Th细胞分化

Th细胞分化（精选九篇）

Th细胞分化 篇1

1 Materials and methods

1.1 Materials

RPMI-1640 was purchased from SIGMA,rhGM-CSF and rhIL-4 from Cytolab Ltd,rhIL-2 from Nanking Academy of Military Medical Sciences,rhT-NF-αfrom CHEMICON International Inc.,anti-CD1a and anti-CD83 MoAb from CALTAGLABORATO-RIES,anti-80 and anti-86 MoAb from SOUTHERN Biotechnology Associates Inc.,ELISA kits for IL-4,IL-6,IL-12 and IFN-γwere from Shanghai Senxiong Technology Ltd.,Dynal cell detachment kit for CD4+cell from Shanghai Jingmei Biotechnology Co.,Fix&PERM kit from Suzhou Lianke Biotechnology Co.,flow cytometer was from BECTON DICKINSON.

1.2 Researched objects

40 cases of CHB patients were visiting patients from the Department of Hepatitis in the Affiliated Hospital of Nantong University,24 cases were male,16 cases were female,and the ages were twenty to fifty years old.All of them were diagnosed as CHB referred to the diagnostic criteria of the viral hepatitis[6].Control group was composed of 12 male health volunteers and 4 female health volunteers,whose serum alanine aminotransferase level was normal and whose serum HBV-marker(HBVM)was negative.

1.3 Inducing DCs in vitro

Mononuclear cells isolated from peripheral blood were suspended with complete medium,and the cell suspension(2×109/L)was put into a 24-well plate in 1mL per well.The mononuclear cells were incubated at37℃5%CO2for 2 hours.The adherent cells were obtained by discarding the culture supernatants and washing the well to remove non-adherent cells.Then,1 mL of the culture medium containing IL-4(500 ku/L)and rhGM-CSF(1000 ku/L)was added in each well.After being cultured for 3 days,every well was added with rhTNF-αin the concentration of 100μ/mL.The cells were sequentially cultured.

1.4 Detection of DC′s phenotypes

DCs were collected and washed,and then were incubated with PE or FITC labeled mAbs respectively against human CD1a,CD80,CD83,CD86 or HLA-DR.After two washes,the stained cells were analyzed by flow cytometer to determine the expression condition of every phenotype of CD1a,CD80,CD83,CD86and HLA-DR.

1.5 Detection of cytokines

The supernatants of DCs cultured for 7 days or Th cells cultured for 5 hours were collected and conserved for detecting cytokines of IL-6,IL-12,IFN-γand IL-4 with ELISA at the same time.The experiments were operated in accordance with instruction manual of ELISA kits.

1.6 Purification of Th cells from PBMCs with Dy-nal immunomagnetic beads

PBMCs were obtained from 5 mL peripheral blood with density gradient centrifugation and were suspended in PBS.First,the agent A was added into the PBMCs suspension to absorb CD4+T cells.Thereafter,the agent B was added into the same suspension to get rid of absorbing effect and then the purified CD4+T cells were harvested.CD3-FITC McAb(20μL)and CD4-PE(20μL)were added into 2×105purified cells and the cells were incubated at 4℃in dark for 30 minutes.The cells were washed twice and were suspended again in 200μL PBS.Detected by flow cytometer,the purity quotient of CD4+T cells purified with Dynal beads was 98.5%.

Note:覮P<0.01,compared with the group of health adults.

1.7 Detection of intracellular cytokines IFN-γand IL-4

Purified Th cell suspension(106cells/mL)was added with PMA(20 ng/mL),Ionomycin(1μg/mL)and Brefeldin(10μg/mL),and cultured at 37℃5%CO2for 5 hours.Subsequently,these cells were labeled with IFN-γ-FITC or IL-4-PE.With flow cytometer,the labeled cells were counted to reveal the expression levels of intracellular cytokine of IFN-γor IL-4.

1.8 Co-culture of DCs with allogeneic Th cells

Th cells from health adults were purified and frozen at-70℃in two weeks.The DCs which were induced from PBMC of CHB patients or health adults and cultured till the 7th day were respectively mixed with the Th cells from health adults at the ratio of 1 to3,and the mixed cells were cultured in a 96-well plate.Meanwhile,the purified Th cells from health adults and the DCs from health adults which had been cultured for six days were respectively cultured and treated as two control groups.48 hours later,the culture supernatants of the cells were collected for detecting cytokines of IFN-γand IL-4 with ELISA kits.

1.9 Statistical analysis

The data in the paper were displayed as mean±standard deviation.The t-test was applied and the statistical treatment of the data was operated with Stata6.0 statistical program.

2 Results

2.1 Analysis of phenotypes on DCs from CHB pa-tients

After being cultured for 6 days,the DCs from both CHB patients and health adults were harvested,and the DCs′phenotypes were analyzed.The experimental result(displayed in Table 1)demonstrated the expression of every molecule phenotypes of CD1a,CD80,CD86,CD83 and HLA-DR on DCs from CHB patients was less than that on DCs from health adults of control group.

2.2 Changes on capabilities of secreting IL-12and IL-6 of DCs from CHB patients

The culture supernatants of DCs cultured for 6days were collected,the cytokine contents of IL-12and IL-6 in the supernatants were assayed.Shown as table 2,the content of IL-12 in supernatants of CHB patients′DCs was obviously lower than that in supernatants of health adults′DC,but the content of IL-6in supernatants of CHB group was notably higher than that in supernatants of normal controls.

Note:1):P<0.05,2):P<0.01,compared with the group of health adults.

2.3 State of Th cell differentiation in peripheral blood of CHB patients

2.3.1 Capabilities of secreting IFN-γand IL-4 of Th cells from peripheral blood of CHB patients

Purified Th cells were irritated with PMA+Ionomycin and cultured for 5 hours,then,the contents of IFN-γand IL-4 in culture supernatants of Th cells were respectively detected.Showed as Table 3,the content of IFN-γin supernatants of Th cells from CHB patients was remarkably lower than that of Th cells from persons of control group(P<0.01),but there was no obvious discrepancy on content of IL-4 in supernatants of Th cells between the two groups.

Note:覮P<0.01,compared with control group.

2.3.2 Variation of subgroups of Th1 and Th2 inperipheral blood of CHB patients

Purified Th cellswere irritated with PMA+Ionomycin and cultured for5 hours.Then,the cells which could create IFN-γor IL-4 in these Th cells were determined,and the ratio of Th1 or Th2 in CD4+T cells of peripheral blood was respectively calculated.The experiments manifested that the percentage of Th1 in CD4+T cells of CHBgroup was notably lower than that of control group(P<0.01),however,the contrast of the percentages of Th2 in CD4+T cells between the two groups had no statistical significance,the experimental results were displayed in Table 4.

Note:覮P<0.01,compared with control group.

2.4 Alteration of ability to stimulate Th1/Th2 cell differentiation of DCs from CHB patients

The full-grown DCs from health adults(group 1,n=8)and purified Th cells from health adults(group2,n=8)were respectively cultured,and the DCs from CHB patients(group 3,n=8)or from health adults(group 4,n=8)were respectively co-cultured with Th cells.After culturing for 48 hours,the supernatants of each well were harvested to detect the contents of IFN-γand IL-4.Showed as Figure 1,the contents of IFN-γand IL-4 in supernatants of full-grown DCs(group 1)or Th cells(group 2)were very low,but the contents of the two cytokines in the supernatants of co-cultured cells of group 3 and group 4 were obviously high,furthermore,the content of IFN-γin supernatants of group 3 was strikingly higher than that in the supernatants of group 4[(884±78)pg/mL and(342±34)pg/mL,respectively;t=18.0167,P<0.01)]and the content of IL-4 in supernatants of group 3was slightly higher than that in supernatants of group4(P>0.05).

3 Discussion

The exact mechanism has not been elucidated that HBV eludes the effect of human immunity to lead to persistent infection.In the immune response on removing HBV,specific CD4+Th cells and CD8+CTL play important roles.The efficient Th1 cell reaction is necessary not only for stimulating specific CTL response to virus but also for inducing neutralizing antibody,so it occupies central position in immune network against viral infection[7～9].The former experimental and clinical research data have revealed that the insufficiency of Th1 cell reaction may be found in most of CHB patients and may be related to consistent infection of HBV[10～12].Up to now,DCs are the only kind of antigen presenting cells(APC)known by us which can activate Th0 cells to differentiate Th1 cells or Th2 cells.In this study,we investigated the relationship between the state of DCs′functions and differentiation of Th cells.

First,we observed the expression of molecules of CD1a,CD80,CD86,CD83 and HLA-DR on DCs as well as the capacity of generating IL-12 in CHB patients were markedly weaker than those in health adults,but the ability of excreting IL-6 in CHB patients′DCs was notably higher than that in normal people,and these phenomena indicated that DCs in CHB patients were immature and out of function.In order to investigate the state on differentiation of Th1/Th2 cells in peripheral blood of the patient with CHB,we synchronously applied the method of ELISA to detect cytokines of IFN-γand IL-4 excreted by Th cells from peripheral blood and the flow cytometer to count the Th cells which could excrete IFN-γor IL-4 at the same time.The experimental results showed that both the contents of IFN-γin culture supernatants of Th cells and the percentages of Th1 cells in total Th cells in peripheral blood of CHB patients were markedly lower than those of health adults,and there were no statistical differences in the contents of IL-4 in supernatants of Th cells and the percentages of Th2cells in total Th cells between the two groups of CHB patients and normal controls.These results suggested the differentiation of Th0 cells to Th1 cells should be insufficient in vivo of CHB patients.

At the initial phase of activation,the undifferentiated Th0 cells need two signals.By recognizing the epitope of MHC-Ⅱmolecule(HLA-DR)with antigen-receptor on the surface of the undifferentiated Th0 cells,the undifferentiated Th0 cells can acquire the first signal,the second signal is provided by many kinds of co-stimulatory molecules on the surface of DCs(e.g.CD40,CD80,CD86)and Th cells(e.g.CD40L,CD28).Besides,IL-12 secreted by DCs is a main cytokine to promote differentiation of Th1 cells,and IL-6 is considered as a kind of cytokine which has down-regulation function for differentiation of Th1cells[13].Because immaturity,the DCs from CHB patients insufficiently express phenotype molecules such as HLA-DR,CD80,CD86,and secrete a little IL-12but too much IL-6,these agents must weaken the function of DCs on deriving Th0 cells to Th1 cells.Simulating the course in which DCs induce Th cells to differentiate through presenting exogenous antigen,we respectively mixed allogeneic Th cells from normal people with CHB patients′and health adults′DCs which had been cultured for six days,and continued co-culturing them.Then,we detected the contents of IFN-γand IL-4 in supernatants of co-cultured cells so as to make an initial inference about the DCs effect on Th1/Th2 cell differentiation[14].The experimental results displayed that the faculty of secreting IFN-γand IL-4 of mature DCs was obviously enhanced when the DCs were co-cultured with Th cells,nevertheless,the ability of the DCs from CHB patients on stimulating Th cells to secrete IFN-γwas lower than that of the DCs from normal controls,but the ability of CHB patients′DCs on stimulating Th cell to secrete IL-4 was the similar to that of health people′s DCs.This consequence indicated that abnormal status of DCs in CHB patients principally diminishes the differentiation from Th0 cells to Th1 cells but does not obviously influence the differentiation from Th0 cells to Th2 cells.

