人角膜上皮细胞（精选四篇）
人角膜上皮细胞 篇1
胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES细胞)是从早期胚胎内细胞团分离获得的,具有体外增殖和全能性两大特点。近年来随着ES细胞研究的不断深入,其逐渐应用于细胞、组织的修复和移植[2]。绿色荧光蛋白(green fluorescen protein,GFP)基因是一种新型的报告基因,用GFP作为标志物来标记ES细胞,可用来追踪ES细胞在体内的分化[3]。本研究利用质粒pEGFP-N1脂质体复合体转染鼠ES细胞,并在体外诱导鼠ES细胞向角膜上皮细胞分化,为治疗角膜损伤及重建角膜上皮提供细胞组织来源。
1 材料与方法
1.1 实验材料
鼠ES细胞由北京大学深圳研究生院分子生物学实验室提供。DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、B-巯基乙醇、非必需氨基酸,购自Sigma公司;丝裂霉素C,购自Kogyo公司;脂质体Lipofectamine 2000、G418,均购自Invitrogen公司;白血病抑制因子(1eukemia inhibitory factor,LIF)、L-谷氨酰胺,购自Sigma公司;质粒pEGFP-N1,购自Clontech公司;明胶、TaqDNA聚合酶,购自博大泰克公司;CK14、CK12、CD44引物,委托宝生物工程公司合成;免疫组化二抗试剂盒、DAB显色试剂盒,购自武汉博士德公司;其余为国产分析纯试剂。
1.2 实验方法
1.2.1 ES细胞的培养
ES细胞复苏后,经丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)做饲养层培养,加入预先铺有明胶(Ⅳ型胶原)的培养皿中,37℃,50 mL/L CO2培养箱中培养,每日更换ES细胞培养液为高糖DMEM(内含0.1 mol/Lβ-巯基乙醇、2 mmol/L谷氨酰胺、150 m L/L胎牛血清、1 000 U/mL LIF、15 g/L非必需氨基酸)。2～3 d传代1次。
1.2.2 转染及诱导ES细胞
将真核细胞表达载体pEGFP-N1转染ES细胞作为实验组,空载质粒转染ES细胞作为对照组。在转染前2 h改为无血清的DMEM培养液;含载体pEGFP-N1质粒的无血清DMEM培养液与含脂质体Lipofectamine 2000的无血清DMEM培养液混合,加入ES细胞培养皿中,置37℃的CO2培养箱中培养,换液,培养基为不含LIF的ES细胞培养基。G418筛选GFP阳性细胞克隆,接种在丝裂霉素C处理的MEF饲养层上,继续扩增培养,获得稳定的转染细胞系。ES细胞诱导前去除饲养层细胞,接种于涂抹明胶(Ⅳ型胶原)的培养皿中,加入无LIF的ES细胞培养液,隔日换液,传3～4代,诱导ES细胞分化成角膜上皮细胞。
1.2.3 形态学和免疫组织化学鉴定
显微镜下观察ES细胞形态,诱导培养7 d后,细胞基本融合,将培养分化的ES细胞用PBS洗涤3次后,冷4%多聚甲醛固定30 min,正常山羊血清封闭30 min,滴加K14、K12及CD44单抗,4℃过夜,0.02%Triton-PBS洗涤,加人生物素标记的二抗,室温下孵育40 min,PBS洗涤数次后,加入链亲和素一过氧化物酶溶液,放置于室温下10 min,0.02%Triton-PBS洗涤,最后DAB显色,显微镜下观察。
1.2.4 RT-PCR检测
Trizol R试剂盒提取ES细胞总RNA,具体过程参照Trizol Reagent说明书。引物序列分别为:CD44正义链5'-atcaacctgcctatgcaacc-3',反义链5'-cttggacgggaactgacact-3'(248 bp);K12正义链5'-cgagagtggtatgaaaca-3',反义链5'-tgggctctcatttcattg-3'(218 bp);K14正义链5'-ggtcgatttgatggatttgg-3',反义链5'-gttcagtgttggcctcttcc-3'(192 bp);内参照β-actin正义链5'-gatgacgatatcgctgcgctg-3',反义链5'-gtccgaccagaggcatacagg-3'(512bp)。每个周期参数如下:94℃30 s,60℃35 s,72℃60 s,共30个循环周期。采用小鼠角膜上皮细胞做阳性对照,每组PCR反应均设一个阴性对照。取RT-PCR产物20μL行琼脂糖凝胶电泳,紫外分析仪观察结果,凝胶成像系统拍照。
