体细胞克隆（精选十篇）
体细胞克隆 篇1
这项成果是省农科院畜牧分院金海国研究员主持完成的。2010年9月4日, 金海国研究员带领畜禽分子与细胞工程研究团队, 将新吉细毛羊的胎儿成纤维细胞注入去核卵母细胞重构胚胎, 然后将重构胚胎移植到代孕母羊体内, 该批次共移植绵羊受体16只, 出生2只, 出生率达到12.5%。该项最新高端动物生物技术成果, 不仅填补了吉林省该研究领域的空白, 也代表着省农科院畜牧分院研究团队的体细胞核移植技术水平达到了国内先进水平。
据了解, 这项成果的获得表明:将转基因动物技术应用于肉羊的育种改良具有可行性, 通过进一步的育种研究工作, 有利于快速繁育优良品种, 加速家畜改良速度, 有力地推动肉羊改良和畜牧业的可持续发展。目前, 这两只克隆羔羊生长发育正常。 (摘自中国牧业网)
我国自主研发猪蓝耳病疫苗告别进口
哈尔滨兽医研究所蔡雪辉和他的团队经过采用体外细胞传代技术和低温致弱技术, 培育成功了具有良好免疫原性和安全性的PR R S弱毒和灭活疫苗种毒, 具有自主知识产权的PRRS灭活疫苗和活疫苗终于研制成功。2005年和2007年4月, 猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗和活疫苗分别通过农业部审查, 获得新兽药证书。
据介绍, PRRS灭活疫苗和活疫苗分别于2006年和2009年获得省政府科技进步一等奖, 猪繁殖与呼吸综合征防治技术及应用获得2010年度国家科技进步二等奖。 (摘编自中国畜牧兽医报)
上海建立人畜共患病检测法
细胞转染及克隆筛选 篇2
2，G418 是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3，汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50% 4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的 G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。加药时间和维持浓度
1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml。
2，加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。一般是转染48小时后加入抗生素。挑出单克隆后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的1/2。关于维持浓度，有人说细胞会出现对抗生素的抗性，应不断提高其浓度。而且，如果你要挑选到几个阳性克隆中较高表达的克隆的话，可以调整抗生素的浓度。当然，抗性基因高表达，目的基因不一定就跟着高表达。
筛选时的培养液
加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题： 1，死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡，因此要及时换液，孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染3T3细胞，在3T3 细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。3，适当增加血清浓度。
筛选时出现的问题及其解决办法：
1，问题1。做hela细胞的筛选，现在已经筛选3周，在6孔板中已经长出一些细胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化过程中，胰酶扩散，细胞已经四散开，和周围的其它细胞簇融合在一起（我的细胞簇离的很近），就是说几个细胞簇被胰酶融合在一起，那样根本没有办法做下去了，该怎么办？
a、可以减少胰酶量；胰酶在加入之前要用37度温箱预热，并且PBS润洗细胞层，以减少可能残存的血清的影响；
b、加入胰酶后，稍过几秒钟就可以吸走消化液了，不用吸干净，然后放到37度温箱中继续作用1MIN，这时，消化酶可以继续作用的，又可避免胰酶扩散；
c、显微镜下观察细胞完全松散开，就可以在你感兴趣的局部加培养基，并吸走你的可隆了呀
d、具体消化的时间，你注意摸索一下，如果 步骤2中显微镜下见细胞尚未完全松散开，可以再重复的，直到松散开，能够被吸走为止。
我的建议：
1、在100mm dish中挑克隆，细胞分的稀一点。
2、把细胞全部消化下来，在96孔板中逐步稀释获得单克隆
2，问题2。筛选成功的概率：只要有抗性加压筛选，挑选到的机率还是比较大的。一般能挑到稳定表达的概率我认为大概有70－80％，但是想挑到表
达量高且能稳定表达的，不大容易。这个可能是在染色体上，合适的整合位点太少的缘故。
3，问题3。细胞形态的改变：稳定转染后阳性克隆均出现不同程度的细胞形态的改变。想请教各位有经验的高手，你们做稳定转染时有此发现吗？我的也是，而且好象还有好几种不同类型的细胞。不过，我转的是一种抑癌基因。
4，问题4。单克隆化的时机和个数：加药筛选时, 一般等到确认的转染细胞长到70%以上时,再做有限稀释法, 以克隆出阳性细胞, 同时要保持适当的药物浓度,以防突变和污染。若细胞长好了,如有40%以上,就可以有限稀释了一般，筛选5，6个克隆就有需要的克隆，但保险起见，筛10个吧。
5，从单克隆化时开始，就要加大营养，清和生长因子。单克隆化的操作方法；
1.方法1。单克隆细胞的培养就是这样的,我现在作了15个96孔板的单克隆,总共才得到大约50株单克隆在做时候应保证每个孔中的细胞是一个,因此,我一般在200毫升的培养液中加入小于96个的细胞,这样平均到每个孔中因该可以由满意的结果你所说的现象我也遇到过,我也百思不得其解,只好做多一点的96孔板来补充。培养SPC-A1（人肺癌细胞），转染了EGFP，然后进行了G418抗性筛选和96孔板单克隆筛选，最终获得了成功将我的实验步骤写出来，希望对你有所帮助。
2.方法2。实验步骤大致为：预先对96孔板除第一排之外的所有孔加含15%胎牛血清的细胞培养液，0.1ml/孔，并放于细胞培养箱中温育，然后胰酶消化稳定表达GFP的细胞，细胞液稀释至密度为1000cell/ml的单细胞悬浮液，上述细胞液接种于96孔板的第一排，0.2ml /孔，从中吸取0.1ml细胞溶液接种于第二排，混合后，从第二排中吸取0.1ml接种于第三排……，一直到第八排，最后一排都丢弃0.1ml细胞液，操作示意图见下图。一般来说，每一列都会有某个孔中只有1~2个细胞。
3.方法3。我的改进之处：我在显微镜下观察，标记孔中小于10个细胞的孔，然后在显微镜下用记号笔在皿底把单个荧光细胞圈住，然后在操净台里用灭过菌底牙签将圈外的细胞戳死，这样留在孔中的就是单克隆了，通过这样的，我一共获得了6株单克隆。但需注意的是：时间不能超过30min，否则细胞极容易死亡。解决操作时间长的方法：拿一个96板，在里面随便种一些细胞，然后用牙签练习，我练了5～6次后非常熟练了
培养液：最好是含15％的胎牛血清，加大营养，有利于细胞生长；另外一种方法是对还没有变黄的细胞液进行过滤，过滤后的培养含有很多生长因子，可以作为单克隆的培养液。然后先在显微镜下把要挑的单克隆初看一遍，算一下大概要挑几个，然后在96孔板内先加好培养基，再将6孔板内的培养基吸出，加入少量的胰酶，大概能盖住板底即可，然后在显微镜下观察细胞状态，在有些变圆时，即用10ul枪在显微镜下直接吸克隆，放入事先准备好的加了培养基的96孔板内，先吸大的克隆，在胰酶完全起到作用使细胞松散扩散开了时，已经吸了将近十个克隆了，动作快一些时能吸十几个克隆，我做过几次了效果很好，没有出现污染。（在要进行操作时，用酒精将手好好擦擦，将显微镜用新洁尔灭也擦一下，一般不会有什么问题），你可以试试，只要小心一些就行了。
5.方法5。关于稳转的方法，好像园子里很多xdjm都用的是有限稀释法来作，但是我们实验室基本上都不用九十六孔做有限稀释来作单克隆的，一般的做法都是这样： 1。3.5cm皿铺细胞，长到大概80％以上的时候作转染。
2。转染后一天消化，传到一个大皿（1：6）或者两个大皿（1：12）。3。再过一天后加入带G418的培养基。
4。依据细胞不同，大概从加入G418的第三天到第八天之间细胞开始出现大量死亡，活下来的细胞就形成单克隆。
5，单克隆长到相对较大的集落后，于显微镜下用200ul枪挑取细胞集落，一般挑上48个，种在两块24孔板上。
6。于24孔板上继续培养，约4、5天后即可消化传代，取部分作收蛋白western之用，根据western结果确定真阳性。
