国2006年3月1日施行对新生儿强制免疫, 对控制乙肝起到划时代的积极意义, 其目的不只是预防个体发病, 更重要的是预防和减少人群慢性携带病毒状态, 从而达到减少或控制乙肝传染源。目前对输入性传播、接触性传播控制能力和水准很难掌握和平衡。血液制品的管理国家做得非常严格, 无论是采集、保存、检验还是运输都做到层层把关, 严肃认真。而随着我国的经济发展、对外贸易的频繁, 一些人的思想、意识、形态受到西方社会不良风气的影响, 出现道德败坏、生活糜烂、吸毒等丑恶现象。这一类人群是乙型感染的传播、被传播的高危人群。所以对这些人群的宣教至关重要。

对于家庭内有乙肝患者防控措施应做到: (1) 生活用品和餐具尽量分开, 并做好定期消杀工作。 (2) 避免接触乙肝患者及病毒携带者的脓、血、分泌物;女性患者月经期应该妥善处理卫生用品, 内裤应定期消毒[3]。 (3) 对乙肝患者家庭其他成员应全程接种乙肝疫苗。并定期复查是否产生抗体, 抉择是否进一步继续加强。如果母亲是HBsAg阳性的应在新生儿出生12h内接种乙肝疫苗。 (4) 关心乙肝患者的饮食起居, 同时要做好心理护理, 让患者拥有一个积极向上、乐观的生活态度去面对自身疾病。科学防治, 不病急乱投医, 盲目服药或擅自停药。 (5) 外出务工的人员要洁身自好, 树立正确的人生观, 价值观。关爱自己, 关爱家庭。

摘要：目的 了解乙型肝炎患者家庭内乙型肝炎病毒感染状况, 为乙型肝炎患者及家属提供切实有效的健康教育和防范措施。方法 通过对241例乙型肝炎患者的家庭所有成员进行健康体检, 开展主要以筛选HBV感染率的活动。结果 241例患者, 209个家庭, 感染HBV者有468例, 平均每个家庭中有2.24HBV感染者。结论 重视乙型肝炎患者及家属的健康教育工作, 做好有效的防控措施, 把子级病例的发生率降到最低。

关键词：乙型肝炎患者,家庭,感染状况调查

参考文献

[1]刘敏华.家属健康教育对慢性乙型肝炎患者生存质量的影响[J].中国厂矿医学, 2009, 22 (6) :737～738.

[2]周惠霞, 曹丽萍.乙型肝炎患者家庭内乙型肝炎病毒感染状况调查[J].现代医药卫生, 2008, 24 (24) :3791.

乙型脑炎病毒 篇8

1 材料与方法

1.1 毒株和血清

JEV SA14-14-2毒株及其阳性血清, 哈尔滨兽医研究所步志高研究员惠赠;H3N8亚型马流感病毒 (EIV) 阳性血清、马动脉炎病毒 (EAV) 阳性血清、马鼻肺炎病毒 (EHV) 阳性血清, 哈尔滨兽医研究所马病研究组保存。

1.2 载体和菌株

克隆载体pMD18-T, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;表达载体pET28a (+) , 哈尔滨兽医研究所马病研究组保存;DH5α、Rosetta (DE3) 感受态细胞, 购自哈尔滨赛拓生物技术有限公司。

1.3 主要试剂

RNA提取试剂盒、 胶回收 (小量) 试剂盒, 购自上海华舜生物工程有限公司;质粒提取试剂盒, 购自OMEGA公司;DL-15 000、DL-2 000 Marker、低分子质量蛋白质标准、限制性内切酶 (EcoRⅠ、HindⅢ) 、Ex Taq 酶、dNTP mixture、T4 DNA连接酶、M-MLV、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG) 、氨苄西林、卡那霉素 (kan) , 均购自宝生物工程 (大连) 有限公司;兔抗马IgG辣根过氧化物酶 (HRP) 标记二抗、邻苯二胺 (OPD) , 购自Sigma公司;Western-blot超敏发光液, 购自北京普利莱基因技术有限公司。

