蛋白质研究技术

蛋白质研究技术（精选十篇）

蛋白质研究技术 篇1

1 大豆蛋白的提取技术

大豆蛋白的工艺主要分为: 碱溶酸沉法、乙醇提取法、膜分离法、酶解酸沉法、离子交换法等。其中碱溶酸沉提取工艺是利用弱碱性水溶液浸泡低脱脂大豆,将其中的可溶性蛋白质萃取出来,然后用一定量的盐酸水溶液加入已溶解出的蛋白液中,调节其p H到大豆蛋白的等电点,使大部分蛋白质沉析下来得到该大豆分离蛋白产品[4]。乙醇提取法是通过将乙醇溶液在水浴中对原料大豆进行反复浸提,将浸提液进行溶剂回收, 得到的即是能浓缩蛋白产品[5]。其中碱溶酸沉法、乙醇提取法提取大豆分离蛋白工艺是目前国内外生产大豆分离蛋白的主要方法也是比较传统的方法。

而酶法、超滤膜法、离子交换法和发酵法为近年来发展的新型提取方法[6,7,8]。采用传统的醇法和酸碱法存在得率较低、 工艺较复杂、特别是废水给环境带来相当大的危害。酶法主要是采用蛋白酶、淀粉酶,能获得大豆蛋白的良好功能及营养性,但是在使用蛋白酶时,需要控制低的水解度( DH) ,提取工艺的难度加大。超滤膜技术的分离原理是利用高分子半透膜,以压差为动力,使提取液中的蛋白与其它物质分离,然后进行喷雾干燥。但是成膜法提取大豆蛋白,目前还没有很好地应用于工业化生产的主要原因是膜分离过程中膜的污染,使膜通量大幅度下降的问题。离子交换法是在电渗析的基础上发展而来的,其基本原理与碱提酸沉法基本相同,该工艺中的双极膜由三层组成: 阴离子交换膜、阳离子交换膜以及阴阳离子交换膜中间的亲水层。水分子在电流作用下,在双极膜上可以电离为H+和OH-,由于膜选择透过阴离子或阳离子,导致溶液的p H值降低,从而达到大豆蛋白的等电点而使蛋白沉淀。该工艺的优点在于不需要加入酸或碱调整蛋白溶液的p H值,可以避免分离得到的大豆蛋白中混入盐离子,保护大豆蛋白的功能性,生产的蛋白纯度高、灰分少、色泽浅,但生产周期过长,目前仍处于实验研究阶段,有待于更深入的研究与开发。

2 主要提取方法的技术演进

经过梳理发现,碱溶酸沉法是大豆蛋白的主要提取方法, 不管是试验阶段,还是产业阶段,该法都是重要手段之一。其中日本的不二制油株式会社在提取大豆蛋白的研究中正是主要着手于该法的研究,不二制油株式会社的碱溶酸沉提取蛋白质技术最早始于1967年,主要是将大豆用碱性的水溶液进行提取,然后再将其调节到酸性将其沉淀以得到分离。而在提取的过程中,也可以通过对p H严格的分段控制,来实现大豆蛋白的分级提取[9]。随着技术的演进,为了减少在酸沉过程中产生的钠或氯含量,不二制油株式会社对该酸沉过程中使用的材料由常用的HCl改进为特定比例的碳酸钾和氢氧化钠[10]。进入到20世纪90年代后,该公司对于大豆蛋白提取方向的研究中, 不再是简单的碱溶酸沉法,还出现了很多的预处理或者后处理步骤,例如,在预处理中加入同工酶来获得更好的口味,或者是将获得的大豆蛋白在酸性条件下用含有盐以及甘氨酸的盐溶液处理,收集得到的上清液为一种低过敏性的大豆蛋白。进入21世纪,随着对大豆蛋白提取研究的深入,不二制油株式会社对该提取方法的研究更注重于提取得到大豆蛋白能在产业上得到很好的应用,其主要体现在三个方面: ( 1) 继续对大豆蛋白的口味进行改善; ( 2) 提高大豆蛋白在酸性食品中的应用可能性; ( 3) 对大豆蛋白做更细的分级研究。分级的主要目的是为了把大豆蛋白分离成富含7S球蛋白的级分和富含11S球蛋白的级分,因为这两种级分是大豆蛋白级分中的主要成分,并且它们具有不同的性质,例如粘度、凝结力、表面活性等,把两者分开富集,就能够应用两种蛋白的性质,借此可扩大蛋白质的应用。

不难发现,碱溶酸沉法的历史悠久,在20世纪50年代就已经开始使用,在近十年的研究中,碱溶酸沉的技术日趋成熟,对该法的研究逐渐减少。与此相反,酶法的起步晚,但是随着时代的推进,酶法的研究进展上升较快。