我们基本上都是这样pick stable的，除非一些对细胞生长抑止作用强大或者apoptosis的inducer之类的基因比较难挑到stable外，一般还都能挑到 stable。当然，转染效率不能太低，超过50％就相对比较容易了，10％以上的可能最后形成的细胞集落就少，而且真阳性也较少。对于那些转染效率很低的细胞，我会连续转染三次（中间如果细胞长满了就传代），好像比较有效。
除非是类似带GFP这样能直接观察到是否真阳性的基因，我们才用有限稀释法来作，要不好像也太麻烦了吧？耗时也多
单克隆化后细胞特点和处理：
1.单克隆后细胞生活习性改变：考虑质粒的表达对细胞的生长有一定的影响，查文献确认一下。
2.单克隆后的培养需要多加些血清，再传代时保证板子不影响细胞贴壁，避免出现传代后细胞浮起来后死亡的现象。
3.筛选成单克隆后，不加药培养2代，再加药继续筛选两代，此时如果不出现死亡细胞则可以认为是稳定细胞系。复苏后加G418传代2次，然后按部就班。
4.过一段时间再筛选时，G418的浓度有人认为需要比稳转时小写，此外，加药后对蛋白质的表达，细胞形态有影响，因此做功能时要停药培养合适时间后再做。5.稳转PA317细胞后再此筛选（需要隔一段时间再加压筛一次），细胞也是死的厉害，不过还是可以筛到，不过需要用合适的浓度。可以在细胞传几代后，分出一小部分，不加G418培养一段时间，然后再加你维持细胞的抗性的G418浓度培养一天看细胞会不会死亡，如果死亡，说明外源基因还没有丢失。
6.有人这样做的：转染加药一段时间后，板子上出现了几个克隆，如果有几十个克隆，然后挑其中七八个克隆到24孔板里继续加药筛选，等24孔长满后再转到6孔板继续加药筛选，6孔板里长差不多满后，每孔消化下来大概一半做WB鉴定目的基因表达，剩一半留着继续加药培养，等WB结果出来有阳性的孔就保留下来，阴性的丢掉。
单克隆化后鉴定：
1.稳定转染细胞，通过PCR鉴定，发现目的基因并不上调，瞬时转染表达是增高的。原因：瞬转是在强启动子下,稳转时你得到的细胞株可能失去了此启动子,或者是改变了细胞的生理特性!用WB和瞬转对照鉴定一下。
造血干细胞移植治愈克隆氏病等 篇3
第三军医大学新桥医院血液科首次将造血干细胞移植技术用于治疗自身免疫性疾病取得成功。患有罕见克隆氏病的李媛(化名)移植成功后，逐渐恢复出院。造血干细胞移植成功后，李媛紊乱的免疫功能已经完全去除，并顺利重建了一套新的造血系统。经过移植后观察，其皮肤大面积溃烂的疮口也逐步趋于愈合，消化道出血症状也没有再次出现。此举标志着为难治性自身免疫性疾病找到了一种全新而有效的治疗方法。(《科技日报》)
自闭症也可助人成功
著名精神病学家指出，许多政界、科学界和艺术界的伟人都是因为有自闭症特征才达致成功的。很多天才都有类似自闭症的特征。他以牛顿、爱因斯坦、乔治·奥威尔、H·G·韦尔斯和维根斯坦等伟人为例，他们都有包括阿斯伯格症候群在内的自闭症特征。根据死后诊断结果，贝多芬、莫扎特、安徒生和康德亦患有阿斯伯格症候群。
自闭症、创造力和才华有相同的基因因素。菲茨杰拉德将约一千六百名自闭症患者的特征和名人的生平事迹作比较，得出上述结论。(《中国新闻社》)
婴儿吮手指是智力在发育
很多宝宝出生两三个月，最爱做的事情是“吃手”，专家说，婴儿与幼儿吮吸手指的意义是不同的。婴儿时期吮吸手指是婴儿智力发展的一个信号，是婴儿进入手指功能分化和手眼协调准备阶段的标志之一。家长不要轻易打搅孩子的快乐。起初他们只是将整个手放到嘴里，接着是吮吸两三个手指，最后发展到只吮吸1个手指，从笨拙地吮吸整只手，发展到灵巧地吮吸某一个手指，这说明婴儿支配自己行为的能力大为提高。吮吸手指动作，促使婴儿手、眼协调行动，为5个月左右学会准确抓握玩具打下了坚实的基础。另外，这一时期的婴儿主要是通过嘴来了解外界，婴儿认为手也是外界的东西，所以总爱将它塞进嘴里吮吸感知。家长需要做的是保持婴儿小手干净，保持婴儿口唇周围清洁干燥以免发生湿疹。(《新华网》)
细菌“隐身衣”躲避人类免疫系统
英国科学家近日称，他们最近在一项研究中发现细菌能够利用硅酸分子制造“隐身衣”，并以此逃避人体内的免疫系统。有了这种名为“隐身衣”的工具，诸如流感嗜血杆菌等细菌就可以在人体内游来荡去，躲避人类的免疫系统。研究人员说：“这种新奇的酶与‘隐身衣’制造所需的其它步骤一样，为我们提供了一个研发新抗菌剂的机会。”(《新浪科技》)
爱发脾气与大脑结构有关
为什么十几岁的青少年爱发脾气?为什么有些青少年比其他同龄人更难管教?科学家通过对受轻微刺激易怒的青少年和自制能力强的青少年的大脑结构进行扫描，揭示了问题的根源在于他们控制情绪的大脑结构不同。检查位置集中在3个区域：易引发情感冲动的扁桃体，扣带皮层前部以及眼窝前额皮质，后者为主要用于思考的大脑前额部分。表现得更偏激的青少年，不论是男孩还是女孩，扁桃体比其他人更大一些。而左脑比右脑前额扣带皮层小的男孩则表现得更倔。同时，左脑眼窝前额皮质面积相对小的男孩更可能在面对父母的生气态度时，回敬生硬的态度。(《科技日报》)
抗药性最强的肺结核菌
世界卫生组织发表的最新报告称，他们发现了有记录以来抗药性最强的肺结核菌。在81个国家的9万名肺结核病人中进行的调查显示，能抵抗多种药物的肺结核菌的抗药性比科学家预期的要强得多。调查还在45个国家发现，那里的具有广泛抗药性的肺结核几乎无法治愈。六个月疗程的标准治疗对这些病人不起作用，必须用毒性更强的药物进行长达两年的强化治疗，才会有效果。(《中国新闻网》)
治癌药物可增加死亡风险
促红细胞生成素(EPo)是一种治癌药物，用于帮助癌症病人造血。但最新的研究表明，这种药物应用不当会增加病人死亡的风险。最近德国和美国的医学研究人员发现，应用大量的促红细胞生成素，会增加病人腿和肺部血块的形成，并有可能加速癌细胞的生长，从而增加病人死亡的风险。(《科技日报》)
人造精子让女人自育后代
只有男性才会生产精子，然而最近英国纽卡斯尔大学的科学家却计划从女性骨髓中提取干细胞，培育女性“人造精子”。这一研究可望令女同性恋者不需要男人也能通过这些“女性精子细胞”与卵子受精，生育小孩。这项技术理论上也可以用在男人骨髓细胞，以转换成卵子。(《科技日报》)
运动神经原病研究获突破
英国科学家宣布，一种名为TDP-43的基因发生变异可能与运动神经原疾病有关。运动神经原是控制人类肌肉运动的神经细胞。位于大脑的运动神经原称为上运动神经原，位于脑干和脊髓中的运动神经原称为下运动神经原。当运动神经原发生病变时，由于肌肉接受不到来自大脑和脊髓的指令而无法正常行使功能。患上这种疾病十分可怕，患者几乎是一天天看着自己的肌肉变得无力和萎缩，看着自己的生命一天一天的消亡。由于无法确定致病机制，至今没有什么的治病良方。虽然运动神经原疾病仅有5％～10％的病例具有家族遗传性，但科学家发现，95％患者的运动神经原细胞中有团簇状TDP-43蛋白存在。这一发现将有助于揭开运动神经原疾病复杂而神秘的面纱。(《科技日报》)
脱发关键因素现形
经过6年的研究，科学家成功地识别出一种罕见的遗传类型单一性少毛症。科学家说：“尽管单一性少毛症是非常罕见的，但它有可能是证明我们寻找到头发生长机制的关键。”无论男性和女性都会受到这种遗传疾病影响，受害者一般会在儿童时期变成秃顶，脱发的过程会随着年龄的增加而加快，尤其是头皮周围部分。科学家们发现遗传缺陷阻止了头发毛囊细胞表面的受体组织正常形成。(《科技日报》)
盲眼植入牙齿重见光明
爱尔兰57岁的鲍勃·麦柯尼科尔在2年前的爆炸事故中失明，但在医生将他儿子的牙齿移植到他的眼内后，他的视力已经开始恢复。这种神奇的方法是英格兰布赖顿苏塞克斯眼科医院的克里斯多佛·刘实施的骨齿人工角膜手术(OOKP)。20世纪60年代，这种技术首先在意大利出现，它包括利用患者自己的牙齿和牙齿周围的组织支持人造角膜。麦柯尼科尔实23岁的儿子罗伯特为他捐赠了一颗牙齿、牙根和一些组织。麦柯尼科尔的右眼眶是重建的，里面植入了部分牙齿，医生还将一个透镜植入到牙齿上凿的洞内。第一次手术持续了10小时，第二次手术用了5小时。麦柯尼科尔说：“我重新复明的概率是65％。现在视力不断恢复，已经能四处走动，并能看电视了，有能力干些简单的活。”(《新浪科技》)
六种中药材抑制丙型肝炎
台湾工业技术研究院从三百多种中草药筛选出六种药材，研发完成据称全球第一个利用中草药纯化的“C型肝炎(丙型肝炎)新药”，不但可增加动物体内天然
干扰素，也可有效抑制c型肝炎病毒，搭配干扰素使用，可发挥三倍的治疗效果。新药成分多达四十一种，主要成份是黄酮素、木质素等，可有效抑制C型肝炎病毒，还可强化免疫细胞功能，并提升体内的天然干扰素含量，降低病患使用化学合成干扰素剂量。(《中国新闻网》)
英将试验新试管婴儿技术