2 结果
2.1 ES细胞的形态
在饲养层上培养的ES细胞生长旺盛,边界光滑,呈现巢状生长,集落大多呈多角形或椭圆形,集落内细胞排列紧密,边界不清;细胞边界清,胞浆较丰富,细胞核大,核仁大。GFP阳性ES细胞在荧光显微镜下可观察到细胞内有微弱的绿色荧光(图1～2)。
2.2 诱导分化的角膜上皮细胞形态
GFP阳性ES细胞经Ⅳ型胶原诱导培养1周,可见在细胞集落中爬出上皮样细胞,贴壁生长,增殖迅速,逐渐呈集落式生长,生长胞体多为扁平,呈多角型或不规则形态生长,表现出典型的上皮细胞形态,在荧光显微镜下可观察到细胞内有很强的绿色荧光(图3～4)。
2.3 K12、K14及CD44表达情况
RT-PCR检测发现:诱导分化的ES细胞中有K12及CD44表达,而K14则无表达,证实转染后ES细胞向角膜上皮细胞方向分化(图5);免疫组化结果显示:角膜上皮样细胞K14的表达很少,而K12及CD44的免疫细胞化学染色阳性(图6)。
3 讨论
严重的角膜损伤一直是眼科治疗的难题。一些严重的化学或热烧伤,以及Stevens-Johnson syndrome等疾病,常导致角膜上皮的大量缺失。传统的移植方法虽有一定疗效,但由于供体缺乏、移植免疫及伦理等问题,在临床上的应用发展受到很大限制[4]。重建角膜的关键是获得足够的角膜上皮材料。本研究探索采用诱导有多向分化潜能的ES细胞向角膜上皮细胞分化,为角膜上皮移植提供无限的供体来源。
ES细胞是一种具有全能性、可无限增殖和多向分化潜能的未分化细胞,具有两个重要特性:(1)自我更新潜能。干细胞在未分化状态下可不断增殖,从而可自我更新。(2)多向分化潜能。在体内外ES细胞均有分化成许多特定细胞类型的能力。它能迁移到不同部位分化成相应的细胞类型,恢复受损细胞的功能,成为一种新型细胞替代治疗和基因治疗的途径。经丝裂霉素C处理的含LIF的MEF作为饲养层,能够抑制ES细胞的分化和促进其增殖,并使其保持未分化状态以及多向分化潜能[5]。本研究将Ⅳ型胶原作为诱导剂,加入不含LIF的培养板中,诱导体外培养的ES细胞向角膜上皮细胞分化。
GFP是一种由238个氨基酸组成的蛋白,作为荧光标记分子,在研究细胞的分化、细胞移植中具有重要作用[6]。本研究用脂质体方法将含有GFP的质粒转染至小鼠ES细胞中,选择G418筛选并纯化后的GFP阳性ES细胞。将这些能够持续表达GFP的ES细胞在诱导条件下分化成角膜上皮样细胞,并稳定表达GFP,证明GFP基因已完全整合到ES细胞基因组中,这对ES细胞在体内的分化、迁移及整合具有重要意义。
本研究对诱导分化后的ES细胞进行了形态学观察,发现分化后的细胞符合具有典型上皮细胞的形态学特征。细胞呈集落式生长,排列紧密,边界不清;细胞边界清,胞浆较丰富,细胞核大,核仁大。对于眼表上皮而言,区分角膜上皮细胞与结膜上皮细胞是非常重要的,因为它们在功能上有很大区别,影响角膜上皮组织的移植。细胞角蛋白(cytokeratin)是细胞骨架成分中间丝的重要组成部分,是一类在上皮细胞中表达丰富的蛋白质,也是某些上皮细胞重要的标志物,其中,K14主要在结膜上皮表达而不在角膜上皮表达,K12则是在角膜上皮细胞表达的角蛋白,是特异性角膜上皮细胞标志物。而CD44也存在于角膜上皮细胞中,功能与组织修复有关,它可以促进角膜上皮的愈合。本实验诱导分化的上皮细胞CD44和K12表达阳性,而表达K14阴性,说明诱导分化的细胞是角膜上皮细胞,而非结膜上皮细胞。提示ES细胞能在体外定向诱导分化为角膜上皮样细胞。本研究应用RT-PCR技术检测ES细胞及分化的角膜上皮样细胞中均有K12及CD44的表达,而结膜上皮标志物K14则无表达,证实转染GFP后的ES细胞向角膜上皮细胞方向分化。