技术初始,酶解技术是与传统的碱溶酸沉法一起使用,例如于碱溶后采用了蛋白酶酶解,然后再进行酸沉,其中酶解步骤将被纤维包裹的在碱液中不容易析出的蛋白质能够彻底析出,大豆蛋白的得率可达到48% 以上,比现有的提高了10% , 且降低了生产成分,且纯度也提高了2% ~ 3% 。随着技术推进,酶解反应可以单独提取大豆蛋白,以解放传统的酸碱溶液的使用,可以是通过激活原料自身所含蛋白水解酶,使原料在该蛋白水解酶的作用下发生水解反应得到蛋白乳,水解至p H值5. 0 ~ 3. 0,分离收取沉淀蛋白和乳清液,沉淀蛋白经调中性干燥成为分离蛋白粉; 这种方法在原理上不同于传统的化学方法,不再需要使用大量的酸和碱,生产工艺及设备都得到简化[11]。而用复合酶类酶解大豆也正是现下研究的热点,比如采用了复合的纤维素酶和蛋白酶,通过控制其酶解工艺来获得高的蛋白收率。

3 主要的改进方向

在大豆提取蛋白质的工艺改进中,最常见的技术问题是: 提高蛋白质收率、提高蛋白质纯度; 其次是改善产品口味与色泽,以扩大其应用以及减少工业废水、促进排污。而针对大豆蛋白自身的特点应运而生的还有两个其他的技术问题: ( 1) 7S球蛋白、11S球蛋白的分级技术; ( 2) 脱除肌醇六磷酸盐等营养障碍物。其中第一个技术问题,在介绍不二制油株式会社的碱溶酸沉技术推进中已经有所涉及,在此不展开叙述。

而对于脱除营养障碍物这一技术问题的起因源于肌醇六磷酸配合物的存在能妨碍哺乳动物吸收矿物质,从而削弱了大豆蛋白的营养质量。对于该技术问题最早在1971年时候就受到重视,涉及的专利源自美国[12],其公开了在中性条件下于超滤前通过肌醇六磷酸酶将肌醇六磷酸酶解,使肌醇六磷酸盐的含量降低。除了上述用单个酶处理的之外,还有用复合酶脱除肌醇六磷酸,例如,在碱溶后加入酸性磷酸酶和肌醇六磷酸酶以降解,再酸沉。这种酶解处理不仅可以脱除肌醇六磷酸,还可以降低溶液中核糖核酸这一营养障碍物的浓度。但是用酶解法的加工方法,仅是在试验室中的小规模范围内的降低大豆分离蛋白中的肌醇六磷酸盐含量方面的研究,而为了获得一种工业规模生产的低肌醇六磷酸的大豆蛋白,德国BRISTOL MYERS CO公司中是将原料p H值调整为8 ~ 10,温度为65 ℃ 萃取2 ~ 5 min,然后通过将温度迅速降至50 ~ 60 ℃ ,过滤掉不溶的肌醇六磷酸。

4 展 望

目前,碱溶酸沉法、酶解法依然是主要的大豆蛋白分离方法,在提纯目标上,国内仍然更加注重分离出的大豆的纯度和提取率等传统的需求,而国际上,美、日等国更多的已经转向蛋白的分级技术、脱除肌醇六磷酸盐等营养障碍物等更精细化的需求。因此,国内大豆分离蛋白生产企业亟需同科研单位紧密合作,借助于产学研优势,加大大豆分离蛋白的科研开发力度,改善大豆分离蛋白提取的工艺,研制出应用范围更广、产品性能稳定、功能品种多样、符合多种市场需求的产品。

摘要：大豆蛋白质含有人体所必需的八种氨基酸,并具有优良的食品性能和营养价值,是一种重要的植物蛋白,在食品工业中得到了广泛的应用,是近年来的研究重点。其中,大豆蛋白的提取方法有碱溶酸沉法、酶解法、乙醇提取法、离子交换法、超滤膜分离法、发酵法等等。本文以研究方向和工艺改进两方面为着力点综述了碱溶酸沉法和酶解法这两种主要的提取方法的发展脉络。

蛋白质研究技术 篇2

一、双杂交和其他双成分系统

二、用GST融合蛋白进行Far Western 印记来检测蛋白质-蛋白质相互作用

三、用GST融合蛋白沉降技术检测蛋白质-蛋白质相互作用

四、通过免疫共沉淀确定结合蛋白

五、采用GFP和荧光共振能量转移技术测定蛋白质相互作用

六、利用BIAcore通过表面胞质基因共振光谱学分析相互作用的蛋白质

七、。。

导言

一、多数蛋白质研究工作可分为四个类别：

1.二、蛋白质-蛋白质相互作用研究的3个层次

1.研究的目的是确定各种可能与目标蛋白相互作用的蛋白质，此时要撒大网，因此生理意义暂时不被看重；

2.感兴趣的相互作用蛋白质已被确定，研究的目的是通过详细分析生物学功能，来确定相互作用的生理学意义和影响。

3.某中相互作用已被发现，并且被证实是生理性的，此时研究的目的是提供一种高通量的方法，以发现能够按所需的方式调节这种相互作用的试剂。

三、与蛋白质相互作用直接相关的另一领域是分子模建：

四、各种技术应用分析：

1.所列方案（1~6），不能证明观察到的相互作用是直接或间接的，如果研究目的是确定直接相互作用，最终使用的方法中必须采用纯化的蛋白质。

2.特定蛋白质的内在性质在某种程度上决定了哪种技术能有效的用于分析蛋白质相互作用；`` 3.双杂交和基于GST-融合的筛选方法（方案1，2，3）适用于撒大网式的应用研究。方案2，3只是用来确定体外的相互作用,这种体外的相互作用应当进一步在体内通过单独的方法来证实。

