绵羊链球菌的分离鉴定

绵羊链球菌的分离鉴定（精选七篇）

绵羊链球菌的分离鉴定 篇1

1 材料与方法

1.1 培养基、药敏纸片及菌株

胰蛋白胨大豆肉汤琼脂培养基和胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基均购自北京奥博星生物技术有限责任公司;5%绵羊血琼脂平板系在胰蛋白胨大豆肉汤琼脂培养基中加入5%无菌绵羊血配制而成;Mueller-Hinton (M.H.) 培养基购自杭州微生物试剂有限公司。

PCR反应试剂包括10×PCR Buffer、25 mmol/L Mg Cl2、2.5 mmol/L d NTPs和2.5 U/μL Taq DNA聚合酶, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;DL-2 000Marker分子量标准, 购于日本Ta KaRa公司;TAE电泳缓冲液, 自配;电泳级琼脂糖, 购自OXOID公司;其余试剂均为国产分析纯。

氨苄西林、菌必治、苯唑西林、氨苄西林+舒巴坦、替卡西林+克拉维酸、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、四环素、诺氟沙星、复方新诺明、氯霉素、利福平、头孢西丁等15种药敏纸片均购自杭州微生物试剂有限公司;对照菌株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌 (MSSA) ATCC25923购自卫生部临床检验中心。

1.2 样本采集与金黄色葡萄球菌的分离纯化

无菌采集来自四川省阿坝州若尔盖县和青海省海南州的4只肺炎患病绵羊的肺部病变组织, 直接接种血琼脂平板, 37℃培养24 h。在每个平板上挑取3个金黄色、光滑、边缘整齐的圆形β溶血菌落, 划线接种至胰蛋白胨大豆肉汤琼脂培养基, 37℃培养24 h。再挑取金黄色菌落在胰蛋白胨大豆肉汤琼脂培养基上连续传代3次进行纯化。每传代一次之后都进行革兰染色和镜检, 观察细菌形态、颜色、大小及染色特性。

1.3 PCR鉴定

按照参照文献[5]的方法对临床分离株进行PCR鉴定。扩增的靶基因为金黄色葡萄球菌的23S rRNA基因, 上游引物:5'-GGA CGA CAT TAG ACG AAT CA-3', 下游引物:5'-CGG GCA CCT ATT TTC TAT CT-3', 扩增片段大小为1 319 bp, 引物由上海英俊生物技术有限公司合成。将分离株接种于胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基上, 在空气浴摇床中37℃、180 r/min培养18 h, 用酚氯仿法提取DNA。PCR采用25μL反应体系:10×PCR Buffer 2.5μL, 25 mmol/L Mg Cl21μL, 2.5 mmol/L d NTPs 2μL, 上下游引物各1μL, 2.5 U/μL的Taq DNA聚合酶0.25μL, DNA模版2μL, 加dd H2O补足至25μL。反应条件为:94℃5 min;94℃1 min, 60℃1 min, 72℃1.5 min, 共进行35个循环;72℃延伸10 min, 于16℃终止反应。以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.4 药敏试验

对PCR鉴定为金黄色葡萄球菌阳性的临床分离株, 采用世界卫生组织 (OIE) 推荐的Kirby-Baller法进行15种抗菌药物的敏感试验。结果判定按临床和实验室标准化研究所 (CLSI) 2009年标准第19版增刊进行。

2 结果与分析

2.1 金黄色葡萄球菌的分离鉴定结果

绵羊病变的肺脏表面呈现严重的充血和水肿, 肺脏上有灰白色病灶, 支气管表面黏膜充血, 轻微水肿 (见184页彩图1) 。采集的肺脏病料直接接触血平板, 培养24 h后出现大小不一的菌落。挑取金黄色的菌落接种至胰蛋白胨大豆肉汤琼脂培养基上, 37℃培养24 h, 经3次传代后出现金黄色、有光泽、表面光滑的圆形凸起单个菌落 (见184页彩图2) 。疑似金黄色葡萄球菌的分离菌株经染色镜检后呈现紫色, 为革兰阳性菌, 显微镜下成葡萄串状排列 (见184页彩图3) 。对7株疑似金黄色葡萄球菌的DNA进行PCR扩增, 通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。结果发现7个分离株中有2株能够扩增得到特异性条带 (见图4) 。

M.DL-2 000 Marker;P.阳性对照;N.无模板对照;1~7.1~7号样品。

2.2 药敏试验结果

2株金黄色葡萄球菌分离株的药敏试验结果见表1。分离株均对苯唑西林等13种药物敏感, 对菌必治中度敏感, 对氨苄西林耐药。

3 讨论

1) 金黄色葡萄球菌感染能够导致多种动物患肺炎, 但其在绵羊肺炎中的感染情况尚未见报道。绵羊肺炎主要由支原体感染引起, 但由于绵羊支原体肺炎常呈慢性表现并且死亡率比较低, 一直以来并没有引起人们的重视。近年来的研究发现, 绵羊支原体肺炎的死亡率呈上升趋势, 给养羊业造成了巨大的经济损失。支原体和大肠杆菌混合感染的绵羊肺炎具有高发病率和高致死率[6]。本研究从2只患肺炎的绵羊肺部病变组织中分离并鉴定出2株金黄色葡萄球菌, 说明黄色葡萄球菌也是绵羊肺炎的病原之一, 同时提示其可能参与绵羊支原体肺炎的继发感染或混合感染。鉴于金黄色葡萄球菌在羊群中的严重带菌情况[7], 提示在诊断和治疗绵羊肺炎时要考虑到黄色葡萄球菌感染的可能性。

2) 金黄色葡萄球菌的耐药现象在世界范围内日趋严重。有报道称人群中已经开始携带动物源性耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌 (MRSA) 。并且动物性食品中的黄色葡萄球菌污染也是导致食物中毒的主要原因之一。因此, 对动物源性金黄色葡萄球菌耐药性的控制无论是对畜牧业发展还是对人类健康都十分重要。国内动物源性金黄色葡萄球菌对青霉素类药物的耐药率最高, 并且已经出现多重耐药的现象。本研究中分离到的2株金黄色葡萄球菌也对青霉素类药物氨苄西林耐药, 但如果联合β-内酰胺酶抑制剂使用, 例如舒巴坦和克拉维酸, 仍然能够得到较好的效果。分离株对头孢菌素类药物菌必治中度敏感, 这提示该类药物已经不适宜继续使用, 以避免产生耐药性。分离株对其他13种抗生素均敏感, 说明这13种药物是绵羊肺炎目前较为理想的预防和治疗药物。

摘要：为了研究金黄色葡萄球菌在绵羊肺脏中的感染情况及其耐药性, 对来自四川省和青海省的4只肺炎患病绵羊的肺脏病变组织进行金黄色葡萄球菌的分离、鉴定及药敏试验。从其中2只患羊的病变组织中分离鉴定出2株金黄色葡萄球菌。对临床分离株进行15种抗菌药物的药敏试验, 结果表明分离株对苯唑西林等13种药物敏感, 对菌必治中度敏感, 对氨苄西林耐药, 药敏试验结果为有针对性地防治绵羊肺炎提供了参考依据。

关键词：绵羊,肺炎,金黄色葡萄球菌,分离鉴定,耐药性

参考文献

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[2]黄冰, 邓志爱, 谭铭雄, 等.食品中金黄色葡萄球菌污染状况、产肠毒素特性及耐药性研究[J].中国卫生检验杂志, 2009, 19 (6) :1380-1382.