1.4 引物的设计

根据NCBI上发表的JEV SA14-14-2毒株NS1基因序列 (登录号为AF315119.1) 设计1对引物, 序列为5′-GAATTCGACACTGGATGTGCCATTGAC-3′ (下划线部分为EcoRⅠ酶切位点) , 5′-AAGCTTTTAAGCAGCGACTAGCACCACATACCT-3′ (下划线部分为HindⅢ酶切位点, 加粗部分为终止子) 。以上引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。预计扩增产物大小为1 245 bp。

1.5 PCR扩增

以病毒RNA为模板反转录成cDNA, 以cDNA为模板扩增NS1基因片段。PCR反应条件:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性 30 s , 54 ℃ 退火30 s, 72 ℃ 延伸90 s, 共30个循环;72 ℃延伸10 min。取PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定, 用胶回 (小量) 收试剂盒回收。

1.6 PCR产物的克隆与鉴定

将PCR产物与克隆测序载体pMD18-T连接, 将连接产物命名为pMD-NS1, 用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定, 取鉴定结果为阳性的克隆送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.7 重组表达载体的构建与鉴定

表达载体pET28a (+) 和pMD-NS1载体分别用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切并鉴定、回收, 将酶切获得的pET28a (+) 片段和NS1片段用T4 DNA连接酶连接, 将连接产物命名为pET28a-NS1, 并转化至DH5α感受态细胞。用质粒提取试剂盒提取重组质粒pET28a-NS1, 取双酶切鉴定结果为阳性的克隆送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.8 重组NS1蛋白的表达与纯化

1.8.1 重组蛋白的表达

将测序结果完全正确的pET28a-NS1质粒和空载体pET28a (+) 分别转化于Rosetta (DE3) 感受态细胞, 将50 μL菌液涂布于含Kan (50 μg/mL) 的LB平板上, 置37 ℃温箱中培养过夜;挑取单菌落, 接种于5 mL含Kan (50 μg/mL) 的LB液体培养基中, 于37 ℃恒温培养箱振荡培养过夜;取过夜培养物按1︰100的比例接种于50 mL含Kan (50 μg/mL) 的LB液体培养基中, 于37 ℃恒温培养箱中振荡培养至OD600值约为0.6时, 加IPTG至终浓度为0.4 mmol/mL, 37 ℃继续振荡培养6 h;12 000 r/min离心10 min, 收集沉淀, 用5 mL PBS重悬, 超声破碎, 4 ℃、12 000 r/min离心10 min;收集沉淀与上清液, 4 ℃保存, 备用。

按常规方法进行SDS-PAGE电泳 (分离胶浓度为12%, 浓缩胶浓度为8%) , 依次加入未经IPTG诱导的pET28a-NS1菌液、经IPTG诱导的空载体pET 28a (+) 、pET28a-NS1菌液、超声破碎后的沉淀和上清液, 上样量为20 μL, 120 V电泳 150 min。电泳结束后, 用考马斯亮蓝染色液染色2 h, 然后脱色1 h, 观察结果。

1.8.2 重组NS1蛋白的纯化

将重组菌进行大量诱导表达, 用切胶纯化的方法进行纯化[3]。

1.9 重组蛋白的抗原性鉴定

1.9.1 Western-blot检测

重组菌按1.7中的方法处理后, 经SDS-PAGE电泳后电转印至NC膜 (硝酸纤维素膜) 上, 将该膜置于5%脱脂乳 (40 mL 1×TBS溶液加5 g脱脂乳粉) 中于4 ℃封闭过夜, 用TBST (含1‰Tween-20的1×TBS) 洗涤3次, 每次10 min;加1︰100稀释的马抗JEV阳性血清, 室温作用1 h;TBST洗涤3次, 每次10 min;加1︰10 000稀释的兔抗马IgG HRP标记二抗中室温作用1 h;TBST洗涤3次, 每次10 min;Western-blot超敏发光液 (A液与B液等量) 显色, 用成像仪扫描记录结果[4,5]。

