体内表达基因

体内表达基因（精选三篇）

体内表达基因 篇1

1 多杀性巴氏杆菌体内表达基因的研究进展

1.1 体内表达技术 (IVET) 筛选Pm菌体内表达基因

自从Mahan等人最先阐述了体内表达技术 (IVET) , 并用其来鉴定细菌体内表达基因以来[4], 国内外学者相继使用IVET研究不同病原体的体内表达基因的研究报告不断出现。IVET的基本原理为:将细菌基因组随机片段与无启动子的报道基因融合, 构建启动子诱捕文库。然后将此文库转化入宿主菌, 重组质粒上的随机片段X由于与宿主菌染色体上的相应片段具有同源性, 当重组质粒转化人宿主菌后, X片段通过插入复制的方式整合入宿主菌染色体, 这样整个质粒序列就嵌在该重复的两段DNA片段之间, 构建可随机报道体内基因表达的细菌库。用该库去感染宿主, 如果随机片段X中含有体内诱导基因的启动子, 那么它将会激活体内诱导基因及报道基因。用相应的方法筛选, 就可得到细菌在宿主体内被激活的基因。最后去除体外也表达的基因就得到只在宿主体内表达的基因。根据采用报告基因的不同, 可将体内表达技术分为4个不同类型:营养缺陷型筛选、抗生素型筛选、重组酶筛选和差异荧光诱导筛选[5]。2001年, Hunt等人使用IVET通过构建禽多杀性巴氏杆菌依赖Kan抗性标记表达的启动子探针型质粒, 建立禽Pm体内表达基因筛选系统, 成功筛选到10几个体内表达基因, 并初步推测它们可能与细菌编码外膜蛋白、催化生物新陈代谢的酶、以及合成一些假想蛋白有关[6]。

1.2 信号标签突变技术 (STM) 筛选Pm菌体内表达基因

STM是一种基于转座子的突变技术, 每一个转座子都标记了一个独特的DNA序列标签。标签由包括一个40bp的可变中心区和两边不可变的“臂”, 这种“臂”方便于采用PCR手段来进行共扩增和标记中心区。用这些转座子对细菌进行随机突变, 然后进行动物模型的体内筛选。利用PCR及膜杂交技术, 把经过宿主选择存活下来的突变株与在培养基中培养的全部突变株相比较, 从而选择出那些不能在选择条件下 (宿主体内) 存活的毒力基因突变株。2000年, Fuller等人使用信号标签突变技术 (STM) 从牛多杀性巴氏杆菌中成功筛选出20多个体内表达基因, 并对它们进行了功能预测[7]。2003年, Harper等人使用STM技术, 以小白鼠和小鸡作为感染模型, 建立多杀性巴氏杆菌体内基因表达筛选系统, 成功筛选到10几个体内表达基因, 并对其做了功能预测分析, 还阐述了体内表达基因的表达可能与宿主的不同有较大的关系, 即某基因在该常见宿主上可能是体内表达基因, 而在其他宿主上则不一定是体内表达基因[8]。

1.3 DNA微阵列 (DNA Microarray) 技术筛选Pm菌体内表达基因

DNA Microarray也叫寡核苷酸阵列 (Oligonucleitide array) , 该技术的基本原理是在固体表面上集成已知序列的基因探针, 被测生物细胞或组织中大量标记的核酸序列与上述探针阵列进行杂交, 通过检测相应位置杂交探针, 实现基因信息的快速检测。2002年, Boyce等人率先使用DNA微阵列技术, 通过建立小鸡禽Pm自然感染模型, 对禽Pm进行了体内表达基因的筛选研究, 并提出在宿主体内高水平表达的病原菌基因很有可能就是其毒力基因。还分析阐述出细菌体内表达基因与宿主菌本身以及所建立宿主菌自然感染模型有关, 筛选结果的差异与筛选技术的不同有关[9]。

2 展望

IVET和STM在鉴别细菌体内表达基因及毒力基因的研究中, 表现出了强大的筛选能力, DNA微阵列技术在基因表达图谱的绘制、寻找目的基因和功能基因等研究方面也已取得了显著的成绩。近年来, 利用体内诱导抗原技术 (IVIAT) 来筛选细菌体内表达基因在国内外均有所报道。IVIAT的基本原理是通过利用已感染过目标病原的宿主血清来研究在宿主体内特异性表达的病原基因, 即收集的康复宿主血清用体外培养的病原菌及其裂解产物进行吸附, 从而扣除血清中针对病原菌体外表达抗原的抗体, 血清里便余下那些只与病原在体内诱导表达的抗原相反应的抗体亚群。再用这些处理过的血清作为探针来筛选该病原菌基因组DNA表达文库, 就可以获得病原菌的体内表达基因。国内外学者利用该技术, 分别对伴放线菌[10]、结核杆菌[11,12]、肠炎沙门菌[13]、胸膜肺炎放线杆菌[14]进行了体内表达基因筛选研究, 这将对使用IVIAT来进行多杀性巴氏杆菌体内表达基因的筛选研究具有重要的借鉴和指导意义。

