低温(4℃)（精选三篇）
低温(4℃) 篇1
1 材料和方法
1.1 动物及分组
SD雄性大鼠108只, 鼠龄10～12个月, 体重 (275±25) g, 由北京天坛医院动物房提供。
分组:依据不同处理分为3组:亚低温组 (A) , 常温对照组 (B) , 假手术组 (C) , 每组36只, 每组依据不同观察时间分为3个亚组;每亚组中6只用于免疫组化检测, 另6只用于脑水含量的测定。24 h:亚低温组 (A1) , 常温对照组 (B1) , 假手术组 (C1) , 每亚组12只;72 h:亚低温组 (A2) , 常温对照组 (B2) , 假手术组 (C2) , 每亚组12只;7 d:亚低温组 (A3) , 常温对照组 (B3) , 假手术组 (C3) , 每亚组12只。实验过程中对动物的饲养及取材, 遵守实验动物管理与保护的有关规定。
1.2 方法
1.2.1 动物模型制备
大鼠术前4 h禁食, 2 h禁水, 用10%水合氯醛以400 mg/kg剂量腹腔麻醉, 俯卧位固定于动物脑立体定位仪 (美国Benchmark) 上。取头皮正中切口, 切开皮肤, 剥离骨膜, 暴露前囟及冠状缝, 取前囟点向后1.0 mm中线矢状缝向右3.0 mm处为注射穿刺点 (右侧基底节区尾状核) , 用牙科钻穿透颅骨, 用以稀释肝素预先冲洗过的微量注射器 (宁波三爱) 抽取尾静脉血50μl, 将注射器固定于立体定位仪上, 将针尖置于穿刺点平颅骨, 垂直进针5.5 mm后, 以微量注射泵 (美国Benchmark) 10μl/min的速度向内注射, 先注入10μl, 停针2min, 继续缓慢注入40μl, 留针5 min, 退针2.0 mm, 再停针5min, 缓慢将注射器针完全退出后, 用骨蜡封闭颅骨创口, 缝合头皮, 局部皮肤用碘酚消毒。假手术组与常温对照组同样定位穿刺, 注入50μl生理盐水。参照Longa及Bederson五级评分法, 2～3分作为成功模型入组。
1.2.2 亚低温处理具体方法
进行亚低温治疗6 h。大鼠采用冰块覆盖及医用冰毯 (大连欧姆龙) 降温, 体温采用肛温法测定, 用医用电子温度计 (大连欧姆龙) 连续间隔15 min监测肛温。常温对照组及假手术组肛温维持在 (37.5±1.0) ℃, 亚低温组在脑出血后10 min内将大鼠放在冰毯上用冰块覆盖降温, 约15min左右降至 (33.0±1.0) ℃, 如体温过低, 用热灯加温, 并在大鼠快要苏醒时 (一般为3 h左右) 再次用10%水合氯醛以150 mg/kg剂量腹腔麻醉, 并继续降温。亚低温组6 h后在室温下自动复温。
1.2.3 冰冻切片制备
在不同观察时点, 即术后24 h、72 h、7 d处死动物:各组大鼠在出血后不同时间用10%水合氯醛以400mg/kg剂量腹腔麻醉, 仰卧位固定于动物脑立体定位仪上, 剪开胸腹腔, 夹闭下腔静脉及胸主动脉, 用注射泵 (美国Beachmark) 先将生理盐水250 ml经心腔灌注, 后将4%多聚甲醛溶液250ml经心腔灌注固定, 断头取脑, 沿针孔冠状面切开, 将针孔后脑标本置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h, 后用20%蔗糖溶液脱水固定72 h, 在注射针道平面切取脑组织块后以冰冻切片机 (Leica CM1850) 行冰冻切片, 每张厚度20μm。以脑切片中明显的圆形、椭圆形或不规则形的血肿存在为模型成功标准, 血液针道反流进入脑室, 大鼠死亡者均摒除, 符合制作成功标准的模型108只。
1.2.4 免疫组化SABC法染色检测AQP4蛋白表达水平