4.对于相互作用在生理上的证实和探索，采用内源蛋白质的免疫共沉淀（方案4）和FRET（方案5）的方法更可取；

5.为快速分析过去已确定的相互作用，双杂交和GST沉降分析具有一些明显的优势；

一、双杂交和其他双成分系统

二、用GST融合蛋白进行Far Western 印记来检测蛋白质-蛋白质相互作用(一)`引言

1.细菌表达的谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白被用于直接测定蛋白质-蛋白质相互作用，以及亲和纯化。

2.融合蛋白的设计依赖于所选择的检测方法和计划采用的筛选方式。

[1].对于文库筛选，将尽可能大的探针蛋白包括进去可以增加检测到的相互作用的数目。

[2].如果探针蛋白含有已知的相互作用区，并且他们用于证实预期的相互作用，那么仅含有这些结构区域的融合蛋白可能更好。

3.GST成分可以二聚化并能产生背景。

4.筹划Far Western 印记实验需要考虑的因素：

[1].最重要的因素是：在没有过多降解和不溶解蛋白质的条件下合成融合蛋白的能力。

[2].从不同融合蛋白制备物得到的结果可能有所不同，所以监控融合蛋白的状态是非常重要的，这包括纯化期间和纯化后，如果蛋白质被存放，还包括使用前后。[3].有助于确认蛋白质-蛋白质相互作用特异性的两个对照是 a)用融合蛋白突变体探测，这种突变体可以破坏相互作用； b)用标记GST来探测膜。？

[4].最终，还要确定是否用变性/复性循环来探测膜，这样设计是为了使错误折叠的蛋白质重新折叠成天然构像。

a)从SDS-PAGE转移到膜的蛋白质通常不需要变性和复性，如果在检测SDS-PAGE时没有产生蛋白质-蛋白质相互作用，那么引入变性/复性过程可能产生阳性结果； b)在探测表达文库覆盖印记的滤膜时，许多研究人员发现变性/复性是必需的步骤。[5].5 5.5(二)实验方案

1.Materials [1].缓冲液和溶液 [2].2.Methods: [1].放射标记蛋白探针的制备 [2].探测膜

3.3(三)注意事项

三、用GST融合蛋白沉降技术检测蛋白质-蛋白质相互作用

(一)`引言

1.GST-pull down 利用了GST对谷胱甘肽偶联球珠的亲和性，从非相互作用蛋白的溶液中纯化相互作用蛋白。该技术对探测蛋白质在溶液中的相互作用特别有用，而这种相互作用在膜的分析中可能是检测不到的。2.GST-pull down通常有两种应用：

1)确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间新的相互作用；

a)未知蛋白可能受浓度的限制，为确定新的相互作用，未知蛋白质必须以足够的量存在，以使这种相互作用能用所选择的检测方法观察到。b)放射标记的细胞裂解液时最常用的蛋白质来源

c)在实验前要考虑：实验目的，探针蛋白的表达等。2)证实探针蛋白与已知蛋白间可疑的相互作用；

a)各种蛋白质来源可用于确定和探询这种相互作用。

b)用于检测相互作用的方法是由能否获得对靶蛋白的抗体来决定的；如果抗体得不到，那么就可利用S标记的体外翻译蛋白或靶蛋白用表位做标签。必要时，可用编码蛋白的质粒转然培养细胞，以增加分析蛋白质的丰度。c)控制质量作用（如非特异性聚集）的影响，并确认探针蛋白同靶蛋白分子间结合的特异性是非常重要的。

d)结合特异性的最好控制是包括一种带有突变相互作用域的GST融合蛋白，丧

35失与这种突变探针蛋白的结合就表明靶和探针间的正常结合是特异性的。e)测试假定靶蛋白与GST间的结合也很重要。

3)3

这两种实验的设计和实施都有所不同。

3.GST-pull down必须对每个蛋白质复合物的分析进行优化：

1)发生相互作用的缓冲液；

2)与融合（探针）蛋白混合的把蛋白的量；所需材料的量主要由把蛋白的丰度和相互作用的亲和力决定（实验开始时两个参数通常是未知的。）3)清洗球珠的条件； 4.4(二)实验方案 A.材料

1.缓冲液和溶液

1）裂解缓冲液：? 2）50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液：在裂解缓冲液中配。（Beads are often supplied by commercial vendors in solutions containing alcohols.It is important to wash the beads thoroughly in GST pull-down lysis buffer and to generate a 50/50 slurry of beads in GST pull-down lysis buffer prior to use.）