体内表达基因 篇2

我国是肝癌高发国家, 每年新发病例30万。为找到并确认容易导致肝癌的遗传易感基因, 周钢桥课题组联合南京医科大学、中国医学科学院肿瘤研究所、复旦大学、中山大学肿瘤医院、广西肿瘤医院等10多家单位的100余位科研人员, 在国内5个肝癌高发区收集了4500多名肝癌病例和对照个体, 运用全基因组关联分析方法, 在全基因组范围内进行了系统的筛选和实验验证。经过潜心研究, 他们在人体第1号染色体的一个特殊位置发现了一个由多个基因组成的区域, 这个区域是容易导致肝癌的“罪魁祸首”。据课题组成员、军事医学科学院放射与辐射医学研究所博士张红星介绍, 如果该区域的基因发生了变异, 人类患有肝癌的风险系数就会大大增加。

贺福初介绍说, 该研究是国际上首次基于大规模人群和全基因组水平的肝癌易感基因的筛查研究, 所使用的全基因组关联研究技术是目前全球科学界公认的行之有效的拉网式搜寻重大疾病易感基因的研究方法。蛋白质组学国家重点实验室长期致力于包括肝癌在内的多种肝病的易感基因及其致病机理的研究, 过去10年间已经在乙型肝炎病毒感染的慢性化和重症化等关键环节找到了易感基因。

骨髓移植对表皮松解症有疗效

日本北海道大学的研究人员日前报告说, 他们在利用老鼠做实验时发现, 骨髓移植对于表皮松解症有显著疗效。

表皮松解症有多种类型, 基本症状是患者皮肤等表皮组织变脆弱, 即使是遇到比较轻微的刺激, 患者皮肤和黏膜也会出现水疱和糜烂, 这种疾病较难治疗。

北海道大学讲师阿部理一领导的研究小组在新一期美国《国家科学院学报》上报告说, 他们注意到骨髓中的造血干细胞能发育成皮肤细胞。科研人员人工培育出患有表皮松解症的老鼠, 然后为其移植正常老鼠的骨髓。

结果发现, 接受骨髓移植的20只患病老鼠的皮肤症状得到改善, 它们移植后200天的生存率达到73.7%, 而未接受移植的17只老鼠, 同一时期的生存率只有27.5%。

据参与研究者介绍, 此前表皮松解症只能以对症治疗为主, 上述新发现为根治该病带来了希望。

控制胆固醇水平应从年轻时开始

有些人认为, 青年人胆固醇水平异常无关紧要, 将来再治也不迟。但美国科研人员的新研究显示, 如果青年人胆固醇水平异常, 他们在40多岁后患心脏病的风险会提高, 因此控制胆固醇水平宜趁早。

加州大学旧金山分校的研究人员在美国学术刊物《内科学文献》上报告说, 他们从1985年开始, 对来自美国4个城市的约3200名不超过30岁的青年, 进行了为期20年的跟踪调查。调查期间, 研究人员时常测量并记录被调查者的低密度脂蛋白胆固醇 (坏胆固醇) 和高密度脂蛋白胆固醇 (好胆固醇) 水平。

20年后, 研究人员用X射线断层摄影技术观察被调查者的冠状动脉钙沉积程度。冠状动脉钙沉积状况是判断患心脏病风险的一个重要指标。

体内表达基因 篇3

试验通过RT - PCR方法测定NGF mRNA在2 月龄来航鸡大脑、下丘脑、胸腺、法氏囊、脾脏、腺胃、肌胃、胰腺、肝脏、肺脏、心脏、垂体、甲状腺、松果体、肾上腺、肾脏、睾丸和卵巢的表达量变化,以期揭示NGF在各组织的发育过程中发挥的作用。

1 材料

SPF鸡胚,购自山东昊泰试验动物繁育有限公司,自行孵化,于SPF动物房饲养。鸡饲料,购于河南宝顿饲料科技有限公司。TRIZol、随机引物,购自宝生物工程( 大连) 有限公司; DEPC、琼脂糖,购自Ta KaRa公司; 2 × Taq Master Mix,购自北京康为世纪生物科技有限公司; 核糖核酸酶抑制剂,购自北京索莱宝科技有限公司; AMV反转录酶,购自Promega公司; DNA Marker,购自天根生化科技有限公司。