According to the above findings,we could infer that immaturity and hypofunction of DCs of CHB patients are one of the important causes for insufficiency of Th1 cell response in vivo.

摘要：目的探讨慢性乙型肝炎患者树突状细胞(dendriticcells,DCs)与CD4+Th细胞亚群分化的关系。方法分离慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞,以rhIL-4(50ng/mL)、rhGM-CSF(10ng/mL)和rhTNF-α(100μ/mL)诱导培养DC。以流式细胞仪检测DCs表面CD1a、CD83、CD80、CD和HLA-DR分子的表达情况。免疫磁珠分离外周血CD4+T细胞亚群,PMA+Ionomycin刺激后胞内荧光染色,流式细胞仪检测Th细胞内特征性细胞因子IFN-γ/IL-4以判断Th1/Th2分化。ELISA法检测DCs或Th细胞培养上清中IL-6、IL-12、IFN-γ和IL-4的含量。结果慢性乙型肝炎患者的DCs表达CD1a、CD83、CD80、CD86和HLA-DR分子的水平明显低于正常人;培养至第7天,慢性乙型肝炎患者DCs分泌的IL-12水平低于正常人,而分泌的IL-6水平高于正常人。与正常人相比,慢性乙型肝炎患者外周血中Th1细胞占CD4+T细胞的百分比较低,Th细胞培养上清中IFN-γ的量也较低。患者DCs与同种异体的健康人Th细胞共培养,刺激Th1型细胞因子IFN-γ产生的能力低于正常人。结论慢性乙肝患者体内DCs功能的异常可能导致了外周血Th1分化不足。

细胞分化教案 篇2

[设计思路]

关于细胞分化，课程标准的要求是“说明细胞的分化”和“举例说明细胞的全能性”，这都是“理解”水平的要求；课程标准建议开展的学生活动是“搜集有关干细胞研究进展和应用的资料”。鉴于细胞分化的重要性，课程标准从知识层面对细胞分化的学习内容提出了比较高的要求。本节内容是这样安排的：先介绍什么是细胞分化，细胞分化对多细胞生物体的发育有什么重要意义；再介绍已经分化的细胞，仍然可能具有发育为完整个体的潜能，即具有全能性；最后安排“干细胞研究进展与人类健康”的资料搜集与分析活动。

细胞分化是多细胞生物体发育的基础和核心，为提高学生的学习兴趣，联系媒体上经常有号召大家向白血病患儿献爱心，捐骨髓的报导，引导学生思考，为什么骨髓移植能治疗白血病？只要平时关注媒体报道的学生，大多数能说出“是因为骨髓中有造血干细胞。”就此引入细胞分化的学习。

细胞分化的概念，内涵较深刻，也是学生较难理解的，可通过提供充分的感性材料：图像信息，多媒体课件演示动物个体发育过程，植物个体发育过程；帮助学生理解早期胚胎中彼此相似的细胞，经过分裂和分化，发育为形态、结构和功能上不相同的细胞。从而认同细胞分化的重要意义。在学生理解了细胞分化的重要意义后，可引导学生由现象深入到本质，探究细胞分化产生的稳定性差异是不是遗传物质的改变引起的？怎样用科学的方法来证明你的观点？培养了学生的科学研究方法和创新精神。

细胞的全能性是教学的难点，可通过利用多媒体动、植物细胞全能性的试验，以及学生列举事例来加深理解。掌握全能性的概念、组织培养和克隆知识在工农业生产方面的应用。[教学目标]

1、知识目标：

（1）说出细胞分化的概念及在生物个体发育中的意义

（2）举例说明细胞的全能性在生产实践与科学研究中的作用，说出细胞全能性的实质及植物细胞和动物细胞全能性的不同点，能够区分具体细胞全能性的大小（3）举例说明干细胞的种类、特点和应用。

2、能力目标：

（1）在教师的引导下，师生共同探究，使学生学会学习，培养分析、归纳的思维能力和自主学习的能力

（2）探究细胞分化的特点，细胞全能性的概念，培养学生的科学探究方法和生物学素养

3、情感态度价值观：

1（1）通过学习使学生体会生命的运动性，体会内因和外因对生命进程的影响等哲学思想

（2）引导学生关注当今世界面临的重大社会问题和人类健康问题，激发社会责任感和使命感，激发学生关爱生命的美好情感。[教学重点与难点]

教学重点

（1）细胞分化的概念和意义（2）细胞全能性的概念 教学难点

（1）细胞分化的概念

（2）细胞全能性、干细胞概念及实例。教法学法：

高中阶段的学生已经有了一定的抽象思维能力和综合思维能力。由于此部分知识比较抽象，学生将抽象知识具体化、形象化的能力还不够，需要教师由浅入深，从生活中的事例入手，从学生身边常见的实例展开组织教学活动。同时，由于学生的心理特征存在个体差异，对新鲜知识的接收与认知程度不一，因此，教学中要注意从学生的具体实际出发，抓住学生的认知特点，采用恰当的教学策略，使生物科学知识有效地整合到学生原有认知结构中去，丰富和发展原有知识体系，在大脑中建构起新的知识、能力、价值观联系。

1．本节课的授课形式以学习分析正确例证为主，教师主要起引导和提示作用，是“学与教”的过程模式。

2．在教学中为了激发学生的学习动机，采取了以下策略：创设问题情境，激发学生的认识兴趣和求知欲；使学习材料与社会生活相联系，增强学生对获得有用的知识本身发生兴趣；进行正确的评价和适当的表扬，以巩固和发展学生正确的学习动机。课时安排： 1课时。教学过程： 【提出问题】

个体发育的起点是什么？

受精卵发育成个体的过程中细胞由少变多，依靠的是哪种细胞增殖方式呢？ 如果单纯通过细胞分裂使细胞数目增加，会不会形成一个独立的生物个体？ 【学生讨论】

学生联系细胞增殖的有关知识。个体发育的起点是受精卵，受精卵发育成个体的过程中细胞由少变多，依靠的是有丝分裂，而如果只有细胞分裂是不能形成一个独立的生物体的。要形成一个生物个体，就还要经过细胞的分化，引入“第一节 细胞分化“ 【教师引导】

个体的形成除了通过细胞分裂使细胞数目增多，还要经过细胞分化的过程。那什么是细胞分化呢？ 【学生回答】

在个体发育过程中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。【教师引导】

那么细胞分化发生在什么时期？有什么样的特征呢？（引导学生阅读课本113页，归纳细胞分化的特征和意义）【学生讨论 教师共同归纳】

细胞分化是生物界中十分普遍的一种生命现象（普遍性）；细胞分化发生于生物体的整个生命进程，但在胚胎发育期最旺盛、最频繁（持久性）；分化后的细胞将一直保持分化后的状态，而不会再变为其它细胞（稳定性）；造血干细胞会分化为红细胞，红细胞最终衰老、死亡，而不会再形成造血干细胞（不可逆性），分化的过程中遗传物质不改变（遗传物质不变性）。

那么细胞分化对生物体的生长发育具有什么样的意义呢？

细胞分化使多细胞生物中的细胞趋向专门化，有利于提高各种生理功能效率。是生物个体发育的基础。【教师引导】

现在我们知道了，一个个体的形成既要有细胞分裂，又必须进行细胞分化。既然同一个体的每个细胞都由受精卵有丝分裂产生，而细胞分化使细胞之间存在稳定的差异，这些差异差异是不是细胞的遗传物质改变引起的呢？ 【学生讨论 教师共同归纳】

细胞有丝分裂能够保证每个子细胞都获得了与母细胞同样的一份染色体，具有相同的遗传信息，并未发生遗传物质的改变，细胞分化的遗传本质是基因选择性表达的结果。教师例举关于细胞分化的具体例子。红细胞 红细胞合成血红蛋白

——均来自中胚层 ——基因选择性表达的结果——细胞分化

心肌细胞 心肌细胞合成肌动、肌球蛋白 【过度】 高度分化的细胞，已经失去了继续分裂的能力，那它们还能像早期胚胎细胞那样，再分化成其他细胞吗？引入细胞全能性的探究。

根据细胞分化和分裂的关系，细胞分裂是分化的基础，要想让高度分化的细胞再继续分化，必须要具备什么条件？（首先要恢复其分裂能力。）那能否实现呢？

【学生思考阅读与分析】

展示图7-1植物组织培养的流程图。

【学生讨论】通过对植物组织培养实验的分析，得出什么是细胞全能性的概念？细胞为什么会有全能性呢？

【学生讨论】细胞全能性是指高度分化的植物细胞，仍然具有发育成完整个体的潜能，这种潜能我们称之为细胞全能性。高度分化的植物细胞中含有保持本物种遗传性的全部基因，这也就是细胞具有全能性的根本原因。

【教师引导】通过对植物组织培养实验的分析，得出高度分化的植物细胞，仍然具有发育成完整个体的潜能，这种潜能我们称之为细胞的全能性。那么细胞为什么会有全能性呢？

【教师引导】：高度分化的植物细胞中有没有因为分化而失去基因？（没有）高度分化的植物细胞中含有保持本物种遗传性的全部基因，这也就是细胞具有全能性的根本原因。【提出问题】

按照以上逻辑进行分析，高度分化的动物细胞也应该具有全能性，也应该能够发育成一个完整的个体。但事实是否如此呢？到目前为止，人们还没有成功的将单个已分化的动物细胞培养成新的个体。那有些同学可能就会提出疑问了，那克隆羊又是怎么回事呢？

【图7-2】蛙的核移植实验流程图，讲解动物克隆——“多莉”产生的过程图解。【学生讨论】得出高度分化的动物细胞全能性受到限制，而高度分化的动物细胞的细胞核具有全能性。

设问推测克隆羊和哪只绵羊最相似？推测的依据？（提供细胞核，细胞核中含有本物种全套遗传物质）。因此高度分化的动物细胞全能性虽然受到限制，而细胞核具有全能性。

【教师引导】从上述实验，我们知道了动物细胞的细胞核具有全能性，既然每个细胞的细胞核仍然具有全部遗传物质，那为什么高度分化的动物细胞不能直接发育成一个完整的个体，动物细胞的全能性究竟怎样呢？并让学生比较植物细胞，动物细胞；受精卵，卵细胞、体细胞的全能性大小。【学生讨论】