英国将对一种新试管婴儿技术进行大规模临床试验。与现行试管婴儿技术不同的是，这种技术让受精卵子直接在子宫中而不是在试管中发育。原理是将试管婴儿的一组晶胚放入一个穿孔的胶囊型硅容器中，然后植入人体子宫，使它们在更自然的环境中发育，数天后取出这个容器，再选出成活可能性最大的晶胚重新植入子宫。这种存放受精晶胚的硅胶囊约长5毫米，宽不到1毫米，壁上穿有360个孔，每个孔直径约40微米。在比利时进行的小规模试验显示，活体中生长的晶胚比试管中培育的晶胚重量更大，因此活体中生长的晶胚成活的可能性更高。(《新华社》)
科学家绘出玉米基因组草图
美国科学家成功测序得出了玉米基因组的草图，这是人类成功测序的第二种农作物基因组，第一种被测序的农作物是水稻。科学家们以代号为B73的高产玉米品种为研究对象，完成了约95％的基因组测序工作。玉米基因组的基因数量为5万至6万个，碱基对数量大约为20亿个。相比之下，水稻基因组的规模要小得多，仅有大约4.3亿个碱基对。今后科研人员就可以更加准确、高效地研究玉米的基因组，培育玉米新品种，提高产量，增强抗旱、抗病虫害能力。(《新闻晚报》)
台湾研发第一个艾滋疫苗
台湾研究人员利用化合物，成功研发出第一个艾滋疫苗，也是国际上第一个以醣类为基材的艾滋疫苗。如果成功，可让正常人预防艾滋。但目前还只完成了动物实验，距离临床的真正成功还非常遥远。台湾“中研院”基因体研究中心博士后研究员徐翠玲表示，这个研究成果也许可为未来的艾滋病防治开启另一扇希望之窗。(《福建日报》)
再甜美的爱情也不过4年
墨西哥科学家研究发现，爱情只不过是“暂时的痴迷”，再甜美的爱情也持续不过4年。爱情并不等同于好感、眷恋和性欲等情感因素。在恋爱初期，人的大脑里会产生一种特殊的化合物，这种物质会集中在大脑的各个神经原中。这时候大脑负责情感的部位活动非常积极。也就是说，这时大脑中会发生一种复杂的化学反应，它致使人们除了所爱的人以外很少再想别的事。
从解剖学角度讲，这种复杂的反应最多不超过4年，哪怕是最最浪漫的爱情也不过超过这一“持久期”。此外，科学家们还强调称，人的一生只会爱某一个具体的人一次，而之后之所以还会与这个人产生情感的火花，那是因为出于对这个人的眷恋和对他(她)的性向往。(《新浪科技》)
人体的极限
人可以吃下多辣的咖喱
咖喱和辣椒中的活跃成分是辣椒素。辣椒素越多，咖喱就越辣。虽然辣椒素不会直接对人类造成化学烧伤或是其他组织破坏，但它对人类神经系统造成的影响相当于过敏性反应。除了觉得疼痛，你的眼睛、鼻子都会不自觉地流出液体，一些人甚至会出现身体痉挛或者呼吸困难的症状。如果你身体健康，没有得过心脏病或者哮喘，吞下一匙纯辣椒素没有问题，但接下来几个小时休想再吃下任何东西。理论极限：5克辣椒素。目前纪录：0.1克。
人能承受多大的失血量
一个健康成年人体内的血液大约在3.8到5.6升之间。人体内迅速失去15％的血量不会立刻让你觉得不适，但一旦超过这个标准，你的脉搏就会加速跳动，你可能会觉得晕眩发冷。若是失去40％的血量，这将影响血液流回心室，从而使人出现心动过速的症状。理论极限：1.9到2.8升，约占人体血液总量50％。目前纪录：约占人体血液总量75％。(1987年，一名癌症病人被发现体内只有0.9升血液，不过她的血液是在几个星期内慢慢流失的。)
人类可以忍受多低的体温?
人的正常体温一般会稍微超出37摄氏度。一旦体温降到36摄氏度，人的反应和判断能力都会削弱，降到35摄氏度走路会觉得困难；降到33摄氏度的时候，你会失去理智；30摄氏度的时候，人们则会失去知觉。而体温降到20摄氏度，人的心脏将停止跳动。不过儿童忍受低体温的能力更强一些，因为孩子器官的复原能力更强。理论上的人类体温最低极限是零摄氏度。在这个温度下，人体组织会结冰，体内的细胞则会被摧毁。理论极限：0摄氏度。目前纪录：16摄氏度。
人可以同时玩转几个球?
目前世界上只有少数人能同时在手中抛接11个或者12个球，没有人可以同时应付13个球。问题在于球越多，你手动得也要越快。有人在1997年做过一项实验，当时工作人员在一些世界上最出色的魔术师手上装了一些加速器，有的魔术师最终做到可以同时抛接16个球，但每个球要扔到同样高度，落在同一个位置。(《现代快报》)
伟哥会降低精子功能
英国研究人员最近通过实验室研究发现，万艾可(俗称“伟哥”)会降低精子与卵细胞结合成受精卵的能力。研究者将志愿者的精液样本浸泡在含有万艾可的溶液中，溶液浓度与一名男子服用一片100毫克万艾可后其血液中的万艾可浓度相当。他们发现这种药物在让精子变得更活跃的同时，也会破坏精子头粒蛋白。精子头粒蛋白是一种位于精子顶端的蛋白，能分解保卫卵细胞的细胞膜，使精子与卵细胞结合。一些医疗机构给男性患者服用万艾可以增加其配偶的受孕几率，他对此感到担忧。他认为，让遇到生育问题的男性服用可能导致情况恶化的药物，不是正确之举。(《新华网》)
科学家公布全球疟疾分布地图
体细胞克隆 篇4
本节内容为人教版高中生物选修三《现代生物技术》中细胞工程的内容, 课标要求为“举例说出动物细胞融合与单克隆抗体”, 而高考考纲中为较高的Ⅱ级“理解”要求。单克隆抗体的制备和应用是近几年生物科学和医学发展的热点之一, 也是高考的常考题型, 比如2012江苏卷第22题、2011年江苏卷第14题、2010福建理综第32题、2010广东理综第24题、2010江苏卷第17题中都曾涉及。
高二理科学生有较强的自主学习、归纳知识能力, 可以要求学生在课前利用教辅资料和学案进行预习, 完成植物体细胞杂交技术和动物细胞融合的比较表格, 并思考单克隆抗体制备过程的相关问题, 以锻炼学生的自主学习和思考能力。学生在前一节已经学习了植物体细胞杂交技术, 为动物细胞融合的学习做了知识铺垫。单克隆抗体的制备是本节的重点难点, 学生在必修一第6章知道了癌细胞的特点、必修三第2章学习了免疫的相关知识, 这些将有助于对单克隆抗体的理解。制备过程中多次实验操作的原因及结果是学生较难理解的内容, 笔者设计了小组合作进行细胞模型模拟操作的探究活动突破这一难点。
二、教学目标
1.知识与能力
举例说出动物细胞融合与单克隆抗体技术及应用。
2.过程与方法
(1) 运用必修一中细胞的知识分析动物细胞融合与单克隆抗体的理论基础; (2) 小组合作探究活动中培养合作学习、探究式学习的能力; (3) 搜集有关单克隆抗体应用的资料, 进行整理、分析和交流。
3.情感态度和价值观
(1) 感受科学探究的魅力, 受到创新精神的教育; (2) 关注动物细胞融合与单克隆抗体的发展和应用前景。
三、教学重点和教学难点
1.教学重点
动物细胞融合、单克隆抗体的制备和应用。
2.教学难点
单克隆抗体的制备过程。
四、教学策略
通过填写比较表格培养学生的自主学习、知识迁移能力; 通过一段关于“蓝猫———单克隆抗体及生物导弹”视频激发学生兴趣, 让学生获得感性认识;通过利用纸质细胞模型模拟单克隆抗体制备过程的小组探究活动, 培养学生的合作精神和探究学习能力;通过两位学生利用PPT讲解单克隆抗体的应用锻炼学生搜集整理信息的能力、语言表达能力等。
五、教学过程
1.情景引入
(1) 教师行为
课件展示番茄—马铃薯杂交植物图片和必修一中“小鼠细胞和人细胞融合实验示意图”。两幅图片利用了什么生物技 术呢? (细胞融合) 动物细胞是否也能进行融合呢?展示教材中动物细胞融合的图片, 指出这就是要学习的内容:“动物细胞融合与单克隆抗体” (板书) 。
(2) 学生行为
回顾思考上一节课中植物体细胞杂交的知识, 积极思考、回答, 自然过渡到新知识的学习。
(3) 设计意图
温故知新, 体现新旧知识的联系、必修知识和选修知识的联系。
2.动物细胞融合
(1) 动物细胞融合概念、与植物体细胞杂交的比较
①教师行为
课件展示教材中动物细胞融合的概念, 并强调关键词:两个或多个、杂交细胞。
图片展示两个实例:受精作用、鸡血细胞融合。同一张课件中展示植物体细胞杂交和动物细胞融合的图片, 让学生说出两者的相同点和不同点。点评学生的回答。引导学生思考细胞两两融合后可产生几种杂交细胞并讲解。请同学们拿出预 习学案中的比较表格来, 根据PPT中的答案进行更正。
(答案 :全能、增殖、聚乙二醇PEG、灭活的病毒、果胶酶、胶原酶、杂种植物、细胞产品、遗传物质)
②学生行为
理解动物细胞融合的概念, 利用实例加深对概念的认识。填写植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较表格。
③设计意图
通过强调关键词、举例等方法加深学生对概念的理解。学生通过填写与植物体细胞杂交的比较表格培养知识迁移、构建知识网络的能力。 通过让学生思考细胞两两融合后会产生三种杂交细胞为单克隆抗体的知识做好铺垫。
(2) 动物细胞融合的意义与应用
①教师行为
请学生结合植物体细胞杂交的意义思考动物细胞融合的意义。在实际应用中, 多数动物细胞融合都是为了制备单克隆抗体。那么什么是单克隆抗体? 有何作用? 如何制备呢? 播放视频:“蓝猫———单克隆抗体及生物导弹”。请同学们观看的同时思考两个问题:制备单克隆抗体运用了什么技术? 单克隆抗体的优点?