[3]吕婉飞, 汪丽, 张媛媛, 等.金黄色葡萄球菌耐药性变迁分析[J].中华医院感染学杂志, 2010, 20 (13) :1951-1952.

[4]孙继国, 袁万哲, 景翠, 等.绵羊支原体肺炎的研究概况[J].中国兽医杂志, 2009, 45 (7) :66-68.

[5]谢志勤, 谢芝勋, 唐小飞, 等.多重PCR快速检测奶牛乳房炎3种主要病原体[J].畜牧与兽医, 2006, 38 (7) :4-7.

[6]彭晓玲, 盛卓君, 马为卫.绵羊传染性胸膜肺炎与大肠杆菌混合感染的诊断与防治[J].中国兽医杂志, 2012, 48 (7) :46-48.

一株猪链球菌的分离鉴定 篇2

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 河北省某猪场的疑似链球菌病病死猪剖检病料。

1.1.2 试剂

改良马丁肉汤、营养琼脂;细菌DNA提取试剂盒购自Tian Gen公司, PCR相关试剂均购自宝生物 (大连) 有限公司;抗生素药敏纸片购自北京天坛生物技术有限公司, 细菌生化反应管购自杭州天和微生物试剂有限公司;普通营养琼脂绵羊血平板、按常规方法制备。

1.1.3 试验动物 昆明白小鼠20只, 体重18g左右, 购自山东省实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 细菌的常规分离及生化特点

生物安全柜内将病料样品用划线接种于普通琼脂绵羊血平板, 于37℃培养36h后观察其菌落特点, 挑取疑似链球菌菌落染色、镜检观察细菌形态。将分离菌株分别接种于各个细菌生化微量反应管, 37℃培养条件下观察生化反应特点。

1.2.2 玻片凝集试验

将疑似菌落接种改良马丁肉汤, 于37℃培养12h, 取0.5ml培养物, 经5000r/min离心2min, 弃上清, 用70μl的无菌pbs悬浮沉淀, 取20μl菌体悬浮液分别与等体积的无菌pbs、猪链球菌2型阳性血清做玻片凝集试验, 其中无菌pbs作为阴性对照并观察阴性对照是否成立。

1.2.3 猪链球菌的PCR鉴定及毒力因子检测

取细菌培养物1 ml离心取沉淀, 使用DNA提取试剂盒提取基因组DNA备用, 细菌16S RNA通用引物为本实验室保存、链球菌毒力因子鉴定参照文献[7,8,9,10]及NCBI上部分基因序列, 相关引物由生工生物工程上海有限公司合成见表1, 细菌16S RNA扩增PCR产物送生工测序。 (1) 细菌16S RNA扩增条件为:Taq酶0.5μl、10×PCR Buffer 5μl、d NTP Mixture 4μl、16S r DNA上下游引物各1μl、提取模板1μl, 加无菌水至50μl, 分型扩增参数为:95℃预变性5min, 94℃变性45s, 55℃退火50s, 72℃延伸80s, 30个循环, 最后72℃延伸8min。 (2) 猪链球菌毒力因子2型荚膜多糖CPS2J加样体系为:Taq酶0.5μl、10×PCR Buffer 5μl、d NTP Mixture 4μl、cps2J-F、cps2J-R各1μl、提取模板1μl, 加无菌水至50μl, 分型扩增参数为:95℃预变性5min, 94℃变性45s, 55℃退火45s, 72℃延伸45s, 32个循环, 最后72℃延伸8min。 (3) 猪源链球菌毒力因子溶血素基因sly PCR鉴定反应体系为:Taq酶0.5μl、10×PCR Buffer5μl、2.5mmol/L的d NTP Mixture 5μl、sly基因上下游引物各0.5μl、模板DNA1μl、加无菌水至50μl, 扩增参数为:95℃预变性5min, 94℃变性45s, 51℃退火45s, 72℃延伸45s, 32个循环, 最后72℃延伸8min;gdh、epf、mrp各个反应体系同sly。

1.2.4 对小鼠致死性试验

将该分离菌接种到改良马丁肉汤培养基中, 37℃恒温培养36h (含菌量约为2.0×108CFU/ml) 。20只昆明白小鼠分成4组, 每组5只, 分别腹腔接种1.0×106、1.0×107及1.0×108细菌培养物, 同时取1组小鼠作对照, 腹腔接种0.5ml无菌培养基。腹腔注射该分离菌后小鼠隔离饲养, 观察其发病、死亡情况。

1.2.5 药敏试验

将分离株细菌马丁肉汤培养物用灭菌PBS稀释后均匀涂布150μl于普通琼脂平板, 摇匀后用灭菌枪头吸出多余菌液, 选取相应抗生素阿莫西林、青霉素、红霉素、等常用抗菌药物, 药敏纸片轻轻放在固体平板上, 37℃培养24h后观察并判定结果。

2 结果

2.1 细菌的常规分离及生化特点

经37℃培养24h候后在普通琼脂绵羊血平板上形成小圆形、乳白色、菌落表面光滑整齐、边缘相对整齐的菌落、菌落周围出现明显的溶血环如图1和图2。染色为典型革兰氏阳性球菌, 生化试验表明该链球菌菌可以发酵乳糖、蔗糖、葡萄糖、七叶苷, 不发酵山梨糖、山梨醇、甘露醇、等, VP阴性, MR检测阳性。

2.2 玻片凝集试验

分离株与猪链球菌2型阳性血清玻片凝集试验为阳性, 阴性对照成立。

2.3 猪链球菌PCR分型鉴定及毒力因子检测

分离菌16SRNA扩增见图3, 目的片段大小为1500bp, PCR产物测序表明该分离菌是一猪链球菌;毒力因子PCR检测结果如图4, 荚膜多糖CPS2J片段大约480bp、胞外因子epf片段大约740bp、溶血素sly基因片段大约248bp、谷氨酸脱氢酶gdh片段大约为325bp、溶菌酶释放蛋白mrp片段大约为204bp。将扩增阳性的PCR产物分别回收后送生工测序, 测的序列与NCBI上公布的序列比较后进一步确定为2型猪链球菌。

2.4 对小鼠致死性试验

攻毒16h后, 河北分离株1.0×106剂量死亡1只、1.0×107攻毒组死亡4只, 1.0×108全部死亡, 空白对照组5只小白鼠全部健在, 由此可见此分离菌在1.0×107剂量对小鼠有致死性。