3）溶于50mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)中的还原型谷胱甘肽（20mmol/L）

（glutathione;γ-L-glutamyl-L-cysteinylglycine, GSH）

4）

2.专用设备

1)沸水浴

2)翻转样品旋转仪（有，无？）3)谷胱甘肽琼脂糖球珠 3.细胞和组织 4.附加试剂 B.方法

预清除细胞裂解液

1.将细胞裂解液与50l的50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和25g GST在4℃翻转混合孵育2h（实验室内如何实现？）。需要检测相互作用的裂解液的量是高度可变的。开始用1×106~1×107个细胞的裂解液。（细胞裂解液提前制备好是否可以？若提前制备好，放于4℃还是-20℃）

a)预清除步骤主要是从裂解液中除去与GST成分或球珠有非特异性相互作用的蛋白质。b)如果相互作用的检测主要是用针对候选相互作用蛋白质的抗体，那么做预清除并不总是必须的。包含两种对照很重要：GST加球珠和仅有球珠。

c)在用35S标记的细胞裂解液用于确定新的蛋白质-蛋白质相互作用时，预清除步骤有助于降低本底。

d)实验的目的是比较GST与GST融合蛋白，有必要对每个反应制备足够量的预清除细胞裂解液。（多少算足够？以蛋白质的浓度定？还是靶蛋白的表达量来定？）

e)试剂有效的混合是成功的关键，为达到此目的，反应应在一个合理的体积中进行：一个好的起始值是500~1000l。

2.在微量离心机上以最大速度在4℃离心混合物2min。（13,000 rpm）3.将上清（就是预清除的细胞裂解液）转移到新的离心管中。

探测细胞裂解液

4.设定两个含等量预清除细胞裂解液及50l的50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液的微量离心管。在一个管中加约（~5-10 µg）的GST蛋白，另一管中加约（~5-10 µg）的GST融合探针蛋白。将离心管在4℃翻转混合孵育2h。两个反应中加入的探针和对照蛋白终浓度应该是相同的。（终浓度相同的意义是什么？如果融合蛋白不纯化，如何确保其浓度相同？）

5.在微量离心机上以最大速度离心样品2min。（13,000 rpm）（谷胱甘肽琼脂糖球珠的分子量，其连上蛋白后是否可以沉淀下来？）

6.在新的离心管中收集上清。这些样品可通过步骤10中的SDS-PAGE进行分析。（进行分析的目的：How much of the interacting protein was depleted from the total cell lysate.以优化实验条件）

7.用1ml冰冷的裂解液洗球珠。在微量离心机上以最大速度离心混合物1min。弃去上清。重复洗三次。（4次---cold spring harbor protocol）8.（可选）加入50l 20mmol/L的还原型谷胱甘肽到球珠中，洗脱GST融合蛋白及任何与其结合的蛋白质。在微量离心机上以最大速度离心2min。（洗脱方法的缺点：若多次洗脱，最后终体积较大，后续上样较麻烦。所以多数研究者选择将球珠煮沸以使目的蛋白与GST融合蛋白分离。）

9.将球珠（来自步骤7）或洗脱蛋白质（来自步骤8）与等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液混合。

检测相互作用蛋白质

10.将样品煮沸4min并作SDS-PAGE分析。

11.检测与GST融合蛋白结合的蛋白质的方法取决于细胞裂解液是否被的目的。

5S标记以及实验a)如果目的是检测与融合蛋白结合的所有的35S标记的蛋白，就在干胶仪上将胶抽干，并用X线胶片曝光进行放射自显影。

b)如果目的是检测特异性结合的蛋白质，就将蛋白质从SDS-PAGE转移到膜上，进行免疫印迹分析。

c)如果目的是确定与融合蛋白结合的蛋白质的大小和丰度，而这些蛋白质是来自非放射性的裂解液，就用考马斯亮蓝或硝酸银将胶染色。

(三)注意事项

四、通过免疫共沉淀确定结合蛋白

(一)`引言(二)实验方案

A.材料 1.缓冲液和溶液 2.专用设备 3.细胞和组织 4.附加试剂

B.方法

(三)注意事项

五、采用GFP和荧光共振能量转移技术测定蛋白质相互作用

(一)`引言(二)实验方案

A.材料 5.缓冲液和溶液

6.专用设备 7.细胞和组织 8.附加试剂

B.方法

(三)注意事项

六、利用BIAcore通过表面胞质基因共振光谱学分析相互作用的蛋白质

研究青霉素结合蛋白测定技术 篇3

【关键词】氘标记 青霉素结合蛋白 聚丙烯酰胺凝胶电泳 荧光放射自显影

【中图分类号】R515【文献标识码】A【文章编号】1672-5158（2013）02-0334-01

当前，细菌耐药性问题日趋严重，给临床治疗带来困难，对β-内酰胺类抗生素而言，某些菌青霉素结合蛋白（PBPs）改变造成的耐药性，是β-内酰胺类抗生素的特点。PBPs为细菌的胞浆膜上的一些膜蛋白，是参与细菌细胞壁肽聚糖生物合成的霉。β-内酰胺类抗生素正是通过与PBPS结合，抑制细菌细胞壁的合成引起细菌细胞死亡从而发挥杀菌作用。PBPs的数目、位置、亲和力的变化造成与PBPs类抗生素不易结合而产生耐药性。人们常采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影的方法研究PBPs图谱，以便了解敏感菌和耐药菌的区别。PBPs测定技术是研究β-内酰胺类耐药性的重要手段。一般放射自显影法的穿透力弱，不能获得PBPs图谱。要获得获得PBPs图谱需采用荧光闪烁剂增效的“荧光放射自显影法”。国内有关PBps测定技术报道甚少，以3H标记者更少，本文介绍这一技术。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种肺炎链球菌31003，30301（北京药品生物制品检定所； Pen08.R6本室保存菌种。

