单核苷酸的多态性分型

单核苷酸的多态性分型（精选九篇）

单核苷酸的多态性分型 篇1

1 SNPs的发生和特点

1.1SNPs的发生

SNPs主要是指近缘种群或同种个体基因组水平上, 由于单核苷酸变异所引起的DNA序列多态性, 常表现为单碱基的转换、颠换、插入及缺失, 但通常所说的SNPs不包括插入和缺失, 而且任何一种等位基因在群体中的频率不小于1%[8]。根据转换和颠换方式, SNPs有6种不同类型, 即2种转换C↔T、G↔A, 4种颠换C↔A、C↔G、T↔A和T↔G。这6种SNPs类型在生物体中的发生频率不同, 通常发生转换与颠换的SNPs之比为2:1, 这可能与核苷酸中易发生5-甲基胞嘧啶的脱氨基作用有关[9]。但是, 在拟南芥中, C↔T (G↔A) 约占总数的52%[10]。根据它在基因组分布的位置, SNPs可分为基因编码区SNPs (coding region SNPs) 、基因周边SNPs (perigenic SNPs) 和基因间SNPs (intergenic SNPs) 3类。大多数SNPs位于基因组的非编码区, 对蛋白质的编码无直接影响, 这一类SNPs可以作为遗传标记在群体遗传和进化中发挥重要作用[11]。只有少数的SNPs分布于基因组编码区, 称为cSNPs。cSNPs直接影响蛋白质的编码, 对其功能产生重要作用。HALUSHKA等[12]对人类75个基因的SNPs进行性质、类型和频率分析, 共发现874个SNPs, 其中387个为cSNPs, 54%的cSNPs导致蛋白质序列的改变。理论上在二倍体生物中, 1个SNP位点可能有2、3或4个等位基因, 然而3或4个等位基因的SNPs非常少见。因此, 通常把SNPs当作双等位基因分子标记。

1.2SNPs的特点

1.2.1 数量多且分布广

SNPs几乎遍布于整个基因组。对于人类基因组而言, SNPs的平均密度已达到1·1.9 kb-1, 而在其他哺乳动物中SNPs频率为每500～1 000个碱基出现1次[13];在牡蛎等海洋贝类中则更高, 达到几十个碱基出现1次。植物中SNPs数量也很多, TENAILLON等[14]测算出玉米一号染色体上平均104个碱基中就有1个SNPs, 远高于人类1 000个碱基包含一个SNPs。

1.2.2 富有代表性

某些位于基因编码区的SNPs有可能直接影响蛋白质结构或表达水平, 因此, 它们可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。SEKI等[15]在1种软骨中间层蛋白的基因CILP中发现1个与腰椎间盘疾病易感的SNP, 该机制主要通过改变蛋白的表达量来完成。

1.2.3 易于实现自动化的分析

SNPs在生物中一般为双等位基因变异, 检测时往往只需+/-的分析, 而不用像检测微卫星标记那样测量片段的长度, 这就有利于自动化技术的应用。因此, SNPs的双等位基因特性易于进行自动化、规模化分析, 同时也有利于基因分型[16]。

1.2.4 具有遗传稳定性

SNPs是基于单核苷酸的突变, 突变率为10-9, 因而与微卫星等重复序列多态性相比, 具有更高的遗传稳定性, 结果也更可靠[17]。

2 SNPs的检测方法

理论上凡是能够检测点突变的方法都可用于鉴定SNPs。最初的方法都是建立在凝胶电泳基础上对个体进行分析, 如测序、变性梯度凝胶电泳及单链构象多态等。随着分子生物学技术的快速发展, 涌现出许多高灵敏、高通量的SNPs检测技术, 如变性高效液相色谱、单碱基延伸技术、基因芯片法、引物入侵分析法、TaqMan探针法、质谱法和高分辨率溶解曲线法等。在这些众多的检测方法中, 根据其检测原理, 主要分为4种类型:直接测序法、以构象为基础的检测法、基于PCR和酶切的检测法和基于杂交的检测法。文章侧重介绍几种常用的SNPs检测技术。

2.1变性高效液相色谱

变性高效液相色谱 (denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC) 是近几年发展起来的用于高通量检测SNPs的一门技术, 其基本原理是在不完全变性条件下, 通过高效液相色谱将发生错配的异源双链DNA与完全匹配的同源双链DNA分离开[18]。该方法能够快速、准确地检测出单核苷酸差异, 在基因突变检测、SNPs筛选和疾病诊断等方面得到广泛应用。WOLFORD等[19]以基因组DNA池的方法证实, DHPLC可以成功检测出20个等位基因混合物中的1个变异等位基因, 可检测的变异频率为5%, 而同样条件下测序则为10%。LI等[20]在人乳头瘤病毒的研究中, 采用DHPLC的方法对多种人乳头瘤病毒基因特异位点进行检测, 检出率为95.8%, 且成功鉴定出几个新突变株。其不足之处是不能准确检测出碱基突变位点在片段的位置, 需要通过测序来确定新的突变或多态性位点[21]。

2.2单碱基延伸技术

单碱基延伸技术 (single nucleotide extension) 又称微测序技术 (minisequencing) , 其基本原理是设计一条位于待测SNPs位点上游的引物, 在该引物的3′端距SNPs位点1个碱基, 加入不同荧光标记的ddNTPs后进行检测。只有当加入的ddNTP与SNPs位点碱基互补时, 引物才能够延伸, 通过检测延伸碱基释放的荧光来判断SNP的类型[22]。单碱基延伸技术反应前必须对PCR产物进行纯化以去除其中含有的PCR引物及dNTP, 因为PCR引物会和延伸引物竞争产生多个扩增片段, 而多余的dNTP会使延伸反应延伸多个碱基。目前, 单碱基延伸技术发展迅速, 反应形式已经从液相发展到固相。GALBIATI等[23]利用单碱基延伸技术在人类β球蛋白基因筛选到了8个突变位点, 表明它是一种高通量、快速和可靠的检测方法。

2.3TaqMan探针法

TaqMan探针技术, 也称核酸外切酶法, 是一种通过检测PCR过程中和PCR之后产生的荧光信号来区分等位基因类型的SNPs检测技术[24]。在这个PCR反应中除了2个传统的PCR引物外, 还有1个等位基因特异性TaqMan探针。等位基因特异性TaqMan探针的5′端和3′端分别标有荧光基团和猝灭基团。在PCR扩增过程中, 利用Taq酶5′核酸酶活性降解与目标序列完全互补的探针, 使荧光剂与淬灭剂分离而发出荧光。如果探针与目标序列间存在错配, 就会减少探针与目标序列结合的紧密程度及TaqDNA聚合酶切割活性, 大大减少了荧光释放量, 从而区分出突变链和正常链[25]。TaqMan探针技术最大的优点是不需要分离或洗脱等PCR后处理过程, 从而提高了检测速度并减少了PCR污染的可能性, 但是其敏感性受Taq酶活性影响较大, 设计探针时需注意PCR扩增效率, 且探针设计成本较高[26]。LATIF等[27]利用荧光偏振技术, 对90个样品的20个SNPs进行检测, 结果表明只需要很少量的探针就能得到可靠的结果, 大大降低了成本。

2.4质谱法

质谱 (mass specrometry) 技术的基本原理是样品分子离子化后, 根据不同离子间的荷质比 (m/e) 的差异来分离并确定分子量。质谱检测不需要荧光标记, 样品来源广泛, 如PCR产物、引物延伸反应、酶切产物等。通过质谱分析可直接检测样品或探针的不同质量, 推导出样品的SNPs。目前, 基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS) 在SNPs的检测中已得到广泛的应用。理论上该技术检测分子量没有上限的限定, 且具有分析速度快、准确、分辨率高等特点, 缺点是对样品的纯化程度要求很高。SAUER等[28]提出的GOOD Assay对此进行了改进, 通过化学修饰省去了纯化的步骤而大大节约了检测的成本。REN等[29]以肽核酸为探针, 对基因组DNA进行核酸酶酶解, 可直接进行质谱分析, 而无需样品的分离制备。FU等[30]应用MALDI-TOF-MS对P53抑癌基因的外显子5和8进行测序分析, 发现了以往未知的SNPs。

2.5高分辨率溶解曲线法

高分辨熔解曲线分析法 (high resolution melting analysis, HRMA) 是近年来发展起来的一种筛选SNPs和检测基因突变的新方法, 是一种通过比对不同DNA分子溶解度的不同从而检测突变的方法。其基本原理是在PCR反应前将LCGreen荧光染料与反应缓冲液、引物、模板DNA混合, 采用双链DNA的饱和染料LCGreen和非标记的探针 (LunaProbes) 熔解温度 (Tm值) 来区分不同的基因型[31]。野生型和纯合子可以通过Tm值的迁移来区别, 而杂合子和纯合子可以通过被改变的曲线形状来区分。REED等[32]用HRMA对杂合子序列SNPs进行筛选, 发现检测300 bp以下的样品准确率为100%, 400 bp和100 bp准确率分别为96.1%和99.4%, 表明HRMA是一种高灵敏和特异的技术。CHOU等[33]对HRMA和dHPLC进行了比较, 表明HRMA具有更高的特异性和灵敏度, 而且在大量样本的处理上更方便、性价比更高。目前HRMA主要应用在突变筛查、肿瘤早期诊断以及生物进化等方面。

3 SNPs在海洋生物遗传研究中的应用

SNPs在基因组中广泛而稳定存在, 提供了一批很好的分子标记。其最初用于医学研究, 随着人们认识的提高和检测技术的发展, SNPs已在海洋生物遗传图谱构建、群体遗传学、亲缘关系、关联分析和基因功能分析等方面得到广泛的应用。