免疫组织化学SABC法染色检测步骤如下: (1) 载玻片用APES处理, 干燥备用。冰冻切片用4℃丙酮固定后滴加2%过氧化氢, 室温孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶的活性, 滴加抗原修复液, 室温孵育30 min, 蒸馏水洗2 min×3次。 (2) 滴加10%正常山羊血清封闭液, 室温孵育30 min, 甩去多余液体, 不洗, 滴加1∶100的一抗 (兔抗大鼠AQP4) (美国SIGMA) , 4℃过夜。 (3) 用0.1 mol/L PBS冲洗5 min×3次, 滴加生物素二抗 (山羊抗兔IgG Santa Cruz) , 室温孵育30 min。0.1 mol/L PBS冲洗5min×3次, 滴加试剂辣根酶标记的链霉卵白素SABC, 室温孵育20 min, 0.1 mol/L PBS冲洗5 min×4次。 (4) DAB显色:滴加新鲜配制的DAB溶液 (广州中杉) , 0.1 mol/L PBS冲洗5 min×3次, 镜下观察显色强度。 (5) 苏木素轻度复染, 透明、脱水、封片。 (6) 显微镜下观察, 免疫组化染色:免疫组化阳性细胞胞浆或胞核内可见棕黄色颗粒。
1.2.5 脑水含量的测定
取血肿周围约150 mg脑组织在分析天平 (200S) 上称湿重后放入电热烘箱100℃烘烤24 h再称干重。按下列公式计算组织水含量。
水含量= (湿重-干重) /湿重×100%
1.3 图像分析
1.3.1 伊红 (HE) 染色
部分标本按常规程序制成厚度5μm的石蜡切片, 进行苏木素+伊红 (HE) 染色, 以观察血肿周围脑组织病理改变。
1.3.2 冰冻切片图像分析
每只大鼠各取3张冰冻切片, 在400倍高倍镜下 (×400 HPF) 分别随机取血肿周围水肿区6个区域测量其平均值, 然后减去背景区平均值, 采用生物医学图像分析系统进行染色深浅定量分析, 测得AQP4积分光密度值。3张切片的均值作为最终平均值。
1.4 统计学处理
采用SPSS 11.0软件包进行分析, 计算每组的积分光密度值及脑水含量, 以均数±标准差 (x±s) 表示。计量资料两两比较, 若方差齐则用t检验, 方差不齐多组间比较用单因素方差分析。P<0.05表示有显著性差异。
2 结果
2.1 HE染色光学显微镜下观察血肿周围脑组织病理改变
亚低温组及常温对照组脑出血后24 h血肿周围可见神经元胞体肿胀, 细胞间隙和血管周围间隙增宽, 出现液化坏死的脑组织, 呈空隙状, 可见神经元数目减少, 排列紊乱, 神经细胞、胶质细胞轻度肿胀, 大量中性粒细胞浸润;脑出血后72 h上述病变加重, 并见大量神经元核浓缩格子细胞浸润, 胶质细胞增生活跃, 血肿周围细胞肿胀明显, 神经细胞变性坏死, 开始出现泡沫细胞, 组织疏松明显, 表现为重度水肿;出血后7 d, 神经细胞肿胀减轻, 胶质细胞增生, 泡沫细胞形成, 软化区组织疏松减轻, 小胶质细胞增生, 可见少许新生毛细血管。亚低温组脑组织的病理改变无论是病变范围还是程度均轻于常温对照组。假手术组大鼠脑组织结构完整, 各层细胞排列整齐, 无肿胀, 均无明显异常改变。
2.2 各组脑组织AQP4表达的比较 (见表1)
脑出血模型大鼠出血后24 h, 即可见出血灶周围AQP4的表达, 随着出血时间的延长其表达亦明显增强, 72 h达高峰, 以后逐渐下降, 7 d时仍高于假手术组。不同时间点之间比较:假手术组不同时间点AQP4的表达差异无显著性 (均P>0.05) , 而亚低温组和常温对照组各时间点差异均有显著性 (均P<0.01) 。3组间两两比较差异有显著性 (均P<0.01) , 同时间点亚低温组AQP4的表达明显低于常温对照组 (均P<0.01) 。
注:*表示与常温对照组比较在各时间点P<0.01, Δ表示常温对照组在各时间点两两比较P<0.01, #表示假手术组各时间点比较P>0.05
2.3 脑水含量的比较 (见表2)
常温对照组大鼠注血后24 h脑水含量开始增加, 72 h达到高峰, 7 d后下降 (P<0.01) 。亚低温组脑水含量在24 h、72 h、
7 d均低于常温对照组 (P<0.01) 。
注:*表示与常温对照组比较在各个时间点P<0.01, Δ表示常温对照组在各时间点两两比较P<0.01
3讨论