1.1.2 培养基C+Y培养基，参见文献。

1.1.3 仪器及药品

垂直板凝胶电泳槽（吴县科研仪器厂）；NG-l型真空凝胶干燥器（太仓电视机厂）；TGLL-1a型台式高速冷冻离心机（中科院上海生物化学研究所）；8438-超低温冰箱（FormaSclentifi。美国）；电泳仪DY-1型（上海医用分析仪器厂）；丙烯酰胺（Aerylamide，临海止学厂产）；甲撑双丙烯酰胺.（big；瑞士产品）；N，N，N，N一四甲基乙二胺（TEMED，上海前进农场制剂厂）；3H标记青霉素乙酰呱陡盐（NewEngiandNuclear，美国）；x光底片（天津感光材料厂；KodakDiangnostiefilmX-OmatAR13X18em）；2，5-二苯基嗯哇（PPO，闪烁纯，上海试剂一厂）；月桂酰肌氨酸钠（Sarkosyl，Sigma）；十二烷基硫酸钠（SDs，上海新华化工厂）；二甲基亚矾（DMso，北京旭东化工厂）。

1.2 方法

1.2.1 肺炎链球菌PBPs样品的制备：将肺炎链球菌接种c+Y培养基，37℃过夜培养。次日移种新鲜培养基中，37℃培养2～3h至对数生长期。菌液分装试管，每管lml，于冰浴中加入不同浓度的氖标记青霉素，37℃保温10min。在冰浴中加入5ml非标记青霉素G钠盐20万单位/ml， 5000转/min冷冻离心，弃去上清，菌体沉淀用50ml磷酸缓冲液（PH6.8）做成菌悬液。然后加入5～10ml20%月桂酰肌氨酸钠，37℃保温10min使细胞溶解。煮沸3min，置室温备用。

1.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳：采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法。凝胶薄片的制备（厚0.2cm），凝胶配方：分离胶（10%）：Aerylamide：bis（30：0.5）6.7ml，Tris（pH8.8，1.5ml/L）5ml，10%SDS 0.2ml，蒸馏水8.1ml，真空搅拌10～15min除去气体，再加入TEMED。浓缩胶（5%）：按上述配方依次为1.7ml，2.5ml，0.1ml，5.6ml。先配制分离胶，灌注直立式电泳槽后，使凝胶凝固。次日加入浓缩凝胶，放入加样梳，静置2h。在加样槽内依次分别加入PBps样品。接通电流，第一小时维持电压在60V，至染料前沿到达分离胶和浓缩胶交界处，调高电压至120V，走完全程约需3～4h，用考马斯蓝R250染色30～45min，过夜脱色。

1.2.3 荧光放射自显影法：凝胶片用二甲基亚矾（DMSo）处理30min，再用新鲜DMSo再次处理30min，再用20%2，5-二苯基嗯哇处理2～3h，l%甘油和1%乙酸处理lh，将凝胶片贴附在厚滤纸上，使用凝胶真空干燥器进行真空干燥。将凝胶片和x光底片贴紧，置于x光射线暗匣内，置超低温冰箱中-70℃使曝光1～2wr，将x光底片显影，定影，冲洗得到PBPs的放射自显影图谱。x光底片预曝光条件：（1）国产x光底片用照相闪光灯红色滤光片，加6层红色玻璃纸滤过，x光底片上覆盖6层红色玻璃纸，距离50cm，闪光灯闪二次；（2）进口x光底片预曝光用x光机最小功率100mA40kV，距离40cm，每张x光底片曝光0.04s。

1.2.4 竞争性结合试验：定量菌液中分别加入不同浓度的甲氧西林，37℃保温10min，然后加入饱和量的3H标记青霉素，37℃保温10min，再按上述方法继续进行实验。

2 结果与讨论

本法测定肺炎链球菌全细胞中PBPs的含量，首先需要分离菌体蛋白，为使菌体蛋白浓度维持在一定的水平上，必须控制菌龄和菌液浓度。肺炎链球菌破碎细胞的方法以采用离子型去污剂sarkosyl为宜，它能选择性地作用于胞浆膜，使胞浆膜破裂，菌体蛋白释放出来，与此同时，已经与青霉素结合的膜蛋白PBPs也一起释放出来。样品制备完毕，煮沸3min，以便除去某些蛋白质的干扰，青霉素与PBPs结合较牢固，不会被破坏。

本实验采用SDS-PAGE方法（4-5），SDS在分离胶与浓缩胶中的终浓度均为0.1%。分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为5%。