3.1高密度遗传连锁图谱的构建

遗传连锁图谱 (genetic linkage map) 是基因或分子标记在染色体上的线性排列, 在生物基因组结构研究和数量性状位点 (quantitative trait locus, QTL) 准确定位中至关重要。DNA分子标记出现后, 遗传连锁图谱的构建逐渐得到发展, 微卫星 (simple sequence repeat, SSR) 曾是最受欢迎的作图标记。SNPs在同一位点上双等位基因特性及其在基因组中分布的广泛性, 使其适合于自动化大规模扫描, 成为继SSR之后最受推崇的作图标记。KUCUKTAS等[34]对鲶鱼 (Silurus spp.) 基因组DNA和表达序列标签 (expression sequence tag, EST) 进行分析, 得到了413个SSR序列和125个SNPs, 构建了鲶鱼的遗传连锁图谱。HAYES等[35]则对大西洋鲑 (Salmo salar) EST数据库扫描, 得到2 507个假定存在的SNPs, 挑选86个SNPs对不同地区大西洋鲑中进行检测, 结果发现74%表现出多态性, 有利于大西洋鲑遗传图谱构建和重要经济性状QTL定位。随后MOEN等[36]构建了大西洋鲑的雄性和雌性遗传连锁图谱, 分别鉴定出29和30个LG, 雄性图覆盖390 cM, 雌性图覆盖1 983 cM, 为大西洋鲑物理图谱的构建提供了基础。其还对挪威12个大西洋鳕 (Gadus morhua) 家系分离数据进行了分析, 构建了第一张大西洋鳕的遗传图谱。该图谱共有25个连锁群, 覆盖1 225 cM, 包含有174个SNPs位点和33个微卫星序列。随着SNPs检测技术的提高, 其将被更广泛地用于构建海洋生物遗传连锁图谱。

3.2群体遗传学和亲缘关系的研究

群体遗传学是研究群体遗传结构及其变化规律的一门学科, 其主要的研究工具是DNA分子多态性。由于SNPs的丰富性和稳定性使人们可以利用连锁不平衡分析来深入研究群体遗传学的一些基本理论问题, 可为海洋生物改良与筛选提供分子基础。SNPs作为一种稳定的、高密度的遗传标记, 成为群体遗传学研究中最好的标记。RYYNÄNEN等[37]采用intron-primed exon-crossing (IPEC) 技术克服了大西洋鲑中出现的基因重复问题, 在27个高质量序列中检测出19个SNPs, 发现大西洋鲑的SNPs频率和总体的基因多样性都比其他生物低, 表明大西洋鲑是一个相对年轻的群体。在扇贝中, ELFSTROM等[38]在95个风标扇贝 (Patinopecten caurinus) 中发现了27个SNPs, 并用TaqMan探针法和等位基因特异性扩增法对其中12个进行检测, 描述了风标扇贝的群体结构, 证实SNPs是目前较好的一种分子标记。ARIAS等[39]对西班牙和爱尔兰的317～327个女王海扇贝 (Aequipecten opercularis) 的4个SNPs和168个黑海扇贝 (Mimachlamys varia) 的2个SNPs进行检测, 发现2个物种中的SNPs频率都是大约100个碱基出现1次SNP。这些SNPs为评价这2种扇贝的遗传变异提供了资料, 同时为以后的群体研究奠定基础。在牡蛎中, SAUVAGE等[40]对太平洋牡蛎 (Crassostrea gigas) 进行研究, 结果获得290个SNPs, 其中76个定位在外显子, 214个定位在非编码区, 在编码区SNPs的平均密度为每60 bp出现1次SNPs, 在非编码区每40 bp出现1次SNPs, 这是目前报道的无脊椎动物中发现比较大的SNPs群体。这些基因组资源为将来标记的确认和遗传连锁以及QTL分析提供了材料基础。

亲缘关系的确定与分类研究对于种质资源保护和新品种选育具有十分重要的战略与现实意义。SNPs作为新一代分子标记技术, 是亲缘关系分析的有力工具。STEPHENS等[41]利用TaqMan探针法对加利福尼亚本地金鳟 (Oncorhynchus mykiss aguabonita) 和引进的虹鳟 (O.mykiss) 的20个SNPs进行检测来评估2个亚种之间的杂交情况, 结果显示等位基因频率差异在0到1之间, 平均差异为0.75, 表明虹鳟已经有一定程度的基因入侵。RENGMARK等[42]利用微卫星和SNPs标记对5个大西洋鲑野生群体和2个养殖群体进行分析, 得到16个SSR和26个SNPs, 平均杂合度分别为0.51和0.41, SNPs的频率为3 000 bp出现1次。遗传分析表明, 95.8%的个体都在样品群体中, 养殖大西洋鲑群体明显比野生群体变异率低。由于等位酶标记受到取样难度及数量大小限制, 而微卫星标记数据在不同实验室或国家之间传输困难, SMITH等[43]对美国和加拿大育空河流域的大麻哈鱼 (O.keta) 10个SNPs位点进行分析, 成功地将它们区分开来, 其精确度超过95%。

3.3关联分析及基因功能分析

关联分析, 亦称连锁不平衡作图 (linkage disequilibrium mapping, LD mapping) , 是一种研究复杂数量性状的遗传方法。其通过准确而快速地进行生物体基因型和表型的相关性研究, 从而最终确定某一性状差异的特征位点。近年来, 新型SNPs标记的发展促进了关联分析在海洋动物中的应用, 国内外学者在寻找与海洋动物生长性状相关的SNPs位点上取得了初步成效。HE等[44]利用聚合酶链式反应-单链构象多态技术 (polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP) 对119个日本牙鲆 (Paralichthys olivaceus) 雌激素受体基因中与繁殖性状相关的12个SNPs进行检测, 然后用一般线性模型对SNPs进行关联分析, 结果表明, 日本牙鲆雌激素受体基因第四外显子中的2个SNPs (A803G和C864T) 与肝体指数显著相关, 3′非翻译区的10个SNPs与血清17 β-雌二醇相关。不久之后该实验室又用相同的方法分析了52个雌性日本牙鲆的睑裂狭小基因 (FOXL2) 与繁殖能力的关联性, 在编码区和3′非翻译区获得5个SNPs位点, 且与繁殖能力呈显著相关[45]。RENGMARK等[46]认为转铁蛋白与罗非鱼 (Oreochromis niloticus) 的海水耐受性有关, 这主要是由于2个微卫星标记和几个SNPs的共同作用。XU等[47]克隆了尖吻鲈 (Lates calcarifer) 的小清蛋白基因 (PVALB1和PVALB2) , 在PVALB1基因的3′非编码区发现1个SSR与尖吻鲈孵出90 d后的体质量、体长性状极显著相关;同时在PVALB2基因的第三个内含子上检测到3个SNPs, 但与尖吻鲈的生长性状无关。

对于SNPs位点与某一性状是否关联, 最终需要进行功能学研究加以证实。目前主要有以下几种常用方法进行功能学分析:1) 基于关联分析方法, 分析个体或群体对疾病的易感性、抵抗力等表型的差异, 该方法出现较早, 但仍然是有效的研究手段[48]。2) 基于生化和细胞水平, 分析酶活力、细胞信号通路等来解释SNPs对基因功能的影响, 目前, 该方法在结论的可靠性方面有了一些进步。3) 基于SNPs影响基因表达的分子机制, 分析SNPs对基因转录、翻译及蛋白质翻译后修饰的影响, 从而更好地解释SNPs影响基因功能的机理, 该方法在分子水平对SNPs影响基因功能机制的解释最为深刻, 但理论还有待完善。在所有影响基因功能的SNPs中, 大多数分布在基因启动子区域可能发挥调节转录效应和蛋白质编码区域引起编码氨基酸改变。虽然SNPs影响基因功能的研究已经是一个十分活跃的领域, 但在海洋生物中的应用较少, 目前的研究主要集中在人类疾病上。SASABE等[49]对多巴胺D2受体基因进行研究, 发现多巴胺D2受体基因第6号内含子中的1个SNP (rs1076560, C/A) 与酒精中毒的易感性相关, 相比健康人群, 在酗酒病人中, A等位基因出现的频率更高。另有研究表明, 多向性耐药基因1 (MDR1) 第3 435位的一个同义cSNP (3435C/T) 可改变MDR1基因产物的功能。该机制不是通过改变mRNA或蛋白的产量, 而是通过改变mRNA的构象、蛋白的修饰及细胞定位, 进而影响基因功能[50]。SNPs的功能学验证这一特点是其他分子标记不具备的, 具有其他分子标记无可比拟的优越性, 首先利用SNPs进行关联分析, 然后进行功能分析极大地提高了标记的可靠性。虽然SNPs功能分析在海洋生物中还没有相关报道, 但随着分子生物技术的不断发展, 其独特的优点必将使其广泛应用于海洋生物遗传育种中。

4 展望

SNPs标记技术的问世和发展加快了海洋生物分类学、遗传多样性和遗传育种的发展, 成为海洋生物遗传学研究中的有力手段。大量研究表明, SNPs是一种非常有用的遗传标记, 在生命科学领域具有广阔的应用前景, 但在实际应用中仍存在一些问题。其中最主要问题是SNPs检测技术, 虽然已经实现了检测技术的高度自动化和高效率, 但试验成本高昂, 大大限制了SNPs标记技术的广泛应用。其次是知识产权保护问题, 在SNPs的开发过程中, 相关企业申请专利进行产权保护, 阻碍了数据共享, 妨碍了信息交流, 不利于科学发展。

单核苷酸的多态性分型 篇2

单核苷酸多态性及其在作物遗传育种中的应用

单核苷酸多态性(simple nucleotide polymorphism,SNP)是等位基因间序列差异最为普遍的类型,可以作为一种高通量的分子标记.本文主要介绍SNP的定义、几种植物学中常用的.检测SNP方法及SNP标记在作物遗传育种中的应用.