脑出血的病理生理机制是近年来研究的热点, 但其机制是一个十分复杂的过程, 至今仍然难以完全阐明。脑水肿形成是脑出血后最重要的病理学过程, 如何预防和控制脑水肿, 保护血脑屏障 (Blood-brain barrier, BBB) 一直是脑出血治疗的关键。Filippidis等[1]研究表明AQP是一种膜蛋白, 广泛分布于机体的不同组织器官中, 介导不同类型细胞膜的跨膜水转运, 已从哺乳动物组织中鉴定出13种AQP, 其中AQP4是脑组织中含量最多、分布最广的AQP, 在脑内主要分布于星形胶质细胞、脑表面的软脑膜、脑室系统的室管膜、脉络丛、下丘脑的视上核和室旁核。Iacovetta等[2]研究显示, AQP4在星形胶质细胞的终足上表达强烈, 星形胶质细胞足突可以作为血液与神经细胞间体液和代谢物转运的细胞内通路, 起调节水运输的作用, 作为构成BBB的界膜。通常因各种原因形成的脑水肿早期, 其血脑屏障破坏尚不明显, 主要为细胞毒性脑水肿, 此时脑内AQP4水平或活性主动降低, 减少进入脑组织中的水含量, 延缓血管源性脑水肿的形成;但在脑水肿24 h后, 血脑屏障破坏显著, 血管源性脑水肿占据主要地位, 由于水肿液的扩散, 血红蛋白、凝血酶等释放的毒性物质的积聚, 导致细胞内外水、电解质平衡失调, 渗透压改变, 激活位于星形胶质细胞终足上的AQP4, 致使其表达增强, 而AQP4既是水通道蛋白又是渗透压感受器, 其通透性增加引起细胞外的水、钠离子内流增多, 从而加重了细胞毒性脑水肿, 故此期既存在血管源性脑水肿又存在细胞毒性脑水肿。AQP4在脑水肿形成过程中表达增强或降低的时间取决于血-脑屏障破坏的早晚, 而各种病因形成的脑水肿, 其血管源性脑水肿形成及占据优势的时间各不相同, 其促发AQP4表达及持续的时间亦有差异, Zador等[3]研究发现脑损伤后24 h AQP4在损伤区表达下降, 而3 d后损伤区边缘的表达开始增强。Eefsen等[4]的研究发现, MCA阻塞后AQP4 mRNA的表达上调, 第3 d达高峰, 第7 d仍处于较高水平, 皮质的分子层和外颗粒层可见AQP4 mRNA及蛋白质表达最强。Venero等[5]通过大鼠脑内注射胶原酶制作脑出血模型, 结果显示脑出血后6 h, 脑水肿区蛋白质的表达均开始升高, 1 d后明显加强, 第3 d达峰值, 其后逐渐有所下降, 但持续7 d仍高于正常水平。这提示AQP4可能参与了脑出血后的水肿形成。因此, 以AQP4作为治疗的靶向, 可能对防止脑水肿的发生及加剧有一定作用。
近年来研究[6]认为亚低温具有降低脑组织氧耗量, 减少脑组织乳酸堆积, 保护血-脑屏障, 抑制内源性毒性产物对脑细胞的损害作用。随着对亚低温研究的不断深入, 人们发现亚低温对脑卒中后AQP4的表达有影响, 亚低温已经被证明在颅脑损伤和脑梗死治疗中有确切的脑保护作用, Kollmar等[7]有实验表明, 全身亚低温可以减轻大鼠脑出血后产生的脑水肿。目前关于亚低温对AQP4影响的研究较少, Xiao等[8]发现, 与常温组相比, 在大鼠诱发心脏停跳前给予亚低温可以抑制心脏停跳后脑组织AQP4表达的上升以及脑含水量的增加。亚低温对脑出血后脑水肿的抑制是否通过AQP4起作用国内外报道较少。Kawanishi等[9]研究发现局部亚低温可以明显降低各时间点脑含水量及BBB通透性, 亚低温组AQP4的表达在各时间点均明显下降, 减轻脑出血后的脑水肿形成。
本研究观察了全身亚低温对自体血造模大鼠脑组织中AQP4表达的影响, 通过本研究结果显示:脑出血后BBB完整性的破坏可以导致AQP4表达的上升, AQP4在血管源性脑水肿中发挥了重要作用;亚低温组与常温对照组相比, 不同时间点其血肿周围AQP4表达明显降低, 由此推测, 亚低温可能通过降低血肿周围脑组织AQP4的表达, 减少经破坏的BBB进入脑组织细胞间隙的大分子物质及水分, 抑制血管源性脑水肿。因此, 亚低温可能通过降低血肿周围脑组织AQP4的表达, 达到改善脑出血后脑水肿的作用, 对脑出血后血管源性水肿有抑制作用。本实验通过观察实验性脑出血大鼠脑内AQP4表达水平的变化, 推测亚低温治疗可能通过抑制AQP4产生脑保护作用, 为今后进一步探讨亚低温脑保护更深层次的作用机理提供了一些资料。
参考文献
[1]Filippidis A S, Kalani M Y, Rekate H L.Hydrocephalus and aquapor-ins:the role of aquaporin-4[J].Acta Neurochir Suppl, 2012 (113) :55-58.