2.5 药敏试验

分离菌株对阿莫西林、青霉素、复方新诺明、红霉素、卡那霉素等抗菌药中度敏感, 对四环素耐药。

3 讨论

本试验分离到的猪链球菌是从脾脏中分离到的, 病猪死前呈典型的猪链球菌病症状, 在毒力因子的PCR检测中发现该链球菌分离株的溶血素基因sly、胞外因子ef及溶菌酶释放蛋白mrp三个毒力因子均为阳性, 且小白鼠致病性试验表明此分离菌具有一定的毒力, 药敏试验表明该分离株对青霉素、复方新诺明、红霉素等抗菌药敏感, 在治疗时选择这些抗生素取得的治疗效果较好, 此菌的分离鉴定为自家灭活菌苗的制备提供了候选菌株, 为今后该猪场猪链球菌病的防治提供了一定的参考价值。

摘要：从河北某猪场送检的一份病猪病料中分离出1株链球菌, 革兰氏染色表现为G+球菌, 该菌在普通琼脂绵羊血平板上形成圆形、乳白色、表面光滑整齐、具有溶血环的小菌落, 通过对该菌进行细菌16SRNA、PCR扩增, 测序结果表明分离菌是一链球菌, 对该分离菌株的毒力因子检测中发现, 其荚膜多糖CPS2J+、gdh+、sly+、epf+、mrp+均为阳性、该菌一定剂量对小白鼠有致死性, 对阿莫西林、青霉素、复方新诺明比较敏感, 对四环素耐药。该结果对今后该猪场猪链球菌病的临床防治具有一定的指导意义。

关键词：链球菌,分离,鉴定

参考文献

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[4]Muckle A, López A, Gottschalk M, et al.Isolation of Streptococcus suis from 2 lambs with a history of lameness[J].Can Vet J, 2014, 55 (10) :946~949.

[5]Sánchez Del Rey V, Fernández-Garayzábal JF, Bárcena C, et al.Molecular typing of Streptococcus suis isolates from Iberian pigs:A comparison with isolates from common intensively-reared commercial pigbreeds[J].Vet J, 2014, 202 (3) :597~602.

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[8]马建华, 魏建忠.猪链球菌毒力因子研究进展[J].动物医学进展, 2014, 35 (8) :95~99.

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一株猪链球菌的分离与鉴定 篇3

1 材料和方法

1.1 主要试剂和试验动物

绵羊鲜血琼脂平板、普通琼脂平板及麦康凯琼脂平板自配;生化试剂购自广东环凯微生物科技有限公司;革兰氏染色试剂和药敏试纸购自福州富利达生物实验制品有限公司;昆明鼠8只, 购自福建中医学院。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养

将病死猪的脾、肺淋巴结等组织划线接种于鲜血琼脂平板, 置37℃厌氧培养24 h后观察结果, 挑取单个可疑菌落作纯培养。

1.2.2 细菌形态学观察

挑取单个经纯培养的菌落涂片, 革兰氏染色后镜检。

1.2.3 细菌培养特性鉴定

挑取单个菌落接种于普通琼脂平板、鲜血琼脂平板、麦康凯琼脂平板分别在有氧和厌氧条件下培养, 观察其生长表现, 挑取单个菌落涂片, 革兰氏染色后镜检。

1.2.4 细菌生化鉴定

根据生化鉴定管使用说明书, 将细菌分别接种到葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、山梨醇、七叶苷、甘露醇、乳糖、鼠李糖、肌醇、木糖、阿拉伯糖、棉籽糖、淀粉、靛基质、硫化氢、尿素等生化鉴定管中, 37℃培养8~24 h后观察结果。

1.2.5 动物接种

昆明鼠8只, 分成试验组和对照组, 各4只。试验组每只腹腔接种菌液0.5 m L, 对照组注射相同剂量的灭菌生理盐水。两组隔离饲养观察, 发病或死亡者取其内脏进行病原菌分离培养鉴定。

1.2.6 药敏试验

按常规试纸片法进行。

2 结果

2.1 细菌形态学观察

从肺脏中分离到1株细菌, 在绵羊鲜血琼脂平板上厌氧培养24 h后, 长出针尖大小、灰白色、半透明、表面光滑、圆形、隆起、边缘整齐的菌落;革兰氏染色阳性, 菌体呈圆形, 短链, 以8~12个菌体相连的链状排列为主, 也可见单个或长达20个以上菌体相连的长链状。

2.2 细菌培养特征鉴定

该菌于厌氧和有氧条件在麦康凯琼脂平板不生长, 在普通琼脂平板上生长极贫瘠、鲜血琼脂平板培养在厌氧比有氧条件下生长好。挑取单个生长菌落涂片, 革兰氏染色后镜检, 均呈阳性、圆形, 长、短链状排列。菌落周围形成完全透明的溶血圈, 为β-溶血。该细菌在血清肉汤中管底呈透明状。

2.3 细菌生化鉴定

接种18种生化试剂后发现, 该菌可发酵葡萄糖、果糖、肌醇、蔗糖、乳糖;不发酵鼠李糖、甘露醇、木糖、山梨醇、麦芽糖、尿素、阿拉伯糖、棉籽糖、七叶苷、淀粉阳性 (+) ;靛基质阴性 (-) 、硫化氢阴性 (-) 。

2.4 动物试验

昆明鼠于接种后12 h出现临床症状, 精神沉郁、被毛逢松、活动减少、个别48 h内死亡, 未死小鼠于48 h后开始恢复。剖检死亡小鼠可见肝脏肿大、出血, 脾脏出血, 腹腔充满胶胨液体;对照组小白鼠正常。对病死昆明鼠的肺脏进行细菌分离, 能分离到原分离菌。

2.5 药敏试验

分离菌株对阿莫西林和先锋V高度敏感;对菌必治、呋喃妥因、庆大霉素和磺胺类药中度敏感;对青霉素、链霉素、卡那霉素、蒽诺沙星、复方新诺明、环丙沙星不敏感。

3 分析与讨论

1) 根据分离细菌的形态观察、培养特性和生化试验结果鉴定, 结合猪场的发病情况和剖检变化, 确诊该猪场发生疫病的病原主要为链球菌。该分离菌为短、长链排列的革兰氏阳性球菌, 偏向厌氧型, 对营养要求也较高。厌氧条件下, 在鲜血琼脂平板上生长良好, 但在普通营养琼脂平板上生长不良, 在麦康凯琼脂平板上不生长。有氧条件下, 在鲜血琼脂平板上和普通营养琼脂平板上生长贫瘠, 在麦康凯琼脂平板上不生长。动物试验表明, 该分离的菌株对鼠有致病性, 且发病急, 24 h内发病, 说明该分离菌具有一定致病性。猪链球菌病一年四季都可发生, 猪群在不良的条件下, 如饲养管理较差、气候变化频繁, 加上各种应激因素的作用, 容易导致猪群发病、死亡。

2) 药敏试验结果表明, 分离菌株对阿莫西林和先锋V高度敏感, 对磺胺类药中度敏感。因此, 该猪场根据药敏试验结果, 在全场饲料中添加高敏的阿莫西林, 在饮水中添加替米考星及多维, 同时给发病猪注射阿莫西林等药物, 并加强环境消毒措施, 最终使疫情得到有效控制。