作 者：娄虹 阮亚男 李其久 韩阳 LOU Hong RUAN Ya-Nan LI Qi-Jiu HAN Yang 作者单位：辽宁大学,生命科学院,辽宁,沈阳,110036刊 名：辽宁大学学报(自然科学版)英文刊名：JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION)年，卷(期)：36(3)分类号：Q75关键词：单核苷酸多态性 分子标记 遗传育种

单核苷酸的多态性分型 篇3

【关键词】 痛风；单核苷酸多态性；rs2231142；三引物法；早期诊断

痛风是一种单钠尿酸盐沉积所致的晶体相关性关节病，与嘌呤代谢紊乱及（或）尿酸排泄减少所致高尿酸血症直接相关，属于代谢性风湿病范畴，流行病数据表明，近年来我国人民由于生活水平提高和生活习惯改变，痛风发病率急剧升高，并呈现低龄化趋势[1]。研究表明，遗传因素是痛风发病的一个重要因素，三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2基因（ATP-binding cassette，subfamily G（WHITE），member 2；ABCG2）是一种ATP结合转运蛋白，广泛分布在具有分泌和排泄功能的组织，其功能异常可导致尿酸排泄能力下降[2]。目前认为ABCG2基因上单核苷酸多态性在这一过程中起了重要作用，其中（single nucleotide polymorphism，SNP，rs2231142，）C421A（rs2231142）位点与痛风发病相关性最大，能够解释10 %～29 %的痛风发病[3]。ABCG2基因单核苷酸多态性在闽南地区人群中研究还未见报道，本文采用改进的单引物等位基因特异性扩增方法，不经过基因提取，直接对154例痛风患者和160例健康志愿者的外周血样品进行扩增检测，并分析rs2231142位点基因型与痛风发病相关性，为痛风的预防控制和治疗提供参考。

1 实验样本

所有的基因组样本均来自福建省泉州市正骨医院痛风患者及健康志愿者，年龄17～78岁，平均（64±14）岁。痛风组154例，为2010年7月至2011年12月福建省泉州市正骨医院门诊和住院的痛风患者，均符合1977年美国风湿病协会制定的痛风性关节炎诊断标准。对照组160例，为2010年7月至2011年12月福建省泉州市正骨医院日常体检等健康志愿者，排除痛风、高尿酸血症、高脂血症、高血压、冠状动脉硬化性心脏病、糖尿病、恶性肿瘤等疾病。

2 试验方法

2.1 引物设计 本文主要检测人群ABCG2基因rs2231142位点基因型，SNP位点附近的相关基因序列从NCBI获得，引物设计使用Primer 5.0软件，Tm值计算采用网上软件工具OligoAnalyzer 3.0[4]；为增加检测的特异性，引物3′端倒数第3个碱基引入了错配碱基，见表1。

2.2 血液样本与基因组的获得与保存 用EDTA（或柠檬酸钠）抗凝管抽取实验对象的外周静脉血5 ml（在知情同意的前提下，获取患者和志愿者的血液样本）置4 ℃保存备用。取200 μl外周血样本，用全血DNA提取试剂盒（Beijing Sunbiotech Co.td）按说明书提取基因DNA，TE缓冲液溶解，并将其浓度调整为50 ng·μl-1，置4 ℃保存备用。

2.3 三引物SNP基因型特异性扩增 扩增体积25 ?l，包括1.5 mmol·L-1的MgCl2、0.25 mmol·L-1的dNTPs、1.0 U Taq DNA聚合酶（大连TaKaRa公司生产），0.4 ?mol·L-1的P142FW，0.4 ?mol·L-1的P142RN（每个样品需要两管PCR进行反应，内引物分别为P142RN1和P142RN2）， 2.5 ml10×PCR buffer（50 mmol KCl、15 mmol Tris?HCl、pH 8.0，TaKaRa公司，大连），1 ?l基因组模板。将上述各试剂加入200 ml规格的PCR管中，按下述程序进行PCR操作，95 ℃ 5min；95 ℃ 30 s，57.3 ℃ 35 s，72 ℃35 s，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保持。

2.4 全血PCR扩增 扩增体积25 ?l，包括0.25 mmol·L-1的dNTPs、1.0 U Taq DNA 聚合酶（TaKaRa公司，大连），0.4 ?mol·L-1的P142FW，PN1的浓度为0.4 ?mol·L-1的P142RN（每个样品需要两管PCR进行反应，内引物分别为P142RN1和P142RN2），2.5 ml10×PCR buffer（全血扩增缓冲液，HpH buffer[5]），0.7 ?l外周血样品。将上述各试剂加入200 ml规格的PCR管中，按下述程序进行PCR反应：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57.3 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，35个循环；然后 72 ℃ 10 min；4 ℃ 下进行保持。

2.5 电泳检测 对所有PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析：取7 ?l PCR产物，混合1.5 ?l 的6×loading buffer，2 %琼脂糖电泳，电泳缓冲液为1×TAE，电压100 v，电泳时间10 min；琼脂糖凝胶采用GoldView核酸染料染色（5 μl·100ml-1），凝胶成像仪观察结果并拍照，记录并分析相关基因型。

2.6 相关生化指标检测 采用全自动生化分析仪对所选人群的与痛风发病相关的血尿酸、尿尿酸、血沉、C–反应蛋白、血甘油三酯、血胆固醇、尿素氮、肌酐等进行检测，同时还测量血糖、收缩压、舒张压、肾结石等指标，根据肾结石大小和分布将其量化，其中未见明显异常为1，单侧肾脏出现结石为2，双侧结石为3。

2.7 统计分析 将痛风患者和健康志愿者按年龄分为3组，对获得的实验数据进行整理，SNP的hardy–weinnerg平衡采用在线工具进行计算，采用SPSS17.0 数据分析软件对获得的数据进行分析和处理（P<0.05为显著性差异），各等位基因的相对危险度（odd ratio，OR）值通过非条件Logistic回归法计算OR的比值比和95 %的可信区间[6]，并经年龄、甘油三酯等因素校正。根据以上结果分析泉州地区人群痛风相关的rs2231142位点基因性型的与闽南地区人群痛风发病的相关性。

3 结 果

3.1 引物设计与全血扩增 有关rs2231142位点的扩增引物如下表，为了增强三引物法扩增特异性，等位基因特异性内引物（rs142PRN1，rs142PRN2）倒数第3位引入了错配碱基。本研究采用华东医学技术研究所研制的全血扩增缓冲液（HpH buffer）[5]，结合本课题发展的三引物扩增法，随机选用不同基因型的样品（痛风患者），按上述试验方法进行扩增，检测结果如图1所示，外周血样本与经提取基因组样本扩增结果一致，扩增效率相近，证明直接对外周血进行三引物法PCR进而检测其SNP基因型是可行的。从图1还可以看出，样品A基因型为（A/C），样品B为（AA）型。说明泳道1～2提取基因组样品A扩增电泳结果；泳道3～4EDTA抗凝剂处理外周血样品A直接扩增电泳结果；泳道5～6柠檬酸钠抗凝剂处理外周血样品A直接扩增电泳结果；泳道7～8EDTA抗凝剂处理外周血样品B直接扩增电泳结果。

图1 不同方式处理的样品三引物法检测ABCG2基因SNP位点（rs2231142）结果图

3.2 SNP位点（rs2231142）基因型分布与痛风发病相关分析 依据笔者建立的三引物等位基因特异性扩增法，对154例痛风患者和160例健康志愿者进行SNP分型检测，对所测得数据进行Hardy-Weinberg平衡分析，结果显示，对照组P=0.063567；痛风组P=0.706304，均符合Hardy-Weinberg平衡分析。为了进一步分析ABCG2基因SNP位点（rs2231142）基因型与闽南地区人群痛风发病的相关性，我们对所检测到的rs2231142位点不同基因型做了基本统计分析和OR值计算，其中OR校正因子为年龄、尿尿酸、C-反应蛋白、甘油三脂、尿素氮、收缩压、舒张压、肾结石等因素。

结果如表2所示，rs2231142位点AA基因型，在痛风组中分布频率为18.18 %，对照组中为8.12 %；A/C杂合型基因型在痛风组中携带频率为50.65 %，对照组为30.63 %；CC基因型，在痛风患者中携带频率为31.16 %，对照组为62.51 %，各基因型携带频率在痛风患者和健康人群之间有显著性差异（P<0.01）。rs2231142位点等位基因A在痛风患者中携带频率也远高于正常人群（分别为43.52 %和23.44 %， P≤0.01）。经过分析，rs2231142位点AA基因型携带者痛风发病风险提高了4.397倍，A等位携带者发病风险与正常C等位基因携带者相比提高了2.516倍。这些均揭示了rs2231142与泉州地区人群原发性痛风具有相关性。

为了验证rs2231142位点与其他痛风相关的生化指标是否有关联性，将rs2231142基因型与相关生化指标进行了单因素方差分析，结果如表3所示，rs2231142多态性与血尿酸、C-反应蛋白、甘油三酯、收缩压、舒张压、肾结石等生理生化指标具有相关性，具体机理则需要开展进一步实验及相关研究。

4 讨 论

rs2231142，又称Q141K或C421A，是一个在ABCG2基因第5外显子的SNP，Owen等[2]实验证实ABCG2作为一种转运蛋白及尿酸分泌蛋白定位于细胞膜，广泛分布在具有分泌和排泄功能的组织，在14783名受试者中进行ABCG2单核苷酸基因多态性分析，发现rs2231142多态性的存在与血清尿酸浓度密切相关。C421A引起ABCG2蛋白141位谷氨酰胺转变为赖氨酸（Q141K），使尿酸的转运速率下降53 %[7]，从而导致血尿酸水平升高，影响痛风的发生，约有10 %的白人痛风病案与C421A缺失突变相关。在采用基因组关联法对7699例（Framingham）和4148例（Rotterdam cohort）以及4000例非裔美国人研究后，得出其odds ratio为1.74，其中AA型更被认为是导致痛风的原因，而杂合型AC也增加了1.7倍患病风险[8]。Kazumasa等[3] 在3925名年龄在40～90岁的日本人中，分析了rs2231142多态性与血清尿酸浓度及高尿酸血症和痛风的关系，证明两者具有密切相关性并可解释29 %的痛风发病原因。Wang Binbin、李发贵等 [9，10]通过对不同地区汉族人群ABCG2基因的rs2231142位点基因型携带规律的研究，发现中国汉族男性人群中rs2231142位点AA基因型的携带者痛风发病率远高于CC基因型携带者，表明rs2231142位点多态性与中国汉族男性原发性痛风的发病密切相关。因此可以说rs2231142多态性位点是一个重要的痛风发病遗传标志，但其在闽南地区人群中还未做充分研究。