3H标记物穿透力较弱，用一般放射自显影方法不能得出图像，本实验采用荧光放射自显影法（6-8）（Fluoro，aphy），检测聚丙烯酰胺凝胶片上3H标记的蛋白质，有一定的优点。PPO是荧光增效剂，其作用原理不是直接依赖3H放射出来的射线，而是藉助3H上的粒子与PPO相互作用发射出的光，造成x光底片的局部发黑得到深浅不同的暗线，从而获得青霉素结合蛋白的图谱。肺炎链球菌的PBPs图谱上可见有三条区带，即PBP1 （a、b）， PBP2和PBP3。一般情况下，青霉素浓度越大，亲和力越强，颜色越深，在竞争性试验中，甲氧西林浓度越大，亲和力越强，颜色越浅。

据报道（7-9），x光底片预曝光可增加荧光放射自显影法的灵敏度，因为预曝光可以纠正样品放射性和x光底片图像吸收值之间的非线性关系。所以，经预曝光的x光底片上所得到的图像可以正确反映出样品的放射性分布情况。

用国产x光底片不经预曝光时，无图像出现，经预曝光则有图像出现，用进口x光底片未经预曝光者，图像的暗线区别不大。预曝光后的x光底片显示出暗线深浅不同的正确图像。国产x光底片与进口x光底片比较，国产片敏感性较低，预曝光后的x光底片上出现的暗线普遍较浅且细，PBP1不可见。

参考文献

[1] 钱海伦.细菌对卜内酰胺类抗生素耐药性的研究进展.中国药科大学学报，2007；20（3）：188

[2] 钱海伦，李静.肺炎球菌生长培养基和菌种保存方法的研究.徽生物学通报，2009；16（l）：15

蛋白质研究技术 篇4

1 2-DE的基本原理

2-DE技术由O Farrell和Klose于1975年分别在两个实验室独立建立, 他们将高分辨率的等电聚焦 (Iso-electric focusing, IEF) 电泳和十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Sod-ium dodecyl sulphate polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS—PAGE) 联合组成双向电泳。其基本原理是:第一向基于蛋白质等电点的不同在pH梯度胶内等电聚焦;第二向则沿着与一向垂直的方向根据分子量大小的不同进行分离, 把复杂的蛋白质混合物在二维平面上分开。

2 2-DE的具体步骤

2.1 样品的制备

双向电泳成功的关键在于建立一套有效的、可重复的样品制备方法[3]。对于不同的样品性质及研究目的, 其方法也不尽相同, 但一般都遵循以下几个基本原则[4,5]: (1) 尽可能提高样品中蛋白质的溶解度, 以抽提最大量的蛋白质 (包括疏水性蛋白) ; (2) 减少溶液介质中多肽链的人工修饰; (3) 破坏蛋白质与其它生物大分子之间的相互作用, 使样品中的蛋白质处于完全变性状态, 均以分离的多肽链形式存在; (4) 去除盐离子、核酸、脂类和多糖等非蛋白杂质的干扰。样品制备还必须遵循严格的处理方法以避免蛋白质组成的任何定性和定量变化: (1) 定性:保证蛋白质不被修饰, 避免其等电点的改变; (2) 定量:尽可能扩大其溶解度和解聚, 尽量减少蛋白提取过程中的降解和丢失, 以提高分辨率。应尽量简化样品处理步骤, 理想的状态是一步完成蛋白的完全处理。样品制备的裂解液主要是变性剂、表面活性剂和还原剂的联合使用, 使蛋白去折叠并保持还原状态。绝大多数样品往往都需要通过多次实验才能摸索到最适宜的条件。

2.2 第一向电泳

第一向是等点聚焦电泳, 根据一向等电聚焦方式的不同, 可将双向电泳分为3种系统: (1) ISO-DALT (iso-electric focusingfollowed byseparationwithrespecttomolecularmass expressedin daltons) 系统, 以O Farrell技术为基础, 采用经典的两性电解质载体在电流作用下形成pH梯度。这一系统的主要缺点是pH梯度不稳定 (如阴极漂移) 、重复性差、上样量低; (2) 非平衡pH梯度电泳 (non-equilibrium pHgradient electrophoresis, NEPHGE) 系统, 主要用于分离碱性蛋白质, 但如果聚焦达到平衡状态, 碱性蛋白会离开凝胶基质而丢失, 其重复性仍比较差; (3) 20世纪80年代发展建立起具有pH梯度的固相化胶条 (IPG gel) , 于是产生了固相pH梯度等电聚焦 (IPG-DALT) 系统。与传统两性电解质载体在电流作用下形成pH梯度不同, IPG由丙烯酰胺衍生物与聚丙烯酰胺共价聚合而成IPG胶条, 其优势主要有[6]:pH梯度稳定, 聚焦准确, 精度高, 梯度分辨率可达0.001pH;无阴极漂移及碱性蛋白丢失的现象;蛋白上样量大, 可以提高低丰度蛋白的分辨效果;样品中盐的干扰少, 无边缘效应;pH梯度和分离结果的重复性好。IPG-IEF已成为现在主要和通用的一向等电聚焦方式[7]。