1.9.2 间接ELISA

将纯化的重组蛋白以2 μg/mL包被酶标板 (每孔100 μL) , 4 ℃过夜;用PBST洗涤3次, 弃包被液, 加入5%的脱脂乳粉 (每孔200 μL) , 37 ℃封闭2 h;用PBST洗涤3次, 将待检马血清按1︰100稀释, 每个样品平行重复5次, 37 ℃作用1 h;用PBST洗涤3次, 将兔抗马IgG HRP标记二抗按1︰10 000稀释, 37 ℃作用40 min;用PBST洗涤3次, 加入含4 mg/mL OPD的显色液 (0.1 mol/L 柠檬酸溶液和0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液各5 mL) , 每孔100 μL, 避光显色15 min;加2 mol/L H2SO4溶液 (每孔50 μL) 终止反应后, 于492 nm处测定OD值。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

以提取的病毒RNA为模板进行RT-PCR, 经琼脂糖凝胶电泳检测, 得到约1 200 bp的片段 (见图1) , 与预期 (1 245 bp) 相符。

1.DL-2 000 Marker;2.目的片段的PCR产物;3.阴性对照。

2.2 扩增产物的酶切鉴定结果

将获得的重组克隆载体pMD-NS1用EcoRⅠ和HindⅢ进行酶切鉴定, 得到1 200 bp左右的片段 (见图2) , 与预期相符。

1.DL-2 000 Marker;2.pMD-NS1的EcoRⅠ和HindⅢ酶切结果。

2.3 重组表达载体的鉴定结果

将获得的重组表达载体pET28a-NS1用EcoRⅠ和HindⅢ进行酶切鉴定, 得到5 300 bp和1 200 bp左右的片段 (见图3) , 与预期相符。

1.DL-15 000 Marker;2.pET28a-NS1的EcoRⅠ和HindⅢ酶切结果

2.4 测序结果及分析

测序结果经DNAMan软件分析, 显示目的片段NS1基因未发生碱基突变, 与NCBI发表的JEV SA14-14-2毒株NS1基因的序列一致, 同源性为100%。

2.5 重组NS1蛋白SDS-PAGE电泳分析

通过对表达条件的优化, 确定在温度为37 ℃、最佳诱导时间为6 h、IPTG浓度为0.4 mmol/L时, 目的蛋白的表达量最大。菌液经超声波破碎和SDS-PAGE电泳分析, 出现1条约46 ku的蛋白条带 (见图4) , 与预期相符。

1.低分子质量蛋白质标准;2.诱导前菌液;3.空载体菌液诱导对照;4.诱导后阳性菌液;5.阳性菌液超声后的沉淀;6.阳性菌液超声后的上清液;7.纯化的NS1蛋白。

2.6 Western-blot检测结果

将纯化的NS1蛋白进行Western-blot检测分析, 结果表明, 重组NS1蛋白可与JEV阳性血清发生特异性反应, 而pET28a (+) /Rosetta (DE3) 与阳性血清不反应 (见图5) 。

1.空载体菌液对照pET28a (+) /Rosetta (DE3) ;2.JEV阳性血清;3.低分子质量蛋白质标准。

2.7 间接ELISA反应结果

间接ELISA检测结果显示, 纯化的重组蛋白能够与JEV阳性马血清发生特异性反应, 而不与EIV、EAV、EHV阳性马血清、健康马血清发生反应 (见图6) 。

1～4.JEV、EIV、EAV、EHV阳性马血清;5.健康马血清。

3 讨论

NS1是病毒的主要抗原成分之一, 具有可溶性补体结合活性, 可在不出现中和抗体的情况下诱导保护性免疫, 使动物获得免疫[6];另外, NS1是一个高度保守的糖蛋白, 其基因型和表型具有高度同源性, 其核酸序列适用7种黄病毒, 这就为NS1可能发展成为一种具有广泛作用的黄病毒亚单位疫苗提供依据[7]。本试验用pET28a (+) 原核表达载体成功大量表达JEV-NS1蛋白, 分子质量约为46 ku。Western-blot检测及间接ELISA反应结果证明, 该蛋白能够与乙脑病毒感染马血清特异性结合, 具有良好的反应原性及特异性, 为进一步研究其功能和研制血清学检测试剂提供了材料。