[2]Iacovetta C, Rudloff E, Kirby R, et a1.The》role of aquaporin 4 in thebrain[J].Vet Clin Pathol, 2012, 41 (1) :32-44.
[3]Zador Z, Stiver S, Wang V, et a1.Role of aquaporin-4 in cerebraledema and stroke[J].Handb Exp Pharmacol, 2009 (190) :159-170.
[4]Eefsen M, Jelnes P, Schmidt L E.Brain expression of the water chan-nels aquaporin-1 and-4 in mice with acute liver injury, hyperammone-mia and brain edema[J].Metab Brain Dis, 2010, 25 (3) :315-323.
[5]Venero J L, Tomas-Camardiel M, Herrera A J, et al.Blood-brainbarrier disruption highly induces aquaporin-4 mRNA and protein inperivascular and parenchymal astrocytes:protective effect by estradioltreatment in rat[J].Neurosci Res, 2008, 80 (2) :235-246.
[6]Harris O A, Colford M J, Good M C, et al.The role of hypothermia inthe management of severe brain injury[J].Arch Neuro, 2007 (59) :1077.
[7]Kollmar R, Staykov D, Dorfler A, et a1.Hypothermia reduces perihem-orrhagic edema after intracerebral hemorrhage[J].Stroke, 2010, 41 (8) :1684-1689.
[8]Xiao F, Arnold T, Zhang S, et al.Cerebral cortical aquaporin-4expression in brain edema following cardiac arrest in rats[J].Acad EmergMed, 2004 (11) :1001-1007.
低温(4℃) 篇2
胡世全1，陈世林1，刘进2，钟家成1，谢合平1，刘云鹏3，黄先彪4
（1湖北省宜昌市夷陵区特产技术推广中心，宜昌，443100；2湖北省宜昌市夷陵区农业局；3湖北省宜昌市夷陵区气象局；4湖北省当阳市特产中心）
摘要：4月中旬湖北省宜昌市夷陵区极端低温过后，调查了夷陵区小溪塔、龙泉、鸦鹊岭，当阳市凤凰山等地低温对柑桔新梢、叶片、花蕾等的影响。结果表明，2.8℃以下，早熟龟井温州蜜柑、崭獭⑴低呓酆吞鸪仁艿降臀吕浜Γ2.5℃以下，中熟尾张温州蜜柑花蕾、新叶受冷害；受害程度龟井温州蜜柑最轻，崭獭⑴低呓巯嗟保甜橙最重；花蕾的受害程度重于新叶。
关键词：极端低温；柑桔；花叶
中图分类号：S666；S161.2文献标志码：A文章编号：1007-143106-0026-02
低温(4℃) 篇3
老肯牌LK/MJQ-50型过氧化氢低温等离子体灭菌器的工作原理是通过过氧化氢在较低的温度下被“激励”成等离子体状态进行灭菌。灭菌系统提供了有效、安全、快速、经济、方便、可靠和灵活的灭菌途径,在大中型医院被广泛使用[1]。我院有LK/MJQ-50灭菌器2台,已经使用多年,现将使用过程中遇到的一些故障情况和检修分析总结如下,供同行参考。