本研究以314例闽南人群样本为研究对象进行分析，发现ABCG2基因上的rs2231142位点，痛风患者携带高风险基因型（A/C、CC型）的比率为68.83 %，正常人群中为仅为38.75 %；而且rs2231142位点各基因型在正常人和痛风患者携带频率均有显著性差异（P<0.01）。根据本研究对发病风险分析结果，AA基因型携带者痛风发病风险提高了4.397倍，A等位携带者发病风险与正常C等位基因携带者相比提高了2.516倍。因此将rs2231142作为对闽南地区人群进行痛风筛查的一个遗传标记对于痛风早期诊断和发现有很大参考意义。另外，我们还发现ABCG2 基因的rs2231142位点多态性还影响到收缩压、舒张压以及血尿酸、C-反应蛋白、甘油三酯、肾结石等指标，这与实际临床痛风患者临床表征相符，痛风患者常合并糖、脂等物质代谢紊乱，肾结石和高血压也出现的较多，但其中遗传及分子机制还需要进一步研究。

本研究采用了一种简便、准确和低成本的三引物法检测痛风相关基因的SNP的方法，仅用一条外引物和两条序列一样的内引物（仅3′端第一个碱基为等位基因特异性碱基），虽然需要两管PCR反应，但这种方法对大部分样品，特别是对于模板量变化不定的全血PCR扩增而言，重复性好，操作简便，易于实现，经改进和完善后适于在普通医疗机构临床使用。

5 参考文献

[1] 阎胜利.痛风的流行病学资料特点[J].山东医药，2010，50（43）：107.

[2] Owen M，woodward，Anna k?ttgen，etal.Identification of a urate transporter，ABCG2，with a common functional polymorphism causing gout [J].PNAS，2009， 106（25）：10338-10342.

[3] Yamagishi K，Tanigawa T，kitamura A，et al.The rs2231142 variant of the ABCG2 gene is associated with uric acid levels and gout among Japanese people [J].Oxford Journals， Medicine， Rheumatology，2010， 49（8）：1461-1465.

[4] Salk JJ， Sanchez JA， Pierce KE， et al. Direct amplification of single-stranded DNA for pyrosequencing using linear-after-the- exponential （LATE）-PCR [J].Anal ytical Biochemistry， 2006， 353（1）：124-132.

[5] Bu Y，Huang Y，Zhou GH. Direct polymerase chain reaction （PCR） from human whole blood and filter-paper-dried blood by using a PCR buffer with a higher pH[J]. Analytical Biochemistry， 2008， 375（2）：370-372.

[6] 韩瑞刚， 冯凯， 刘保池， 等.单核苷酸多态性数据的卡方及Logistic回归分析在SPSS统计软件中的实现[J]. 总装备部医学学报， 2008， 10（2）：63-65.

[7] Phipps-Green AJ， Hollis-Moffatt JE， Dalbeth N， et al. A strong role for the ABCG2 gene in susceptibility to gout in New Zealand Pacific Island and Caucasian， but not Maori， case and control sample sets[J]. Human Molecular Genetics， 2010， 19（24）：4813-4819.

[8] Dehghan A，Kottgen A，Yang Q， et al. Association of three genetic loci with uric acid concentration and risk of gout： a genome-wide association study[J]. The Lancet， 2008， 372（9654）：1953-1961.

[9] Wang BB， Miao ZM， Liu SG， et al. Genetic analysis of ABCG2 gene C421A polymorphism with gout disease in Chinese Han male population[J]. Human Genetics， 2010， 127（2）： 245-246.

单核苷酸的多态性分型 篇4

1 材料与方法

1.1 样本

我们收集了272例胃癌患者和374例健康者的新鲜血液,所有癌症患者均由病理学确诊,其中男性184名,女性88名,年龄36～80岁,平均年龄64岁;健康对照者中男性243名,女性131名,年龄35～80岁,平均年龄63岁。病例组和健康对照组在性别和年龄分布方面差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 基因分型

用酚/氯仿抽提法提取DNA,然后采用TaqMan方法进行基因分型。引物、探针由应用生物系统公司(Applied Biosystems)设计提供。所有样品试验均在384孔板上完成,用ABI PRISM 7900HT仪器检测。

1.3 统计分析

用χ2检验检测基因型分布在健康对照中是否符合Hardy-Weinberg平衡;用非条件性Logistic回归分析估计相对发病风险,并以优势比(ORs)和95 %可信区间(95 % CIs)表示。所有的OR值都平衡了性别、年龄、吸烟和饮酒等因素的影响。

2 结果

在正常对照中,rs7943115的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。SNP rs7943115与胃癌的发病没有关联,见表1。

3 讨论

目前,胃癌在恶性肿瘤中发病率高、死亡人数多,我国每年因胃癌死亡16万人。目前,早检查、早治疗是降低胃癌死亡率的最关键手段,通过一些生物标记,如胃癌易感基因来判定胃癌发生的高危人群,从而采取有针对性的预防和治疗措施势在必行。

MUC6基因位于11号染色体短臂15区5带[5],这一区域在胃癌中经常显示杂合性丢失[6],因此,该基因是胃癌分子遗传学研究的一个重要候选基因。MUC6基因SNP rs7943115位于MUC6基因的3’区域,因此我们推测它可能通过影响RNA的稳定性以及二级结构,从而对MUC6基因的表达或功能起到一定的调控作用,但我们的研究结果显示这个MUC6基因SNP与胃癌没有关联。鉴于在我国这是首次研究MUC6基因多态性与胃癌的关系,因此需要其它研究来证实我们的结果。

参考文献

[1] Blaser MJ.Helicobacter pylori and gastric diseases[J].BMJ,1998,316(7143):1507-1510.

[2]Peek RMJr,Blaser MJ.I Helicobacter pylori and gastrointes-tinal tract adenocarcinomas[J].Nat Rev Cancer,2002,2(1):28-37.

[3]De Bolós C,Garrido M,Real FX.MUC6 apomucin shows adistinct normal tissue distribution that correlates with Lewisantigen expression in the human stomach[J].Gastroenterolo-gy,1995,109(3):723-734.

[4] Reis CA,David L,Carvalho F,et al.Immunohistochemical study of the expression of MUC6 mucin and co-expression of other secreted mucins (MUC5AC and MUC2) in human gastric carcinomas [J].J Histochem Cytochem,2000,48(3):377-388.

[5] Pigny P,Guyonnet-Duperat V,Hill AS,et al.Human mucin genes assigned to 11p15.5:identification and organization of a cluster of genes[J].Genomics,1996,38(3):340-352.

单核苷酸的多态性分型 篇5

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2006年10月至2007年6月在中南大学湘雅医院及湘雅二医院经剖腹或腹腔镜手术后病理证实为内异症的住院患者70例为内异症组, 年龄25～55岁, 平均年龄35.4岁。选取同期因异位妊娠, 要求绝育及输卵管吻合术等行盆腔手术而术中未发现有内异症病灶者88例为对照组, 年龄22～45岁, 平均年龄32.3岁。两组间年龄比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。为保证遗传背景相同, 内异症组及对照组均来自中国湖南汉族人群, 无血缘关系。3个月内均未服用过激素类药物, 未发现肝炎、糖尿病、结核、类风湿、妇科肿瘤或其他自身免疫性疾病。所有受试者均无遗传病家族史。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA的提取

抽取每位受试者的肘静脉血2～3 ml, 采用标准的苯酚-氯仿萃取法手工提取其DNA, -20℃保存待测。

1.2.2 PCR-RFLP扩增与分析

引物设计序列参考相关文献, 并核对Gene Bank中原始DNA序列, 经上海生物工程公司鉴定并合成。引物序列、扩增片段如下:上游引物:5′-TCCTGGCGACTAACATCGGTGACTTA-3′;下游引物:5′-AGCTACGTGCCTGACTTCTCGGACAC-3′。目标扩增片段长度为304bp。PCR反应体系为20 μl。扩增条件为:95℃3分钟, 95℃40秒, 60℃30秒, 72℃30秒, 30个循环, 72℃延伸5分钟, 4℃保温。用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳, 100 bp为标准分子量对照, 鉴定PCR产物。取2 μl PCR产物, 加入限制性内切酶AluⅠ0.5 μl及其缓冲液组成10 μl反应体系, 37℃ 恒温育2小时。取酶切产物1μl用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳, 银染后用成像系统显像, 判读结果。由于AluⅠ实际识别位点为AGCT, 因此使用AluⅠ酶切预期结果如下:野生型aggt (G/G) , 不能被酶切, 其酶切产物片段为304 bp;突变纯合子agct (C/C) , 能被酶切, 产生两个片段, 长度分别为96 bp, 208 bp;突变杂合子aggt/agct (G/C) , 酶切后产生3个片段, 长度分别为96 bp, 208 bp, 304 bp。

1.3 统计学分析

基因型频率按直接计数法计算, 采用卡方检验, 分析内异症组和对照组分布是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律, 以及比较两组基因型分布频率的差异, 计算比值比 (odds ratio, OR) 及95%可信区间 (confidence interval, CI) , 两组间基因型的两两比较以P<0.0125为差异有统计学意义, 余以P<0.05为差异有统计学意义。数据均用SPSS 13.0软件进行统计分析。