总之,通过以上实验本研究成功建立了转染GFP基因的ES细胞系,并利用Ⅳ型胶原体外诱导ES细胞定向分化为角膜上皮样细胞,为临床治疗角膜损伤提供新的材料来源。
参考文献
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人角膜上皮细胞 篇2
【学生学习情况分析】
1、学生通过上一节课《观察植物细胞》的学习，基本掌握显微镜的正确操作方法和步骤，对于利用显微镜进一步观察动物细胞有着强烈的愿望。但在使用显微镜的过程中还要教师认真指导，纠正不足。
2、初一的学生活泼好动，不少同学注意力难以集中，实验操作不规范。也有的同学应付了事，草草收兵，教师在学生实验的过程中，应多查多看，及时指出问题，给予正确指导。
【教学目标】
1、知识目标
①了解并掌握使用显微镜的方法。
②掌握动物细胞的基本结构。
2、能力目标
①学习实验探究的方法。
②培养实验探究的能力。
③训练学生独立思考及其完成任务的能力。
3、情感与价值观目标
培养学生积极思考、合作交流的精神。
【教学重点】
①由于在前面的章节中已经让学生们学会了使用显微镜，故本实验的重点已不是教学生使用显微镜，而是在做实验的过程。
②学生首次通过显微镜观察了解动物细胞，动物细胞的基本结构知识是本节的重点。
【教学难点】
虽然学生在本实验之前已经做过一些实验和制作过临时装片，但他们毕竟还是刚接触生物实验，所以本节的难点仍然是制作临时装片的过程。
【教学方法】
1、教材中虽然详细地列出了临时装片制作过程的具体步骤，但要让七年级的学生完全按照书本的介绍进行独立操作，还有一些难度。因此采用边讲解边实验的教学策略。教师通过引导学生观察，边实验边指导，激发学生学习热情。
2、教师在课前培训几位小老师，在课堂上请他们谈谈做装片的体会，这对全体学生是很好的激励，有助于学生树立做好装片的信心。而且这几位小老师动手能力强，操作准确规范，在整个实验教学中发挥示范作用。
3、以小组活动形式为载体，本节实验每1人为一实验小组。让学生在动手实验的同时动脑思维、动口讨论，在亲身实践中，发展自己的思维能力，最大限度地调动学生的学习自主性。
【课前准备】
学生：预习；铅笔，绘图纸；上课前漱口。
教师：生理盐水、稀碘液、消毒牙签、滴管、纱布、镊子、吸水纸、载玻片、盖玻片、显微 镜、清水。
【教学过程】
1、引入
在准备好实验器材后，老师先让学生们回忆上节实验观察的洋葱表皮细胞的大体结构，以此作为引入，把学生的注意力从实验桌上转移到老师身上来，不仅可巩固上节所学内容还为本节实验观察的动物细胞结构对比做铺垫。
教师提问：①洋葱表皮细胞主要是有哪些基本结构组成的？
②那动物细胞又是由哪些基本结构组成的呢？
然后让学生们先阅读课本上的实验部分，老师再演示一遍本实验的过程。
2、实验
实验目的：a．巩固制作临时装片的基本方法。
b．认识并阐明人口腔上皮细胞的基本结构，并使用显微镜观察自己制作的临时装片。
c．初步学会绘制动物细胞结构简图。
①制作人的口腔上皮细胞临时装片（在制作临时装片时，教师要不时的观察学生的实验动作是否规范到位，并提醒注意事项）
a、用洁净的纱布将载玻片、盖玻片擦拭干净。
b、在载玻片中央滴一滴生理盐水。
c、用消毒牙签在自己已漱净的口腔内侧壁上轻刮几下。把牙签附有碎屑的一端放在载玻片上的生理盐水中，轻涂几下。
d、用镊子夹起盖玻片，使它的一边先接触载玻片上的水滴，再将盖玻片缓缓放平盖在水滴上。注意避免盖玻片下出现气泡。
e、在盖玻片的一侧滴加几滴稀碘液，用吸水纸在盖玻片的另一侧吸引，使碘液浸润标本的全部。
②用显微镜观察人的口腔上皮细胞（观察细胞时，教师要仔细观察学生使用显微镜观察的步骤是否正确，并让学生们仔细观察人口腔上皮细胞结构与洋葱表皮细胞有哪些异同点）
③将临时装片放在光学显微镜下观察。
④绘图
依照所观察到的细胞，画一个细胞结构简图，并尝试注出各部分名称。
3、总结