高度分化的动物细胞的全能性小。高度分化的植物细胞的全能性大于高度分化的动物细胞；受精卵的全能性最大；以此得出结论：细胞分化程度越低，全能性就越高。【教师引导】

那么在动物体和人体内，就没有能够进行分裂和分化的细胞了吗？（讲解细胞分化的过程）

【学生讨论，师生共同归纳】

在动物和人体内仍保留少数具有分裂和分化能力的细胞——干细胞，【学生思考】图7—3干细胞分化形成各种血细胞的过程示意图。讨论干细胞的分类

根据干细胞分化潜能不同可分为全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞。总结出受精卵早期分裂出的细胞是具全能性的。随着细胞的分裂与分化，发育的潜能渐渐被局限，从全能干细胞到多能干细胞，到专能干细胞，最后成为分化终端的细胞。

【教师讲述】 有关白血病和骨髓移植方面的文字资料。【提出问题】

1、请同学们说说对白血病的了解。

2、捐献适量的造血干细胞，为什么不会伤害捐献者的身体健康？

3、骨髓移植为什么可以治疗人类白血病？ 【学生讨论】

1、白血病患者的血液中出现大量的异常白细胞，而正常的血细胞明显减少。

2、健康人的造血干细胞会不断产生新的血细胞。

3、骨髓内有造血干细胞，造血干细胞可以产生各种血细胞（过渡）同学们，我们是幸运的，因为我们是健康的，对于白血病患者，我们能做些什么呢？学生发表自己的意见，教师说，啊，只要人人都献出一点爱，世界将变成美好的人间。

【小结】细胞分化是生物界普遍存在的一种生命现象，细胞分裂是细胞分化的基础，通过细胞的分裂和分化，生物体才能完成生长、发育和繁殖的过程。细胞的全能性是指已经分化的细胞，仍具有发育成完整个体的潜能。人类利用植物细胞的全能性，通过组织培养，生产出大量的植物优良品种，拯救珍稀物种，为人类造福。对动物和人体干细胞的研究，将为人类战胜病魔带来福音。同学们，努力吧，走科学研究的道路，胜利是属于你们的。

板书设计 第二节 细胞分化

一、细胞的分化

1、概念

2、特征（1）普遍性

（2）持久性

（3）稳定性

（4）不可逆性（5）遗传物质不变性

3、意义

4、实质：基因选择表达的结果

二、细胞分化的基础——细胞全能性

1、概念

2、原因

三、干细胞

1、概念

2、种类

Th细胞分化 篇3

关键词：Th1/Th2细胞因子,细胞因子磁珠分析(CBA),肺结核

结核病属于有菌免疫,主要致病原是结核分枝杆菌(简称结核杆菌),机体主要通过Th1细胞反应和Th1细胞因子组成的免疫网络监测结核杆菌的感染。细胞因子可分为Th1型(IFN-γ、IL-2、TNF-α等)和Th2型(IL-4、IL-5、IL-10等),前者有利于清除体内的结核杆菌,后者则有利于结核杆菌在机体内存活。Th1/Th2细胞因子已成为结核病疫苗免疫原性评价的重要指标,有利于刺激Th1细胞反应和Th1细胞因子的疫苗才具有研究价值[1];另一方面,Th1/Th2细胞因子也应用于结核病诊断,患者外周血单核细胞(PBMC)经结核病杆菌特异的抗原或合成多肽刺激(如ESAT-6抗原或多肽)分泌IFN-γ的细胞数目多,表明患者结核病可能性大,即酶联免疫斑点(enzyme-linked immunospot,ELISPOT)技术[2]。

胞内Th1/Th2细胞因子可将Th细胞分为Th1细胞和Th2细胞,循环细胞因子可用于结核病诊断,常规检测方法有ELISA和RT-PCR(检测m RNA)[3];较少报道基于磁珠技术的流式细胞术(cytometric bead array,CBA)检测结核病患者分泌的细胞因子。CBA方法直接检测蛋白水平,无需PBMC体外刺激培养,这样可排除PPD皮试阳性者外周血培养对结果的影响;同时,CBA还可减少ELISA操作繁琐和人为因素引起的误差。本文的目的是建立CBA用于结核病患者循环细胞因子的检测,同时了解结核病患者Th1/Th2细胞因子水平。

1 材料与方法

1.1 对象

涂阳肺结核患者19例,涂阴肺结核患者17例,均来自我院结核病研究所结核四科;诊断标准按2001年中华医学会结核病学分会颁布的《肺结核诊断和治疗指南》进行:具有肺结核病一般临床症状,X线检查有肺部病灶,痰检查抗酸杆菌阳性(痰菌阴性者符合痰菌阴性肺结核诊断标准);均为新发现的初治肺结核患者,男性22例,女性14例,年龄16~87岁,平均年龄42岁。健康者为采用国际通用Mantoux法进行PPD 5 u皮试反应结果为一般阳性、X线检查未发现肺部病灶的志愿者,共10名。其中,男性3名,女性7名,平均年龄28.3岁。

1.2 试剂和仪器

人Th1/Th2细胞因子检测试剂盒和FACSCalibur流式细胞仪购自BD Biosciences公司。

1.3 临床标本收集

抽2 m L静脉血于ETDA抗凝管中,2 500 g离心10 min,吸取上清立即储存于-80℃待测。

1.4 方法

1.4.1 细胞因子磁珠分析法(cytometric bead array,CBA)

试剂盒提供的Th1/Th2细胞因子冻干标准品溶解于2.0 m L稀释液,15 min后进行稀释。采用倍比稀释(取300μL标准品溶液加入300μL稀释液,并吹打混匀,即为1∶2倍稀释。依次进行1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256及1∶512倍稀释。6种细胞因子捕获磁珠等体积混合、震荡,取50μL混合的Th1/Th2细胞因子捕获磁珠于分析管中。依次加入50μL PE标记的检测试剂,50μL标准品或50μL待检样品,震荡混匀后室温避光3 h。加1 m L洗液,200 g离心5 min。加300μL洗液悬浮磁珠,上流式细胞仪前各样品振荡3~5 s。采集流式图谱并用BD FACSComp软件分析换算成浓度。

1.4.2 统计学方法

计量资料以均数±标准差表示,采用一元方差分析,分析软件为SPSS13.0,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 CBA检测细胞因子

涂阳、涂阴肺结核病患者和健康人外周血细胞因子均为pg/m L水平(附图)。

2.2 不同组别患者外周血循环细胞因子

涂阳肺结核患者和涂阴肺结核患者循环IFN-γ显著升高,而IL-5显著降低;涂阳肺结核患者循环IL-10显著升高,涂阴肺结核患者循环IL-10含量绝对值升高,但差异无显著性;两组患者循环的

附表初治肺结核病患者循环Th1/Th2细胞因子含量(pg/m L)

注:(+):涂阳;(-):涂阴;1)与健康人比较,P<0.05;2)与健康人比较,P<0.01

A:涂片阳性肺结核;B:涂片阴性肺结核;C:健康对照

3 讨论

结核杆菌感染机体或巨噬细胞可引起细胞因子(炎症因子)的分泌发生变化,ELISA和RT-PCR均证实,活结核分枝杆菌感染巨噬细胞后诱导IL-1、IL-12、IL-18及TNF-α的表达[4]。结核病患者细胞因子蛋白水平检测经历了ELISA法以吸光值表示[5]、双夹心ELISA法和CBA法以浓度表示检测结果的过程[6]。王琳[5]报道,初治肺结核患者IL-4和IFN-γ值分别为(0.439±0.16)、(0.213±0.017),健康对照组分别为(0.429±0.024)、(0.213±0.017),肺结核患者IL-4升高、IFN-γ降低;因ELISA法检测吸光值为0.2表示基本无显色反应,所以受检测方法的限制,该结论欠妥。李嫣红[6]报道双夹心ELISA法检测初治肺结核患者和健康对照者(PPD阳性)血清中IL-10的含量、初治结核性胸膜炎患者血清IL-2、IL-10的含量均为0 pg/m L。本文的结果与李嫣红报道结果一致,即初治肺结核患者血清IL-2、IL-4含量与健康对照组差异无显著性;另外,本文采用CBA检测初治肺结核患者IFN-γ含量显著高于健康对照组;涂阳肺结核患者IL-10含量显著性高于健康对照者。相反,文献报道初治肺结核患者此两种细胞因子含量均与健康对照组差异无显著性[6]。

本研究结果和文献报道均表明,结核病患者和健康患者血清中细胞因子含量均在pg/m L水平,双夹心ELISA法出现个别因子检测结果为0 pg/m L[6]。为了提高检测灵敏度,不直接检测外周血循环的细胞因子,而是检测经特异抗原刺激PBMC的培养上清。结果表明,初治结核病患者和结核病接触者的PBMC经结核杆菌抽提的混合蛋白刺激并培养24~48 h后,分泌的IFN-γ、TNF-α和IL-4差异无显著性[7]。进展型和中度肺结核患者的PBMC经PPD刺激培养7 d后,CBA检测培养上清发现,Th1和Th2型细胞因子均分泌表达,差异无显著性[7]。ELISA法测定发现,结核患者外周血经IFN-γ刺激后分泌因子(RANTES)明显增加,而此种现象在IL-4刺激的结核患者外周血中未出现,说明Th1细胞参与了结核病免疫防御反应[8]。上述结果表明,PBMC刺激培养分泌的细胞因子不能反映机体真实水平,特别是结核杆菌感染者PBMC经结核杆菌抗原刺激也会产生细胞因子分泌。

结核病患者经治疗后可引起细胞因子变化。双抗体夹心法检测显示,活动性肺结核组和非活动性肺结核组血清TNF-α、s TNF-RⅠ、IL-1β、IL-1R、IL-6、IL-6R水平及TNF-α/s TNF-RI比值均显著高于正常对照组。抗结核治疗2月末,17例患者中有15例患者血清TNF-α、s TNF-RI、IL-1β、IL-1R、IL-6、IL-6R水平及TNF-α/s TNF-RI比值均较治疗前明显降低,且上述患者临床症状改善[3]。编码65 k D蛋白的DNA疫苗治疗后可刺激CD8+T细胞活化、部分开始生产TNF-α,同时促进Th1免疫反应、抑制Th2细胞因子和减轻炎症反应程度,涉及到IL-17、TNF-α、IL-6和TNF-β等因子[9,10]。肺结核小鼠口服M.vaccae可增加Th1免疫和IL-4δ2,同时抑制IL-4、TGF-β的表达[11];肺结核患者1周治疗后IL-4下降4倍、IL-4δ2上升32倍,TGF-β、TGF-βRII表达无变化[12];进展型和中度肺结核患者治疗6个月后,PBMC经PPD刺激培养7 d后,CBA检测培养前者IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-5表达升高,后者则降低[8]。以上研究表明,治疗可影响与免疫下调相关的因子。

综上所述,监测结核病患者治疗前、后血清中细胞因子变化,可为结核病免疫机制研究提供试验数据,同时可建立结核病治疗效果评价指标。CBA检测细胞因子灵敏度高、可直接检测血浆或血清中的细胞因子。CBA方法自动化程度高、使用标本量少,一管反应可同时检测多个因子,受试验操作影响小。该方法与Th1/Th2细胞联合检测,可客观评价结核病患者免疫状态。

参考文献

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生物教案《细胞分化》 篇4

1、能用细胞分化形成各种组织的观念，说出细胞分化的概念。

2、基于对骨髓中造血干细胞分化图的分析，运用归纳和总结的方法，得出细胞分化的概念。

3、能根据细胞分化的概念，探究观察植物的不同组织和细胞。

4、能够为细胞分化的现象作出科学合理的解释，辨别伪科学。

二、教学重难点

重点：细胞分化概念

难点：细胞分化的原因

三、教学过程

(一)新课导入

血细胞并不具有分裂能力，但是每次献血200m并不会影响自身健康，并且短时间内，体内血液含量会恢复正常。白血病患者的血液中出现大量的异常白细胞，而正常的血细胞明显减少。通过骨髓移植可以有效地治疗白血病。人体失去少量血液后，新生的血细胞是从哪儿产生的?