2 结 果

2.1 MIF-173位点基因多态性分析

PCR扩增产物长度为304 bp, 内异症组和对照组中均检出3种基因型:-173GG (野生型) , 不能被酶切, 产生1个片段, 长度为304 bp;-173CC (突变纯合型) , 能被酶切, 产生2个片段, 长度分别为96 bp、208 bp; -173GC型 (突变杂合型) , 酶切后产生3个片段, 长度分别为96 bp、208 bp、304 bp。见图1。

1:标记 (Mark) ;2:PCR产物;3:GG基因型; 4:GC基因型;5:CC基因型

2.2 两组Hardy-Weinberg平衡检验

计算出对照组和内异症组研究对象中MIF基因中-173G/C基因型频率观察数与期望数, 差异均无统计学意义 (P>0.05) , 表明研究对象符合Hardy-Weinberg遗传平衡, 本研究资料具有群体代表性。见表1。

2.3 两组MIF-173G/C多态性分布及比较

内异症组患者MIF-173位点多态性存在GG, GC, CC 3种基因型, 分别占57.14%, 25.72%和17.14%;G, C等位基因频率分别为70.00%, 30.00%。对照组中3种基因型分别占72.73%, 22.73% 和4.54%, G, C等位基因频率分别为84.09%, 15.91%。两组组间基因型和等位基因频率差异均有统计学意义 (P<0.05) 。内异症组与对照组比较, GG, GC基因型分布频率差异均无统计学意义 (χ2= 4.209, P>0.0125;χ2=0.190, P>0.0125) , CC基因型分布频率差异有统计学意义 (χ2=6.798, P=0.009) 。 见表2。

2.4 两组MIF基因型优势比分析

内异症组MIF-CC基因型优势比 (OR=4.345, χ2=6.798, P=0.009) 。OR值95%的CI为 (1.335～14.140) 。

3 讨 论

MIF是一种多功能细胞因子, 它限制巨噬细胞移动, 增加病灶处及腹腔内巨噬细胞浓度, 促使巨噬细胞分泌多种细胞因子及化学物质[4]。MIF在免疫反应、炎症反应、细胞生长及抑制细胞凋亡过程中起重要调节作用。国外学者研究发现, MIF可能通过多种途径促进了内异灶的发生和发展。Pakozdi等 [5]指出, MIF 可诱发内异症妇女异位和在位子宫内膜细胞中基质金属蛋白酶 (MMP-2) 的分泌、合成和激活, 从而利于异位的子宫内膜在宿主组织中植入和生长。Akoum等[6,7] 研究发现, 腹膜巨噬细胞产生的单核细胞趋化蛋白 -1 (monocyte chemotactic protein-1, MCP-1) 和 MIF可能促成了内异症患者巨噬细胞的旁分泌和自分泌活性及其在腹膜腔聚集。MIF还可以促进新生血管生成, 这些机制可能加重了腹膜炎症并促进了子宫内膜的迁移、浸润、生长。另外, MIF与内异症的进展程度及其导致的盆腔疼痛和不孕等有关。

人类 MIF基因定位于第22号染色体长臂 22q (11.2) , 基因片段小于1 kb, 包含了3个外显子, 2个内含子。MIF基因存在4个多态性位点, 分别是位于启动子区的 CATT (5-8) 微卫星多态, 5′侧翼区的-173 (G/C) 单核苷酸多态和位于内含子区的 +254 (T/C) 、+656 (C/G) 的两个单核苷酸多态。近年来有研究表明MIF基因启动子区CATT (5-8) 微卫星多态, 5′侧翼区的-173 (G/C) 单核苷酸多态性影响MIF基因的转录进而影响其基因的功能, 在疾病的发生或基因的功能方面具有重要的意义, 被称之为功能多态性, 是目前多基因病遗传易感基因鉴定研究的热点。研究证实MIF基因功能多态性与多种疾病的发生有遗传易感性, 特别是在一些自身免疫性疾病中。

我们在内异症组和正常对照组中都发现了GG、GC、CC 3种基因型, 表明该位点在我们所研究的人群中均具有G/C单核苷酸多态性, 与国外单核苷酸多态性 (SNP) 数据库检索的结果一致。同时, 我们确定了基因型在两组中的分布频率, 且两组人群均符合Hardy-Weinberg遗传平衡的随机婚配大群体。比较两组人群基因型频率及等位基因频率时我们发现, 两组中均以MIF-173GG型及G等位基因为主, 与费保莹报道的我国浙江地区汉族人群和单志新报道的我国广东汉族人群中MIF-173G/C单核苷酸多态性分布结果相似, 但同周韶璋所研究的陕西人群SNP分布不一致。这与基因多态性具有种族、人群、地域等差异有关。

研究结果显示MIF-173多态位点的基因型频率和等位基因频率在内异症组和对照组之间比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。内异症组中MIF-173CC基因型的分布频率 (17.14%) 显著高于对照组 (4.54%) , (OR=4.345, 95%CI 1.335～14.140, P=0.009) , 其CI值均大于1, 可以初步认为CC基因型与内异症的易感存在相关性。CC基因型使内异症的相对危险度提高, CC基因型可能是内异症的易感基因型。

MIF-173G/C单核苷酸多态与内异症的遗传易感性相关的机制尚不明确, 可能与以下方面有关: MIF-173C等位基因具有4-膦酰基丁酸 (AP4) 应答元件结合位点, 单核苷酸的不同可导致与AP4应答元件亲和力的不同, 影响转录启动频率, 从而对MIF的表达水平造成影响。研究发现MIF-173C (GC+CC) 基因型的健康志愿者血清中MIF水平要显著高于MIF-173GG基因型的健康志愿者[8]。人在位、异位子宫内膜及腹腔液中均有MIFmRNA及蛋白的表达, 而且异位内膜的表达水平明显高于在位内膜。单核苷酸的改变可能引起MIF增多, 导致局部细胞因子及生长因子改变, 腹腔内环境变化, 从而促进异位内膜细胞迁移、浸润、生长。本研究中我们初步发现MIF-173位点G/C单核苷酸多态性与湖南汉族人群内异症的遗传易感性相关, 其CC基因型可能是内异症的易感基因型。这为MIF可能在内异症中发挥作用的假说提供了遗传学依据。

摘要：目的:检测子宫内膜异位症患者和非子宫内膜异位症患者巨噬细胞移动抑制因子 (MIF) -173位点单核苷酸多态性, 探讨MIF-173位点G/C多态性与子宫内膜异位症遗传易感性的关系。方法:应用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性 (PCR-RFLP) 分析技术, 检测湖南汉族子宫内膜异位症患者70例 (内异症组) 及非子宫内膜异位症患者88例 (对照组) MIF-173酶切位点单核苷酸多态性, 并进行MIF基因分型。结果:①MIF-173位点GG, GC, CC基因型在内异症组和对照组中的分布频率分别为57.14%, 25.72%, 17.14%和72.73%, 22.73%, 4.54%, 两组组间比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。②G、C等位基因频率在内异症组中的分布频率分别为70.00%, 30.00%;在对照组中分别为84.09%, 15.91%, 两组间比较差异有统计学意义 (P=0.003) 。③MIF-173CC基因型在内异症组中的分布频率 (17.14%) 明显高于对照组 (4.54%) (OR=4.345, 95%CI 1.33514.140, P=0.009) 。结论:MIF-173位点单核苷酸多态性与湖南汉族人群子宫内膜异位症的遗传易感性相关, 其CC基因型可能是其易感基因。

关键词：子宫内膜异位症,巨噬细胞移动抑制因子,单核苷酸多态性

参考文献

[1]金爱红, 何福仙.巨噬细胞移动抑制因子与子宫内膜异位症[J].国外医学妇产科分册, 2005, 32 (2) :78-80.

[2]Weed JC, Arquembourg PC.Endometriosis:can it produce an autoim-mune response resulting in infertility[J].Clin Obstet Gynecol, 1980, 23 (2) :885-893.

[3]Rier SE, Yeaman GR.Immune aspects of endometriosis:relevance ofthe uterine mucosal immune system[J].Semin Reprod Endocrinol, 1997, 15 (3) :209-220.

[4]Suzumori N, Zhao XX, Suzumori K.Elevated angiogenin levels in theperitoneal fluial of women with endometriosis correlate with the extentof the disorder fertile[J].Steril, 2004, 82 (1) :93-96.

[5]Pakozdi A, Amin MA, Haas CS, et al.Macrophage migration inhibi-tory factor:a mediator of matrixmetalloproteinase-2 production in rheu-matoid arthritis[J].Arthritis Res Ther, 2006, 8 (3) :R132-R135.

[6]Akoum A, Kong J, Metz C, et al.Spontaneous and stimulated secre-tion of monocyte chemotactic protein-1 and macrophage migration in-hibitory factor by peritoneal macrophages in women with and withoutendometriosis[J].Fertil Steril, 2002, 77 (12) :989-994.

[7]Akoum A, Metz CN, Al-Akoum M, et al.Macrophagemigration inhib-itory factor expression in the intrauterine endometrium of women withendometriosis varies with disease stage, infertility status, and pelvicpain[J].Fertil Steril, 2006, 85 (12) :1379-1385.