学生用显微镜观察并绘制了人口腔上皮细胞的图后，让学生们分组讨论自己看到的人口腔上皮细胞与上节课所观察到的洋葱表皮细胞在结构上有什么异同点，并请同学来回答。然后老师总结同学们的观点，相同点：都有细胞膜、细胞核、细胞质；不同点：洋葱表皮细胞有细胞壁和液泡，而人口腔上皮细胞则没有。然后让学生们阅读课本本节的知识内容，让他们证实一下自己得出的结论是否和书上的知识点一致，如果不一致，是哪些地方不一致，为什么？由学生们自由讨论并与其他同学分享。
最后老师得出本节知识点：动物细胞的基本结构有细胞膜、细胞质和细胞核。
【注意事项】
实验前教师要重点强调本实验注意事项
1．取材前，口腔一定要用清水漱净。
2．用牙签在口腔壁上轻轻刮动，不要刮在牙缝里，因为牙齿上刮下来的是食物碎屑，不是口腔上皮细胞。
3．选择适宜的取材部位
人的口腔顶壁前部为硬腭，后部为软腭，两侧壁为颊部。口腔各壁都有黏膜覆盖。本实验取材部位，以口腔两侧颊部为好。因为在这一部位能取到较多的口腔上皮细胞，而在口腔顶壁取得的上皮细胞数较少。
4．选取适宜的染液浓度，只有选取了合适的染液浓度，才能将口腔上皮细胞的细胞质、细胞核和细胞膜较明显地显示出来。
【教学反思】
1、本次实验是在学生学习了显微镜的使用及洋葱鳞片叶表皮细胞的制作后才设计的，有了这两次的实验经验，所以这次实验比较成功。学生的动手和动脑能力运用的也比较恰当。
2、存在的问题是：学生取材是方法不对，有的组没有取到口腔上皮细胞，还有的组取到的是较多的食物残渣；另外学生的画图能力还有待进一步提高。
【作业布置】
1、完成好课后习题。
2、复习巩固本节所学内容并预习下节课的课程。
3、绘制一幅动物细胞与植物细胞结构的示意图，并标出个结构名称。
《制作并观察人的口腔上皮细胞临时装片》导学案
一、学习目标
1、制作和观察人的口腔上皮细胞临时装片
2、认识人的口腔上皮细胞基本结构
3、进一步熟练使用显微镜观察细胞
二、自主学习
1、本实验你所选用的材料和用具
2、根据人的口腔上皮细胞临时装片的方法和步骤，独立完成临时装片的制作。
总结出制作口腔上皮细胞的动作步骤。
3、用显微镜观察临时装片，同时依照所观察到的细胞，画一个细胞结构图，并写出各部分的名称
4、实验完成后，如何整理实验桌面？
三、合作探究
1、制作人口腔上皮细胞临时装片时，取材前漱口的原因是什么？
2、制作人口腔上皮细胞临时装片时，在载玻片的中央滴的是0、9%生理盐水而不是清水，为什么？
人角膜上皮细胞 篇3
关键词：人乳腺肿瘤上皮细胞系；生物反应器；胶质细胞源性神经营养因子；表达载体；帕金森病
中图分类号： Q789文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0016-04
收稿日期：2014-07-23
基金项目：国家自然科学基金（编号：31060304）；内蒙古高等学校科学研究项目（编号：NJ10184） 。
作者简介：张学明（1970—），男，内蒙古包头人，博士，副教授，主要研究方向为重组药物蛋白。E-mail：byzhxm@126.com。帕金森病（Parkinsons disease，PD）是老年人群中常见的一种神经元退行性疾病，其临床表现主要是以静止性震颤、运动迟缓、肌僵直和姿势平衡障碍为特征。PD的病理特征主要是中脑黑质多巴胺能神经元退行性丧失，导致纹状体中多巴胺含量显著降低[1]。目前用于PD临床治疗的常规药物主要有复方左旋多巴、多巴胺受体激动剂、抗胆碱能药物等，这些药物能够暂时减轻或缓解症状，但不能阻止PD的进程，且长期用于PD治疗会出现多种并发症[2]；因而，研制开发新的药物用于PD的有效治疗是非常必要的。
胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-direved neurotrophic factor，GDNF）是由Lin等于1993年在B49神经胶质瘤细胞中分离纯化出的一种分泌性糖蛋白，属于TGF-β超家族成员[3]。研究表明，GDNF对多巴胺能神经元具有营养及保护作用[4]，应用GDNF治疗帕金森病已进入二期临床研究[5]。然而由于GDNF在人和动物体中含量低，从动物组织中分离纯化GDNF用于疾病动物模型和临床实验研究是不现实的；因而，应用转基因技术大量生产重组GDNF用于疾病动物模型和临床研究具有潜在的重大社会效益和经济效益。