(健康人体可由红骨髓不断分化产生新的血细胞。)

人和动物的细胞经过分化能形成不同的细胞，形成不同的组织，那植物细胞呢?引出课题——《细胞分化》

(二)新课教学

1、回顾细胞分化的.概念

提问：哪位同学说说细胞分化的概念?

(像骨髓造血干细胞经过增殖分化形成红细胞、白细胞、血小板这样由一个或一种细胞经细胞分裂产生的后代，在形态结构和生理功能上逐渐发生稳定性差异的过程，称为细胞分化。)

根据学生回答作出表扬。

2、观察植物中不同组织和细胞

过渡：细胞分化是一种持久性的变化，在个体发育中，细胞分化能够增加细胞的类型，不同类型的细胞构成了生物体的组织和器官，执行不同生理功能。生物体的各种细胞最初都由受精卵发育而来，为什么在形态、结构和功能上会有明显的差异呢?这和细胞分化有关。植物体的主要组织有保护组织、输导组织、基本组织和分生组织。不同组织的细胞为什么会有不同的形态结构?

进行生物实验小组为单位进行观察实验，选取天竺葵的叶表皮、茎、叶肉、根尖制作临时装片，在显微镜下观察细胞的形态，并且在练习本上绘制不同组织细胞的形态结构图。

教师巡视指导，强调实验的注意事项和安全问题。

请小组代表结合自己的细胞形态结构图描述不同组织细胞的特点。

(表皮细胞无色透明，细胞排列紧密，形状为多角形或细长的纺锤形;叶肉细胞细胞壁薄排列不规则，内有大量的叶绿体，能够进行光合作用;疏导细胞呈管状;营养细胞壁薄有大液泡。)

请学生讨论讨论：不同组织中的细胞为什么会有不同的形态结构?

(叶片营养器官由保护组织、基本组织和疏导组织等构成组。在形态结构和生理功能上存在差异，但他们都是由一种细胞发育来的。

教师根据学生回答进行表扬，并归纳总结：叶片营养器官由保护组织(如上下表皮)、基本组织(如叶肉细胞和储藏细胞)和疏导组织(如叶脉中的导管和筛管)等构成。表皮细胞的细胞壁有角质层，具有保护作用;叶肉细胞内有大量的叶绿体，能够进行光合作用;导管和筛管参与营养物质的运输;储藏细胞储藏营养物质同一片页上的不同细胞，在形态结构和生理功能上存在差异，但他们的最初来源都相同。)

教师追问：不同组织中的细胞为什么会有不同功能?

学生回答：是由基因决定的。

教师根据学生回答进行归纳总结：细胞分化是生物个体发育的基础，是生物界中普遍存在的生命现象。现在生物学研究表明，细胞分化与基因选择性表达有关。

(三)巩固提升

提问：举一些细胞分化的实例。

(造血干细胞分化成血细胞;受精卵分化成各种干细胞等)

(四)课堂小结

师生共同总结本课的知识点。

(五)布置作业

课后预留细胞的全能性以及细胞衰老和凋亡的内容。

Th细胞分化 篇5

关键词：非小细胞肺癌,化学治疗,Th1/Th2型细胞因子

辅助性T细胞(Th)是T淋巴细胞亚群之一,Th1/Th2型细胞因子平衡表达在机体控制肿瘤中起重要作用[1]。肺癌患者常常合并Th2型细胞因子强势表达和Th1型细胞因子表达下降,研究发现化疗能够逆转晚期恶性肿瘤Th1/Th2型细胞因子平衡紊乱增强机体抗肿瘤免疫[2],但对于肺癌Th1/Th2型细胞因子表达与化疗疗效的相关性及是否能预测疗效研究较少,有必要进一步研究。

1材料与方法

1.1研究对象:收集2013年10月至2014年6月我科住院的经肺穿刺或支气管镜检查活检病理确诊为Ⅳ期非小细胞肺癌患者74例为研究对象,预期生存>3个月,年龄44~74岁,平均年龄59.1岁,均为确诊且无法手术根治的晚期非小细胞肺癌。

1.2方法:晚期非小细胞肺癌患者均采用标准一线含顺铂的双药方案化疗,21 d为1个周期。分别于化疗第1周期前,第3周期化疗前分别采集患者外周肝素抗凝血3 m L,外周血在2 h内,室温下以2500 r/min离心10 min分离血浆,分离血浆-80℃保存待测[3]。待收集完标本后采用酶联免疫双抗夹心法(ELISA),定量检测各细胞因子表达,IL-2、IFN-γ、IL-6和IL-10的标准品及其检测试剂盒均购自Genezyme公司。

1.3疗效评价:所有患者第3周期化疗前行疗效评价,疗效评价标准均按照欧美国家肿瘤研究所实体瘤疗效评价标准(NCI-RECIST)1.0版进行。有效组为疗效评价为CR(完全缓解)和PR(部分缓解)患者,无效组为疗效评价为SD(稳定)和PD(进展)患者[4]。

1.4统计学处理:采用SPSS18.0统计软件,外周血细胞因子浓度检测结果以(±s)表示,显著性差异采用t检验。

2结果

2.1化疗疗效及各组化疗前血IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-10表达情况:74例患者经化疗2周期后按NCI-RECIST 1.0标准行疗效评价:有效组共31例,其中CR(完全缓解)2例,PR(部分缓解)29例,无效组共43例,其中SD(稳定)37例,PD(进展)6例,有效率为42%。见表1。

2.2化疗前及化疗后各组中血IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-10表达情况:非小细胞肺癌疗效评价有效组化疗2个周期后血IL-2、IFN-γ浓度明显高于化疗前,IL-6和IL-10水平明显低于化疗前(P<0.05)。疗效评价为无效组中化疗2周期后血IL-2、IFN-γ、IL-6和IL-10浓度与化疗前相比,差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

3讨论

研究显示,非小细胞肺癌3周期化疗能够使Th2细胞因子表达下降,Th1细胞因子表达升高,说明化疗药物杀死肿瘤细胞的同时,促使肿瘤的抗原暴露,从而增强机体的抗肿瘤免疫反应,而过度化疗反而抑制机体抗肿瘤免疫[5]。本研究显示:非小细胞肺癌疗效评价有效组化疗2周期后血IL-2、IFN-γ浓度明显高于化疗前,IL-6和IL-10水平明显低于化疗前。化疗疗效为有效的患者外周血Th1/Th2细胞因子平衡紊乱较前治疗前好转,Th1表达因子表达增强,Th2相关因子表达下降,机体抗肿瘤免疫增强,表明外周血Th1/Th2细胞因子平衡是化疗有效的一个重要因素。对于Th1表达因子表达增强,Th2相关因子表达下降是化疗控制肿瘤从而诱导了机体抗肿瘤免疫功能的恢复,还是Th1/Th2细胞因子协同化疗协同抗肿瘤达到了较好的疗效,有待进一步研究。疗效评价为无效组中化疗2周期后血IL-2、IFN-γ、IL-6和IL-10浓度与化疗前相比,差异无统计学意义(P>0.05),表明肿瘤未能控制的患者机体仍存在明显的Th1/Th2细胞因子水平紊乱,2周期的化疗对于机体Th1/Th2细胞因子表达水平影响不大,说明化疗对于机体T淋巴细胞的影响作用有限。化疗期间合理配合免疫治疗对改善患者的预后会有一定帮助。

参考文献

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Th细胞分化 篇6

关键词：T细胞亚群,环境因素,习惯性流产,转录因子

习惯性流产 (habitual abortion, HA) 是妇产科常见的一种疾病, 发病主要与母体生殖道异常、母体内分泌异常、染色体异常、生殖道感染、宫颈功能不全及免疫功能异常等有关, 约50%的HA病因不明[1]。 随着人们对疾病的免疫学发病机制研究的不断深入, 尤其是对辅助性T细胞的深入研究, 国外学者发现, T细胞亚群分化失衡与HA密切相关, 且受到相关转录因子的调控[2]。 同时, 环境因素也不容忽视, 如吸烟[3]、饮酒[4]、家族史[5]、体重指数 (BMI) [6]等。 本研究以50 例HA非孕期患者和50 例正常非孕妇女为研究对象, 采用问卷调查、酶联免疫吸附试验 (ELISA) 、实时荧光定量聚合酶链反应 (RTQ-PCR) 等技术, 统计分析问卷调查结果, 测定患者外周血Th1, Th2, Th17 的百分比, 细胞因子IFN-γ、IL -4 和IL -17 的表达水平及相关转录因子T-bet、GATA-3 和STAT-3 m RNA的含量。 旨在探讨HA患者Th1、Th2、Th17 细胞变化及环境因素与HA的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料

选择2011 年6 月~2012 年9 月河南省开封市妇产医院就诊的50 例非孕期HA患者 (HA组) , 以及同期50 例健康非孕期妇女 (NNP组) 。 HA组纳入标准:1年龄20~40 岁;2有两次或两次以上自然流产史;3无糖尿病、高血压、生殖器畸形等器质性疾病。NNP组纳入标准: 1 年龄21 ~40 岁; 2 与HA组无血缘关系;3无自然流产史, 无肾炎、肝病、生殖器感染等病史。 所有研究对象均知情同意并签署知情同意。

1.2 主要试剂和仪器

莫能霉素、离子霉素和PMA购自Takara公司, RPMI-1640、小牛血清购自Sigma公司, Tap DNA聚合酶购自北京天根公司, ELISA检测试剂盒购自上海生工, 流式细胞仪购自美国Guava。

1.3 方法

1.3.1 分离和体外培养PBMC采集患者抗凝静脉血5 m L, 收集其中的单个核细胞层, 加入PBS 3 m L, 1200 r/min离心洗涤10 min, 弃上清。 用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基重悬。 在24 孔板上加入PBMC, 同时加入莫能霉素 (2 μg/m L) 、离子霉素 (1 μg/m L) 和PMA (25 μg/m L) , 5 h后收集细胞, 对细胞表面的CD分子和胞内的IFN-γ、IL-4、IL-17 及相应的对照抗体染色, 利用流式细胞仪进行检测。