摘要：为了研究马乙型脑炎病毒NS1蛋白的特性, 试验采用RT-PCR方法获得SA14-14-2弱毒株的NS1基因, 将该基因克隆于pMD18-T载体后进行测序, 进而构建重组表达质粒pET28a-NS1, 并转化于Rosetta (DE3) 中, 再进行IPTG诱导和SDS-PAGE分析。结果表明:获得分子质量约为46 ku的重组蛋白, 经Western-blot和间接ELISA检测证明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。

关键词：马,乙型脑炎病毒,NS1基因,原核表达

参考文献

[1]WU S C, YU C H, LIN C W, et al.The domainⅢfragment of Japa-nese encephalitis virus envelope protein:mouse immunogenicity andliposome adjuvanticity[J].Vaccine, 2003, 21:2516-2522.

[2]俞永新, 张国铭, 郑铮.流行性乙型脑炎 (乙脑) 活疫苗和灭活疫苗对不同乙脑毒株的免疫性[J].病毒学报, 1989, 5 (2) :106-110.

[3]于在江, 马学恩, 周建华.切胶纯化表达蛋白包涵体的可行性分析[J].生物技术, 2007, 17 (3) :46-48.

[4]ANDREW F Van den HURK, SCOTT A R, JOHN S M.Ecologyand geographical expansion of Japanese encephalitis virus[J].An-nual Review of Entomology, 2009, 54:17-35.

[5]马健男, 杨涛, 王群, 等.西尼罗病毒NS1基因的原核表达与抗原性鉴定[J].中国预防兽医学报, 2009, 31 (8) :592-599.

[6]景川.乙型脑炎疫苗研究概况[J].中国病原生物学杂志, 2010, 5 (5) :375-377.

乙型脑炎病毒 篇9

NS1蛋白是乙型脑炎病毒的一种非结构蛋白。NS1蛋白抗体没有中和活性和血凝抑制活性,但它具有可溶性补体结合活性,可在不出现中和抗体的情况下诱生保护力,这种保护作用依赖于抗体的Fc片段[3]。无论是主动免疫NS1蛋白,还是被动免疫NS1蛋白的特异性抗体,均能对接受致死量的病毒攻击试验动物产生保护性免疫。因此,NS1蛋白具有使宿主产生保护性免疫而没有抗体依赖性增强感染作用[4]。据此,国外已经利用NS1蛋白进行JEV 亚单位疫苗的研制,并开展对JEV诊断和监测的研究,但国内对该蛋白的相关研究报道较少。研究构建了表达NS1 基因的重组表达质粒,表达的可溶性融合蛋白MBP-NS1具有良好的抗原性和特异性。

1 材料和方法

1.1 质粒、菌种与血清

DH5α、ER2523感受态细胞,由哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室制备并保存;含编码JEV NS1蛋白基因序列的质粒pET30-opti-JEV-NS1(未发表),由哈尔滨兽医研究所乙型脑炎研究组构建并保存;猪抗JEV阳性血清及鼠抗JEV阳性血清,由哈尔滨兽医研究所乙型脑炎研究组收集并保存。

1.2 主要试剂

pMAL融合蛋白表达与纯化试剂盒,购自NEB公司;Ex Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、限制性内切酶,购自宝生物工程(大连)有限公司;质粒DNA 小量试剂盒、胶回收(小量)试剂盒,购自上海华舜生物工程有限公司; 山羊抗鼠辣根过氧化物酶标记的IgG,购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 NS1融合蛋白重组表达质粒的构建

用BamHⅠ与XhoⅠ双酶切质粒pET30-opti-JEV-NS1,回收大小约为1 200 bp的DNA片段,同样用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切表达载体pMAL-c5X。回收后的NS1 基因与酶切处理的pMAL-c5X 载体用T4 DNA 连接酶连接并转化DH5α感受态细胞。提取重组质粒pc5X-NS1,用BamH Ⅰ与Xho Ⅰ双酶切鉴定,将阳性质粒送南京金斯瑞生物公司测序验证。