本研究构建了牛β-casein基因启动子驱动的人GDNF基因乳腺上皮细胞高效特异表达载体，转染人乳腺肿瘤上皮细胞系Bcap-37细胞，获得了能够表达重组人GDNF蛋白的转基因Bcap-37细胞系，为高效制备与天然人GDNF蛋白结构完全一致的重组人GDNF蛋白，并将其用于帕金森病临床治疗的研究奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
大肠杆菌DH5α、pP40R、pCMV-Red、pUC-gdnf为内蒙古科技大学包头医学院医学生物化学实验室保存。
质粒提取试剂盒（QIAGEN公司）、小量RNA提取试剂盒（上海舜华生物工程有限公司）、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒（TIANGEN公司）、DNA纯化试剂盒（TIANGEN公司）。
Taq Plus、Pfu DNA聚合酶购自TIANGEN公司；T4 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、M-MLV反转录酶、Oligo（dt）、限制性内切酶均为TaKaRa产品。
人乳腺肿瘤上皮细胞系Bcap-37购自中国科学院上海细胞研究所；RPMI-1640、催乳素、氢化可的松、胰岛素购自Sigma 公司；兔抗人多克隆GDNF抗体（Rabbit Polyclonal GDNF Antibody）购自Santa Cruz公司；连接了碱性磷酸酶的羊抗兔二抗（Goat Anti-rabbit Second Antibody Conjugated with Alkaline Phosphatase）及 BCIP/NBT 试剂盒购自博士德公司。
1.2试验方法
1.2.1重组人gdnf乳腺特异表达载体的构建根据Bonsing等发表的牛β-casein基因序列（M55188）[6]设计PCR上游引物：5′-TCTGGGCCCGAAAAGGGAAATGTTGAATGGGAAG-3′，下游引物：5′-GGCCTCGAGCTCCTGGGAATGGGAAGATGA-3′，上下游引物两端分别引入ApaⅠ和XhoⅠ 酶切位点。提取牛基因组DNA，PCR扩增牛β-casein基因5′端上游包括启动子、第1外显子、第1内含子及部分第2外显子的3.6 kb调控序列，经ApaⅠ/XhoⅠ双酶切后插入到骨架载体pP40R[7]的ApaⅠ/XhoⅠ双酶切位点作为gdnf cDNA乳腺特异表达的调控序列。XhoⅠ 酶切质粒pUC-gdnf获得人gdnf cDNA基因插入到牛β-casein基因5′端3.6 kb调控序列下游的XhoⅠ位点。PCR检测gdnf cDNA的插入方向，PCR上游引物设计在载体3.6 kb调控序列上，引物序列为5′-ACTATTTCCTCATCTTCCCATTCCCAG-3′，下游引物设计在gdnf cDNA序列上，引物序列为5′-GAGCTCCAGTCAGATACATCCACACCTTTTAG-3′；反应条件：94 ℃变性45 s，62 ℃复性45 s，72 ℃ 延伸1 min，共35个循环。正向插入将获得598 bp的特异产物，反向插入则无特异性PCR产物。载体构建完成后，对载体与片段连接处、牛β-casein基因5′端调控序列核心区域进行测序。
1.2.2Bcap-37细胞的稳定转染与筛选用含20%胎牛血清（fetal calf serum，FBS） 的RPMI-1640培养液，于37 ℃、5%浓度、饱和湿度条件下培养B-cap37细胞至70%～80%汇合时，消化细胞，以3×105个细胞/孔接种于6孔板。24 h后，按照脂质体Lipofectamine操作说明，每孔加入2.0 μg 线性化载体DNA转染细胞。48 h后，消化每孔细胞接种于 100 mm 培养皿中，并加入浓度为300 μg/mL 的G418筛选8～10 d后，将表达红色荧光蛋白的细胞克隆分离、扩培、冷冻保存备用。