②学生行为
动物细胞融合突破了有性杂交方法的局限, 使远缘杂交成为可能。观看视频, 思考问题。
③设计意图
由动物细胞融合的应用自然引入单克隆抗体的知识, 然后以一段视频展示单克隆抗体的概念、制备, 视频中幽默的语言激发了学生的学习兴趣。
3.单克隆抗体
(1) 传统抗体与单克隆抗体
①教师行为
利用问题串引出单克隆抗体。问题1:获得抗体的传统方法是什么? 有何缺陷? 问题2:抗体由什么细胞产生的? (课件展示:必修三免疫调节一节中的图片, 说明一种B淋巴细胞只能产生一种抗体。) 问题3:如何才能让B淋巴细胞产生单一大量抗体? (课件展示:一个B淋巴细胞→细胞群→抗体, 即为单克隆抗体。) 问题4:什么细胞是可以无限增殖的? (课件展示: 骨髓瘤细胞是一种癌细胞) 问题5:如何才能将两种细胞的特点结合起来? (课件展示:如果将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合, 那么融合后的细胞就可能既能迅速大量繁殖, 又能产生专一抗体。 ) 很好, 同学们都想到了利用动物细胞融合的方法, 其实早在1975年两位科学家成功制备了单克隆抗体, 并因此获得了1984年的诺贝尔奖。PPT展示两位科学家的照片。
②学生行为
依次回答。问题1:向动物体内反复注射某种抗原, 然后从血清中提取。缺陷是产量低, 纯度低, 特异性差。问题2:由B淋巴细胞分化来的浆细胞分泌。问题3:一个B淋巴细胞增殖形成的细胞群, 就能生产种类单一、特异性强的抗体。问题4:癌细胞。问题5:动物细胞融合。
③设计意图
通过环环相扣、层层递进的问题串引发认知冲突, 引导学生联想到只有将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合才能获得单克隆抗体。充分调动学生的旧知识构建新知识, 体现必修与选修知识的联系, 帮助学生构建单克隆抗体的概念。
(2) 单克隆抗体的制备过程
①教师行为
下面同学们认真理解教材图2-24, 阅读P54, 思考学案上制备过程的8个小问题, 然后分4人一个小组用纸质细胞模型模拟单克隆抗体的制备过程。此时向每个学生小组提供纸质细胞模型和剪刀、双面胶等工具。模型由一张细胞模型和一个流 程示意图组成, 均由一张A4纸打印而成。 (8个问题为:为什么向小鼠注射羊红细胞? 从小鼠脾脏中获到的B淋巴细胞有哪些类型?细胞两两融合后, 产生几种融合细胞?如何把杂交瘤细胞筛选出来?杂交瘤细胞有何特点?如何得到大量杂交瘤细胞?如何挑选出分泌羊抗红细胞抗体的细胞群?利用抗体阳性的杂交瘤细胞得到大量单克隆抗体的两种途径是什么? ) 教师在学生活动期间了解各小组的活动过程, 不时加以指导。随后让某个小组代表展示完成的流程图。教师按照8个问题的顺序讲解单克隆抗体的制备过程, 同时点评学生做的流程图。注意强调三种融合细胞、两次筛选、克隆化培养、抗体检测等知识要点。总 结归纳单克隆抗体的优点, 注意与传统抗体的特点相比较。
②学生行为
学生先自主学习, 阅读教材。再组成探究小组集体讨论每一个实验操作的原理和结果, 以及流程示意图中每个位置应该贴哪些细胞。最后进行粘贴纸质细胞模型的操作, 在操作中体验单克隆抗体制备中的每一个实验步骤的操作及原理。得出单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高、可大量制备的特点。
③设计意图
这一部分是本节课的核心环节, 能否有效充分地实施这一环节直接关系到本节课的教学效果。此环节大约需要15分钟。学生在之前的视频中已经对单克隆抗体的制备有了感性认识, 在这一探究活动的开始阶段再结合教师给出的8个问题进行自主学习, 加深了理解。随后小组成员在讨论如何粘贴细胞模型的过程中必然会有观点的交流碰撞, 这种交流又一次加深了学生的认识。学生在探究活动中培养了自主学习能力、小组合作探究和交流能力及动手实践能力, 等等。教师点评一个小组探究结果的同时讲解单克隆抗体制备过程, 强调科学实验的严谨性, 使学生感受科学探究的魅力, 受到创新精神教育。
(3) 单克隆抗体的应用
①教师行为
下面请两位同学与大家分享单克隆抗体的应用。 (点评)
②学生行为
两位学生利用PPT讲解单克隆抗体在诊断试剂、治疗疾病方面的应用。在讲解诊断试剂时, 学生以淘宝店主的身份介绍了验孕棒的原理和使用方法, 其搞笑幽默的语言、夸张的表情博得了学生的阵阵掌声。其后举例说明了生物导弹的原理。
③设计意图
学生对单克隆抗体应用的内容比较感兴趣, 且易于理解, 因此课前让学生小组合作搜集整理信息, 然后在课堂上与全班同学进行分享交流, 培养学生获取整合信息的能力、语言表达能力。学生了解了单克隆抗体的应用的同时体会科学、技术、社会三者的联系, 受到了STS教育思想的影响。
4.课堂小结
(1) 教师行为
以流程图的形式对本节内容进行归纳、总结。
(2) 学生行为
学生随着老师的思路集体回答问题, 总结、归纳、反刍知识。
(3) 设计意图
有利于学生的知识构建, 达到了巩固升华的目的。
参考文献
[1]杜永娟, 樵福奎.小纸片、大用处.中学生物学, 2012 (2) :33-34.
[2]孔爱华.“单克隆抗体的制备”的教学设计.生物学教学, 2010 (2) :14-15.
体细胞克隆 篇5
及难点 教学重点 单克隆抗体的制备和应用 教学难点 单克隆抗体的制备过程 教学方法 问题引入，诱导启发、阅读思考、讨论交流相结合，加上多媒体课件应用。 教学反思 板书设计 专题二：细胞工程
Subject 22?2 动物细胞融合与单克隆抗体
一。动物细胞融合
1.概念：动物细胞融合(cell fusion)也称细胞杂交(cell hybridization)，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程，融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞(hybrid cell)
2.方法：诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒、电激等。
二。单克隆抗体 杂交瘤技术( hybridoma )
1.单克隆抗体的制备
2。单克隆抗体的应用
Subject 22?2 动物细胞融合与单克隆抗体
一。动物细胞融合
1.概念：动物细胞融合(cell fusion)也称细胞杂交(cell hybridization)，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程，融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞(hybrid cell)
?细胞融合是正常的生命活动
SHAPE MERGEFORMAT SHAPE MERGEFORMAT
2.方法：诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒、电激等。
二。单克隆抗体 杂交瘤技术( hybridoma )
抗体
是机体受抗原刺激产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
浆细胞产生抗体。
1.单克隆抗体的制备
单克隆抗体技术-----动物细胞融合技术最重要的用途
正常淋巴细胞(如小鼠脾细胞)，具有分泌抗体的能力，但不能长期培养
瘤细胞(如骨髓瘤)可以在体外长期培养，但不分泌抗体
1975年英国人Kohler和Milstein 将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖
单克隆抗体制备
单：一个杂交瘤细胞
克隆：该细胞增殖分化为相同的细胞群
抗体：该细胞群产生的抗体。
特点：特异性强 灵敏度高
2。单克隆抗体的应用
与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。
主要应用有：
1)临床诊断
2)作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤
【file】目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。
思考1、本过程利用了哪些原理?
免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理
2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合?