1.4 重组融合蛋白的诱导表达与SDS- PAGE分析

用经鉴定正确的阳性质粒pc5X-NS1转化ER2523感受态细胞,挑取单个菌落,接种于5 mL 含有氨苄西林(100 μg/mL )的LB 液体培养基中,37 ℃培养过夜。按照1∶100比例接种于新鲜LB 培养基中,37 ℃振荡培养至OD600值约为0.5时,加IPTG 至终浓度为0.3 mmol/L,分别于28 ℃、33 ℃、37 ℃诱导4 h,培养物离心后用1/20体积PBS重悬,超声波裂解后12 000 r/min离心分离上清液和沉淀;对上述样品进行SDS-PAGE分析;同时对pMAL-c5X空载体进行同样的操作并作为对照。

1.5 MBP- NS1纯化重组菌的诱导表达

按照pMAL 融合蛋白表达及纯化试剂盒说明书操作,利用直链淀粉树脂柱对融合表达的MBP-NS1进行纯化,测定纯化蛋白含量,冻存,备用。

1.6 重组蛋白的Western-blot分析

诱导表达的菌经SDS-PAGE电泳后进行电转印,转印后的硝酸纤维素膜用含5%脱脂奶粉的PBS封闭液于4 ℃封闭过夜;在以1∶200稀释的JEV小鼠阳性血清中室温作用1 h;用PBST(含0.5 mL/L 吐温-20的pH值为7.4的PBS)洗涤5次,再与1∶15 000稀释的红外染料标记的山羊抗鼠辣根过氧化物酶标记的IgG抗体室温作用1 h;避光条件下用PBST洗涤5次,同样在避光条件下用PBS再洗涤2次,用Odyssey扫描仪扫描。

1.7 间接ELISA 方法的建立

在酶标板上用包被液将NS1蛋白稀释成8个梯度,以每孔100 μL包被反应板并于4 ℃过夜;弃去包被液,用PBST洗涤3次,加含5%脱脂奶粉的PBS封闭液于4 ℃封闭过夜;用PBST 洗涤3次。用稀释液将猪抗JEV阳性血清及阴性血清稀释成6个梯度后分别加到酶标板中,100 μL/孔,37 ℃作用1 h;用PBST洗涤3次,用羊抗猪的二抗IgG进行1∶10 000倍稀释,100 μL/孔,37 ℃作用1 h;用PBST洗涤5次,加入TMB显色液,100 μL/孔,37 ℃避光反应20 min;加入终止液2 mol/L H2SO4,50 μL/孔,终止反应。用酶标仪测定OD450值,试验设标准阳性孔(P)、标准阴性孔(N),计算反应的P/N值,以P/N最大值作为间接ELISA最佳反应条件的判断依据。

2 结果

2.1 重组质粒pc5X- NS1的构建结果

提取重组质粒pc5X-NS1,经限制性内切酶BamHⅠ与XhoⅠ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳分析,其酶切结果与预期结果一致,可切下与回收NS1基因片段大小相同的基因片段(见图1);同时重组质粒中BamHⅠ、XhoⅠ间序列与pc2X-NS1、质粒pET30-opti-JEV-NS1中NS1编码序列完全一致。

1.NS1基因回收产物;M1.DL-2 000 Marker;M2. DL-15 000 Marker;2.重组质粒pc5X-NS1经BamHⅠ与XhoⅠ双酶切结果。

2.2 表达产物的SDS- PAGE 电泳分析结果

用重组质粒转化ER2523感受态细胞后,于28 ℃、33 ℃、37 ℃经0.3 mmol/L IPTG诱导4 h,融合蛋白MBP-NS1都得到了表达并部分以可溶形式存在的,但是以28 ℃诱导的可溶蛋白最多(见图2)。