1.2.3PCR检测稳定转染细胞提取稳定转染细胞基因组DNA，PCR检测 gdnf cDNA是否整合到细胞基因组DNA中。PCR 上游引物：5′-GACCTCGAGATGAAGTTATGGGATGTCGTGGCTGTC-3′，下游引物：5′-GAGCTCGAGTCAGATACATCCACACCTTTTAG-3′；反应条件为：94 ℃变性45 s，58 ℃ 复性45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环。
1.2.4转基因细胞的诱导表达阳性转基因细胞生长至80%汇合时，更换诱导培养基（RPMI-1640+4 μg/mL催乳素+10 μg/mL胰岛素+1 μg/mL氢化可的松），分别诱导培养24、48 h 后，收集细胞及细胞培养上清液。
1.2.5RT-PCR分析gdnf的表达诱导培养的细胞按照RNA提取试剂盒操作说明提取RNA，以1.0 μg RNA为模板反转录合成cDNA第1链。以cDNA为模板PCR检测转基因细胞诱导培养后是否有 gdnf 在mRNA水平的表达。PCR引物、反应条件同“1.2.3”节。
1.2.6Western Blot 检测 gdnf 的表达三氯乙酸法浓缩细胞诱导培养上清液，Lorry法测定蛋白浓度。取40 μg 蛋白，12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封膜，一抗4 ℃过夜杂交，二抗室温孵育1 h，BCIP/NBT显色。
2结果与分析
2.1重组人gdnf乳腺特异表达载体的鉴定
载体物理图谱见图1，PCR检测目的基因gdnf的插入方向见图2。酶切鉴定gdnf 插入方向正确的载体，用ApaⅠ单酶切载体后，线性载体大小与预期大小（11 507 bp）相符；用XhoⅠ酶切载体能够获得预期的576 bp的目的基因 gdnf 片段；用ApaⅠ/XhoⅠ双酶切载体能够获得预期的3.6 kb调控序列片段和576 bp目的基因gdnf 片段（图3）。载体与片段连接处、牛β-casein基因5′端调控序列核心区域的测序结果正确（数据未显示）。结果表明，本研究成功构建了以neo基因和DsRed2作为双筛选因子、牛β-casein基因5′端调控序列驱动的重组人 gdnf 乳腺特异表达载体。
2.2转基因细胞的鉴定
线性化载体转染B-cap37细胞，G418筛选8～10 d 后，获得了表达红色荧光蛋白的细胞克隆（图4）。分离扩培红色荧光细胞，提取基因组DNA，PCR扩增重组人gdnf，发现未转染细胞无特异条带，而稳定转染的红荧光细胞获得了与预期一致的特异条带（图5），表明重组人gdnf已整合到细胞基因组之中。
2.3gdnf 基因的诱导表达
2.3.1RT-PCR检测阳性转基因细胞及未转染细胞诱导培养24、48h后提取RNA，以RNA为模板PCR扩增 gdnf cDNA，无特异条带产生，表明RNA未受基因组DNA污染；以RNA为模板反转录合成cDNA第1链，PCR扩增 gdnf cDNA基因，诱导培养24、48 h的转基因细胞获得了558 bp特异条带，而阴性对照无特异条带产生（图6）。结果表明牛β-casein基因启动子能够驱动gdnf cDNA基因转录为mRNA。
2.3.2Western Blot检测诱导培养48 h的转基因细胞上清液经Western Blot探测，有大约15、18 ku 的2条特异带形成，而未转染细胞无特异带形成（图7），表明 gdnf cDNA基因能够翻译成蛋白，而且能进行翻译后加工形成糖蛋白分泌到细胞外。
3结论与讨论
当前，用于疾病动物模型和临床研究的重组人GDNF是用转基因大肠杆菌发酵制备的[8]。用大肠杆菌生产的重组人GDNF不能被糖基化[8]。临床研究表明，糖基虽然对GDNF的神經营养功能不是必要的，但在帕金森病Ⅱ期临床研究中，约有10%的病人由于重组人GDNF缺乏糖基化而产生了抗GDNF抗体的免疫反应[9]；因而，利用大肠杆菌生产重组蛋白虽然快速经济，但该表达系统由于缺乏翻译后修饰功能，而不适用于需要进行翻译后修饰的重组蛋白的生产。而且，已有研究表明利用大肠杆菌生产的重组人GDNF由于蛋