单核苷酸的多态性分型 篇6

1 材料和方法

1.1 研究对象

1 00例早产患者为2007年6月～2010年2月在河北省石家庄市第四医院产科住院治疗的北方籍汉族妇女,平均年龄为28.13±5.97岁(23～42岁)。患者的年龄、孕周、月经史、生育史及家族史等资料均有病历详细登记,所有病例均选择为胎膜早破型并且无早产史,产后胎盘、胎膜送病理证实为炎症的早产妇女,将小于等于32周的早产定义为早期早产,大于32周的早产定义为晚期早产。100例健康对照为同地区无早产史及遗传病史的无关个体,且均为汉族女性,平均年龄为28.89±5.37岁(22～38)。以上标本采集均由本人知情同意。

1.2 方法

1.2.1标本采集及外周血白细胞DNA的提取所有研究个体均采集静脉血5 ml,经枸橼酸钠抗凝,4℃冰箱保存。采血后1周内,以蛋白酶K-饱和氯化钠盐析法[3]提取外周血白细胞DNA。

1.2.2 MMP-9基因启动子区SNP基因分型MMP-9基因型检测采用PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)方法。PCR反应体积为25μl,其中含100ng模板DNA,2.0mM MgCl2,0.2 mM dNTPs,0.2μM上、下游引物,2.5U Taq-DNA聚合酶和2.5μl 10×PCR缓冲液。MMP-9-1562C/T扩增的上、下游引物序列分别为5'-GCCTGGCACATAGTAGGCCC-3'和5'-CTTCCTAGCCAGCC GCATC-3'。PCR反应条件为:94℃预变性5 min,然后94℃30 s,62℃30 s,72℃30 s,35个循环后,72℃再延伸5 min。扩增产物经限制性内切酶SphⅠ37℃消化过夜后[3],于4%琼脂糖凝胶电泳分析基因型。MMP-9-1562C/T的T/T基因型为435 bp,C/C为247bp和188 bp,T/C基因型为435 bp,247bp和188 bp。(见图1)

为进行基因型检测的质量控制,每一批PCR反应均以蒸馏水替代DNA作为阴性对照。10%的DNA标本进行了二次分型以确定实验结果的可靠性。

A泳道为T/T基因型;B～H泳道为C/C基因型;I泳道为T/T基因型。

1.3 统计学分析

统计分析采用SPSS11.5软件包进行。采用χ2检验比较基因型频率的观察值与预期值,并进行Hardy-Weinberg平衡分析。病例组和对照组的MMP-9-1562C/T的等位基因频率及基因型分布比较采用行×列表的χ2检验。应用非条件logistic回归模型计算表示相对风险度的比值比(odds ratio,OR)及其95%可信区间(confidence interval,CI),OR值经年龄进行校正。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般特性

本研究数据的统计学处理显示,MMP-9-1562C/T多态性位点基因型频率分布在对照组符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。100例早产患者平均年龄为28.13±5.97(范围23～42);100例对照者平均年龄为28.89±5.37(范围22～38),两组的年龄无统计学差异,t=0.95,p=0.35(见表1.)。

2.2 MMP-9基因启动子区-1562C/T与早产的关系

MMP-9基因启动子区-1562C/T SNP:病例组和对照组MMP-9基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡。C和T等位基因频率在早产和对照组中分别为89.00%、11.00%及92.50%、7.50%,差异无统计学意义(χ2=1.46,P=0.23)。早产患者MMP-9的C/C、C/T和T/T三种基因型频率分别为79.00%、20.00%和1.00%,与对照组人群(85.00%、15.00%、0.0%)相比也无显著差异(χ2=1.22,P=0.27)。与C/C基因型相比,携带T等位基因的个体未能明显增加早产患者的发病风险,经年龄校正的OR值为1.52(95%CI=0.78～3.10)(见表2)。早期早产患者T等位基因频率为11.96%,与晚期早产患者(10.19%)相比没有显著差异(χ2=0.16,P=0.69)。早期早产患者MMP-9三种基因型频率(C/C、C/T、T/T)分别为76.09%、23.91%和0.00%,与晚期早产患者(81.48%、16.67%、1.85.%)也没有显著性差异(χ2=0.44,P=0.51)(见表3)。

a年龄校正,相对C/C基因型,C/T+T/T基因型的风险值.此处将C/T和T/T合并

a此处将C/T和T/T合并

3 讨论

胎膜早破是早产的危险因素之一,而感染是胎膜早破的主要因素,30周前的早产80%由感染引起[4],感染造成MMP-9异常表达,MMP-9主要通过对Ⅳ型胶原的降解,在胎膜破裂的过程中发挥重要的作用。Van等人研究发现感染使MMP-9表达增高,从而激活IL-8、IL-1β等细胞因子[5],这些细胞因子使炎细胞聚集,破坏胎膜造成胎膜早破。

MMP-9基因启动子的结合区域有AP-1、NF-κB、Ets和Sp-1等转录因子。其中NF-κB与感染引起的早产相关[6]。NF-kB在感染诱导下,受基因调控,与启动子区或增强子上的结合序列相结合,诱导多种细胞因子表达,从而参与感染性早产的发生。

MMP-9启动子区-1562bp处的C/T多态为启动子区域转录抑制因子的识别位点,由于胸腺嘧啶T替代了胞嘧啶C而破坏了抑制因子的识别结合序列,从而显著提高了启动子的活性,增加了MMP-9的表达水平[7]。

目前该多态与一些肿瘤、心脏疾病、牙周病等发生发展的关系已有报道[8,9,10],与早产的相关性报道较少。本研究结果显示MMP-9-1562C/T多态与中国北方妇女早产的发病风险无关,与C/C基因型相比,携带T(C/T+T/T)等位基因的个体未能明显增加早产患者的发病风险。提示-1562bpC/T基因多态性可能与中国北方妇女早产的发病风险无关。这与Ferrand等人[11]的研究相一致,他们认为MMP-9-1562C/T多态与非洲裔美国妇女早产的发病风险无关。

以上结论与早产胎盘组织MMP-9的高表达可能并不相矛盾,因为MMP-9的表达可能受其他调控机制的调节,如酶原激活、基质金属蛋白酶抑制剂和激素水平的调节等。另外该研究结果还可能说明-1562C/T与早产的发病风险的关系可能存在不同种族、不同地区差异。

根据早产孕周分期分析,本研究未发现MMP-9-1562C/T多态与早产的孕周分期之间存在明显关联。该多态的等位基因和基因型频率分布在早期与晚期早产之间的差异无统计学意义,由于我们的样本量较小,需要扩大样本量来验证我们的结论。

摘要：目的:研究基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)与中国北方妇女早产遗传易感性的关系。方法:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法,检测100例早产患者和100例对照组妇女的MMP-9基因启动子区-1562C/T单核苷酸多态性位点的基因型。结果:早产患者组和对照组的MMP-9基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。早产患者MMP-9中C和T等位基因频率在病例组和对照组分别为89.00%,11.00%及92 50%,7.50%,两组差异无统计学意义(χ2=1.46,P=0.23);病例组C/C,C/T和T/T基因型频率分别为79.00%,20.00%和1.00%,对照组分别为85.00%、15.00%和0.00%,两者差异亦无统计学意义(χ2=1.220,P=0.27)。与C/C基因型相比,携带T等位基因未能明显增加早产的发病风险,经年龄校正的OR值为1.52(95%CI=0.78～3.10)。结论:MMP-9启动子区-1562C/T多态性可能与早产的发病风险无关。

关键词：早产,基质金属蛋白酶-9,单核苷酸多态性,易感性

参考文献

[1]金镇,尚涛,吴桂清,等.胎膜早破孕妇羊水中基质金属蛋白酶-9及炎症细胞因子的变化[J].中华围产医学杂志,2002;5(4):284-285

[2]陈一喆,郑佳音.基质金属蛋白酶-9、白介素-1β与未足月胎膜早破的关系[J].中国优生与遗传杂志,2007;17(6):48-50

[3] Miller SA,Dykes DD,Polesky HF.A simple salting out procedure for extracting DNAfrom human nucleated cells[J].Nucleic Acids Res,1998;16(3):12- 15

[4]余加林.产前感染与早产[J].实用儿科临床杂志,2005;20(12):1169-1171

[5] Van Den Steen PE,Wuyts A,Husson SJ,et al.Gelatinase B/MMP-9 and neutrophil collagenase/MMP-8 process the chemokines human GCP-2/CXCL6,ENA-78/ CXCL5 and mouse GCP-2/LIX and modulate their physiological activities.Eur J Biochem,2003;270(18):3739-3749

[6] Lappas M,Permezel M,Georgiou HM,et al.Nuclear factor kappa B regulation of proinflammatory cytokines in human gestational tissues invitro.Biol Reprod, 2002;67(2):668-673

[7] Zhang B,Ye S,Herrmann SM,et al.Functional polymorphism in the regulatory region of gelatinase B gene in relation to severity of coronary atherosclerosis[J]. Circulation,1999;99(14):1788- 1794

[8] Gil Ugarteburu R,Rivas del Fresno M,Gonzalez Rodriguez I,et al.Matrix metalloproteinase-9 polymorphisms in the diagnosis of prostate cancer.A preliminary experience.Arch Esp Urol.2010;63(2):125- 132

[9] Shevchenko AV,Golovanova OV,Konenkov VI,et al.Analysis of the gene polymorphism of matrix metalloproteinase-2 and -9 in patients with coronary heart disease.Ter Arkh,2010;82(1):31-34

[10] Vokurka J,Klapusova L,Pantuckova P,et al.The association of MMP-9 and IL-18 gene promoter polymorphisms with gingivitis in adolescents.Arch Oral Biol. 2009;54(2):172-178

单核苷酸的多态性分型 篇7

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用随机数字表法抽取2010年1月～2012年10月于解放军第一一七医院(以下简称“我院”)心内科就诊的冠心病患者240例作为病例组,其中,稳定型心绞痛(atable angina,SA)84例,不稳定型心绞痛(unstable angina,UA)90例,急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)66例。病例的诊断及分型参照1997年WHO的诊断标准。同时随机抽取同期至我院其他科室就诊的患者200例作为对照组,患者冠状动脉造影结果均正常,未患有心脏相关疾病,无冠心病史。病例及对照组均排除患有恶性肿瘤、免疫系统疾病、感染性疾病、外周血管疾病、严重肝肾功能不全及使用免疫抑制剂者。两组平均年龄、性别构成等一般情况比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。见表1。所有入组调查对象间均无血缘关系,并且均签署知情同意书。所有实验操作规范及样本采集方式均经我院伦理委员会伦理会议通过。

注:1 mm Hg=0.133 kPa;BMI:体重指数;SBP:收缩压;DBP:舒张压;Glu:血糖;TG:三酰甘油;TC:总胆固醇;HDL-C:高密度脂蛋白胆固醇;LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇

1.2 方法

1.2.1 试剂和仪器

SphⅠ限制性内切酶由伊普瑞斯科技有限公司提供,紫外分光光度计、PCR仪由上海医科大学仪器厂提供。

1.2.2 资料收集及常规检测

收集病例组及对照组的一般人口学特征(年龄、性别)、家族史、冠心病史、冠心病危险因素暴露情况(高血压、糖尿病、高脂血症等),对调查对象进行血压、血糖、血脂等常规检测。

1.2.3 PCR检测

采用PCR-RFLR法对调查对象血液样本进行基因分型,并对比病例组及对照组之间的差异。人类MMP-9基因(ID:4318)位于20q11.2～q13.1,长7654 bp,mRNA长2387 bp,编码13个外显子,该基因共155个单核苷酸多态性(SNPs),本次研究选择位于启动子区的-1562C/T作为研究位点。采用盐析法提取调查对象外周血基因组DNA,对提取的DNA进行鉴定,若DNA的OD260/OD280>1.7,说明DNA纯度合格,否则需从新提取。将鉴定合格的DNA进行定量,根据测定原液的DNA浓度加入TE液,将DNA的终浓度稀释为20 ng/μL。建立PCR反应体系10μL及酶切体系15μL,PCR的反应条件如下:95°C 5 min;95°C 30 s,69°C 30 s,72°C 40 s,35个循环;72°C7 min,产物为435 bp。引物序列为(U)5'-CCTGCTA CAATATACCCCC-3',(L)5'-CTTCTCTAGCCTCAGGGCATC-3'。内切酶酶切片段长度C等位基因为435 bp,T等位基因为247 bp+188 bp。当-1562C/T多态性为C等位基因时,PCR产物不能被SphⅠ内切酶识别,反应后MMP-9-1562C/T为CC纯合子基因型的个体片段长度为仅一个片段,为435 bp;MMP-9-1562C/T多态性为T等位基因时,PCR产物可被SphⅠ识别,因此,MMP-9-1562C/T为TT纯合子基因型个体经限制性内切酶SphⅠ酶切后产生两个片段,分别为247 bp和188 bp;MMP-9-1562C/T为CT杂合子基因型个体的PCR产物经SphⅠ酶切后产生3个片段,分别为435 bp、247 bp和188 bp。采用琼脂糖凝胶电泳法鉴定样本的基因型,凝胶成像结果胶片拍照保存并由两名医师独立判断结果,核实后录入数据库。

1.3 统计学方法

采用SPSS 14.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用t检验;计数资料用率表示,组间比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

病例组MMP-9-1562C/T基因型为CC、CT、TT的频率分别为0.78、0.20、0.02,对照组分别为0.81、0.18、0.01,两组基因型的分布差异无统计学意义(χ2=0.59,P>0.05);病例组与对照组CC/CT+TT的OR值为0.83,差异无统计学意义(OR 95%CI:0.51～1.36,P>0.05),见表2。病例组与对照组C/T等位基因OR值为0.83,差异也无统计学意义(OR 95%CI:0.44～1.55,P>0.05),见表3。提示MMP-9-1562C/T基因型及等位基因与冠心病的发生无关联性。

3 讨论

目前越来越多的研究证实MMPs启动子区域的SNPs影响着MMPs的转录活动,MMPs活性增强时[5,6,7],会引起动脉中胶原成分的减少,使冠状动脉中斑块结构脆化,纤维帽易于破裂,从而引起冠心病的发生。MMP-9是MMPs中重要的一员,能够广泛降解明胶、胶原及弹性蛋白。有动物实验建立了敲除MMP-9基因的小鼠模型[8],结果发现,敲除模型小鼠比野生小鼠更不容易发生动脉粥样硬化病变。因此,认为高度表达的MMP-9基因与冠脉粥样硬化、冠状动脉斑块不稳定、支架内再狭窄等有关。人类MMP-9基因(ID:4318)位于20q11.2～q13.1,共155个SNPs,其中,位于启动子区的-1562C/T与冠心病发生的关联性较受关注。既往研究认为,-1562C/T多态性位点的碱基突变能够在转录水平影响基因表达,从而影响酶蛋白合成数量。当突变位点位于该基因与转录抑制蛋白结合的区域内,C碱基突变为T碱基后,区域的构型即可发生变化,导致基因与转录抑制蛋白的结合力下降,转录抑制的作用减弱,启动子活性增强,基因转录增强,MMP-9表达量增加,MMP-9对细胞外基质的降解增加,导致冠状动脉破坏增加。

单核苷酸的多态性分型 篇8

1 对象与方法

1.1 研究对象

所有的胃癌病例为甘肃省武威市各医院经病理组织学确诊并且在手术前均未接受过化疗或其他任何抗肿瘤治疗的患者, 为胃癌组。胃癌标本为手术切除的胃癌组织, 当地人群胃癌发病率 (209.8/10万) 居全国首位[1]。对照组为当地出生的、在年龄以及性别上与胃癌组相近的健康志愿者。

1.2 胃癌组的组织学分型

依照Lauren’s分型法[6]分为肠型和弥漫型2种。

1.3 DNA提取

对照组标本的DNA采用标准的蛋白酶K消化、酚-氯仿抽提法从EDTA抗凝的外周静脉血中提取。手术切除的胃癌标本先冻存于-70℃冰箱, 经粉碎后采用相同方法提取DNA。

1.4 p53基因第72密码子单核苷酸多态性的基因分型方法

p53基因第72密码子单核苷酸多态性的基因分型采用PCR-RFLP法。每份PCR反应液 (30μl) 中包含0.12μmol各种引物、1.0 mmol MgCl2、120μmol各种dNTP、Taq DNA聚合酶1.6U以及DNA模板20 ng。引物设计按照Ara等的报告[7], F:5’-TTGCCGTCCCAAGCAATGGATGA-3’和R:5’-TCTGGGAAGGGA-CAGAAGATGAC-3’。PCR条件为:初变性 (94℃5 min) , 后接35个周期的变性 (94℃, 30 s) 、复性 (55℃, 1 min) 和延伸 (72℃, 1 min) 。PCR产物用BstU I限制酶消化 (60℃13 h) 。仅有Arg等位基因具有限制性位点, 能够被酶切而产生113 bp及86 bp的2个片段。消化产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析, 等位基因编码如下:Arg/Arg=113 bp+86 bp, Pro/Arg=199 bp+113 bp+86 bp, Pro/Pro=199 bp[7]。

1.5 统计学分析

所得数据采用SPSS 10.0统计软件处理;每个等位基因位点的Hardy-Weinberg平衡用χ2检验评定;各基因型的频率用优势比 (odds radio, OR) 及95%可信区间 (95%CI) 的相应统计学软件分析。2组之间年龄和性别的差异以及胃癌不同病理亚型的基因型频率差异用χ2检验评定, P<0.05, 被认为具有显著性差异。

2 结果

自2002年10月~2005年3月, 本研究共检测胃癌患者385例以及对照组412人。2组在年龄和性别方面无显著性差异 (见表1) 。

胃癌组有弥漫型胃癌患者305例 (79.22%) , 肠型胃癌患者80例 (20.78%) 。胃癌组及对照组的p53基因Arg72Pro单核苷酸多态性均被评价, 所有的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡。对照组Pro/Pro、Pro/Arg以及Arg/Arg基因型的频率分别为27.18%、50.49%及22.33%;而胃癌组相应基因型的频率分别为21.82%、45.45%和32.73%;以Pro/Pro为指示物, 胃癌组尤其是弥漫型胃癌组与对照组的Arg/Arg基因型频率之间具有显著性差异, 优势比 (OR) 分别为1.83 (1.24~2.70) 和2.25 (1.47~3.43) , 见表2。

3 讨论

国内外一些关于p53基因Arg72Pro单核苷酸多态性与胃癌风险相关性的研究得出了有争议的结论, Shepherd等人于2000年首先报告, 美国胃癌患者p53基因Arg72Pro单核苷酸多态性各基因型频率与对照组无显著性差异, 但他们注意到胃贲门癌病例Arg/Arg基因型频率高于非贲门癌患者, 并且基因型频率分布与种族有关:白种人Arg/Arg基因型频率为64%, 而黑种人Arg/Arg基因型频率为24% (P=0.001) 。还发现p53基因Arg72Pro基因型与地域、性别和肿瘤的组织类型无关 (P=0.067) , 认为白种人Arg/Arg基因型频率增高而黑种人Pro/Pro基因频率增高可能是白种人易患贲门癌和黑种人易患胃窦癌的原因[8]。Zhang等2003年报告, 他们对英国胃癌病例的研究得出了与Shepherd等相似的结果[9]。2002年Hamajima等报告, p53基因Arg72Pro单核苷酸多态性与日本人群的胃癌风险无关[10]。Hiyama等2002年发现在并发幽门螺杆菌相关慢性胃炎的日本胃癌患者中, p53基因Arg72Pro单核苷酸多态性各基因型频率与对照组之间无显著性差异, 但Pro/Pro基因型与弥漫型胃癌相关。他们注意到在日本人群中, Pro/Pro基因型与胃癌不同病理亚型之间具有相关性[11]。Wu等2004年报告, p53基因Arg72Pro单核苷酸多态性与中国台湾人群的胃癌风险无相关性[12]。Shen等2004年报告了他们对324例中国胃癌患者的研究结果, 与Pro/Pro基因型相比, Arg/Arg基因型频率与胃癌有相关性, OR=1.44, 患非贲门胃癌的风险更大, 调整后的OR=1.67, 且饮酒能显著提高Arg/Arg基因型个体患胃癌的风险, OR=2.85[13]。