1.3.2 血清中IFN -γ、IL -4 和IL -17 的含量测定按照ELISA试剂盒要求对患者血清中IFN-γ、IL-4和IL-17 的含量进行检测。

1.3.3 RTQ -PCR检测T -bet、GATA -3 和STAT -3m RNA的表达将提取的总RNA逆转录成c DNA, 运用RTQ-PCR技术扩增T-bet、GATA-3 和STAT-3m RNA。 PCR反应体系:10 ×buffer 5 μL, 10 mmol/L d NTP Mix 5 μL, c DNA 2 μL, Primers各20 μmol/L, Tap酶0.25 μL, 总反应体系50 μL。 反应条件:94℃预变性5 min;94℃ 45 s;55℃ 50 s;72℃ 1 min;30 个循环;72℃延伸10 min。 扩增所需引物见表1。

1.3.4 问卷调查采用一对一方式, 对HA组及NNP组进行相同问卷调查。 调查内容主要包括社会生物学特征、文化程度、BMI值、被动吸烟状况和饮咖啡史等。以BMI< 24.0 kg/m2和BMI≥24.0 kg/m2为分段标准, 被动吸烟以无、< 1 h/d和≥ 1 h/d为分段标准, 饮咖啡以无、<100 mg/d和≥ 100 mg/d为界限[1]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差 (±s) 表示, 两组间比较采用t检验;计数资料用率表示, 组间比较采用 χ2检验, 以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般情况比较

两组BMI≥ 24.0 kg/m2所占比例比较, 差异有统计学意义 (P < 0.05) 。 两组年龄、文化程度、被动吸烟、体重指数 (< 24.0 kg/m2) 及饮咖啡比较, 差异无统计学意义 (P > 0.05) 。 见表2。

注:与NNP组比较, *P < 0.05;HA:习惯性流产;NNP:健康非孕期妇女

2.2 两组Th1、Th2 和Th17 细胞水平比较

与NNP组相比, HA组Th1 和Th17 细胞百分比较高, 而Th2 细胞百分比较低, 差异均有统计学意义 (均P < 0.05) 。 见表3。

注:HA:习惯性流产;NNP:正常非孕妇女

2.3 两组血清中IFN-γ、IL-4 和IL-17 的表达水平比较

HA组IFN-γ 和IL-17 的含量明显高于NNP组, 差异有统计学意义 (P < 0.05) , 而IL-4 的表达水平低于NNP组, 差异有统计学意义 (P < 0.05) 。 见表4。

注:HA:习惯性流产;NNP:健康非孕期妇女;IFN-γ:γ-干扰素;IL:白细胞介素

2.4 两组T-bet、GATA-3 和STAT-3 m RNA的表达水平比较

结果显示, 以NNP组3 种转录因子的表达量分别为1, 与其相比较, HA组T-bet和STAT-3 m RNA的表达量明显增高 (6.3 倍和3.5 倍) , 差异有统计学意义 (P < 0.05) , GATA-3 m RNA表达量显著降低 (P < 0.05) 。见表5。

3 讨论

辅助性T细胞为CD4+T细胞, 按其所产生的细胞种类, 可分为Th1 和Th2 细胞。Th1 细胞主要分泌IL-2、IFN-γ 和TNF-α 等;Th2 细胞主要分泌IL-4、5、6 和IL-10 等。 两类亚群细胞对不同细胞因子的反应性各异:IFN-γ 可诱导Th1 细胞分化, 但抑制Th2 细胞增殖;IL-4 诱导Th2 细胞分化, 但可与IL-13 等一起抑制Th1 细胞功能和分化。 机体在正常功能状态下, 各细胞因子处于动态平衡状态, 共同维持机体的体液免疫和细胞免疫功能。 T-bet是T-box基因家族的新型转录因子, 选择性地表达于Th1 细胞, 可诱导IFN-γ的产生, 并可抑制IL-4 的分泌。 GATA-3 是Th2 细胞重要的特异性转录因子, 可诱导产生IL-4。 T-bet和GATA-3 分别促进Th1 和Th2 的发育, 二者存在交互抑制作用[7,8]。 Th17 是一种新发现的能够分IL-17 的T细胞亚群, STAT-3 是其主要的转录因子[9]。

近年来的研究报道显示, T细胞亚群分化失衡与妊娠结局存在较大关联[10]。 Liu等[11]研究结果显示, 正常妊娠妇女外周血Th细胞亚群与未妊娠妇女无差异, 而与正常的未妊娠妇女相比, HA患者外周血Th17比例较高。 这与本研究结构相一致。 本研究结果还显示, HA组Th1 明显增高以及IFN-γ、IL-17 的水平均高于NNP组。 Th2 细胞所占比例及IL-4 的水平均低于NNP组, 表明HA组患者存在T细胞亚群比例以及功能失调。 另外, 从转录因子的表达水平看, HA组患者T-bet和STAT-3m RNA表达水平较高, 再次证明了HA组患者Th1 和Th2 细胞特异性转录因子呈高表达状态。

此外, 环境因素与HA发病的关联日益受到学者们的关注, 国内外学者对此也有相关报道。 Zhang等[12]对中国南方女性HA与环境因素的关联进行了分析, 被动吸烟 (≥ 1 h/d) 和肥胖 (BMI≥ 24.0 kg/m2) 与HA有关。 国外学者报道, 患者的高胰岛素抵抗与HA相关[13], 并且由于胰岛素抵抗而出现的高血压、高血脂、高糖与肥胖导致的自然流产有关[14]。 本研究也发现, 肥胖 (BMI≥ 24.0 kg/m2) 与HA之间存在关联 (P < 0.05) , 但未发现被动吸烟与HA相关, 这与Zhang等[12]的研究结果不相一致, 原因可能与本次研究样本量不足或此次的研究对象对烟草的敏感性较低有关。

Th细胞分化 篇7

精确的Th1/Th2平衡是维持生理妊娠所必需的, 平衡失调则导致妊娠失败。尽管上述细胞因子在人、小鼠和其他试验动物生殖免疫中的作用得到广泛的研究, 但在反刍动物则研究较少, 有关Th1/Th2型细胞因子的动态变化对山羊妊娠影响的研究在国内外尚未见报道。试验研究了山羊在妊娠早期及流产前后外周血液中Th1 (TNF-α、IL-2) 与Th2 (IL-10) 型细胞因子含量的动态变化规律, 探讨其生理学意义, 为提高山羊繁殖效率及胚胎移植妊娠率提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验动物

试验山羊均取自于保定市某大型山羊场, 选择营养状况良好、临床健康、无空怀史的经产未孕母山羊30只, 分两圈饲养。在相同的饲养管理条件下, 观察母山羊两个发情周期, 从中挑选发情周期及发情期正常的母山羊25只, 于第3次发情时进行配种, 每只山羊配种2次。在配种后第30天进行B超检查, 判定是否妊娠, 挑选妊娠的20只山羊作为检测对象。

1.2 主要仪器与试剂

酶标仪 (318MC, 上海三科仪器有限公司) 、B型超声断层扫描仪 (HY3000, 无锡海鹰电子医疗系统有限公司) 、离心机 (GS-15R, 上海安婷仪器设备厂) 、超低温冰箱 (MDF-382E, SANYO公司) ;山羊TNF-α、IL-2、IL-10 ELISA试剂盒 (规格96T , 美国A.D.L公司) , 氯前列烯醇 (040428, 上海市计划生育科学研究所) 。

1.3 试验方法

1.3.1 流产模型的建立

在山羊妊娠第60天时, 颈部肌肉注射氯前列烯醇 (0.2 mg/只) , 间隔12 h后再注射0.1 mg/只, 注射后72 h内观察山羊反应:有无努责;是否外阴潮红、轻度肿胀, 阴道流出黏液或血液;子宫颈口是否开张。当观察到外阴部有血液或胎儿排出时, 记为流产第1天, 并记录流产山羊号。20只妊娠山羊注射PG后36～48 h内全部发生流产, 并排出胎儿。

1.3.2 血液样本的采集与处理

于妊娠第0, 10, 20, 30, 40, 50, 60天和流产第1, 3, 8, 10天颈静脉采集血样。每次采血均在上午9:00进行, 用10 mL一次性无菌注射器颈静脉采血5 mL/只, 置于加入0.5 mL 0.109 mol/L柠檬酸钠的高压灭菌试管中, 3 500 r/ min离心15 min, 分离血浆, 分装标记后-80 ℃冰箱保存, 待测。

1.3.3 细胞因子含量的测定

以酶联免疫吸附测定法 (ELISA) 检测血浆中TNF-α、IL-2、IL-10的含量:将待测样品从冰箱中取出, 室温条件下自然解冻, 按试剂盒说明书操作。待反应终止后, 在酶标仪上450 nm波长下读数, 记录OD值, 依据标准曲线计算出细胞因子的含量。

1.4 统计学处理

试验用Excel 2003和SPASS 16.0软件以单变量方差进行比较分析统计, 数据以平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 妊娠早期Th1/Th2型细胞因子含量 (见表1)

由表1可知:母体妊娠后, TNF-α含量先上升, 至妊娠第10天时含量最高, 而后逐渐降低;妊娠第10, 20, 30天各时间点含量均无显著性差异 (P>0.05) , 但显著高于妊娠第0天及妊娠第50, 60天含量 (P<0.05) ;妊娠第40, 50, 60天含量无显著性差异 (P>0.05) 。IL-2含量先升高, 至妊娠第10天时含量最高, 随着妊娠的进行又逐渐降低;在此期间, 妊娠10～60 d各时间点含量差异均不显著 (P>0.05) , 但均显著高于妊娠第0天含量 (P<0.05) 。IL-10含量在妊娠0～60 d基本呈逐渐升高的趋势;妊娠第10天含量显著高于妊娠第0天含量 (P<0.05) , 妊娠20～60 d各时间点含量极显著高于妊娠第0天含量 (P<0.01) , 妊娠第30, 40, 50, 60天含量差异不显著 (P>0.05) , 但均显著高于妊娠第10, 20天含量 (P<0.05) 。

注:同列数据肩注大写字母不同表示差异极显著 (P<0.01) , 小写字母不同表示差异显著 (P<0.05) , 字母相同表示差异不显著 (P>0.05) 。

2.2 流产前后Th1/Th2型细胞因子含量 (见表2)

注:同列数据肩注大写字母不同表示差异极显著 (P<0.01) , 小写字母不同表示差异显著 (P<0.05) , 字母相同表示差异不显著 (P>0.05) 。

由表2可知:山羊TNF-α含量在流产后的第1, 3, 8, 10天均极显著高于流产前含量 (P<0.01) ;流产1～3 d逐渐升高, 8～10 d逐渐降低, 以流产第3天最高, 流产后各时间点含量差异均不显著 (P>0.05) 。山羊IL-2含量在流产后的第1, 3, 8, 10天均显著高于流产前含量 (P<0.05) , 流产第1, 3, 8天逐渐升高, 第10天稍降低, 以流产第8天含量最高, 流产后各时间点含量差异均不显著 (P>0.05) 。山羊IL-10在流产1～10 d依次降低, 流产后第1, 3, 8, 10天的含量均低于流产前含量 (P<0.05或P<0.01) ;妊娠第3, 8, 10天含量差异均不显著 (P>0.05) , 但极显著低于流产第1天含量 (P<0.01) 。