白质的错误折叠而影响了其生物学功能[10]。也有研究者用昆虫细胞和酵母菌制备重组人GDNF，这些低等真核细胞虽然可以表达糖基化的重组人GDNF，但其糖基化与天然的人GDNF的糖基化有差异[11-13]，从而在临床研究中同样存在安全问题。
当前，需要进行翻译后修饰的重组蛋白大多用非人类的哺乳动物细胞进行表达[14]。用非人类的哺乳动物细胞可以表达与天然人蛋白结构一致的重组人蛋白，但也有时候存在差异[15]；因而在治疗应用上，人们更希望利用人细胞系来生产与天然人蛋白结构完全一致的重组人蛋白[16]。
本研究将人gdnf cDNA插入到3.6 kb牛β-casein基因5′端调控序列下游，并用SV40 polyA序列作为其转录终止信号，构建了重组人 gdnf 乳腺特异表达载体。将其转入人乳腺肿瘤细胞系Bcap-37中，获得了随机整合转基因细胞，用激素诱导表达后在细胞上清液中检测到了重组人GDNF蛋白。人GDNF蛋白为同源二聚体糖蛋白，单体糖蛋白18 ku，去糖基化单体约15 ku[17]。本研究从激素诱导的转基因细胞上清液中通过Western Blot 探测到约15、18 ku的2条特异条带，且重组人GDNF蛋白绝大部分为糖基化蛋白（图7）。由于该重组蛋白是用人乳腺肿瘤细胞系作为反应器制备的，因而，我们推测在人乳腺肿瘤细胞系Bcap-37中表达的18 ku重组人GDNF蛋白与天然的人GDNF相比，在结构上应当没有差异，如果用于临床研究应当更具有安全性。本研究为高效制备与天然人GDNF蛋白结构完全一致的重组人GDNF蛋白用于帕金森病临床治疗研究奠定了基础。
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人角膜上皮细胞 篇4
1资料与方法
1.1动物及主要试剂
1.1.1家兔:体重1.5～2.0 k g
1.1.2羊膜匀浆上清液:自制,方法如下:在超净台上将羊膜在PBS液中清洗3次,约10～15分钟,取适当大小称湿重,按1:1加PBS液放入匀浆机中,每分钟5000转,10冲程磨制匀浆,每冲程30秒。取出匀浆按1:5加PBS液于离心管中离心,2000 r p m,10分钟,取上清液备用(1小时内用)。后加入细胞冻存液放入～8 0摄氏度冰箱过夜,再放入液氮中冻存。
1.1.3 b FGF:贝复舒眼液
1.1.4 1mol/L AaOH:自制
1.2碱烧伤动物模型的制备
1.2.1 1%丁卡因眼液点眼3次。
1.2.2乙醚吸入麻醉。
1.2.3开睑器开睑,将浸在mol/L AaOH的直径为8mm的滤纸片置于兔角膜中央30s。
1.2.4生理盐水冲洗结膜囊3 min。
1.3动物分组
1.3.1不同浓度羊膜匀浆上清液点眼分组:取20只(40眼)家兔随机分为4组:A组(生理盐水对照组)、B组(1:1羊膜匀浆组)、C组(1:2羊膜匀浆组)、D组(1:3羊膜匀浆组)。每组5只兔子10只眼,烧伤后每天行角膜荧光素染色并在裂隙灯下观察角膜愈合情况,每组在术后第1天、第3天、第7天照相。
1.3.2羊膜匀浆上清液和贝复舒眼液点眼治疗碱烧伤分组:取15只家兔(30只眼)分为3组:对照组(生理盐水点眼)、羊膜匀浆组(1:2羊膜匀浆上清液点眼)、bFGF组(贝复舒眼液点眼),每组5只兔子10只眼,烧伤后每天行荧光素染色并在裂隙灯下观察角膜愈合情况,每组在术后第1天、第3天、第5天、第7天和第1 4天照相。
1.4动物点眼
1.4.1不同浓度羊膜匀浆上清液点眼:
碱烧伤后立即开始点眼,A组(生理盐水+氯霉素眼液点眼)、B组(1:1羊膜匀浆上清液+氯霉素眼液点眼)、C组(1:2羊膜匀浆上清液+氯霉素眼液点眼)、D组(1:3羊膜匀浆上清液+氯霉素眼液点眼)。
1.4.2羊膜匀浆上清液和贝复舒眼液点眼:
碱烧伤后立即开始点眼,羊膜匀浆组(1:2羊膜匀浆上清液+氯霉素眼液点眼)、b FGF组(贝复舒眼液+氯霉素眼液点眼)、对照组(生理盐水+氯霉素眼液点眼)。每天每眼点眼3次,羊膜匀浆组每天从液氮中取出新鲜配制。
1.5角膜上皮愈合率测量并行计算机图像分析