3) 猪链球菌病自20世纪50年代在我国发现以来, 曾一度由于疫苗的应用, 该病的流行得到了一定控制。但是由于猪链球菌的血清型众多, 不同地区的链球菌对抗生素敏感性报道不一, 导致当前我省许多规模猪场用苗和用药预防后该病仍然频频发生, 并呈现流行趋势, 造成较大的经济损失。因此, 建议各个猪场应加强饲养管理, 建立健全严格的防疫消毒制度、全面做好各种疫苗的免疫工作, 对于链球菌病压力较大的猪场, 可以选用多价链球菌灭活疫苗免疫产前30 d免疫的母猪, 免疫35日龄的小猪, 对防控该病的发生具有一定效果。

摘要：从疑似发生猪链球菌病患猪的肺脏和淋巴结中分离到1株细菌。该细菌经形态学观察、培养特性、溶血试验、生化试验和动物试验鉴定为偏向厌氧型链球菌。该菌株对小白鼠存在致病性。药敏试验表明:分离菌株对阿莫西林和先锋V高度敏感, 对菌必治、呋喃妥因、磺胺类药中敏, 对青霉素、链霉素、卡那霉素和恩诺沙星等药物不敏感。

关键词：猪链球菌,分离,鉴定

参考文献

[1]陈溥言.兽医传染病学[M].5版.北京:中国农业出版社, 2006:155-162.

[2]陆承平.兽医微生物学[M].4版.北京:中国农业出版社, 2007.

猪源链球菌LY株的分离和鉴定 篇4

采集相关病变组织、器官(关节囊胶冻样物、心脏、肝脏、脾脏),进行细菌分离培养,均分离到一株较纯的链球菌,菌种冻干保存。2007年初经鉴定为C群链球菌,称猪源链球菌LY株。本次实验主要对LY分离菌株进行了一系列病原特性分析,并与链球菌标准株进行对比试验。经过免疫原性鉴定,证明链球菌LY株具有良好的免疫原性。

1 材料

1.1 参考菌株:ATCC35246,马腺疫链球菌兽疫亚种,属链球菌兰氏分群C群,由上海畜牧兽医总站惠赠。

1.2 培养基:基础培养基、生化试验用培养基、化学试剂及微量发酵管,上海市生物制品研究所生产。

1.3 API 20 Strep细菌快速鉴定试剂条,法国梅里埃公司生产。

1.4 定型用诊断血清:链球菌乳胶凝集标准诊断试剂盒,由兰氏分群A-G的乳胶诊断试剂。

2 方法

2.1 形态观察及培养特性鉴定

用相关病料及24 h鲜血琼脂平板、血清马丁肉汤(5%犊牛血清,按常规方法配制)的培养物,分别涂片、革兰氏染色、镜检观察其形态,并观察其在固体培养基和液体培养基中的培养特性。

2.2 生化特性鉴定

分离菌经24 h血平板纯培养后,用微量生化发酵管进行糖发酵及其他生化特性试验。

2.3 溶血试验

以平板法测定了LY株和ATCC35246的溶血特性。

2.4 药敏试验

按常规法对分离菌做药敏试验。

2.5 乳胶凝集试验

取分离菌株24 h血平板培养物,分别与试剂盒的兰氏分群A-G的乳胶诊断试剂作凝集试验,方法按说明书进行,并设PBS空白对照、A-G群混合阳性抗原对照和ATCC35246对照。

2.6 毒力试验

取分离菌株18 h血清马丁肉汤培养物,分别腹腔注射小鼠4只(体重20～25 g,注射剂量0.5 m L/只)、静脉注射家兔2只(体重2 000 g,注射剂量1 m L/只)、静脉注射断奶猪2头(体重15 kg,注射剂量2 m L/头)。

2.7 免疫原性鉴定

用链球菌LY株制备油乳剂灭活疫苗,肌肉注射体重为5 kg左右的健康仔猪3头,免疫28 d后连同条件相同的对照仔猪3头,各静脉注射强毒效检菌株ATCC35246菌液0.5 m L(含活菌4×107CFU)。观察10日,将发病、死亡或观察结束时未死亡仔猪进行剖检,观察内脏病变情况。

3 结果

3.1 分离菌形态观察

病料直接涂片及分离菌固体培养物镜检,均为G阳性球菌,以双球、散在为主。液体培养物均以长链为主,少则3～5个排列,多则6～10个排列。

3.2 分离菌培养特性

病料接种绵羊鲜血琼脂平板,初代培养即获得纯培养菌。在鲜血琼脂培养基上形成无色、透明、圆形、凸起、湿润、表面光滑、边缘整齐、针尖大的露滴样小菌落,呈溶血。在血清马丁肉汤培养基中呈白色絮状均匀混浊。培养特性见表1。

注:“+”表示生长良好;“–”表示不生长

3.3 分离株生化特性鉴定

分离菌株的糖发酵特性不活泼,重复试验结果不稳定,见表2。

3.4 溶血试验检测

分离菌LY株、ATCC35246的溶血性,结果均具有溶血。

3.5 药敏试验

分离菌株共进行了14种抗生素的药物敏感试验,其中恩诺沙星、氨苄青霉素、氯霉素、青霉素G效果较好,而对其他抗生素则产生了不同程度的耐药性,尤其是链霉素、磺胺甲基异口恶唑、壮观霉素、强力霉素等。

3.6 分离菌的血清型鉴定

ATCC35246与C群诊断试剂反应阳性,A-G群混合抗原对照皆阳性。LY株与C群诊断试剂反应阳性,A-G群混合抗原对照皆阳性,结果表明分离菌属于兰氏C群。

3.7 毒力试验

分离株LY株对于小白鼠、家兔和断奶仔猪的致病性较强,家兔和小白鼠均在注射后24 h内死亡,仔猪在72 h内发病死亡。

3.8 免疫原性鉴定

用链球菌LY株制备的油乳剂灭活疫苗免疫健康仔猪,28 d后,用4×107CFU的ATCC35246进行攻击。观察10日,将发病、死亡仔猪或观察结束时仍存活的仔猪进行剖检,观察内脏病变情况。结果表明,对照仔猪于72 h内全部死亡,而免疫仔猪全部健活,未见明显的临床症状,剖检未见脏器出现异常,说明链球菌LY株具有良好的免疫原性,能够保护同源强毒菌株攻击。

4 讨论

猪链球菌病是世界各国常见的一种传染病,危害严重。我国亦有流行,70和80年代曾在上海、江浙、山东一带流行,其病原均确诊为C群链球菌,且多为马腺疫链球菌兽疫亚种,临床上也多表现为关节炎型。90年代由于注射C群链球菌冻干活疫苗进行免疫,病情有所缓解。

猪链球菌的分离鉴定及免疫原性研究 篇5

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

发病猪场送检的日龄30～40日龄保育病猪5头。

1.1.2 培养基

普通营养琼脂、麦康凯、普通肉汤培养基, 购自天津市珠江卫生材料厂。细菌生化微量反应管, 购自杭州天和微生物试剂有限公司、血清牛心浸液培养基按文献[1]配制。

1.1.3 药敏试纸

常见药物的药敏纸片, 购自上海医学化验所。

1.1.4 试验动物

健康18～22g重小白鼠20只, 山东省医疗器械产品质量检验中心实验动物中心提供;试验用健康仔猪由发病猪场畜主提供。

1.1.5 化学试剂

10#白油由杭州炼油厂生产, 硬脂酸铝由上海远航化工厂生产, Tween-80和Span-80由上海大众制药厂生产。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养