本研究结果显示, 与对照组相比, 胃癌组尤其是弥漫型胃癌组Arg/Arg基因型频率明显高于对照组, 有显著性差异。

本研究结果还显示, 我国西北人群p53基因Arg/Arg基因型频率 (22.33%) 明显低于美国白人 (64%) , 略低于美国黑人 (24%) , 提示不同人种中该基因型的频率有差异。

一般认为, 胃癌高发区以肠型胃癌为主, 而在低发区则以弥漫型胃癌为主。比如在胃癌发病率很高的日本, 肠型胃癌占大多数;而在胃癌发病率很低的西方国家, 弥漫型胃癌则最为常见[11,14]。而本研究结果显示, 弥漫型胃癌的患病人数在所研究的人群中占显著优势, 这明显不同于以上规律, 提示西北人群胃癌不但发病率高而且恶性度高。

4 结论

单核苷酸的多态性分型 篇9

C- 反应蛋白 (C- reactive protein, CRP) 是反映机体炎症状态的一个敏感而可靠的指标, 不仅能够在免疫反应中激活一大批下游的细胞因子, 还直接作用于白细胞聚集和血管壁细胞凋亡, 导致疾病发展[2,3]。目前, 有关血清CRP与牙周炎关系的研究已证实血清CRP对牙周组织炎症反应中的炎性介质的影响和血清CRP与牙周炎的显著相关性[4,5,6,7,8];然而, 关于CRP基因多态性与侵袭性牙周炎的关系的研究报道很少, 因此本实验就CRP+1059G/C单核苷酸多态性与侵袭性牙周炎患者的易感性进行相关研究。

1 资料与方法

1.1 病例选择

选取四川大学华西口腔医院牙周科就诊的侵袭性牙周炎患者55 例, 男16 例, 女39 例, 年龄19～42 岁;慢性牙周炎患者87 例, 男45 例、女42 例, 年龄28～60 岁。诊断依据参照1999 年牙周病国际分类的新标准[9]。参与实验者均为汉族人群, 要求无全身系统性疾病, 妇女无妊娠、非哺乳期;牙周炎患者近1 年内未做过牙周治疗, 近3 个月内未服用过抗生素。

具体纳入标准如下:慢性牙周炎组:①年龄20～65 岁;②全口至少有10 颗可以进行牙周评价的牙齿, 至少含4 颗磨牙 (不包括第三磨牙) ;③至少在3 个象限内有1 个或多个位点探诊深度≥6 mm、附着丧失≥ 5 mm;④X线显示牙槽骨吸收≥ 1/3。

侵袭性牙周炎组:①年龄小于45 岁;②快速的牙槽骨破坏和附着丧失;③全口至少8 颗牙齿探诊深度≥6 mm, 邻面附着丧失≥4 mm;④X线片显示有磨牙邻面牙槽骨吸收;⑤无明显的错畸形。

正常对照组:口腔卫生情况良好, 牙龈无明显炎症表现, 龈沟深度≤3 mm, 全口牙CAL ≤0.5 mm, 牙齿无松动, 缺失牙不超过3 颗;X线片显示无牙槽骨吸收;共有53 例, 男26 例, 女27 例。

所有参与实验者均被告知该实验目的并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 样本收集和DNA提取

用无菌棉签取双侧颊黏膜拭子, 室温下自然干燥过夜, 在无菌容器中保存。取颊黏膜拭子, 浸泡于装有1 000 μl无菌水的试管内, 旋转拧干拿出, 12 000 r/min离心5 min, 弃掉上清液。加入5%Chelex- 100液200 μl, 使其浸没标本, 再加入蛋白酶K (20 mg/ml) 10 μl, 漩涡混匀, 55 ℃水浴3 h, 煮沸8 min, 冰浴3 min, -20 ℃保存。

1.2.2 CRP+1059G/C单核苷酸多态性目的基因扩增和酶切

应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性 (PCR-RFLP) 核苷酸分型技术检测1059 G/C 基因多态性。根据Cao等[10]提出的引物, 序列如下:上游5′- GAT CTG TGT GTG ATC TGA GAA ACC TCT- 3′, 下游5′- GAG GTA CCA GAG ACA GAG ACG TGG- 3′。PCR反应体系:DNA模板2.5 μl, 2×Taq PCR MasterMix 12.5 μl, 引物A、B各1 μl, 无菌去离子水补足总体积至25 μl, 混匀。PCR 反应条件: 变性94 ℃ 5 min; 循环94 ℃ 1 min , 57 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min , 共35 个循环; 延伸72 ℃ 10 min。扩增产物经电泳分析证实PCR扩增成功。取纯化后的PCR 产物, 限制性内切酶MaeIII (Roche Diagnostics, Germany) 酶切, 55 ℃水浴4 h。酶切片段经2 %琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭染色后通过UV 凝胶成像。

PCR质量控制措施:所有标本均在盲法下进行测定, 随机抽取10%样本在单盲情况下重复测定各位点基因型, 以检验所测基因型的重复性和可靠性。

1.3 统计分析

基因型分布及其与易感性的关系采用SPSS 15.0统计软件包处理, 采用行×列表χ2检验比较各组在基因分型及分布上是否存在统计学差异。

2 结果

2.1 CRP+1059G/C目的基因扩增和酶切分析

目的基因扩增片段长度为744 bp, 根据限制性内切酶Mae Ⅲ酶切结果, GG型 (310 bp, 233 bp, 201 bp) 者为3 条电泳带;GC 型 (434 bp, 310 bp, 233 bp, 201 bp) 者为4 条电泳带; CC 型 (434 bp, 310 bp) 者占2 条电泳带 (图 1～2) 。

2.2 CRP+1059 G/C基因型分布及等位基因的分布

本实验中共有GG型167 例, 其中侵袭性牙周炎组47 例, 慢性牙周炎组75 例, 正常对照组45 例;GC型25 例, 其中侵袭性牙周炎组8 例, 慢性牙周炎组10 例, 正常对照组7 例;CC型3 例, 侵袭性牙周炎组未发现CC型携带者, 慢性牙周炎组2 例, 正常对照组1 例。 3 组间基因型分布差异无显著性 (表 1) 。G型和C型等位基因频率分别为92.05%和7.95%, 等位基因频率在3 组间的差异无显著性 (表 2) 。

3 讨论

致病菌的存在是牙周炎发生的必要条件, 然而仅有细菌存在并不足以导致牙周炎。与遗传有关的宿主易感性是牙周炎发病的主要决定因素之一。AgP被认为是与多个基因有关的多因素疾病。James等[11]通过对73 例AgP患者及95 例慢性牙周炎患者的研究显示TLR4 (Toll like receptor) 多态性与AgP易感性有关。Roshna等[12]通过对40 例广泛性侵袭性牙周炎 (generalized aggressive periodontitis, GAgP) 患者和80 例健康对照者的研究发现HLA- B- 15 (human leukocyte antigen) 多态性与GAgP的易感性及其严重性有相关性。目前已发现的与AgP易感性相关的基因有:IL- 1基因[13]、IL- 4基因、Fcγ受体 (FcγR) 基因[14,15]、N- 甲酰肽受体 (FPR) 基因和维生素D受体 (VDR) 基因[16]、雌激素受体XbaI和PvuII基因[17]等。

(1) :GG/GC/CC 3组间基因型分布差异无显著性

(1) :G型和C型等位基因基因频率3组间差异无显著性

CRP是当机体受到细菌或病毒感染、机械或温度损伤、缺血坏死、炎症以及恶性肿瘤等刺激时, 由肝细胞合成的急性期反应物。CRP参与牙周炎的发病过程, 并在龈沟液中被检出。有学者认为牙槽骨的严重丧失可能与龈沟液内CRP水平相关。Miranda等[5]发现青少年特发性关节炎伴牙周附着丧失组CRP 水平比正常对照组升高。D′Aiuto等[6]对无系统性疾病的94 位重度牙周炎患者做常规基础治疗, 分别在2 个月和6 个月时监测临床指标和血中IL- 6和CRP水平, 结果发现, 在基线检测时病变范围和程度重的牙周炎患者有更高的患CRP相关的心血管疾病的风险 (OR 5.6) 。Slade等[7]研究发现牙周炎患者CRP水平较均数增高1/3, 是牙周健康者CRP水平的2 倍。D′Aiuto研究CRP+1444C>T对牙周治疗后的中等炎症刺激反应, 发现牙周治疗后出现炎症标志物 (CRP, IL- 6) 的迅速增高。TT纯合子携带者的CRP水平比CC纯合子携带者高。基因调节CRP浓度同时也调节个体对内毒素刺激性炎症的反应[18]。Marsik将2 ng/kg内毒素注射入91 位健康男性引起炎症反应。CRP+1444CC纯合子的CRP水平比TT纯合子低约40%[19]。

但是炎症过程中CRP水平有可能受诸如细胞因子网络等复杂过程的调控, 而不仅仅是单个基因因素的影响。Kathirsan等[20]研究发现, CRP存在13 种单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism, SNP) , 其中9 种会影响CRP水平, 进一步对其全部进行分级选择性比较, 发现1 个三等位基因的单核苷酸多态性rs3091244 C>T>A最终保持和CRP水平的相关性。

AgP的发病率有着种族差异, 黑人的患病率平均为白人的2 倍, Saxby[21]报道的亚洲人为0.2%, 黑人为0.8%。虽然大量的研究显示, 在AgP的发生和发展中遗传因素具有重要作用, 现在普遍认为是多个不同的基因决定了宿主的易感性。虽然本实验未发现侵袭性牙周炎组与慢性牙周炎组及健康正常对照组之间在表达上有显著性差异 (P>0.05) , 但是这并不能说明CRP+1059G/C基因型与侵袭性牙周炎的发生发展毫无相关。牙周病与遗传因子的关系并不是简单的一两个基因的问题, 牙周病的发病涉及机体免疫反应的方方面面, 免疫网络、细胞因子网络的重重作用、调控, 以及在基因水平也一定有着复杂的相互作用, 只有深入进行有关的研究, 才有可能揭示出遗传因子在牙周病发病中的作用[15]。