这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体。
【典例分析】
1.(·浙江)人体神经细胞与肝细胞的形态结构和功能不同，其根本原因是这两种细胞的D
A、DNA碱基排列顺序不同 B、核糖体不同
C、转运RNA不同 D、信使RNA不同
2.(2005·广东)关于单克隆抗体，下列叙述不正确的是D
A、可以制成诊断盒.用于疾病的诊断
体细胞克隆 篇6
2013年，这项技术成功地用于婴儿细胞，但是为了在实验室培育可治疗成人疾病的细胞组织，例如：阿兹海默症，科学家需要知道是否这种技术能够应用于成人细胞。
美国俄勒冈健康科学大学发育生物学家舒克拉特-米塔利普维（Shoukhrat Mitalipov）说：“我非常高兴地听到我们的实验经验证是真实有效的。”这项研究证实该过程的关键是采用高质量人类卵细胞，研究人员使用捐赠DNA替代未受精卵细胞中的原始DNA，之后在实验室器皿中进行培育。
体细胞克隆 篇7
猪作为一种重要的经济动物和医学模式动物, 亟需通过克隆或转基因技术来加快其育种速度, 以保存品种资源并建立疾病模型, 但与其它动物的克隆效率相比, 猪的克隆效率更低, 这大大影响了体细胞核移植技术在猪育种和保种中的应用[4]。影响猪克隆效率的原因很多, 其中包括供核细胞的组织来源和猪的品种, 培养体系中的培养液、营养物质和生长因子等众多因素[5]。其中, 供核细胞的组织来源对克隆效率具有非常大的影响, 这是由于不同组织来源的供核细胞的重编程潜力不同, 因此移入去核卵母细胞后重构胚的发育能力也有很大差别, 而这种差异是无法通过改善操作技术和培养环境来改善的。因此, 确定一种或几种克隆效率高的组织细胞对于提高猪的克隆效率具有重大意义。该研究分别采用来自于仔猪的耳成纤维细胞、尾成纤维细胞以及卵母细胞成熟后脱落的颗粒细胞为供核细胞, 对两种成纤维细胞的生物学特征进行了初步研究, 并对比3种来源的细胞对重构胚发育的影响。希望通过该研究为优化猪体细胞核移植技术体系提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
胎牛血清 (FCS) 购自Hyclone公司, 其它化学药品如无特殊说明, 均购自Sigma。
猪卵巢采自哈尔滨市某屠宰场屠宰母猪。
抽卵/清洗液为DPBS+0.1% (质量体积比) 聚乙烯醇 (Polyvinlpyrrolidone, PVA) ;卵母细胞体外成熟液为TCM-199+10% (体积比) 猪卵泡液 (PFF) +0.57mmol·L-1 L-半胱氨酸 (L-Cysteine) +10 ng·mL-1表皮生长因子 (Epidermal Growth Factor, EGF) ;含激素成熟液为在成熟液基础上添加10IU·mL-1孕马血清 (PMSG) 和10IU·mL-1人绒毛膜促性腺激素 (hCG) ;融合/激活液为0.28smol·L-1甘露醇+0.1 mmol·L-1氯化钙+0.1mmol·L-1硫酸镁+0.5mmol·L-1 N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸 (HEPES) +0.01%PVA;胚胎培养液为北卡罗林纳州大学23培养液 (NCSU-23) ;供核细胞培养液为DMEM/F12+10% (体积比) 胎牛血清 (FBS) 。
1.2 方法
1.2.1 卵母细胞体外成熟及判断
屠宰场收集屠宰母猪卵巢, 置于37℃左右的0.9%灭菌生理盐水中, 4h内运回实验室。抽取卵巢中的卵母细胞, 挑选含有多层颗粒细胞的卵母细胞 (COCs) , 用清洗液清洗3次, 再用含激素的成熟培养液清洗3次, 移入含激素的成熟液中培养22h, 再转入无激素培养液中培养至44h, 消化下的卵母细胞周围的颗粒细胞作为供核细胞, 同时挑选排出第一极体有清晰卵周隙的卵母细胞用作受体。
1.2.2 供核细胞处理
剪取出生7d以内的仔猪耳尖和尾尖组织, 切成1mm3左右的组织块, 铺在35 mm培养盘中, 加入少量细胞培养液, 在CO2培养箱中 (5%CO2、38℃饱和湿度) 培养过夜。第2天更换培养液, 以后每2d换1次培养液。当成纤维细胞从组织块中生长并达到80%汇合后消化传代。将传代3次的细胞培养至接触抑制。核移植前用0.25%胰蛋白酶消化细胞, 用操作液离心清洗2次去上清, 0.02mL操作液重悬沉淀的细胞备用。
采用体外成熟的卵母细胞消化下来的颗粒细胞作为供核细胞的颗粒细胞, 清洗备用。
1.2.3 体细胞核移植
操作前将卵母细胞和供核细胞置于100μL含7.5μg·mL-1 CB的显微操作液滴中。去核针吸出卵母细胞第一极体及其附近约1/4的胞质, 选择形态好的供核细胞, 注入透明带下, 注射针轻压透明带, 使供核细胞膜与卵母细胞质膜贴合, 组成重构胚。将重构胚放入NC-SU-23中, 置于CO2培养箱中恢复培养30min。
1.2.4融合、激活及胚胎培养
恢复培养后的重构胚在融合液中清洗3次, 置于铺满融合液的融合槽中。调整融合仪参数至2kV·cm-1、30ms、1次电融合。电融合后移入含卵母细胞移入含5μg·mL-1 6-二甲氨基嘌呤 (6-D) 的操作液中激活4h。最后移到胚胎培养液中, 在38.5℃, 5%CO2最大饱和湿度的培养箱中培养48h, 检查卵裂率, 7d检查重构胚的囊胚率。
1.2.5 数据分析
试验数据用 (Mean±SE) 表示。用SPSS 17.0软件方差分析法进行数据处理, 每个处理重复3次。
2 结果与分析
2.1 供核细胞生物学特征研究
2.1.1 组织块培养情况观察
耳部和尾部来源的组织块在培养过程中, 无论是在生长速度或镜下观察的生物学特征方面均无显著差别。新鲜的耳或尾组织块贴壁培养24h后, 有部分组织块周围游离出个别成纤维细胞, 72h后成纤维细胞呈优势生长 (见图1) 。游离出来的细胞逐渐向周围铺开, 长成单层。细胞多呈梭形、细长条状或不规则长条形, 大量细胞形成旋涡状或放射状排列。
2.1.2 传代细胞
当原代细胞铺满瓶底80%左右时进行传代培养, 新鲜传代后两种细胞贴壁和增殖都较原代快, 生命力旺盛, 传代2~3h即开始贴壁, 24h后大部分细胞已贴壁并开始生长, 在1~2d内开始旺盛生长。7d左右成纤维细胞汇合铺满皿底, 继续培养则出现接触抑制现象 (见图2) , 接触抑制3d的成纤维细胞经消化清洗后, 可作为供核细胞。
2.2 不同来源供核细胞对重构胚发育能力的影响
不同来源的供核细胞对重构胚发育能力的影响很大。在该试验中, 初生仔猪耳成纤维细胞作为核供体时的重构胚发育率最高, 48h观察卵裂, 7d观察统计囊胚数 (见图3) , 卵裂率为65.6%±3.3%, 囊胚率为17.8%±2.2%;初生仔猪尾成纤维细胞作为供体的发育率最低, 卵裂率为20.2%±3.1%, 囊胚率为0;卵丘颗粒细胞供体发育率居中, 卵裂率为61.9%±2.7%, 囊胚率为11.4%±0.9%各组间差异显著 (P<0.05) (见表1) 。
注:不同小写字母为差异显著性 (P<0.05) 。Note:Different letters mean significant difference at 0.05level.
3 结论与讨论
3.1 供核细胞
可被用作核移植供体的细胞种类很多, 但不同来源细胞的核移植效率明显不同, 在经试验的多种不同来源和种类的供体细胞中, 只有少数获得了克隆后代。这是因为重构胚的发育能力主要取决于作为供体的细胞核的发育潜力, 只有发育潜力大的细胞种类作为核供体才能获得克隆后代[6]。目前用作核移植供体的细胞根据其来源大致可以分为成年个体生殖系统的细胞、生殖系统以外的细胞、终末分化细胞和来自于胎儿的细胞四大类。每种来源的细胞都有获得克隆后代的细胞类型, 但克隆效率差异很大[7]。
常用作核供体并获得克隆后代的细胞包括成纤维细胞、肌肉细胞、输卵管上皮细胞及颗粒细胞等[8]。在该研究中, 采用了来自耳和尾的成纤维细胞以及卵母细胞成熟后分离的颗粒细胞。这3种细胞在促进重构胚发育方面的能力相差较大, 以初生仔猪耳成纤维细胞为核供体的重构胚发育率最高, 卵丘颗粒细胞次之, 初生仔猪尾成纤维细胞作为核供体, 只有少量重构胚能卵裂, 但没有得到囊胚。
3.2 核移植效率
影响核移植效率的因素很多, 其中供体体细胞核和受体卵母细胞质的相互作用过程是否协调, 是其中一个非常关键的因素[9]。有研究认为, 选择处于G0/G1期或G1/S交界点的细胞作为供核细胞有利于核的重编程并进一步促进重构胚的发育。颗粒细胞是自然处于G0/G1期的细胞, 最容易被重编程, 加之其来自于卵母细胞周围, 作为供核细胞时与受体卵母细胞间互作更加协调[10]。因此, 理论上说颗粒细胞作为供核细胞时, 其重构胚会有较高的囊胚率, 很多研究者在不同动物的克隆研究中也得到了类似的结论[6]。但在该研究中颗粒细胞作为供核细胞的囊胚率低于耳成纤维细胞作为供核细胞的囊胚率, 也许是因为在核移植前对颗粒的处理方式或整个试验体系不同所致。
由于在克隆或转基因研究过程中需要有大量持续稳定的供核细胞, 因此在供核细胞的选择上, 要求在不影响供体动物健康的前提下能够方便、多次取材。动物的皮肤来源方便, 其中的成纤维细胞能够耐受长期的体外培养, 染色体倍性变异小, 重编程能力相对较强, 而且具有易于传代和保存, 可以进行转基因等遗传操作的特点。该试验通过组织块法建立了能在体外正常培养和传代的大白猪仔猪耳和尾成纤维细胞系。通过传代获得较纯的成纤维细胞, 并用接触抑制法使大多数细胞停留在G0期作为供核细胞。虽然同为皮肤成纤维细胞, 耳源成纤维细胞作为供核细胞的囊胚率较高, 而尾源的细胞为供核细胞则未得到囊胚。但也有研究者利用尾成纤维细胞作为核供体并获得成功的, 如Wakayama等[11]就利用小鼠的尾成纤维细胞经血清饥饿后作为核供体获得了克隆小鼠, 但未见有用猪尾部成纤维细胞获得克隆猪的报道, 这可能是种属差异造成的。
参考文献
[1]Wilmut I, Schnleke A E, McWhir J, et al.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells[J].Cloning Stem Cells, 2007, 9 (1) :3-7.