3 讨论

3.1 Th1/Th2型细胞因子动态平衡对妊娠的影响

生殖免疫学认为, 妊娠是一种移植现象, 胎儿对母体而言是一种半移植体, 母体对胎儿所表达的父系抗原产生应答, 包括一些抗体的产生、细胞毒性物质的释放等。在正常妊娠时胚胎不受母体免疫系统的排斥, 这主要取决于母胎间免疫关系的平衡, 其中以Th1/Th2型细胞因子在妊娠过程中动态平衡的免疫调节作用占主导地位。Th1、Th2型细胞因子各自介导细胞及体液免疫, 二者处于动态平衡, 这种平衡一旦失调就会对妊娠的顺利进行造成威胁, 甚至发生流产。

试验结果显示:山羊妊娠早期、流产前后TNF-α与IL-2的含量变化趋势相似, 而二者与IL-10的含量变化趋势相反。这就更进一步证明了Th1/Th2动态平衡对正常妊娠和流产的重要性。TNF-α和IL-2在妊娠早期最初阶段稍有增加, 说明在最初阶段Th1型细胞因子的表达适当升高有利于胚胎着床, 此时TNF-α、IL-2与IL-10处于一个相对平衡的状态, Th1/Th2动态平衡未被破坏, 妊娠继续顺利进行。随着妊娠的进行IL-10含量继续升高, TNF-α、IL-2表达则开始平缓下降。已有研究表明, IL-10可以抑制Th1型细胞因子如TNF-α、IL-2等的合成与释放, 使母体趋向于Th2型细胞因子在母-胎界面的优势表达, 有利于正常妊娠的建立和维持[3]。流产发生后IL-10含量降低, TNF-α与IL-2含量上升, 其原因可能是IL-10缺乏, 不能对Th1型细胞因子产生抑制作用, 促炎症细胞因子含量相对增多, 致使Th1型免疫反应增强, Th1/Th2平衡被打破, 滋养层细胞受到免疫损伤而导致妊娠失败, 引起流产。

3.2 TNF-α含量动态变化对妊娠的影响

TNF-α属Th1型细胞因子, 主要由巨噬细胞分泌产生, TNF-α可参与抗体依赖细胞毒作用, 并使前列腺素增多, 诱导山羊膜细胞及滋养层细胞的程序化死亡, 导致流产。但适量的TNF-α对妊娠的成功是必不可少的, 正常妊娠期间适量TNF-α能促进分解代谢, 从而满足胎儿的营养需要, 对其他细胞因子及黏附分子的表达具有一定的调节作用, 参与了妊娠期间免疫平衡的建立和稳定[4]。

在妊娠早期阶段, TNF-α含量从妊娠第0天到第10天呈明显的上升趋势, 后逐渐降低至妊娠第60天。说明适量的TNF-α对妊娠的维持是必需的, 而升高到最大含量后为了防止由于TNF-α的过度表达造成胎盘细胞的损伤, 其含量随即降低, 以保护胚胎的发育和胎儿的生长, 使妊娠能够顺利进行下去。流产后, TNF-α含量大幅度升高, 且TNF-α含量在流产后的第1, 3, 8, 10天均极显著高于流产前, 也充分证实了TNF-α的过度表达不利于妊娠的维持。

3.3 IL-2含量动态变化对妊娠的影响

IL-2属于Th1型细胞因子, 由活化的辅助T细胞产生, 主要作用是诱导T细胞增殖和分化, 诱导NK细胞增殖, 活化NK细胞的活性及诱导LAK细胞的产生, 具有免疫杀伤作用。山羊妊娠后, 其含量从妊娠第0天到第10天明显上升, 后逐渐下降至妊娠第60天, 妊娠10～60 d各时间点含量均高于第0天水平。由此可以看出, IL-2的适量表达在妊娠早期是必需的, 有利于妊娠的维持。试验结果表明, 山羊IL-2含量在流产后的第1, 3, 8, 10天均显著高于流产前含量, 说明IL-2的过度表达对妊娠不利, 甚至造成流产。

3.4 IL-10含量动态变化对妊娠的影响

IL-10主要由Th2型细胞分泌, 属有益细胞因子, 它能够有效地刺激B细胞的增殖和分化, 促进其产生IgM、IgG和IgA。另外, IL-10能够抑制T淋巴细胞和单核巨噬细胞分泌TNF-α、IL-2等Th1型细胞因子, 从而在母-胎免疫网络中起重要的调节作用[5]。

研究发现, 在正常妊娠早期IL-10的表达水平随妊娠进展逐渐增高, 无降低趋向, 这与IL-10益于胚胎免疫耐受的作用相符合[6]。流产发生后, IL-10含量在流产1～10 d内依次降低, 并且与流产前水平差异显著。这可能是由于IL-2和TNF-α在流产后含量升高抑制了IL-10的产生, 从而破坏了Th1/Th2动态平衡, 导致妊娠失败。

摘要：为了研究Th1/Th2型细胞因子的动态变化对山羊妊娠的影响, 探讨其生理学意义, 试验通过ELISA方法对山羊妊娠早期及流产前后外周血液中Th1 (TNF-α、IL-2) 与Th2 (IL-10) 型细胞因子的含量进行了检测。结果表明:妊娠早期外周血液中TNF-α和IL-2含量先升高后降低, IL-10含量持续上升;流产后TNF-α和IL-2含量高于流产前含量 (P<0.01或P<0.05) , IL-10则低于流产前含量 (P<0.05或P<0.01) 。说明山羊正常妊娠时Th1/Th2型细胞因子动态平衡应当是以Th2型免疫及其相关因子占优势, 平衡失调则导致妊娠失败。

关键词：TNF-α,IL-2,IL-10,妊娠,流产

参考文献

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[2]JOHNSON P M, CHRISTMAS S E, VINCE G S.Immunological aspects of implantation and implantation failur-e[J].Hum Re-prod, 1999, 14 (2) :26-36.

[3]苗玉青.Th1细胞因子的含量对山羊胚胎移植受胎率的影响及中药提高受胎率的机理研究[D].保定:河北农业大学, 2005.

[4]HAIMOUVICI F, HILL J A, ANDERSON D J.The effects of solu-ble products of activated lymphocytes and macrophages on blastocyst implantation events in vitro[J].Biol Peprod, 1991, 44:69-75.

[5]DEALTRY G B, FARRELL M K, FERNANDEZ N.The Th2cyto-kine environment of the placenta[J].Int Arch Al-lergy Immunol, 2000, 123 (2) :107-119.

Th细胞分化 篇8

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

普通健康昆明小鼠40只,雌雄各半,体重18~22 g(5~6周龄,购自军事医学科学院实验动物中心,检验检疫合格),于军事医学科学院实验动物中心屏障实验室进行实验。将40只昆明小鼠随机分成生理盐水对照组(20只)和实验组(20只)。

1.1.2 主要实验试剂与仪器

致病性大肠杆菌(EPEC-E2348/69)(军事医学科学院实验动物中心惠赠),小鼠T淋巴细胞因子CBA组合试剂盒(BD美国),血细胞分析仪(NI-HON KOHDEN日本),离心机(德国KENDRO公司),-80℃冰箱,涡旋混匀器(IKA公司),流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 感染性腹泻小鼠模型制备

1.2.1 实验组

所有小鼠均单笼饲养,实验前禁食24 h、禁水1 h。(1)实验开始前对每只小鼠进行眼眶静脉采血,放置于经EDTA钾盐溶液浸润过的容器中,留作血细胞分析。(2)给每只小鼠灌胃3%碳酸氢钠溶液0.3 m L。(3)配制浓度为5×108cfu/m L的致病性大肠杆菌混悬液,灌胃碳酸氢钠溶液半小时后,对实验组每只小鼠灌入细菌混悬液0.5 m L;4.8 h后更换空鼠笼,不添加垫料,观察小鼠的大便性状。

1.2.2 对照组

对照组不作血常规检测,处理因素将致病性大肠杆菌混悬液更换为生理盐水0.5 m L,余处理过程同实验组。

1.2.3 实验中观察及检测指标

(1)灌胃8 h后,观察小鼠的大便性状、精神状态、行动动作。(2)灌胃后第24小时,对实验组所有小鼠采血进行血细胞分析。小鼠精神萎靡、少动或激惹躁动,大便性状为黏液、稀便,血细胞分析白细胞计数结果差异有统计意义则视为造模成功。

1.3 感染性腹泻小鼠外周血T淋巴细胞因子检测

1.3.1 外周血采集及血浆分离

在第24小时对实验组、对照组小鼠行摘眼球法取血,取部分血行血细胞分析,余下经过离心10 min(3000 r/min,离心半径16.5 cm),收集血浆,冻存于-80℃冰箱中以备统一检测。

1.3.2 T淋巴细胞因子检测

上述血浆在37℃孵化箱中解冻,细胞因子检测具体步骤按试剂盒说明书进行,经过流式细胞仪上机处理后可获得各细胞因子的荧光强度值,通过标准曲线换算成相应浓度(自动换算),结果以ng/L表示。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析,非正态分布及未知分布形态总体采用秩和检验Wilcoxon W检验,数据以M(P25,P75)中位数、四分位间距表示。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 感染性腹泻小鼠模型的建立

细菌灌胃后约6 h小鼠出现倦怠、精神萎靡、行动迟缓,部分小鼠出现黏液便、稀便,部分小鼠出现松软大便(较正常粪便含水多)。灌胃前后分别取小鼠血液进行血细胞分析,结果表明实验组小鼠灌胃前后白细胞计数(WBC)水平差异有统计学意义(P<0.05),中性粒细胞百分比(N%)、淋巴细胞百分比(L%)虽有改变,但差异无统计学意义(P=0.076>0.05,P=0.086>0.05)。见表1。

注:WBC:白细胞计数;N%:中性粒细胞百分比;L%:淋巴细胞百分比

2.2 血浆中Th1、Th2、Th17淋巴细胞因子水平检测

实验组小鼠在胃肠感染后外周血浆中淋巴细胞因子:IL-2、IL-6、IL-10、IL-4、IL-17A较对照组水平升高,与对照组比较有统计学差异(P<0.05)。TNF、IFN-γ两细胞因子水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

注:IL-2:白介素2;TNF:肿瘤坏死因子;IFN-γ:伽马干扰素;IL-6:白介素-6;IL-10:白介素-10;IL-4:白介素-4;IL-17A:白介素-17A