M.低分子质量蛋白标准;1,11.28 ℃诱导后的全菌蛋白;2,12.28 ℃诱导后超声裂解上清液;3,13.28 ℃诱导物超声裂解后的沉淀;4～6.33 ℃诱导后的全菌蛋白、超声裂解上清液、超声裂解后的沉淀;7～9.37 ℃诱导后的全菌蛋白、超声裂解上清液、超声裂解后的沉淀;10.28 ℃未经诱导的pc5X-NS1。

2.3 表达产物的纯化结果

利用直链淀粉树脂柱对融合蛋白MBP-NS1进行纯化,经SDS-PAGE 分析发现得到了2 种蛋白,一种为融合蛋白MBP-NS1,另一种为标签蛋白MBP。纯化结果表明:pMAL 融合蛋白表达与纯化试剂盒说明书介绍相符(见图3)。

M.低分子质量蛋白标准;1.未经诱导的pc5X-NS1;2.28 ℃ 诱导后超声裂解上清液;3～9.纯化的蛋白。

2.4 表达产物的Western-blot检测结果

Western-blot检测结果表明,纯化的融合蛋白MBP-NS1 能够与JEV猪阳性血清反应,见图4。

M.低分子质量蛋白标准;1.纯化的表达产物;2.空载体对照。

2.5 表达产物的间接ELISA方法建立

经确定最佳抗原稀释度为1︰320(NS1蛋白含量为1.25 μg/mL);当血清稀释度为1︰00时,P/N值最大,确定血清的最佳稀释度为1︰100。同时用建立的ELISA方法对收集的猪血清进行检测,并分别对已经用商品化试剂盒检测的20份JEV阳性猪血清与20份JEV阴性猪血清进行检测,结果表明,该ELISA方法对40份猪血清样品检测结果与现有商品试剂盒检测结果一致,阳性血清OD450值均大于1.0,阴性血清OD450值均小于0.5(见157页彩图5)。

3 讨论

试验以乙型脑炎NS1基因为目的基因, PMAL-c5X为载体构建了原核重组表达系统。蛋白表达的目的蛋白多以可溶形式存在并携带 MBP 标签,易利用直链淀粉树脂柱对其进行纯化,且纯化过程中不必进行变性和复性;因此目的蛋白保持了完好的活性,显示出了良好的抗原性和特异性,为以后开展研究奠定了基础。

目前,基因工程中获得蛋白的主要途径有原核表达、真核表达和细胞表达系统,其中原核表达具有容易操作、成本低、可高效表达外源蛋白等优点而成为重组蛋白的首选。为了使NS1蛋白大量、稳定、高效表达并且获得大量可溶性蛋白,试验对表达的条件进行了优化,确定了合适的OD600值、IPTG浓度和诱导温度,保证了重组菌处于最佳工作条件。OD值低,则细菌数量太少,外源蛋白产量低;OD值高则细菌过老不利于蛋白的表达。IPTG浓度和诱导温度是确保能获得大量可溶性蛋白的关键,IPTG浓度和诱导温度过高则蛋白合成速度太快,以至于没有足够时间进行折叠,二硫键不能正确配对,过多蛋白间发生非特异性结合,蛋白质无法达到足够的溶解度形成包涵体;因此需要找到合适的IPTG浓度和诱导温度。

由于NS1蛋白是非结构蛋白,动物经灭活疫苗免疫不会产生相应的抗体,这样可以区分自然感染动物和免疫动物。鉴于NS1蛋白自身的特点,以其为抗原建立ELISA方法有着广阔的应用前景。试验应用NS1表达蛋白初步建立了JEV抗体的间接ELISA方法,可以鉴别诊断自然感染和人工免疫的猪,但在此基础上还需对敏感性和特异性进一步研究。

参考文献

[1]SOLOMON T.Control of Japanese encephalitis-within our grasp[J].N Engl J Med,2006,355(9):869-871.

[2]陈焕春.规模化养猪场疫病控制与净化[M].北京:中国农业出版社,2000:187.

[3]SCHLESINGER J J,BRANDRISS M W,CROPP C B,et al.Protec-tion against yellow fever in monkeys by immunization with Yellow fe-ver virus nonstructural protein NS1[J].J Virol,1986,60(3):1153-1155.