1故障一
1.1故障现象
机器在使用过程中灭菌失败,提示错误代码 “C13”。
1.2故障分析与处理
根据机器提示的错误代码,推断故障发生在真空阀及其相关电路中。开机后点击“登录系统”进入 “系统维护”,在菜单上点击“真空开关阀”按钮,未听到真空阀动作声音。拆下机器左侧门,在真空阀工作情况下,用万用表测真空阀线圈电压为220 V(正常), 可排除真空阀线圈供电电路故障,说明故障出在真空阀本身。关机,拆下真空阀,测真空阀线圈电阻为1.4 MΩ 左右,正常。检查真空阀内密封垫圈及弹簧, 无老化变形情况;检查真空阀开关电路板上电子元件,无异常现象;检查阀腔,发现阀腔内有许多黑色粉末物。用医用纱布和无水酒精清洗其弹簧、阀芯、 阀腔,晒干组装后,进入维护系统,点击“真空开关阀”按钮,听到真空阀动作声音,机器可以正常使用。
2故障二
2.1故障现象
机器开机预热,灭菌仓温度指示灯一直为红色, 未达到启动条件[2]。
2.2故障分析与处理
根据故障现象,原因可能为:(1)04PT温度模块及相关电路故障;(2)内胆温度后测温探头损坏;(3) PLC程序错误。点击“登录系统”,进入系统维护菜单中参数设置查看内胆温度,温度设置值为45 ℃,温度监测值:内胆温度前为45.6 ℃(正常),内胆温度中为45.4 ℃(正常),内胆温度后为65.4℃(异常)。内胆温度前和内胆温度中监测值正常,说明04PT温度模块及相关电路出现故障的可能性不大,PCL程序出错的可能性也极小,故判断内胆温度后测温探头损坏。打开机器上盖,拆下内胆温度后测温探头,放在室温中观察内胆温度后监测值变化情况,监测值在36.5~103 ℃ 之间变化(正常时温度监测值应该为室温),进一步确定内胆温度后测温探头(PT100型)损坏。更换并组装测温探头后试机,内胆温度后监测值一直在45 ℃ 左右变化,机器恢复正常[3]。
3故障三
3.1故障现象
机器开机后柜门未能打开(关闭)。
3.2故障分析与处理
根据故障现象,原因可能为:(1)灭菌仓内压力值<10 k Pa;(2)门电机控制电路故障;(3)门电机本身及电动机供电线路故障。
点击“登录系统”进入“系统维护”菜单,在菜单上点击“新风阀”按钮,听到新风阀动作声音,查看灭菌仓压力值>10 k Pa(正常),证明新风阀及其相关电路正常。打开机器后盖,在面板上按下“开(关)门”键检查,操作时开关门中间继电器动作正常,开关门交流接触器工作正常,由此排除开关门电动机控制电路故障。用万用表交流挡测开关门电动机端电压为0 V(正常时为交流220 V),可基本排除电动机本身及与其相关的机械系统故障,推断故障发生在电动机供电线路中。用万用表电阻挡检测,发现门电机供电线路中3A保险管与保险座之间接触不良。更换保险座后,柜门可以打开或关闭,机器恢复正常。
4故障四
4.1故障现象
机器在使用过程中出现灭菌失败,提示错误代码“C21”。
4.2故障分析与处理
根据机器提示的错误代码,推断故障发生在真空阀及其相关电路中。开机后点击“登录系统”进入 “系统维护”,在菜单上点击“真空阀开关”按钮,每隔3 s开关1次,共开关20次,每次开关真空阀动作声音均正常,故可排除真空阀线圈及其供电电路故障。在菜单上打开真空泵和真空阀,当灭菌仓压力值下降至650 Pa时关掉真空阀,观察到灭菌仓压力值仍不断下降,正常时灭菌仓压力值不会下降,由此证明真空阀密封性差。拆下机器左侧门,关机后打开真空阀,检查发现真空阀内波纹管上O型密封垫圈严重变形。更换密封圈后进行灭菌仓压力检测,正常, 机器可以正常使用。
5小结
通过对上述故障的分析、处理,体会如下:
(1)购买灭菌器时厂家没有提供该机器的电路原理图、管路图等各种维修资料,但机器运行中大多数问题都有一条系统信息来表示[4],这些信息有利于确定故障的原因,所以在处理故障时要仔细查看系统信息及故障代码。