[2]Galli C, Lagutina I, Perota A, et al.Somatic cell nuclear transfer and transgenesis in large animals:current and future insights[J].Reprod Domest Anim, 2012, 47 (3) :2-11.
[3]Niemann H, Tian X C, King W A, et al.Epigenetic reprogramming in embryonic and foetal development upon somatic cell nuclear transfer cloning[J].Reproduction, 2008, 135 (2) :151-163.
[4]Swindle M M, Smith A C.Comparative anatomy and physiology of the pig[J].Scand J.Lab Anim Sci., 1998, 25:11-21.
[5]Kurome M, Geistlinger L, Kessler B, et al.Factors influencing the efficiency of generating genetically engineered pigs by nuclear transfer:multi-factorial analysis of a large data set[J].BMC Biotechnol, 2013, 20:13-43.
[6]张德福, 刘东, 汤琳琳, 等.不同供体细胞及其处理对猪核移植重构胚体外发育的影响[J].遗传, 2007, 29 (2) :211-217.
[7]姚雅馨, 李向臣, 张勇, 等.不同处理牛卵丘/颗粒细胞作为核供体对克隆胚发育的影响[J].畜牧兽医学报, 2009, 40 (5) :645-651.
[8]吕自力, 石国庆, 王亮.牛输卵管上皮细胞的纯化培养与生长特性研究[J].中国畜牧杂志, 2011, 47 (5) :19-23.
[9]刘海军, 刘灵, 刘玉堂, 等.受体卵母细胞来源和供体细胞类型对山羊体细胞核移植融合率的影响[J].华北农学报, 2008, 23 (1) :41-44.
[10]郭磊, 李慧, 韩之明.DNA甲基化和组蛋白修饰在克隆动物发育过程中的作用[J].遗传, 2010, 32 (8) :762-768.
体细胞克隆 篇8
1 材料与方法
1.1 试剂
葡萄糖、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、牛血清白蛋白、HEPES、L-谷氨酰胺、L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、RPMI1640均购自Sigma公司。
1.2 细胞培养
INS-1E细胞由C.B.Wollheim教授(瑞士、日内瓦)馈赠。INS-1E细胞在潮湿的环境下生长,37℃培养箱(5%CO2,95%空气)培养,培养液是改良RPMI1640,加有体积分数10%胎牛血清,11.1 mmol·L-1的葡萄糖,10 mmol·L-1的HEPES,每毫升100 IU的青霉素,每毫升100 μg的链霉素,0.5%牛血清白蛋白;在细颈瓶中细胞贴壁生长,每周传代1次。
1.3 INS-1E细胞释放INS
应用胰酶消化,培养液稀释,然后离心收集INS-1E细胞,种植在24孔板中,每孔1 mL,浓度是2.5×105个细胞;37℃培养箱(5%CO2,95%空气)培养2 d后细胞贴壁,移出培养液,小心地加入Krebs-Ringer缓冲液1 mL(115 mmol·L-1氯化钠, 4.7 mmol·L-1氯化钾, 1.28 mmol·L-1氯化钙, 5.0 mmol·L-1碳酸氢钠, 25 mmol·L-1HEPES)另外加有0.1%牛血清白蛋白,用2 mol·L-1氢氧化钠调pH至7.4。 37℃培养箱预培养30 min,移出缓冲液;每个孔中小心加入缓冲液1 mL(含葡萄糖和不同AA如图所示)。37℃培养箱培养1 h,从每孔小心吸取300 μL上清液,1000 r·min-1离心2 min,留取200 μL上清液-20℃保存待测INS。
移出每孔中剩余的反应液,加入0.1 mol·L-1氢氧化钠1 mL放置30 min裂解细胞,然后充分混匀收集1 mL溶液,-20℃保存待测蛋白质。
1.4 INS的测定
应用放射免疫方法测定胰岛素,应用豚鼠抗猪的胰岛素抗体,用单125碘标记的人胰岛素作为示踪剂,大鼠的胰岛素(Novo Nordisk, Bagsvaerd, 丹麦)作标准。批内变异系数1.8%,批间变异系数3.6%。
1.5 蛋白质的测定:
应用Bio-Rad公司的蛋白质测定试剂盒进行测定。
1.6 统计学方法:
正态分布的计量资料以X±SE表示,组间比较用t检验。
2 结果
如图1所示,在16.7 mmol·L-1葡萄糖的情况下,L-pro/L-ala/L-lys/L-arg(10 mmol·L-1)诱导的INS-1E细胞释放INS显著高于16.7 mmol·L-1葡萄糖诱发的INS释放,差异有显著的统计学意义;L-arg、L-lys、L-ala促进葡萄糖诱导的INS分泌的作用显著高于L-pro的作用,差异有显著的统计学意义;L-arg促进葡萄糖诱导的INS分泌的作用显著高于L-ala的作用,差异有显著的统计学意义。L-glut/L-leu未显示促进16.7 mmol·L-1葡萄糖诱导的INS分泌。
注:★表示在16.7 mmol·L-1葡萄糖条件下,各组AA与单纯16.7 mmol·L-1葡萄糖组的比较,△表示各个AA组分别与L-谷氨酰胺组的比较,θ表示pro、ala、lys、arg组与leu组的比较,ψ表示ala、lys、arg组与pro组的比较,Ω表示arg组与ala组的比较。Insulin/protein表示每 μg蛋白单位的INS-1E细胞分泌胰岛素(ng)量。
3 讨论
1型糖尿病和2型糖尿病患者的主要临床表现之一是消瘦,因为INS相对或绝对缺乏,碳水化合物、脂肪、蛋白质分解代谢增加,造成高糖、高脂、高AA血症。高糖、高脂对胰岛的毒性作用已得到广泛的研究和认识。本研究应用克隆的胰岛β细胞株INS-1E细胞进行研究,发现在16.7 mmol·L-1葡萄糖存在的情况下,10 mmol·L-1 L-pro、L-ala、L-lys、L-arg均促进葡萄糖诱导的INS-1E细胞分泌INS,与单纯葡萄糖刺激相比,差异有显著的统计学意义;而且L-ala、L-lys、L-arg的促INS分泌作用分别显著强于L-pro、L-leu的作用,差异有显著的统计学意义;L-glut、L-leu未显示促进葡萄糖(16.7mmol·L-1)诱导的INS-1E细胞分泌INS的作用。
L-glut主要在胰岛β细胞经谷氨酰胺酶快速地代谢为谷氨酸,后者经谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase, GDH)代谢为α-酮戊二酸,参与到三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循环的代谢中,经氧化磷酸化使细胞内ATP产生增加,促进INS分泌。GTP是GDH的变构抑制剂,L-leu是变构激活剂。在以前的研究中,L-glut促进11.1 mmol·L-1 葡萄糖诱导的INS-1E细胞和小鼠胰岛的INS分泌,并且L-leu促进11.1 mmol·L-1葡萄糖诱导的INS分泌作用显著强于L-ala的促葡萄糖诱导的INS分泌作用。而在本研究中,L-glut、L-leu未显示促进16.7 mmol·L-1葡萄糖诱导的INS-1E细胞的INS分泌。16.7 mmol· L-1葡萄糖诱导的INS分泌显著强于11.1 mmol·L-1葡萄糖诱导的INS分泌。证实在较高浓度葡萄糖存在的情况下,葡萄糖代谢产生ATP/GTP增加,抑制了谷氨酰胺酶和GDH的活性,L-glut的作用消失;也抑制了L-leu的变构激活作用。
L-leu通过三种机制刺激胰岛β细胞分泌INS,其一作为GDH的变构激活剂增加线粒体的代谢,促进谷氨酸经 GDH代谢为α-酮戊二酸,后者进入TCA循环,ATP生成增加,则L-glut经谷氨酰胺酶快速地代谢补充谷氨酸,即L-leu通过促进L-glut的分解代谢通路增加β细胞分泌INS[2]。其二L-leu经氨基转移酶代谢为α-酮异己酸,再经支链α-酮酸脱氢酶代谢为乙酰辅酶A[1],进入TCA循环,增加ATP产生。其三, L-leu代谢为α-酮酸直接抑制K+ATP通道,进而刺激INS分泌[3]。