2.3 第二向电泳

第二向是十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) , 在恒温下进行, 胶条由一向转移到二向前, 要在平衡液中平衡30分钟, 使胶条浸透SDS缓冲液, 平衡液使固相pH梯度胶条的pH适合第二向电泳, 并防止电内渗 (electroendosmosis) , 以及提高蛋白质从一向到二向的转移效率[8]。一般采用1.5～1mm厚的聚丙烯酰胺凝胶, 进行5～8小时左右。起始时用低电流或低电压, 样品在完全走出一向胶条时, 再加大电流 (或电压) , 待指示剂达到底部边缘时即可停止电泳, 进行染色。目前实验室最常用的显色方法是考马斯亮蓝染色和银染, 也有荧光染色, 同位素标记, 负染法等。

2.4 图像分析与鉴定

成像设备可以摄入图像, 对凝胶图像以数字形式保存, 对每块凝胶图像进行平等的比较, 在各研究组之间传递信息, 并对大量的数据进行归类分析。目前应用较为广泛的图像分析软件有PDQuest、ImageMaster 2D Elite、Melanie、BioImage Investigator等, 分辨率较高, 功能齐全。尽管如此, 仍不可避免约10%的未检出点和假点, 需要手工添加、删除和分割[12,13]。图像采集完成后, 可以应用各种分析软件进行分析, 可以收集、诠释、比较蛋白质组数据资料等。一旦通过差异分析或其它方法找到感兴趣的蛋白后, 就可以从凝胶中或膜上切取这些目标蛋白质作鉴定。现在绝大多数蛋白质的鉴定是通过质谱分析来完成的。

3 2-DE在蛋白质组学研究中的应用

2-DE是目前分离复杂蛋白质混合物的最强有力的方法, 从很多方面来说, 2-DE是最直接寻找和预分离未知蛋白及其翻译后修饰形式 (post-transla-tionallymodified forms, PTMs) 的方法。

3.1 作为监测基因表达的工具

2-DE正是获得蛋白质整体表达情况的工具, 同时还可用于展示基因的差异表达情况。2-DE方法与生物质谱技术的不断进步, 以及两者有效的结合, 使研究人员能够更加有效地分离蛋白质复杂混合物、显示蛋白质差异以及随后鉴定这些蛋白质。

3.2 鉴定细胞器组成

线粒体或细胞核 (nucleus) 等浓缩的细胞器浸液可通过超速离心等一系列步骤获得, 用2-DE分析。因此, 能在单个实验中分离多种细胞器特有的蛋白质。但由于生化分离过程尚不够完善, 因此, 2-DE所呈现的蛋白质并非来自某一种细胞器, 可能混杂了其他蛋白。

3.3 新陈代谢和毒理学的研究

2-DE监测蛋白质表达的整体变化, 通过对重组蛋白质生成的连续监测, 进行生物工程中细胞株生长的质量控制。2-DE也可用于检测药物对细胞株蛋白质表达的影响。通过密切监测药物治疗后蛋白质表达的变化, 可以获得药物作用机理、药物细胞毒性等信息。

3.4 分析简单有机生物体的整体蛋白质组

应用2-DE研究简单生物体的系统已经较完善, 有可能推广使用。简单有机生物体的基因组复杂性较低, 可得到的样本量不受限制。另外, 比较致病菌株和非致病菌株以及测试其药物反应对科学研究也有重要价值。

3.5 免疫印迹法——Western blot和Far-Western blot

根据固定在纤维素膜上的蛋白质仍能结合抗体来特异识别抗原决定簇的原理, 临床上用于患者血清的免疫印迹来发现新的变态反应原, 再通过2-DE分离分析。虽然目前并非所有蛋白质的量都能达到质谱的检测范围, 但这种方法阐明了其单个实验检测大量磷酸化蛋白质的能力。由于其较高的灵敏性和特异性, 即使在蛋白质组学的概念出现之前, 免疫印迹法就已得到广泛的应用。利用Western Blot和Far-WesternBlot方法, 将标记的蛋白、蛋白结构域或多肽与膜杂交, 通过荧光等直接标记方法或其它间接方法检测它们与膜的结合, 从中发现的目的蛋白可以再进行质谱分析鉴定。

4 2-DE的局限性及方法的改进

目前, 双向电泳技术检测的蛋白质数目比估计的细胞内总蛋白少得多, 主要原因有:一些低拷贝数蛋白由于电泳的灵敏度不够, 得不到检测, 实验结果表明当蛋白质的拷贝数低于1000时, 双向电泳技术是不能分辨出来的;部分蛋白 (如膜蛋白) 不溶于样品缓冲液, 疏水膜蛋白和大分子蛋白不易进入凝胶的第二向;一些分子量过大、极端酸性或碱性的蛋白在电泳过程中会丢失;有时一个蛋白质点含有不止一种蛋白。样品处理也是影响双向电泳灵敏度的主要原因之一[14,15]。双向电泳在进行蛋白质分离时, 其自动化不强, 是一项比较费时的工作。双向电泳所能研究的蛋白质数量和类型还受到很大程度的限制。这为双向电泳的研究提出了相当大的挑战。