无菌取病猪的肿胀关节积液、肝脏、脾脏、肾脏等病料接种于普通营养琼脂, 37℃培养24h。挑取单个菌落纯培养后, 再将纯培养物移植到普通肉汤培养基、麦康凯培养基及血琼脂培养基上, 37℃培养24h, 观察培养特性。

1.2.2 细菌形态学观察

取纯培养物涂片, 革兰氏染色, 显微镜观察;18h的普通肉汤培养物涂片, 在暗视野显微镜下观察菌体的运动情况;硝酸银染色法观察菌体周身是否具有鞭毛;用湿墨水染色法观察菌体是否具有荚膜;用Schaeffer-Fulton染色法观察菌体是否具有芽孢。

1.2.3 生化特性检查

将分离菌纯培养物分别接种到微量生化管, 37℃培养24h, 观察并记录结果。

1.2.4 细菌的致病性检测

将10只试验用小白鼠随机分成2组, 分别为试验组和对照组, 每组5只。试验组每只接种6×1010CFU/ml的37℃培养24h的细菌肉汤培养液0.2ml;对照组每只接种0.2ml的无菌肉汤培养基。

1.2.5 药敏试验

采用药敏纸片扩散法进行, 37℃培养24h, 观察并记录结果。

1.2.6 免疫原的制备

将分离菌纯培养物接种于肉汤培养基和普通琼脂培养基, 37℃培养24h, 通过细菌计数, 将菌液浓度调整为150亿/ml, 0.5%甲醛溶液灭活, 然后与高压灭菌的油佐剂按1:3的比例乳化, 制备成油乳剂灭活苗 (张培君, 1997) [2], 经常规检验合格后备用。

1.2.7 免疫原性的检测

由临沂健康良好猪场提供10只14日龄健康哺乳仔猪。随机分成2组, 分别为试验组和对照组, 用上述制备的油乳剂灭活苗免疫试验组, 1ml/只, 14天重复免疫1次;对照组均接种灭菌营养肉汤培养基1ml/只;第2次免疫7天后, 分别用分离菌攻毒 (6亿菌/只, 腹腔接种) 试验组和对照组, 分别观测和记录免疫仔猪的保护率。

2 结果

2.1 细菌分离培养

分离菌在鲜血琼脂平板上在37℃培养24h生长良好, 形成半透明、表面光滑、微隆起的淡灰白色、露珠状的针尖大小菌落, 外层有明显的β溶血环, 在10℃和45℃条件下培养24～48h, 均无生长;在普通琼脂平板上生长贫瘠;在肉汤培养基中先均匀浑浊, 后在试管底部形成沉淀, 不形成菌膜。

2.2 细菌形态学观察

病猪的病料和培养物涂片染色镜检, 均见到单个、成对或呈短链革兰氏阳性球菌, 无芽孢和荚膜;其中培养物中的分离菌明显呈链状, 且较长。

2.3 生化试验

根据生化反应结果见表1, 结合分离菌的形态染色特性、培养特性和菌落特征、溶血性、血清型鉴定及动物试验表明, 该分离菌为致病性猪2型链球菌[3]。

2.4 致病性试验

将分离菌接种的5只小白鼠 (试验组) 在48h内均死亡, 并从死亡的小鼠体中回收到了分离菌, 而对照组、健康组均无异常变化, 健康存活。

2.5 药敏试验结果

从药敏试验结果见表2, 可知分离的猪链球菌菌株对丙氯派酸、环丙沙星、先锋霉素、氨苄霉素高敏;对氯霉素、链霉素、万古霉素、苯唑青霉素低敏或耐药。

2.6 分离菌免疫原性的检测

利用分离到的猪链球菌制备成的油乳剂灭活苗, 经无菌检验、毒性试验、理化性状检验合格。试验组5只仔猪攻毒后没有发病, 保护率100%;而对照组的仔猪攻毒后均发病, 其中2头仔猪在48h内死亡, 剖检后, 均回收到猪链球菌。

3 讨论

根据发病猪中分离菌的形态学特性、培养特性、生化特性等可将分离菌鉴定为猪链球菌。在对5只具有典型症状的病猪的关节液、肝脏、脾脏、肾脏等病料检测过程中, 猪链球菌分离率100%, 且可以造成接种小鼠的急性发病死亡。尽管也从病料中分离到了巴氏杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌, 但其分离率均低于5%。因此, 猪链球菌菌是本次疫情的主要致病菌。

通过药敏试验表明分离的猪链球菌菌株对丙氯派酸、环丙沙星、先锋霉素、氨苄霉素高敏;对氯霉素、链霉素、万古霉素、苯唑青霉素低敏或耐药。药敏试验可以指导广大养殖户合理用药, 减少浪费。通过对分离的猪2型链球菌的免疫原性的检测表明, 该菌对仔猪的主动免疫保护率为80%, 而通过2次免疫14日龄仔猪, 保护率达到100%, 我们建议最好通过制定合理免疫程序和使用合格疫苗来预防该病的发生。

病猪和带菌猪是本病的重要传染源。猪场应建立健全严格的防疫消毒制度, 一旦发现病猪应迅速隔离治疗;对病死猪做无害化处理以防病原扩散;对被病猪污染的圈舍、场地、用具等进行严格消毒。

注:+为不分解/阳性;-为不分解/阴性。

注:抑菌圈直径 (φ) 为㎜

参考文献

[1]陈天寿.微生物培养基的制造与应用[M].北京:中国农业出版社, 1995.182, 302.

[2]倪红波, 何宏轩, 乔军.预防兽医学检验技术[M].长春:吉林人民出版社, 2002.61-64, 278.

绵羊链球菌的分离鉴定 篇6

猪链球菌病一年四季均可发生, 以冬春季多发, 不同年龄均可发病, 病猪和病愈带菌猪猪链球菌病病菌是本病的主要传染源, 主要经消化道和损伤的皮肤感染。根据感染发病的种类不同, 发病率及死亡率不同。不同国家和地区在正常猪体中检出率也不一样, 高的达75%, 而低的只有3%[3,4], 带菌检出率多数在50%以上[5]。我国自从吴硕显报道首例猪败血型链球菌病以来, 广东、福建、四川等省均有本病发生的报道。到目前为止, 已有13个省、市 (区) 相继报道了猪链球菌病, 并在华南、西南和华东地区造成大面积流行[6,7,8]。

随着养猪业的发展, 猪链球菌病的危害日趋严重, 已成为制约养猪业健康发展的重要疾病之一。为摸清猪链球菌病在潍坊地区的流行状况, 掌握发病日龄及饲养管理等因素对猪链球菌病的影响, 并制定合理的防制措施提供科学依据, 本研究对规模化养猪场和有一定规模的养猪专业户进行了猪链球菌病的流行病学调查。对潍坊地区猪链球菌分离株进行血清学分型, 并对分离菌株的地域分布进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 猪链球菌病门诊病例分析