3 讨论

有关动物细菌性腹泻模型的报道较少,主要是大肠杆菌诱导动物腹泻模型,且多为经腹腔注射诱导动物腹泻,但此类方式与传统的人类经口感染方式不同。本实验采用经口灌喂细菌感染小鼠,与传统的运用中草药及腹腔注射制作小鼠腹泻模型原理不同,模仿人类胃肠感染主要诱发途径(经口感染)。通过主观的观察指标(大便性状、行动动作)和客观实验数据(血细胞分析结果)分析判定小鼠感染,更能模拟人类肠道感染时状态。本次实验开始前采取禁食水以及灌胃碳酸氢钠溶液,目的是为了减少肠内容物及营养物、减少胃酸分泌,降低胃肠的屏障功能使得细菌得以存活继而繁殖、黏附,造成肠道组织损伤及其免疫反应以达到腹泻的效果。人类细菌感染一般情况下白细胞计数是升高的,但实验过程中小鼠白细胞计数表现为降低(重复两次),或许是重度感染所致,中性粒细胞及淋巴细胞百分比变化符合人类细菌感染时情况但差异无统计学意义,具体有待进一步研究(但考虑为唯一处理因素,且处理后有统计意义,处理有效)。

细菌肠道感染后,鼠模型的肠黏膜完整性及上皮细胞受损、细菌毒素侵入及局部体液分泌使小鼠出现黏液稀便、精神萎靡等炎性反应的表现,血细胞的组成比例也发生变化。肠道黏膜免疫系统和全身的免疫系统产生应答,有多个细胞因子参与,其中包括Th1类淋巴细胞代表因子:IL-2、TNF、IFN-γ,Th2类淋巴细胞代表因子:IL-6、IL-

1 0、IL-4,Th17类淋巴细胞代表因子:IL-17A,它们在适应性免疫应答过程中起着重要作用。

有研究指出儿童感染性腹泻病发病时体内IL-6水平升高[3,4],包括细菌性和病毒性腹泻,本实验小鼠在细菌感染后血液中IL-6水平也呈升高趋势。IL-6是多功能炎症细胞因子,升高后可促进B细胞增殖分化和分泌抗体,促进抗体与抗原(病原)结合进而清除病原。

IL-2在T细胞介导的细胞免疫应答中起到促进、维持T细胞活化增殖的重要作用,促进所有亚型T淋巴细胞活化增殖及产生细胞因子。IL-4促使活化的B淋巴细胞分泌Ig E和Ig G1,促进Ig G向Ig E类型转换,以自分泌方式促进Th2细胞分化但抑制Th1细胞增殖及其应答等,在变态反应疾病发病过程中有重要作用。关于IL-2、IL-4这两个因子在感染性腹泻病(尤其是细菌性)中少有报道,在一项旅行者腹泻研究中[5]诺瓦克病毒感染组IL-2、IFN-γ升高,主要由Th1细胞介导免疫反应,诺瓦克病毒和产毒性大肠杆菌混合组呈现Th1/Th2双重免疫反应。本研究提示IL-2、IL-4都高于正常对照组,IL-2在疾病过程中促进了各亚型T细胞活化,促进炎症的发展,IL-4的升高一定程度上抑制了Th1介导的免疫反应,同时也促进了Th2介导的免疫反应。

IL-10是一类重要的抑制性细胞因子,抑制IL-2、IFN-γ等促炎细胞因子产生,抑制Th1细胞应答。IL-10作为抗炎介质对脓毒症有一定保护作用,Florquin等[6,7]报道BALB/C小鼠经注射葡萄球菌肠毒素(SEB)4 h后血液中IL-10水平明显高于对照组,IL-10单抗可将SEB攻击小鼠的死亡率提高30%,该作用可被IFN-γ抗体抑制,IL-10是黏膜免疫应答的重要调节因子。本实验提示EPEC肠道感染小鼠血中IL-10水平升高,与上述研究结果类似,对炎症的放大和扩散起到限制作用,避免了炎性连锁反应及无限扩大,具有抑制全身炎性反应综合征、脓毒症的发生发展的作用。

IL-17A主要由Th17淋巴细胞产生,是重要的促炎因子,诱导炎症因子和趋化因子释放,如IL-6、IL-8等,募集、活化中性粒细胞并抑制其凋亡。在儿童感染性腹泻病研究中[8,9],IL-17A参与疾病的免疫反应,且在迁延性感染中IL-17A水平高于急性期组和正常对照组。本次实验小鼠急性期出现感染性腹泻后IL-17A水平与对照组相比升高且有明显统计学差异,与报道不完全相同。IL-17A在急性期促进炎症反应,使机体产生免疫应答,但若长期高于正常水平存在将导致机体的慢性炎症或相关免疫性疾病发生。动物实验显示[10],Th17细胞在肠道慢性炎症的维持中发挥重要作用,中和IL-17A后模型小鼠肠道炎症明显减轻。

本研究显示EPEC肠道感染模型中外周血TNF、IFN-γ水平均有不同程度升高,但与对照组比较无统计学差异。IL-2、IL-6、IL-17、TNF、IFN-γ为促炎因子,IL-4、IL-10为抗炎因子,但多个因子同时具有抗炎和促炎两种作用。本研究显示在出现胃肠道感染后,小鼠体内炎性反应并非单纯的促炎或抗炎细胞因子水平升高,也不是表现为单纯Th1类细胞因子或单纯Th2类细胞因子水平升高,呈现Th1/Th2混合免疫状态。虽然Th1细胞因子有一定程度升高,但IL-4以及IL-6、IL-10的明显升高表明在急性期以Th2细胞介导的体液免疫应答占优势,Th1/Th2下降,失衡的Th1/Th2是否能恢复、何时恢复、如何恢复有待进一步研究。如果调高的Th2、Th17细胞因子水平持续存在,那么推测EPEC肠道感染存在诱导慢性免疫性疾病的可能。

促炎因子反应过强则造成机体组织损伤加重,抗炎因子反应过强则对机体抗病原体免疫反应产生一定程度抑制效应,这种抑制效应在一定程度上能够减少或避免组织更大的损伤,但同时可造成慢性迁延性感染及相关免疫疾病的发生。促炎反应、抗炎反应、Th1/Th2细胞介导的反应是一个动态平衡过程,一旦失衡将导致相关疾病的产生如慢性炎症或免疫相关疾病。多种免疫相关性疾病与感染相关,可由感染直接或间接诱发,本研究表明EPEC肠道感染小鼠模型体内Th2、Th17细胞相关性淋巴因子增高为主,Th1/Th2降低,提示肠道细菌感染可能与某些病原体呼吸道感染[11](合胞病毒等)一样,有增加变应性疾病发生的倾向。有关于非致病性大肠杆菌(Nonpathogenic E.col ATCC 25922)抑制小鼠气道过敏疾病动物模型体内的特异性Ig E、IL-4的水平的报道,且呈时间和剂量依赖性[12],但本研究使用的是致病性大肠杆菌和健康小鼠,结果和研究方式有所不同。鉴于Th2、Th17细胞在变态反应性疾病发病机制中的重要作用,儿童感染性腹泻病(细菌感染)与变态反应疾病是否有一定相关性尚需进一步深入研究。

摘要：目的 检测小鼠致病性大肠杆菌(enteropathogenic E.coli,EPEC)腹泻模型的外周血血浆中的辅助性T淋巴细胞1、2、17型(Th1、Th2、Th17淋巴细胞)代表因子,探索小鼠胃肠道感染时免疫反应的变化。方法 普通健康昆明小鼠40只随机分成生理盐水对照组(20只)和实验组(20只)。实验组EPEC灌胃,建立小鼠感染性腹泻动物模型。对照组生理盐水灌胃。细菌灌胃后24 h取实验组和对照组外周血,离心后取血浆。采用流式液相多重蛋白定量技术(CBA技术)检测血浆中的白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF)、伽马干扰素(IFN-γ)、白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)、白介素4(IL-4)、白介素17A(IL-17A)淋巴细胞因子水平。结果 实验组小鼠灌胃前白细胞(WBC)[7.10(5.825,8.625)×109]较灌胃后WBC[28.85(18.80,38.35)×109]差异有统计学意义(P<0.05);灌胃细菌24 h后外周血浆中IL-2[2.60(2.33,2.70)ng/L]、IL-6[5.65(3.93,28.35)ng/L]、IL-10[15.40(12.10,18.65)ng/L]、IL-4[2.95(2.70,3.30)ng/L]、IL-17A[2.85(2.53,3.48)ng/L]较对照组升高且差异有统计学意义(P<0.05),TNF[11.85(9.38,12.65)ng/L]、IFN-γ[4.50(3.40,10.70)ng/L]细胞因子水平与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 EPEC感染小鼠后IL-2、IL-6、IL-10、IL-4、IL-17A淋巴细胞因子水平改变,Th1/Th2/Th17细胞参与此免疫反应,小鼠体内以Th2细胞介导的体液免疫为主,Th1细胞介导的免疫反应在小鼠模型的炎性反应过程中占非主导地位。

Th细胞分化 篇9

关键词：Th1/Th2,漂移,肿瘤免疫

1986年,Mosman、Cofman[1]及其同事应用T细胞克隆和细胞因子测定技术构建了小鼠抗原特异性细胞克隆,这些克隆可产生不同的细胞因子。第一类细胞因子受抗原递呈细胞(APC)及抗原或受伴刀豆凝集素A(ConA,T细胞促有丝分裂剂)刺激后可以产生IL-2、IFN-γ、GM-CSF等,它主导细胞免疫应答,在抗感染器官移植排斥反应和自身免疫疾病的诱导过程中起重要作用。第二类细胞因子可产生IL-4(B细胞刺激因子,BSF)、IL-5(肥大细胞生长因子)、IL-13。它主导体液免疫应答,辅助抗体生成。这两类分别称为Th1细胞和Th2细胞。Th1/Th2细胞分类使T细胞免疫学的概念清晰化,并对许多感染性和自身免疫性疾病进行重新审视。近来研究发现肿瘤组织多分泌Th2类细胞因子,并认为机体处于Th2细胞因子优势状态是肿瘤免疫逃逸的机制之一。因此,Th1和Th2之间的漂移能否为抗肿瘤的免疫治疗提供新型治疗方案,已成为肿瘤免疫治疗的研究热点。

1 Th1/Th2亚群的发现

1986年研究人员在研究小鼠CD+细胞克隆时发现了2种不同的细胞因子产生模式:Th1细胞分泌IL-2、IFN-γ和INF-β;Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13。1991年有研究,对人T细胞克隆时发现了Th1/Th2的存在,而分泌状况与小鼠大致相似。Th1细胞主导细胞介导的免疫反应和迟发型超敏反应,并可刺激产生抗体;Th2细胞主导机体的体液免疫反应。然而,体外观察到的截然不同的小鼠T细胞克隆在体内并不确定,有许多细胞可以产生Th1和Th2两种类型的细胞因子,这些细胞被称为Th0细胞。