2 方法

2. 1 取材

鸡桥静脉放血处死,迅速剖开腹腔,取出大脑、下丘脑、垂体、松果体、胸腺、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰脏、甲状腺、肾上腺、法氏囊、睾丸和卵巢等器官( 取材以最小的垂体大小的组织块为宜) ,放入2. 0 m L离心管中,编号,液氮骤冷处理后于-80 ℃保存。

2. 2 组织总RNA的提取

1) 称取重量相近的组织( < 100 mg) ,放入灭菌的2 m L离心管中,加入1 m L TRIZol,冰上匀浆,室温静置10 min; 2) 按每毫升TRIZol加入200 μL的比例加入氯仿,剧烈晃动,室温反应10 min; 3) 4 ℃、12 000 r / min离心15 min; 4 ) 将上层透明水相转移至灭菌的1. 5 m L离心管中,等体积加入异丙醇,混匀,室温放置10 min; 5) 4 ℃、12 000 r/min离心10 min;6) 弃上清液,加入1 m L 75% 乙醇( 现用现配) ,颠倒数次至沉淀悬浮; 7) 4 ℃、7 500 r/min离心5 min; 8)重复6) 、7) 步的操作; 9) 弃上清液,晾干至乙醇挥发完全,根据沉淀量的多少加入适量1% DEPC水溶解沉淀,- 80 ℃保存,备用。

2. 3 总RNA浓度的测定

用微量蛋白核酸分析仪测定总RNA浓度,OD260 /280值应控制在1. 8 ~ 2. 0。根据浓度将总RNA稀释成1 μg /μL用于下一步的反转录,以减少总RNA提取过程中因组织不同或操作不当引起的含量差异,确保结果的相对一致性与精确性。

2. 4 样品总RNA的反转录

获得的总RNA经两步法反转录成c DNA后用于PCR的扩增。

2. 5 引物的设计与合成

以鸡的 β - actin( L08165. 1) 作为内参基因,根据Gen Bank上报道的NGF mRNA序列( XM_418016. 2) ,利用Primer Premier 5. 0 软件针对保守序列设计引物,交由生工生物工程( 上海) 股份有限公司合成。引物序列: NGF基因上游5' - AAAACCACCGCCACCGACAT - 3',NGF基因下游5' - TGCTTGCTTGCCCTCCAT - 3'; β - actin基因上游5' - GTGATGAAGCCCAGAGCA - 3',β - actin基因下游5' -CGACCAGAGGCATACAGG - 3'。

2. 6 目的片段的扩增

按照常规PCR方法,以c DNA为模板,用特异性引物扩增目的基因,反应体系( 20 μL) : 2 × Taq Master Mix 10 μL,上、下游引物各0. 5 μL,c DNA 1 μL,dd H2O 8 μL。PCR反应条件为: 94 ℃ 5 min; 94 ℃30 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 25 s,共30 个循环; 72 ℃ 延伸5 min; 4 ℃ 保存。

2. 7 PCR鉴定

1. 5% 琼脂糖凝胶鉴定PCR产物的大小,每个样品上样8 μL,以DL - 2 000 Marker为标准分子质量对照,用100 V的恒压( 5 V/cm) ,在1 × TAE缓冲液中电泳30 ~ 40 min后凝胶成像系统观察结果并拍照保存。同时,将NGF及 β - actin PCR产物送生工生物工程( 上海) 股份有限公司进行基因序列分析。

2. 8 数据处理

Quantity - one软件分析目的条带灰度值,采用SPSS17. 0 软件分析目的基因在来航鸡体内主要器官中的相对表达,结果用“平均值 ± 标准误”表示,用LSD法进行多重比较。

3 结果分析

3. 1 PCR扩增条件的优化

以睾丸组织c DNA为模板,利用特异性引物分别进行NGF基因和 β - actin基因片段的扩增,引物经过最佳退火温度及最佳循环数等扩增条件的优化,最终确定以59 ℃退火,共进行30 个循环。经1. 5% 琼脂糖凝胶电泳分析,成功扩增出大小约为219 bp和277 bp的特异性目的条带,与预期目的片段大小一致,见图1 和图2。