病毒性脑炎误诊1例分析 篇10

1 资料

患者, 男, 16岁, 间断头晕、头痛伴抽搐2年余入院。患者于2010年3月无明显诱因出现发热, 体温38℃左右, 伴恶心、呕吐、头痛, 在当地诊所抗感染治疗4d, 病情缓解, 体温正常, 但此后患者出现视力模糊、斜视, 就诊于当地医院, 未行腰椎穿刺检查, 考虑为颅内感染。给予洛西林钠舒巴坦钠及醒脑静等药物治疗, 15d后好转出院。此后患者出现言语渐减少, 言语不利, 时诉头痛、头晕, 为求进一步诊治入住北京某医院。血生化检查仅有血乳酸偏高, 为2.87mmol/L (正常值0.6mmol/L~2.4mmol/L) 。腰椎穿刺检查:脑脊液 (CSF) 压力170mmH2O (1mmH2O=0.009 8kPa) , CSF常规、生化未见异常, HSV特异性IgM、IgG抗体检测滴度在1∶80以下。头颅CT示:右侧颞叶后部、左侧顶枕部大片状低密度影。头颅磁共振成像 (MRI) 示:右侧颞枕叶、左侧顶枕部大片状长T1长T2信号;MRI增强扫描病灶未见明显强化;头颅磁共振血管造影 (MRA) 未见异常表现。质子磁共振波谱 (MRS) 提示病灶部位乳酸波谱显示比正常部位偏高。诊断线粒体脑肌病 (MELAS型) 。给予对症支持治疗, 患者症状未见明显缓解, 住院10d出院。1周后无明显诱因突然出现四肢抽搐, 持续约2min, 抽搐终止后出现右侧肢体麻木, 不能穿鞋, 无恶心、呕吐, 无大小便失禁。遂就诊于西安市某医院, 行脑脊液检查:CSF压力185 mmH2O, Cl105mmol/L, 乳酸脱氢酶 (LDH) 18U/L, 墨汁染色未找到新型隐球菌、抗酸染色未见结核杆菌。心电图未见异常。头颅MRI发现双侧枕叶、顶叶皮层区大片状不规则长T1长T2信号。腓肠肌活检未见特征性病变。给予头孢西丁抗炎、甘露醇、胞磷胆碱, 降颅压, 营养脑神经等治疗后, 病情好转。此后, 患者常有头痛发作, 但症状较轻, 语言功能仍差, 表现为不完全性感觉性失语, 生活可完全自理。2012年2月及5月分别出现癫痫大发作, 未予处理, 头颅MRI见右侧颞叶、部分顶叶脑回肿胀, 呈稍长T1长T2信号, 双侧枕叶、左侧顶叶、颞叶软化灶。于2012年8月再次出现癫痫大发作入住本院。查体:体温36.5℃, 血压110/70 mmHg (1mmHg=0.133kPa) , 内科系统查体未见异常。神经系统检查:神志清楚, 不完全性感觉性失语, 可简单回答部分问题, 重复语言较多, 查体欠合作。颅神经检查未见异常, 四肢肌力、肌张力正常, 深浅感觉检查不合作, 反射对称, 病理反射未引出, 脑膜刺激征 (-) 。过去史、个人史无特殊, 无家族遗传病史。血尿粪常规正常, 肝肾功能、电解质、血糖均正常。行腰椎穿刺检查, CSF压力220 mmH2O, CSF常规、生化未见异常, HSV特异性IgM、IgG抗体检测滴度在1∶90, CSF未找到新型隐球菌及结核杆菌。脑电图 (EEG) 显示:右侧额区、双侧颞区、双侧枕区及左侧顶区弥漫性高波幅慢波, 右侧额区、双颞区出现散在尖波、棘波及尖慢/棘慢波综合。头颅MRI可见右侧额叶、右侧颞叶及顶叶、左侧颞顶叶、双侧枕叶大片长T1长T2信号, 右侧额叶及左侧顶叶脑回肿胀。诊断“病毒性脑炎, 继发性癫痫”。入院后, 给予阿昔洛韦20 mg/ (kg·d) , 分3次静脉输注, 连用14d, 休息2d, 再给予上述剂量连用14d。卡马西平0.1g/次, 每日3次。入院初给予地塞米松10mg/d, 静脉输注, 连用5d后停药。经上述重复抗病毒治疗, 患者语言功能恢复较好, 语言理解有明显进步, 重复语言亦明显减少。出院后, 经多次复查, 患者未再有癫痫发作, 语言功能恢复尚可, EEG亦有明显改善。