2010年3月至2013年3月3年间, 根据山东畜牧兽医职业学院动物医院门诊资料 (猪病) 统计分析, 送检病猪、死猪均来自潍坊市潍城、寒亭、坊子、青州、诸城、安丘、昌邑、寿光、高密、临朐、昌乐11个生猪养殖大市 (县、区) , 挑选具有疑似链球菌病症状的病例, 共计262个, 涉及205个发病猪群。对其临床症状、剖检变化、流行特点等进行分析。

1.1.2 养猪场 (户) 猪链球菌病发病情况调查

2010年3月至2013年3月, 调查8个规模化养猪场、19户散养户的猪链球菌病发病率、死亡率等。

1.1.3 试剂与药品

链球菌乳胶凝集标准诊断试剂盒 (批号786536601, 法国bio Merieux SA公司生产) ;兰氏 (Lancefield) 分群A~G的乳胶诊断试剂;改良马丁氏培养基 (购自北京双旋微生物培养基厂) ;微量发酵管 (上海医学化验所试剂厂生产) ;THB液体培养基 (购自青岛海博生物技术有限公司) ;猪链球菌1-34型和1/2型标准阳性血清 (中国动物卫生与流行病学中心) ;各种糖发酵培养基, 6.5%Na CL高盐肉汤, 马尿酸钠等生化培养基均为自行配制, 试剂为分析纯。5%绵羊鲜血琼脂培养基为自行配制。

1..1.4试验动物

体重20~25g小白鼠, 清洁级, 购自青岛市药检所。

1.2 方法

1.2.1 检测样品的采集

对送检的猪链球菌病病例, 迅速采取其淋巴结、脾、肝、脑或关节囊液 (关节炎型) 等部位病料, 保存于-20℃。

1.2.2 细菌分离培养

对链球菌病死猪病料进行涂片, 经革兰氏染色后镜检。另外, 按照细菌常规方法分离, 样品接种于5%绵羊血琼脂平板, 放置于37℃恒温培养箱中培养24 h后, 挑取绵羊血平板上针尖大小、表面光滑、灰白色、圆形、半透明、边缘整齐的单个菌落进行革兰氏染色。菌体成对、短链、极少长链状的革兰氏阳性菌接种到THB液体培养基中, 经培养无杂菌生长者, 置4℃冰箱备用, 37℃震荡培养过夜。

1.2.3 细菌的生化试验

将60株命名的分离菌纯培养物分别接种于5%乳糖、海藻糖、水杨苷、七叶苷、甘露醇、菊糖、山梨醇等糖发酵培养基, 6.5%Na Cl高盐肉汤, 马尿酸钠等生化培养基中, 培育后记录结果。

1.2.4 溶血试验

以平板法 (PA) 和接触法 (CH) 测定不同来源的链球菌。 (1) PA法:将链球菌接种于5%绵羊鲜血平板, 37℃培养48h后观察, 菌落周围出现溶血圈者判为溶血阳性。 (2) CH法:将链球菌接种于血清肉汤, 37℃培养24h, 取50μL菌液在“V”, 形96孔微量滴定板上倍比稀释后, 与等体积1%绵羊红细胞混合, 37℃作用1h后观察结果。

1.2.5 动物致病性试验

将分离菌株接种到THB液体培养基中, 37℃恒温培养24h后 (含菌量约为2.0×108 CFU/ml) 。动物试验取分离菌株肉汤培养物, 每株分离菌接种2只小鼠, 每只腹腔接种0.1ml细菌培养物, 同时取2只小鼠作对照, 腹腔接种0.1ml生理盐水。对注射后的小鼠分别隔离饲养, 连续观察7d。观察其发病及死亡情况, 对死亡的及时解剖, 无菌采肝脏, 脾脏病料, 涂片, 革兰氏染色, 镜检。并在鲜血琼脂平板上划线, 分离培养。

1.2.6 兰氏血清分群试验

按链球菌乳胶凝集诊断试剂说明书的方法, 将待检分离菌株接种于7%绵羊血脑心汤琼脂培养基, 经过37℃培养24h, 然后每个菌株选取2~3个菌落接种到含有0.4ml专用提取酶的EP管中, 混匀后放37℃温箱中恒温孵育10~15min。将C、D、E、R、S型乳胶混匀后, 取1滴滴在反应卡的相应位置, 再取消化好的菌液滴1滴于乳胶滴旁作凝集试验, 并设PBS空白对照, 2min后判定结果。出现明显的凝集颗粒即为阳性, 未出现凝集的为阴性。

1.2.7 血清学型诊断试验

取自行分离的菌株接种于5%绵羊血平板培养物的菌体, 用结晶紫染色, 然后用常规方法以猪链球菌1-34型和1/2型的标准阳性血清作玻片凝集试验, 同时设PBS空白对照。在平片每格分别标上标准阳性血清的编号, 每格分别滴加20µL待检抗原;在每一格滴加等量相应的阳性血清;用枪头混匀被检抗原和相应血清, 形成直径2mm的液区, 轻微晃动, 室温下4min内观察结果, 出现大颗粒沉淀者判为阳性。对已确定其血清型的菌株按照其地域来源进行分类, 确定猪链球菌不同血清型在潍坊地方的分布状况。

1.2.8 统计不同血清型菌株的地域分布状况

对已确定其血清型的菌株按照其地域来源进行分类, 确定猪链球菌不同血清型在潍坊地方的分布状况。

2 结果

2.1 潍坊猪场的流行病学调查情况

规模化猪场数和散养户数的年度产仔数、猪链球菌病的发病率、死亡率等情况, 详见表1和表2。规模化猪场链球菌病的发病率达1.99%~2.12%, 散养户猪场链球菌病的发病率达16.49%~22.91%, 两者之间差异极显著 (P<0.01) ;规模化猪场链球菌病的死亡率达0.23%~0.48%, 散养户猪场链球菌病的发病率达2.51%~2.81%, 两者之间差异极显著 (P<0.01) 。不同年度之间规模化猪场与散养户猪场链球菌病的发病率、死亡率差异不显著 (P>0.05) 。

2.2 细菌分离

对链球菌病死猪淋巴结、脾、肝、脑或关节囊液 (关节炎型) 等部位病料进行涂片, 经革兰氏染色后镜检, 可见革兰氏阳性球菌, 多呈单个或成对排列, 还可见多个相连的短链, 偶见长链。无菌挑取5%绵羊血液琼脂平板上典型菌落涂片, 再次进行革兰氏染色, 可见成对、短链、极少长链状的革兰氏阳性菌。从疑似链球菌病病猪, 分离出60株链球菌, 败血型、脑膜炎型、关节炎型和其他型病猪分别分离出25、12、15和8株链球菌。

2.3 猪源链球菌分离株来源及分布情况

在262份病例中, 对其中比较清楚的病例分离到的60株分离株进行了猪源链球菌临床症状类型分类。结果发现, 来自潍坊市潍城区、坊子区、寒亭区, 青州、诸城、安丘、昌邑、寿光、高密、临朐、昌乐11个县市猪链球菌病发病猪场, 病猪表现为败血型的占41.7%, 脑膜炎型的占20%, 关节炎型占25%, 其他病型占13.3%, 分布情况及菌株编号见表3。