M.DL-2 000 Marker;1~6.分别为60,55,56,57,58,59℃。

M.DL-2 000 Marker;1~6.分别为55,56,57,58,59,60℃。

3. 2 PCR产物测序分析

NGF PCR产物测序分析结果表明: 扩增产物的核酸序列与Gen Bank公布的鸡NGF序列相似度为100% ,与牛的同源性为87. 9% ,与羊的同源性为74. 6% ,与大鼠的同源性为60. 6% ,与小鼠的同源性为85. 5% ; 变异区主要集中在鸡NGF基因全序列的433 ~ 500 bp。

3. 3 NGF mRNA在来航鸡体内主要器官中的表达

用TRIZol法提取脑、胸腺、法氏囊、脾脏、腺胃、肌胃、胰腺、肝脏、肺脏、心脏、垂体、甲状腺、松果体、肾上腺、肾脏、睾丸和卵巢总RNA,反转录为c DNA后扩增NGF目的片段,扩增结果见图3。

采用常规PCR方法对各个器官中NGF基因进行扩增,经过1. 5% 琼脂糖凝胶初步鉴定后,通过Quantity - one软件对目的条带进行灰度值分析,结果见表1。

内参基因在机体内的表达相对比较稳定,本试验利用目的片段与内参基因灰度值的比值作为目的基因表达量的参考,数据整理后绘制折线图见图4。

结果表明: NGF mRNA在2 月龄来航鸡体内的表达整体呈现母鸡略高于公鸡; 鸡体内各个器官中均有NGF mRNA的表达,并且在肺脏、心脏、胰腺、胸腺等组织中有大量表达,其中生殖系统( 睾丸和卵巢) 中也有NGF mRNA表达,且卵巢的表达量高于睾丸。

4 讨论

NGF是一种分子质量为26 ku的多肽,是神经营养因子家族中的重要成员。研究者认为,NGF具有为外周神经和中枢神经系统提供营养、促进类神经元的分化、存活及再生等生物学功能,不仅能调节神经系统的生理功能,也可以作用于其他非神经系统,例如,哺乳动物免疫系统中NGF能够刺激机体产生非特异性免疫反应; 所有的脊椎动物的淋巴器官( 胸腺、淋巴结、脾脏、骨髓和肠道相关淋巴组织等) 中均能检测到它的存在,并对NGF的刺激具有高度敏感性［7］; 小鼠体内注射NGF抗体能诱发免疫交感神经的损坏,NGF在淋巴组织中的表达量发生变化［8］。另外,NGF不仅能介导单核细胞分化为巨噬细胞亚型,还能增强其对异物的吞噬作用。万瑶［9］的试验结果表明,NGF能显著地加强脾脏单核细胞的增殖与分化。B. M. Girard等［10］的研究表明,神经生长因子可在小鼠尿路上皮和逼尿肌平滑肌中表达。虽然NGF mRNA及其受体可以在内脏组织中表达,但NGF对内脏组织的生理机能的影响程度尚不太清楚。

有报道称,NGF及其受体( Trk A和p75) 在小鼠睾丸的间质细胞和生精上皮细胞均可表达,并且能调节间质细胞的生理作用［11］。K. H. Wrobel等［12］在7月龄的胎儿和初生早期机体睾丸中发现: NGF及其受体在生精小管和纤维组织样间质细胞有强免疫反应,随着这些细胞逐渐分化为生精小管肌细胞和间质细胞NGF受体不再表达。成年雄性小鼠体内NGF浓度比雌鼠高,雌鼠给予睾酮后,NGF含量增加,而去势雄鼠NGF含量则减少［13］。故肌细胞和间质细胞的表达受到年龄和性别的影响。A. Ricci等［14］通过试验证实人类肺脏能合成和释放神经营养因子,并且肺脏的机能障碍也与NGF的调控有关; R. Abir等［15］对发育早期卵泡的免疫组织化学检测发现,NGF在初级卵泡的最初阶段就会出现,其受体p75主要在支持细胞中有表达。

本试验结果表明,NGF mRNA在心脏、肺脏、胰腺、腺胃、卵巢和睾丸等器官中有较高表达,其中肺脏最高,推测可能与这些器官由能分泌NGF及其受体的间质细胞与肌细胞组成有关,但是详细机制还不清楚,NGF在各个器官发育过程中的作用还有待进一步探讨。

摘要：为了探讨神经生长因子对鸡的生长发育的影响,试验以2月龄来航鸡为试验对象,经RTPCR方法检测鸡体内主要器官中NGF mRNA的表达情况。结果表明:鸡体内主要器官中均有NGF mRNA的表达,并且在肺脏表达量最高,心脏、胰腺和胸腺次之。说明NGF在鸡体内主要器官的广泛表达预示着NGF参与鸡体各系统的发育过程,但具体作用机制还有待深入研究。