2 Th1/Th2细胞分化来源

从前体Th0细胞分化为Th1/Th2细胞需抗原的反复刺激,其分化受到微环境和APC等因素影响。Th1/Th2来自于一个共同的前体细胞。体外研究显示,CD4+T细胞在抗原和APC的初次刺激下易产生IL-2,继续刺激可产生lL-2、IL-4和IFN-γ。Th1和Th2是Th0发展的2种极化形式,IL-4和IL-12是Th0分化的2种主要刺激因子,在初始阶段,若同时加入IL-4,则Th0向Th2方向发展,反之,若加入抗IL-4单抗,则促使Th1型细胞因子IL-12表达,可促进Th0向Th1分化。

3 Th1/Th2细胞的表面标志

Th1/Th2细胞除分泌不同的细胞因子,发挥不同的免疫作用外,它们各自的细胞表面受体也有很多的不同。表面受体不仅可以作为分离Th1/Th2细胞的表面标志物,而且直接影响Th1/Th2细胞对一些细胞因子的反应能力,从而调控着Th1/Th2细胞的分化及功能。

4 影响Th1/Th2细胞分化的因素

4.1 细胞因子的影响

研究表明,细胞因子作用于细胞表面受体,可引起Th细胞内一系列信号转导因子(STF)活化,从而发挥其对基因转录的调控作用,这一过程主要与JAK/STAT家族有关。细胞因子与受体结合后,引起受体亚基二聚化,使结合于受体亚基的“门神”激酶(Janus kinas,JAKs)相互靠近而活化,JAKs使受体上的酪氨酸残基磷酸化,吸引有SH2结构的信号转导及转录活化蛋白(Signal transducers and activators of transcription,STAT)结合于受体上。此时,JAKs使STAT快速磷酸化,活化的STAT与受体亲和力降低并与之解离.磷酸化的STAT可形成同源二聚体,将信号转移至细胞核内,与细胞因子应答基因启动子结合并启动转录。目前已发现的JAK蛋白激酶家族有4种(JAK1、JAK2、JAK3和TYK2),而STAT家族有6种(STAT1~STAT6)。特定的JAK/sTAT蛋白与特定的细胞因子受体联系,调节相应基因转录。如JAK2/STAT-4被IL-12选择性激活,从而启动Th1型细胞因子IFN-7的表达;IL-4选择性激活JAK1/STAT6,使Th0向Th2方向极化。Th1/Th2细胞分化的最主要的因素IL-4、IL-13主要调节Th2细胞分化,而IFN-α、IL-12、IFN-γ则调节Th1细胞分化。

4.2 MHC-抗原肽-TCR亲和力对Th1/Th2细胞分化的影响

其亲和力越高越有利于Th1细胞分化,反之亦然。而抗原肽与MHC之间亲和力越高越有利于Th1细胞分化,越低越有利于Th2细胞分化。

4.3 不同的树突状细胞(DC)在体外对Th细胞产生分离极化影响

髓系DC(Myeloid,DCl)分泌IL-12,作用于Th0,使之向Th1细胞分化;淋巴系DC(Lymphoid,DC2)分泌IL-4,作用于Th0,使之向Th2分化。有关DC对Th1/Th2反应的不同是由于DC本质的区别还是由于纯化DC的方法不同所致,有待进一步证实。

4.4 激素对Th1/Th2分化的影响

前列腺素E2,通过抑制Th1型细胞因子的产生,从而促进Th2型细胞因子的产生,而糖皮质激素、孕酮等促进Th2分化而抑制Th1应答。

5 Th1/Th2细胞的漂移

多种细胞因子可控制Th1/Th2细胞的状况:TFN-α、IFN-β、IFN-γ和TL-12可促进向Th1方向分化,IL-4、IL-12 mAb可刺激向Th2方向分化。

抗原与APC的调控作用:抗原的数量及有无佐剂均会影响T细胞的分化。高剂量水溶性蛋白质抗原促进Th2细胞的形成,对Th1起抑制作用,APC可通过自身分泌的细胞因子调节Th1/Th2的反应。

非CD4+T细胞的参与:CD8+CTL细胞亦存在Tc1和Tc2的分型,且诱导其发生转化的细胞因子也相同,但Tc1和Tc2之间不可发生逆转[2]。Tc1和Tc2的细胞毒活性相似,都是通过Ca2+/穿孔素的机理起作用。NK细胞分泌IFN-γ,促进Th1细胞的产生;β细胞、肥大细胞可产生IL-4,促进向Th2细胞漂移[3]。

6 肿瘤细胞的Th1/Th2漂移与抗肿瘤免疫

恶性肿瘤是目前危害人类健康的严重疾病,它的发生、发展与多种因素有关。当宿主的免疫功能低下,或宿主APC的功能低下或缺陷时,肿瘤发病率增高;而在肿瘤进展时,肿瘤患者的免疫功能受到抑制,两者可互为因果,双方各因素的消长对肿瘤的发展起着重要的作用。机体的抗肿瘤免疫效应机制包括细胞免疫和体液免疫两个方面,其中细胞免疫是抗肿瘤免疫的主力,Th1细胞主导机体的细胞免疫功能,对抗肿瘤免疫反应十分重要。在细胞免疫机制中起主要作用的效应细胞为T细胞、NK细胞和巨噬细胞。抗原活化的T细胞只能特异地杀伤、溶解带有相应抗原的肿瘤细胞,并受MHC限制,具体包括MHCⅠ类抗原限制的CD8+CTL和MHCⅡ类抗原限制的CD4+Th细胞。CTL识别肿瘤细胞自身表达的MHCⅠ类抗原分子,Th细胞识别由APC提呈的MHCⅡ类抗原分子。目前认为,CD8+CTL是抗肿瘤免疫的主要效应细胞,其杀伤肿瘤的机制有二:一是通过其抗原受体识别肿瘤细胞上的肿瘤抗原并与之结合,通过溶细胞作用,直接杀伤肿瘤细胞;二是分泌各种细胞因子,如TFN-α、IFN-β、IFN-γ而间接杀伤肿瘤细胞。如果机体的免疫功能失衡,肿瘤细胞逃避免疫细胞监控,发生免疫逃逸,最终导致肿瘤发生。

机体抗肿瘤免疫的主要方式是细胞免疫,T细胞、NK细胞和巨噬细胞是最主要的效应细胞,MHCⅠ类分子限制的CD8+CTL和MHCⅡ类分子限制的CD4+辅助性T细胞(TH)可分别识别肿瘤细胞内和肿瘤细胞外的抗原肽分子,它们在一系列辅助信号的参与下,被诱导激活并介导抗肿瘤免疫反应。IL-2、IFN-γ、INF-β、IL-12 四种细胞因子在机体抗肿瘤免疫中发挥重要作用,IL-2和IL-12刺激的NK细胞或CTL细胞的杀瘤活性,IFN-γ具有较强的抗肿瘤和免疫调节作用,TNF-β可造成肿瘤细胞凋亡,使肿瘤细胞DNA断裂,细胞萎缩死亡。上述抗肿瘤细胞因子要么为Th1细胞直接分泌(IL-2,IFN-γ,TNF-β),要么能诱导Thl细胞的发育(IL-12),由此可见机体要处于良好的抗肿瘤状态,Th1型细胞应占优势。一旦由Th1向Th2漂移,造成免疫抑制状态,机体的抗肿瘤免疫将受到严重干扰。另外肿瘤细胞释放多种细胞因子影响Th1/Th2的成熟和功能,这些因子包括VEGF、IL-10、TGF-J3、M-CSF、INF-β、IL-6等,其中VEGF可调节Th1/Th2配体对DC生长的影响,IL-10能抑制DC的分化成熟;肿瘤的免疫原性比较弱,肿瘤细胞的MHC类分子表达异常,并且缺乏共刺激因子的表达,因而T细胞缺乏第二信号系统而不能被激活。同时,一般情况下肿瘤细胞不释放危险信号,吞噬细胞不能摄取这些抗原而致其不能分化成熟,导致了免疫耐受。另外,肿瘤细胞还能引起Th1/Th2的凋亡,从而阻断机体的抗肿瘤免疫应答,也是肿瘤免疫逃逸的机制之一。

研究结果显示,肿瘤患者Th1/Th2的漂移主要发生在末梢血淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞上,最近有人以肿瘤细胞株进行研究表明:肿瘤细胞本身也表现Th2细胞因子模式。Huang等[4]用RT-PCR和ELISA法检测5例非小细胞肺癌细胞株IL-10、IL-5、IL-4、IL-13、IL-2、IFN-γ的表达状况,结果5/5细胞株表达IL-10、IL-5;3/5表达IL-4;2/5表达IL-13;没有一株细胞表达IL-2和IFN-γ。IL-10和IL-4是抑制Th1型细胞因子应答和介导Th2型细胞发育的主要细胞因子.已证明IL-10具有多种抑制抗肿瘤免疫应答的作用,包括巨噬细胞炎症反应,抗原递呈功能的下降,T细胞增殖能力的下降等,最近有人建议可将IL-10水平的提高列为肿瘤的恶性诊断指标之一[5]。

Th1向Th2的漂移是恶性肿瘤的特有现象,Th2型细胞因子优势状态将导致机体抗肿瘤免疫功能的减弱,将保护肿瘤逃逸免疫监视和免疫攻击,这可能是肺癌发生发展的免疫机制之一[6],这也为肿瘤的治疗提供新的思路,可以采用以下几种方式促使Th2向Th1逆转:一是直接注射Ⅰ型细胞因子(IL-2,IFN-γ)或IL-12;二是利用上述因子进行基因治疗;三是用抗Ⅱ型细胞因子抗体进行逆转;四是通过主动免疫方式激活Th1。纠正失衡的Th1/Th2细胞因子网络,逆转肿瘤细胞或其宿主机体的Th1/Th2的异常漂移,将非常有利于以细胞免疫为主的抗肿瘤免疫能力的恢复[7],对减少肿瘤发生,防止肿瘤复发、转移,提高长期生存率等都有重要的意义。

参考文献

[1]Mosman TR,Cherwinski H,Bond MW,et al.Two types of murinehelperTcell cloneⅠdefinition to profiles of lymphokine activities and secretedproteins[J].J Immunol,1986,136:2348-2357.

[2]Sad S,Raniguchi Y.Prognostic significance of T helper 1 and 2 and Tcytotoxic 1 and 2 cells in patients with non-small cell lung cancer[J].Immunity,1995,2:271-279.

[3]Yoshimura T,Matsushima K,OppenheimJJ,et al.Neutrophil chemotacticfactor produced by lipolysaccharide(LPS)stimulated human bloodmononuclear leukocytes:partial characterization and separation form in-terleukin1(IL-l)[J].J Immunol,1987,139(3):779-788.

[4]Huang M,Botella-Estrada R,Escudero M,et al.Cytokine production byperipheral lymphocytes in melanoma[J].Cancer Res,1995,55:3847.

[5]江晓东,陈惠晓.Th细胞的分化调控[J].国际免疫学杂志,2007,30(3):79-82.

[6]Knutson KL,Disis ML.Tumor antigen-specific T helper cells in cancerimmunity and immunotherapy[J].Cancer Immunol Immunother,2005,54(8):721-728.