2.4 细菌的生化试验

将60个分离菌株分别接种于乳糖、海藻糖、水杨苷、七叶苷、甘露醇、菊糖、山梨醇等糖发酵培养基, 6.5%Na Cl高盐肉汤, 马尿酸钠等生化培养基中, 发现这些分离株均能发酵乳糖、海藻糖、水杨苷、七叶苷, 不发酵甘露醇、山梨醇, 菊糖反应缓慢, Na Cl高盐肉汤和马尿酸钠均为阴性。

2.5 溶血试验

溶血试验PA、CH两种方法检测分离株以及对照株均为溶血阳性, 溶血价在4~32之间。

2.6 致病性试验

小鼠于攻毒后24h开始死亡, 48h内部分死亡。临床诊断, 小鼠精神沉郁, 厌食。皮肤有出血点, 粪便干燥, 小便呈黄褐色。死后剖检可见肝、脾、肾肿大, 胸腔积液, 心包积液, 心肌出血。用肝脏及脾脏涂片, 革兰氏染色镜检, 发现有大量单个、成对或3~18个左右的短链革兰氏阳性球菌。对照组小鼠未见异常。

2.7 兰氏血清分群鉴定结果

兰氏血清分群鉴定结果表明, 来自潍坊市潍城区、坊子区、寒亭区, 青州、诸城、安丘、昌邑、寿光、高密、临朐、昌乐11个县市猪源链球菌血清群以兰氏分群R群为主, 占调查总数的45%, 其次为C群链球菌, 占30%, S群3株, D群3株, E群4株, 待定5株 (见表4) 。

2.8 血清型鉴定结果

来自潍坊市11个县市猪源链球菌血清型SS2型为主, 占调查总数的46.67%、SS1占5%、SS7型占8.33%、SS9型8.33%、14型6.67%、待定25.00%, 具体数据见表5。

3 讨论

SS在猪群中的感染相当普遍, 各种年龄、性别和品种的猪都易感。20世纪60年代, 猪链球菌病在我国大面积流行。广东、广西、四川、福建、江苏、安徽等地相继爆发。1976年, 四川爆发猪链球菌病导致100多万头猪发病, 死亡70多万头。1998~1999年, 江苏省南通地区猪群暴发猪链球菌病, 发病率26.38%, 病死率达47.21%[9]。猪链球菌病给养猪业造成了巨大的经济损失, 因此积极开展本病的流行病学调查有着重要的意义。本研究发现, 规模化养殖场和散养户猪链球菌发病率均较高。而规模化养殖场的发病率和死亡率均极显著低于散养户, 这应该与规模化猪场饲养环境卫生, 消毒严格等降低了猪链球菌的感染几率有关。猪链球菌病发生有一定季节性, 10月份至次年4月份多发, 说明此病的发生与气候有关, 且阴冷潮湿的冬春季节是本病的高发季节。而章红兵报道, 该病发病没有明显的季节性, 一年四季都有发生。但以4~10月份的夏秋季节发病率高, 春冬季发病较少。魏明奎等认为, 猪链球菌病一年四季均可发生, 但以5~11月份发生较多[10]。邹以仁等认为, 猪链球菌病的发生一般无非常明显的季节性变化, 但调查结果说明, 6、7、8月份发病较少, 这可能与气候炎热、病原菌生存困难有关。

传统上我国猪链球菌病以C群流行为主, 近几年的流行趋势, 似正在发生一此转变[11]。1993年, 陈永林等发现国内19个省 (市、区) 猪链球菌以C群占优势, 约占72.22%, D群占7.14%, S和R群各占4.76%;E、H、T各占0.79%。2001年, 徐涤平等发现湖北、湖南、河南、江西和辽宁等省猪源致病性链球菌C群40株、E群11株、D群8株、R群4株, 各占63.49%、17.46%、12.7%和6.35%。2003年, 张桂荣发现古林省链球菌D群占45%、C群25%、E群15%和A群5%, 兰氏分类法不能分群10%。2005年, 马增军等发现河北秦皇岛、唐山等地猪源链球菌以D群为主, 其次为C群。2007年, 李春玲等发现广东各地猪场链球菌以D群为主, 其后依次为C、G和F群, 未能定群12株, 各血清群菌株分布无明显地域。相似的是, 近两年来潍坊市潍城区、坊子区、寒亭区, 青州、诸城、安丘、昌邑、寿光、高密、临朐、昌乐11个县市地区猪源链球菌血清群同样以R群为主, 占调查总数的45%, 其次为C群链球菌, 占30%, A群3株, B群4株, 待定8株。这与国内传统上的报道以C群为主有些变化, 而与国外有些报道相类似, 如在美国、加拿大等国, 从败血症和脑炎患猪中分离的链球菌主要是D群链球菌的某些血清型, 只有少数C群类马链球菌和L群引起心内膜炎和败血症。此外, 尽管在国内见有S群或R群的1型或2型猪链球菌致病的报道, 但目前发生和流行可能具有一定的地域性。

目前, 我国用于该病免疫预防的疫苗仍以C群兽疫链球菌弱毒株为疫苗株的弱毒活疫苗为主, 而与当地的猪链球菌病流行菌株血清群并不完全相符, 这可能是猪链球菌病不能得到有效控制的主要原因。因此, 在对当地猪链球菌病进行血清学调查的基础上, 研制针对当地流行菌株血清群 (型) 的猪链球菌病疫苗为控制该病的有效措施。

摘要：通过潍坊地区猪链球菌病的流行病学调查发现, 潍坊地区规模化养殖场和散养户猪链球菌病的发生普遍存在, 且规模化养殖场的发病率和死亡率较低。通过对分离的猪链球菌的血清学鉴定发现, 潍坊地区猪源链球菌血清群同样以D群为主, 占调查总数的45%。优势血清型仍为猪链球菌2型, 其他常见的还包括SS1型、SS7型、SS9型和14型。为潍坊地区猪链球菌病的防治提供科学的依据和理论支持。

兔葡萄球菌的分离与鉴定 篇7

1 材料与方法

1.1 主要试剂

普通琼脂平板、鲜血琼脂平板、普通肉汤培养基、3.8%柠檬酸钠、1∶4新鲜兔血浆, 自制。药敏纸片, 购自杭州微生物试剂有限公司;聚合酶链式反应主要试剂混合液 (PCR Master Mix) , 购自Invitrogen公司;DL-2 000 Marker, 购自TaKaRa公司;凝胶提取试剂盒 (Gel Extraction Kit) , 购自OMEGA公司。

1.2 细菌的分离、培养

解剖病死兔, 切开脓包, 挤出脓汁, 将肝脏、肺脏、化脓灶均接种普通琼脂平板、鲜血琼脂平板、普通肉汤培养基, 置37 ℃恒温箱培养24 h, 革兰染色、镜检。

1.3 生化试验

将普通肉汤纯培养菌液接种生化试验管, 置37 ℃恒温箱培养7 d, 每天观察1次, 记录结果。

1.4 血浆凝固酶试验

取3支灭菌的小试管, 编为1, 2, 3号 (1号为试验管, 2号、3号为对照管) , 分别加入1∶4新鲜兔血浆1 mL, 在1号试管中加入已培养24 h的分离菌肉汤纯培养物1 mL, 2号试管中加入已培养24 h的大肠杆菌肉汤纯培养物1 mL, 3号试管中加入普通肉汤1 mL, 混匀, 置36 ℃恒温箱培养5 h, 每小时观察1次, 记录结果。