1.5.1不同浓度羊膜匀浆上清液点眼后的观察
碱烧伤后第1天、第3天、第7天行角膜荧光素染色后角膜上皮愈合情况照相并行角膜上皮愈合率计算机图像分析。
★:与A比较,p<0.05★★:与A比较,p<0.0 1▲:与D比较,p<0.05
a:与1组比较,p<0.05 b:与2组比较,p<0.0 1 c:与3组比较,p<0.01
1.5.2膜匀浆上清液和贝复舒眼液点眼后观察
术后第1天、第3天、第5天、第7天行角膜荧光素染色后角膜上皮愈合情况照相,然后行角膜上皮愈合率计算机图像分析。
1.6统计学处理
所有数据均用均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS10.0软件包行方差分析。
2结果
2.1不同浓度羊膜匀浆上清液点眼治疗兔角膜碱烧伤后角膜上皮愈合率比较(见表1,图1)
碱烧伤后第1天,A组与B组相比差异非常显著(p<0.01),与C组相比差异显著(p<0.05),与D组相比无显著差异;B组和C组无显著差异(p>0.05),B组、C组与D组相比差异显著(p<0.05)。碱烧伤后第3天,A组与B组、C组间差异非常显著(p<0.01),与D组间差异显著(p<0.05),B组、C组和D组三组间无显著差异(p>0.05)。碱烧伤后第7天A组与B组和D组差异显著(p<0.05),与C组差异非常显著(p<0.01),B组、C组和D组三组间无显著差异(p>0.05)。在点眼中发现将1:1组羊膜匀浆点眼后结膜充血明显,3～5分钟后自动消失。
2.2羊膜匀浆上清液和贝复舒眼液点眼治疗角膜碱烧伤的角膜上皮愈合率比较(见表2,图2)
碱烧伤后第1天和第3天,羊膜匀浆组与对照组和b F GF组相比,差异显著(p<0.05),b FGF组和对照组间无显著差异(p>0.05)。第5天、第7天,羊膜匀浆组、bFG F组与对照组相比差异非常显著(p<0.0 1),而羊膜匀浆组和bFGF组间无显著差异(P>0.05)。
3讨论
角膜碱烧伤后眼表常受到严重损害或缺损,眼科医师常常束手无策,最后导致严重的烧伤后遗症如睑球粘连、大量新生血管、角膜上皮反复脱落或经久不愈致溃疡穿孔、大量假性胬肉形成等。近年来羊膜移植被广泛用于碱烧伤治疗中,多数学者认为它是一种暂时性的生物覆盖物,在移植后1～2周,羊膜自行溶解、脱落,而且在碱烧伤的急性期和溶解期,羊膜移植更不能达到预期效果。根据羊膜自身可表达EGF、TGF-a、KGF、HGF、bFGF、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 8种生长因子的mRNA的研究报道[1,2],作者将羊膜制备成匀浆上清液并进行了体外实验,发现羊膜匀浆上清液对兔角膜上皮细胞有明显的促增殖作用,在96小时内随时间的延长、浓度的增加其促增殖作用增强[3],根据体外实验结果,我们认为羊膜匀浆上清液对眼表上皮病变的修复可能有促进作用,因此我们进一步将其用于动物活体实验。结果发现羊膜匀浆组碱烧伤后第1天、第2天、第3天与bFGF组和对照组相比,角膜愈合率比较有显著差异,说明羊膜匀浆在碱烧伤早期就能发挥促上皮细胞生长、增殖作用,其机理可能是羊膜匀浆抑制了早期的急性炎症反应,从而更利于上皮愈合。第7天和第1 4天时与bFGF组无明显差异,说明急性炎症过后羊膜匀浆和bFGF促进角膜上皮愈合的作用相当。
参考文献
[1] Sato H,Shimazaki J.Shinozaki N:Role of growth factors for ocular surface reconstruction after amniotic membrane transplantation.Invest Ophthalmol Vis Sci,1998;39:S428
[2] Koizumi N,Inatomi T,Sotozono C,et al.Growth factor mRNA and protein in preserved human amniotic membrane.Current Eye Research,2000;20:173～177