2 讨论

该病例特点为:少年男性, 急性起病, 反复发热、头痛伴抽搐, 病变呈迁延性, 病程长达3年;发热、头痛半年后出现癫痫大发作;首次诊治后, 症状好转出院;发热、头痛反复发作, 症状较轻, 无进行性加重趋势;癫痫发作较易控制, 口服单药治疗即无发作;头颅MRI检查发现多发病灶, 每次发病即可见新发病灶;心电图正常。首先考虑病毒性脑炎, 不典型的地方是除不完全性感觉性失语, 重复语言较多外, 未再见局灶性神经系统定位体征。

本例患者曾被诊断为线粒体脑肌病伴乳酸血症和脑卒中样发作 (MELAS型) 。该诊断的证据显然不足, 仅依据血乳酸偏高、MRS提示病灶部位乳酸波谱显示比正常部位偏高以及头颅MRI检查结果是不可靠的, 更何况MELAS最常见的影像学表现是基底节铁盐沉积 (类似钙化灶) [3]。MELAS是由线粒体结构和 (或) 功能异常所导致的以脑和肌肉受累为主的多系统疾病, 多为母系遗传, 好发年龄为5岁~40岁, 常有发作性头痛、抽搐、脑卒中样发作, 且病程呈进行性加重, 确诊必须有骨骼肌活检光镜下发现破碎红纤维 (RRF) , 电镜下可见异常线粒体和晶格包涵体[4,5]。由于心肌细胞的能量消耗很大, 因此, 患者常会出现心脏的受累, 导致心电图异常表现。头颅MRI可见大脑半球皮质长T1、长T2信号, 常累及一侧或双侧颞叶、顶叶、枕叶、额叶及岛叶, 皮质下白质可受累, 而深部白质多正常, 病变多对称, 形态呈脑回样分布, 不符合血管分布特点。患者一般有身材矮小、视网膜变性、神经性耳聋等伴随症状[4,5]。本病例患者反复出现头痛及癫痫发作, 与此病较相符。但病程中神经系统症状未见进行性加重;头颅MRI见多发不对称皮质病灶, 且每次发病都可见到新发病灶, 而基底节区始终未见损害;行肥肠肌活检未见线粒体脑肌病的特征性改变;抗癫痫治疗效果较理想。因此, 不支持MELAS的诊断。根据末次住院的CSF检测结果更支持病毒性脑炎的诊断, 且经系统抗病毒治疗, 取得满意效果, 患者至今未再有癫痫发作, 亦支持病毒性脑炎的诊断。

病毒性脑炎需要迅速诊断, 早期治疗。早期应用阿昔洛韦, 可极大改善预后, 否则可能导致严重的后遗症和死亡, 或是复发。本例患者的特点是病程迁延, 3年内反复复发。造成患者病程迁延, 病变未完全得到有效控制的主要原因是对病毒感染存有疑惑, 抗病毒药物应用不及时且疗程明显不足。

关键词：病毒性脑炎,误诊,阿昔洛韦

参考文献

[1]潘晓玲, 梁国栋.病毒性脑炎[J].中华实验和临床病毒学杂志, 2006, 20 (3) :288-291.

[2]罗敏, 肖家和.病毒性脑炎的CT、MRI诊断[J].临床放射学杂志, 2000, 19 (3) :133-136.

[3]郑天衡, 李盛椂.线粒体脑肌病研究进展[J].华夏医学, 2005 (2) :290-293.

[4]吴江.神经病学[M].第2版.北京:人民卫生出版社,