1.5 动物试验

将分离菌接种普通肉汤, 置37 ℃恒温箱培养24 h。

1.5.1 小白鼠试验

取4只小白鼠 (购自西南大学荣昌校区实验动物科) , 试验组2只, 对照组2只。试验组小白鼠腹腔注射分离菌24 h肉汤培养物, 每只0.2 mL;对照组小白鼠腹腔注射普通肉汤, 每只0.2 mL。观察小白鼠发病及死亡情况, 对死亡小白鼠进行解剖、细菌分离培养、染色、镜检。

1.5.2 家兔试验

取4只健康家兔 (购自西南大学荣昌校区实验动物科) :试验组2只, 每只皮下注射1 mL分离菌24 h肉汤培养物;对照组2只, 每只皮下注射1 mL普通肉汤。观察家兔发病情况, 对发病或死亡兔进行解剖及细菌分离培养、染色、镜检。

再取4只健康家兔:试验组2只, 每只静脉注射0.5 mL分离菌24 h肉汤培养物;对照组2只, 每只静脉注射0.5 mL普通肉汤。观察家兔发病情况, 对死亡兔进行解剖及细菌分离培养、染色、镜检。

1.6 16S rRNA基因的扩增及测序

用煮沸法提取菌体DNA作为PCR反应模板。选用16S rRNA V3可变区通用引物 (序列为P1 5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′; P2 5′-CCGCGGCTGCTGG-3′) 扩增V3可变区片段, 预期片段大小为160 bp。扩增条件:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 共20个循环;72 ℃ 5 min。扩增产物经过回收纯化后进行双向测序。

1.7 药敏试验

按照纸片法进行试验, 结果判定参照中国药品生物制品检定所国家抗菌药物细菌耐药性检测中心颁布的《抗菌药物药敏纸片判断标准》。

2 结果

2.1 细菌的分离培养结果

从肺脏、肝脏、化脓灶均分离到很纯的细菌, 在普通琼脂平板上于37 ℃培养24 h, 菌落呈圆形、光滑、湿润、中等大小、灰白色;在常温下放置48～72 h, 菌落呈金黄色。在鲜血琼脂平板上于37 ℃培养24 h, 菌落呈圆形、光滑、湿润、中等大小、灰白色, 菌落周围形成溶血环;培养72 h后, 菌落呈扁平状。在普通肉汤中于37 ℃培养24 h, 呈均匀浑浊。

从肺脏、肝脏、化脓灶分离的细菌均是革兰阳性球菌, 多数成双排列, 少数呈短链状或葡萄状。

2.2 血浆凝固酶试验结果

取菌液接种新鲜兔血浆, 于36 ℃培养3.5 h后, 接种待检菌管的血浆出现凝固, 似胶胨样, 接种大肠杆菌管和普通肉汤管的血浆未出现凝固。

2.3 生化试验结果 (见表1)

注:+表示呈阳性, -表示呈阴性。

结果表明, 分离菌符合葡萄球菌的生化特性。

2.4 16S rRNA V3可变区基因扩增及测序结果

16S rRNA V3可变区基因片段的扩增产物通过1%琼脂糖电泳观察, 在160 bp处得到1条明亮条带 (见图1) 。测序结果与GenBank上已发表序列进行Blast分析, 结果发现其同源性与金黄色葡萄球菌高达99%。

M.DL-2 000 Marker;1.16S rRNA V3可变区基因PCR扩增产物。

2.5 动物试验接种结果

试验组小白鼠接种菌液后24 h内全部死亡, 对照组小白鼠健活。解剖死亡小白鼠, 取心血进行分离培养, 革兰染色、镜检, 结果与接种菌完全一致。

皮下注射试验组家兔接种约12 h后发病, 48 h内死亡;对照组2只家兔健活。死亡家兔皮下注射部位出血、化脓、坏死, 流出大量的渗出液;气管出血;肺脏出血、边缘有小的坏死灶;胸腔聚积大量的液体;肝脏瘀血、肿大;脾脏瘀血、肿大;肾脏瘀血。从心血、肝脏分离培养病原菌, 革兰染色、镜检, 结果与接种菌完全一致。

静脉注射试验组家兔接种约12 h后发病, 36 h内死亡;对照组2只家兔健活。死亡家兔气管出血, 肺脏出血、有小的坏死灶, 胸腔聚积大量的液体;肝脏瘀血、肿大;脾脏瘀血, 肿大;肾脏瘀血;膀胱集尿;从心血、肝脏、肺脏分离培养病原菌, 革兰染色、镜检, 结果与接种菌完全一致。

2.6 药敏试验结果

结果表明, 此次分离的金黄色葡萄球菌对氨苄西林、菌必治、先锋Ⅴ、氨苄西林/舒巴坦高度敏感, 对链霉素、新霉素、头孢噻肟、阿奇霉素、四环素、红霉素中度敏感, 对复方新诺明不敏感。

3 讨论

1) 根据细菌形态、培养特性、生化试验、毒力试验以及基因测序结果, 证实分离菌是金黄色葡萄球菌。

据有关资料介绍, 多数毒力较强的葡萄球菌的菌落呈金黄色, 具有溶血性, 血浆凝固酶试验阳性, 分解甘露醇, 该菌都符合这些特性, 且动物试验也证明了其毒力较强。葡萄球菌生化反应不恒定, 常因菌株及培养条件而异, 因此该菌的少数生化特性与有关资料介绍的不完全一致。但基因测序结果发现其同源性与金黄色葡萄球菌为99%。

2) 葡萄球菌广泛分布于自然界, 可通过多种途径感染动物, 引起发病。

兔葡萄球菌病也是兔的常见疾病之一, 可引起兔的乳房炎、脚皮炎、内脏器官化脓、皮下脓肿、仔兔黄尿病等, 其中危害最严重的是母兔乳房炎和仔兔黄尿病。近年来的报道显示, 该病发病率有所增加[1,2,3,4], 尤其是抗生素的滥用, 使其耐药性增强, 给临床防治带来了极大的难度。由于本兔场是水灾后引起家兔发病的, 病因较为复杂, 笔者通过实验室确诊, 主要病原是葡萄球菌、肺炎克雷伯菌 (另文报道) 和球虫。通过药敏试验筛选敏感的药物进行治疗, 试制葡萄球菌、肺炎克雷伯菌二联灭活疫苗紧急接种, 同时采取更换抗球虫药、严格消毒、隔离病兔等综合防治措施, 使疫情得到有效控制。

参考文献

[1]江冬梅, 谢雄辉.家兔葡萄球菌病的诊断及防治[J].中国养兔, 2004 (6) :33-34.

[2]徐海风, 程菊芬.兔葡萄球菌病暴发的原因及防治[J].中国养兔, 2008 (6) :23.

[3]侯友.家兔葡萄球菌不同感染途径发病试验[J].山东畜牧兽医, 2009 (30) :6.