Dixon[4]研究证实L-ala与钠离子共同转运进入β细胞,钠离子内流,胞浆膜去极化,电压依赖的钙通道开放,Ca2+内流,触发INS胞吐作用。Brennan[5]研究发现,L-ala经钠离子共同转运诱发INS分泌仅占其促INS分泌作用的10~20%,更重要的是经氧化磷酸化代谢产生ATP,致使ATP敏感的钾通道关闭,Ca2+内流,触发INS胞吐作用;直接证据是呼吸链毒素寡霉素显著地降低L-ala刺激的克隆β细胞的INS分泌;而且研究显示在β细胞内L-ala和葡萄糖相互促进彼此的代谢。
L-pro首先代谢为谷氨酸γ-半醛,再氧化为谷氨酸,经转氨基反应形成α-酮戊二酸,进入TCA循环, pro中的碳全部被氧化成二氧化碳; ATP增加,ATP敏感的K+ATP通道关闭,胞浆膜去极化,Ca2+内流,触发INS胞吐作用。
L-arg通过AA转运体mCAT2A 电转运进入胰岛β细胞,胞浆膜去极化,电压敏感的钙通道激活,胞浆内Ca2+浓度增加,触发INS分泌。L-arg能否代谢转化为谷氨酸而影响INS分泌尚需进一步的研究。L-lys除了直接导致胞浆膜去极化触发INS分泌外,也通过代谢来促进胰岛β细胞分泌INS,证据是L-lys使去除任何外源营养物的胰岛ATP含量和ATP/ADP比值增加[6]。Dura等研究发现,在生理剂量的AA混合液中,阳离子AA(L-arg、L-瓜氨酸、L-lys和L-鸟氨酸)确实加强8.3 mmol·L-1 D-葡萄糖诱导的INS释放[7] ,提示阳离子AA在生理剂量范围内的混合液中参与INS的分泌反应。
综上所述,胰岛β细胞快速摄取、消耗L-ala、L-glut、L-leu、L-pro、L-lys、L-arg,在16.7 mmol·L-1葡萄糖存在的情况下,高糖完全抑制L-glut的作用,减弱L-leu的作用, L-pro、L-ala、L-lys、L-arg均显示明显促进INS分泌的作用,糖尿病患者普遍存在着蛋白质、AA的代谢紊乱,AA对胰岛β细胞功能的长期影响需要进一步的深入研究。
(感谢丹麦Aarhus大学医院Eriksen Kirsten和Dorthe Rasmussen的技术指导。)
参考文献
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体细胞克隆 篇9
陆川猪是肉质优良的广西地方猪种之一,具有肉质、风味佳等特点,深受消费者欢迎[10,11,12]。目前,尚未有文献报道陆川猪Myo G基因CDS的克隆及序列分析,试验为今后研究Myo G基因表达与陆川猪优良肉质形成的相关性提供科学依据。试验以11月龄陆川猪作为研究对象,通过克隆获得Myo G基因CDS,并利用相关生物软件进行序列分析,为今后研究该基因在陆川猪肌肉生长发育所起到的关键作用提供工作基础。
1 材料
1.1 试验动物
11月龄陆川猪,广西畜牧研究所种猪场提供。屠宰后采取其背最长肌放入冻存管,而后迅速投入-196℃液氮中冷冻保存,带回广西大学动物科学技术学院动物遗传育种实验室后置于-80℃冰箱,备用。
1.2 试剂
TRIzol试剂,购自天根生化科技(北京)有限公司;胰蛋白胨、酵母浸出物,均购自德国OXOID公司;琼脂糖,购自西班牙琼脂糖公司;大肠杆菌DH5α感受态细菌,购自北京全式金生物技术有限公司;DL-2 000 Marker,购自东盛生物公司;反转录酶、r Taq酶、p MD18-T载体、DNA胶回收纯化试剂盒等,均购自宝生物工程(大连)有限公司;氨苄西林,购自索莱宝公司。
2 方法
2.1 引物的设计
参照参考文献[9]中猪Myo G基因引物序列:上游引物5'-ATGGAGCTGTATGAGACATCCC-3',下游引物5'-TCAGTTGGGCATGGTTTCATC-3',将此对引物序列送上海生工生物工程技术服务有限公司合成。所扩增目的片段大小约为675 bp。
2.2 总RNA的提取
取50~100 mg陆川猪背最长肌组织,根据TR-Izol法提取总RNA,然后用分光光度计测定其浓度,变性凝胶电泳检测其质量,符合测定要求后进行下一步合成c DNA试验。反应体系(20μL):总RNA3μL,2.5μmol/L Oligo(d T)181μL,5×Prime Script Buffer 4μL,10μmol/L d NTPs 2μL,M-MLV Reverse Transcriptase 1μL,DEPC dd H2O 8.5μL,RNA酶抑制剂0.5μL。反应程序:42℃30 min,95℃5mim,5℃5 min。
2.3 RT-PCR
RT-PCR反应体系(20μL):模板3μL,上、下游引物各0.4μL,r Taq酶0.5μL,10×PCR Buffer2μL,2.5μmol/L d NTP 1μL,加dd H2O补至总反应体系20μL。反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸50 s,共35个循环;72℃再延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳观察PCR终产物是否有目的条带,再将试验结果进行拍照。
2.4 克隆及序列分析
按照胶回收试剂盒说明书进行操作,得到纯化、回收RT-PCR扩增产物。将此产物与p MD18-T克隆载体连接,连接温度为16℃,时间为12 h。然后进行大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化,再用弯头玻璃棒将菌液均匀涂布平板。次日取出含有氨苄西林(Amp+)的LB液体培养基,挑取阳性克隆到培养基培养。将判定出含有目的片段的重组质粒菌液分别寄送到北京华大基因公司广州分部和上海英骏生物技术有限公司进行测序。利用生物软件Lasergene7.0和MEGA 6.0对陆川猪Myo G基因CDS序列进行分析,并下载Gen Bank中报道的其他动物Myo G基因CDS序列进行同源性比较,构建系统进化树,采用的方法为邻接(NJ)法。登录Protein Model Portal(PMP)在线蛋白质结构分析软件的相关页面,利用软件预测陆川猪Myo G蛋白质二级结构。
3 结果与分析
3.1 陆川猪Myo G基因CDS的PCR扩增
经过PCR扩增获得的陆川猪Myo G基因CDS,结果见图1。
M.DL-2 000 Marker;1.陆川猪Myo G基因CDS的PCR扩增产物。
由图1可知,目的条带为清晰的特异性条带,大小约为675 bp,可以初步确认此条带为广西陆川猪Myo G基因CDS。
3.2 陆川猪Myo G基因序列分析
北京华大基因公司广州分部和上海英骏生物技术有限公司均对含有目的片段的重组质粒菌液进行测序,经过Lasergene 7.0生物软件分析序列后发现,两家公司的测序结果一致,可靠无误。试验结果表明,获得陆川猪Myo G基因CDS长度为675 bp,与Gen Bank数据库中提供的野猪(登录号为FJ356697)Myo G基因CDS相比同源性达到99.9%,与藏猪(登录号为AY912512)Myo G基因CDS同源性为99.6%,与五指山猪(登录号为AY921007)、延安猪(登录号为AY912514)、荣昌猪(登录号为AY912511)、梅山猪(登录号为AY921006)Myo G基因CDS同源性为99.7%,说明所克隆的片段是陆川猪Myo G基因CDS。
序列对比分析结果见图2。
由图2可知,陆川猪Myo G基因CDS上第642位点存在T→C,并且其碱基C是陆川猪所特有的,但是没有导致氨基酸突变。与藏猪相比,陆川猪Myo G基因第102位点T→C,第636位点T→C,均为同义突变;与五指山猪、延安猪、荣昌猪、梅山猪、杜洛克猪相比,陆川猪Myo G基因均在第636位点T→C,为同义突变。
3.3 陆川猪Myo G基因系统进化树的构建
分析陆川猪Myo G基因CDS与其他几种动物Myo G基因CDS结果表明,该序列与藏猪(登录号为AY912512)、人(登录号为NM_002479)、马(登录号为AB608013)、牦牛(登录号为KC184120)、山羊(登录号为NM_001285733)、绵羊(登录号为NM_001174109)、黄牛(登录号为AB257560)、小鼠(登录号为NM_031189)、褐家鼠(登录号为NM_017115)的CDS同源性分别为99.6%、93.6%、92.4%、91.6%、91.4%、91.1%、90.8%、90.2%、89.6%。与广西陆川猪遗传距离最近的是藏猪,它们聚为同一支,最远是褐家鼠,结果见图3。
3.4 陆川猪Myo G基因二级结构预测
登录在线PMP生物软件页面,预测得到的陆川猪Myo G基因二级结构见图4。陆川猪Myo G基因的二级结构包含1个环、2个螺旋。
4 讨论
Myo G基因是生肌决定因子(Myo D)基因家族中骨骼肌生成的一种正向调控因子。M.F.W.Tepas等[13]研究表明,Myo G基因的3个变异位点与猪肌纤维数、初生重有关,并发现其对生长率、胴体重、瘦肉重均有影响。二花脸猪的肌纤维数及初生重受Myo G基因的影响[14]。王伟等[15]研究表明,Myo G基因直接影响滇南小耳猪的瘦肉率、背膘厚,是影响其肉质性状的主效基因。56日龄吉林白鹅腿肌Myo G基因mRNA的表达量极显著高于同日龄霍尔多巴吉鹅腿肌Myo G基因mRNA的表达量[16]。Myo G基因在畜牧业中的不断深入研究,为今后科研人员进一步分析畜禽优良肉质形成分子机制以及调控畜禽肉品质奠定了工作基础。
张名媛等[9]研究表明,广西巴马小型猪Myo G基因CDS与四川野猪Myo G基因CDS的同源性为99.7%。试验克隆得到的陆川猪Myo G基因CDS与Gen Bank中报道的藏猪、梅山猪、荣昌猪、五指山猪的基因同源性均在99.6%以上。此外,陆川猪Myo G基因第642位点T→C,碱基C为陆川猪所特有,没有导致氨基酸突变,这证实Myo G基因比较保守。猪的Myo G基因定位在第9号染色体q2.1~q2.6上[17],而此染色体上正好存在与猪脂肪沉积和肌肉生长发育相关的数量性状基因座(QTL)[18]。因此,Myo G基因表达对陆川猪的脂肪和肌肉方面的影响还有待于进一步研究。与Gen Bank中已报道的各种动物Myo G基因CDS相比,同源性达89.6%以上。构建Myo G基因系统进化树结果表明,与陆川猪遗传距离最近的是藏猪,最远是褐家鼠。登录在线PMP生物软件页面,预测陆川猪Myo G蛋白质二级结构包含1个环、2个螺旋,与其他研究报道的民猪Myo G结构[1]、湖羊Myo G结构[2]、马鹿Myo G结构[5]以及家兔Myo G结构[6]相类似。研究表明,该蛋白具有MRFs基因家族的保守结构功能域,即典型的碱性螺旋-环-螺旋区(basic helix-loop-helix,b HLH),这对Myo G基因在骨骼肌生长发育中发挥生物学功能具有重要作用[19]。因此,陆川猪Myo G基因具有高度的保守性,今后在进行陆川猪肌肉生长发育的研究中可将Myo G基因作为主要候选基因之一。
5 结论
体细胞克隆 篇10
1材料和方法
1.1材料
BALB/c小鼠和SD大鼠, 购自第四军医大学实验动物中心提供, Sp2/0骨髓瘤细胞株为第四军医大学西京消化病医院肿瘤生物学国家重点实验室保存;SD大鼠正常肝脏石蜡切片由我院病理科医生核对, 辣根过氧化酶标记山羊抗小鼠和DAB显色液购于北京中杉公司, 福氏佐剂 (完全和不完全) 购自美国Invitrogen公司。
1.2方法
1.2.1大鼠肝细胞胆管侧膜蛋白的制备
以percoll和蔗糖为溶液, 利用密度梯度离心方法提取肝细胞不同侧的膜蛋白, 通过蛋白定量及相关酶活性进一步检测ALP和Na+/K+ATP酶的活性来鉴定分离的效果[5]。
1.2.2杂交瘤细胞株的建立
利用标准单克隆抗体技术, 取50μg胆管侧膜小体加等量的福氏完全佐剂混合研磨成油包水的乳糜状, 皮下多点进行初次免疫, 间隔3周, 进行第二、三次免疫, 分别加不完全佐剂和磷酸盐缓冲液 (PBS) , 剂量和途径同第一次, 5—7天后测其效价, 检测免疫效果, 2—3周后, 加强免疫一次, 于加强免疫3天后在无菌条件下取出脾脏, 用不完全培养液 (不含胎牛血清的1640培养液) 洗1次, 置平皿中不锈钢筛网上, 用研磨棒研磨脾脏成细胞后于处于对数生长期的SP2/0细胞进行融合, 通过次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷酸培养液选择杂交瘤细胞, 最后通过酶联免疫吸附实验及免疫组织化学的方法筛选在肝细胞膜上特异分布的抗体。
1.2.3免疫组化检测
新鲜二甲苯梯度乙醇脱蜡脱水, 煮沸法进行抗原修复, PBS冲洗3次, 3%的双氧水室温封闭20min, 10%的山羊血清封闭1h, 弃掉封闭液, 加入单克隆抗体上清, 4℃冰箱过夜, PBS稀3次, 每次5min, 尔后加入生物素标记的山羊抗小鼠的二抗, PBS洗3次, 每次5min, DAB显色, 显微镜下进行观察, 自来水冲洗中止反应, 苏木素进行复染, 梯度乙醇及二甲苯通明封片, 显微镜下进行观察。
1.2.4 Westernblot检测
取不同组分的肝细胞膜蛋白60～100μg进行SDS-PAGE凝胶电泳, 半干法转膜, 丽春红染色标记, 室温下10% (g/L) 脱脂奶粉封闭1h, 杂交瘤上清mAb1 4℃孵育过夜, TBST洗3次, 10min/次;尔后加入HRP标记的二抗 (1:2 000) , 于室温孵育1—2h, TBST摇洗3次, 10～15min/次;ECL显色。
2结果
2.1单克隆抗体的筛选
通过ELISA和免疫组织化学方法筛选获得1株特异性分布于肝细胞胆管膜侧的mAb1, 免疫组化结果显示mAb1主要分布于肝细胞胆管膜侧, 肝细胞窦状隙膜和各细胞器膜上都没有表达分布 (见图1) 。
其中以杂交瘤细胞培养液为阴性对照 (见图2) 。
2.2 mAb1在肾脏组织表达分布
由于肾小管上皮细胞同样具有极性, 因此我们进一步观察mAb1在肾脏组织的表达分布, 可以看到其主要分布肾小管上皮细胞的刷状缘 (见图3) 。
2.3 mAb1的鉴定
Western blot结果如图4显示mAb1的分子量为110 kDa左右 (见图4) 。
3 讨论
近年来, 越来越多肝细胞胆管侧细胞膜转运体被鉴定出来, 其功能在胆汁排泄的过程中发挥了重要的作用。研究发现, 这些转运体的表达缺失可直接导致多种肝内胆汁淤积性疾病的发生。虽然肝细胞胆管侧细胞膜上某些转运体的部分功能已经得到证实;然而, 目前转运体功能的研究结果远不能解释肝脏胆汁排泄这一复杂的生理过程, 因此建立肝细胞胆管侧细胞膜的体外转运模型尤为重要。
利用密度梯度离心法分离细胞亚细胞器, 是目前蛋白质组学经典的分离方法。该方法可以将不同的亚细胞器分离开来, 从而为蛋白质组学的进一步分析创造条件。分离的胆管侧膜小体可完整地保持了体内胆管侧细胞膜上原有转运体的分布, 真实模拟体内肝细胞胆管膜侧胆汁排泄的过程, 利用该模型, 可发现转运相关的新分子。更为重要的是分离的肝细胞胆管侧膜小体是否具有转运活性, 是建立体外CMV转运模型的关键。由于利用密度梯度离心分离亚细胞器, 分离步骤复杂, 分离时间较长, 因此所分离出来的亚细胞器上蛋白质很可能失去蛋白质活性或降解。E217βG为一种葡萄糖醛酸化合物, 是肝细胞胆管侧细胞膜上转运体Mrp2特异性转运底物[6]。我们以[H3]E217βG为转运底物, 对所提取的CMV的转运活性进行了检测, 转运实验表明:CMV对E217βG呈ATP依赖性, 并在5 min时转运活性最高, 证实我们提取的CMV具有转运活性。
利用单克隆抗体技术制备肝细胞胆管侧膜呈极性分布的单克隆抗体是一种比较成熟技术, 早在1985年, ANN L.等人利用此技术筛选出在肝细胞胆管侧膜呈极性分布的单克隆抗体 (HA4) , 随后B10, LAP, CD13[7]等诸多胆管侧的极性分子被鉴定出来, 进一步解释了胆汁代谢的分子机制。既往研究证实, 胆管侧的膜蛋白MDR1, MDR3, MRP2, MRP3, ATP8B1和BCRP属于ATP超家族蛋白[8], 我们的实验表明mAb1能够阻断膜小体ATP介导的E217βG的吸收, 这表明mAb1抗原属于ABC超家族蛋白或他们相互作用的蛋白, 由于ABC转运蛋白可分为7个跨膜蛋白, 分子量除了BCRP[9]都比150 kDa。由于BCRP是72 kDa的半转运蛋白, 而mAb1的蛋白是110 kDa, 因此mAb1抗原可能是参与胆汁分泌的一个新的蛋白。
总之, 以上结果表明mAb1定位于肝细胞胆管侧细胞膜, 可能作为肝细胞胆管细胞膜一个新的标志物, 它可能参与胆汁的分泌和排泄, 为我们进一步认识胆汁淤积性疾病提供很好的帮助。
摘要：为制备肝细胞胆管膜侧的呈极性分布单克隆抗体 (mAb) , 并鉴定其特性, 利用密度梯度离心法提取大鼠肝细胞胆管侧膜小体, 测定特异酶活性。分离成功的肝细胞胆管侧膜小体免疫BALB/c小鼠, 利用标准的杂交瘤技术制备单克隆抗体。利用ELISA法检测抗体分泌的效价。采用免疫组织化学方法观察其组织定位。Western blot对其识别的抗原进行分析。结果成功地获得1株特异性分布于肝细胞胆管膜侧的mAb1。免疫组织化学显示其分布在肝细胞胆管侧膜, 在肾脏组织中也呈极性分布。Western blot结果显示mAb1分子量为110 kDa左右。说明成功地获得了肝细胞胆管膜侧特异性mAb1, 并鉴定其作为极性分子分布于肝细胞胆管膜侧, 它可能参与胆汁的分泌和代谢。
关键词：肝细胞,胆管膜侧膜,极性,单克隆抗体
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