双向电泳技术具有极高的分辨率和灵敏度, 可以同时显示组织或细胞内各种蛋白, 但其重复性却很不理想。高分辨率确保蛋白质最大程度的分离, 高重复性有利于凝胶间的对比。因此, 提高2-DE的分辨率和可重复性成为人们一直关注的焦点。目前, 解决此问题的措施主要有使用商品化的IPG干胶条, 应用窄范围IPG胶条, 减少凝胶厚度, 增大凝胶面积 (30～40cm) , 蛋白质组重叠群 (proteomic contig) 方法都可以提高双向电泳的分辨率。还有另外一些方面也得到了改善:IPG胶条的产生;IPGhor等相关系统的产生使得IEF过程自动化;半自动银染设备使得同时可以进行多块胶的染色;电泳后一步进行蛋白质荧光染色;内标的引入简化了胶的比对过程;有更好的计算机算法硬件设备用于图像分析。

5 展 望

目前双向电泳技术尚未完善, 手工操作较多, 经验性强, 且存在许多局限性, 尽管如此, 该技术目前仍然是蛋白质组研究中不可替代的分离方法, 随着蛋白质组学的兴起, 对技术有了新的要求和挑战。1997年Unlu等提出了差异凝胶电泳 (difference gelelectrophoresis, DIGE) 的概念, 此方法应用于两种或两种以上不同的荧光染料标记多个样品, 将样品混合进行2-DE, 之后根据不同的波长分别检测荧光。该方法用同一块胶分离多个样品, 提高了重复性, 而且不影响后续的胶内酶切以及质谱鉴定, 并可以通过计算荧光强度来比较样品蛋白质的相对含量[16]。最近, GEHealth基于以上原理推出的荧光差异双向电泳 (Ettan DIGE) 系统可在同一块胶上分析3种蛋白质样品, 极大地提高了结果的准确性、可靠性和重复性。

蛋白质研究技术 篇5

生物质谱技术在蛋白质结构鉴定中的研究进展

目前生物质谱技术成为蛋白质结构研究的关键技术之一.本文概述了生物质谱技术的.基本原理及其在蛋白质结构研究中分子质量的测定、肽指纹谱测定、肽序列测定以及蛋白质翻译后修饰的确定和鉴别等方面的应用现状.

作 者：崔丽娟 黄瑾 作者单位：石河子大学医学院新疆地方与民族高发病重点实验室,新疆,石河子,832002刊 名：农垦医学英文刊名：JOURNAL OF NONGKEN MEDICINE年，卷(期)：200931(4)分类号：Q51关键词：质谱技术 蛋白质组学 结构鉴定

花生蛋白饮料加工技术 篇6

1 工艺流程

花生→筛选→烘烤→脱皮→浸泡→磨浆→过滤→煮浆→配料→均质→灌装→封口→杀菌→成品。

2 操作要点

选料。选择颗粒饱满、无损伤、无霉变的花生原料，并除去杂质。

烘烤。在130℃高温下烘烤10分钟，以钝化花生仁中的脂肪氧化酶，防止出现豆腥味，同时高温烘烤花生，有利于脱皮，还可赋于花生乳特殊的香味。

脱皮。人工脱去花生衣，以防止花生皮上的色素和单宁等在浸泡过程中附于花生仁上，使饮料色泽加深、口感发涩。

浸泡。用花生仁8倍重量的水，加入0.5%的碳酸氢钠高温下浸泡24小时，使花生仁充分吸水膨胀，提高出浆率，同时可浸出一部分低聚糖、防止胀腹。

磨浆。浸泡后的花生仁用清水冲洗3～4遍、沥干，加入花生仁10倍的热水（80℃）进行磨浆。

过滤。磨浆后的花生用120目的滤布过滤。此时pH值6.8～7.1。

加热。将滤后的花生乳加热煮沸，当温度达80℃以后，液面起泡、假沸，产生不少汽泡沫，此时可撇去部分泡沫，以保证质量。当温度达94℃～96℃时、液面翻液、维持1～2分钟，即可达到杀菌目的。注意不要过久加热，以免蛋白质变性，产生分层、沉淀现象。

配料。花生浆10%～12%，蔗糖5%～7%，乳糖适量，冲稠剂0.03%，乳化剂0.4%～0.5%，软化过滤杀菌后的饮料水。

均质。把配好的料液在1.9×10E7～2.4×10E7帕的高压下进行均质处理即可灌装，均质时料液温度为70℃～90℃。

杀菌、冷却。成品灌装封口后，在85℃的温度下保持15分钟进行杀菌，然后分段冷却。

3 注意事项

用磨浆机将花生进行磨浆时，注意调节好磨的间隙，以0.05毫米为最佳，使之产生象天然乳那样均匀的悬浮粒度。如间隙过大，花生浆颗粒过粗、影响其纤维组织彻底破碎，包在花生仁里的蛋白质不能充分地提出，从而使花生原浆浓度低，影响其质量，降低营养价值。如果间隙小，颗粒细，在浆渣分离时部分花生渣混入乳中，其颗粒因重力作用，连同凝固蛋白质沉人底部，产生沉淀、分层现象，影响质量。

4 产品质量标准

感官指标 乳白色，均匀一致，口感好，无分层、沉淀现象，有特有的花生香气。

理化指标 总糖5%～7%；蛋白质3.5%～4.3%；脂肪2.6%～3.3%。

卫生指标 细菌总数（个/ml≤100；大肠菌群（个/ml）≤6；铅≤1mg/kg；砷≤0.5mg/kg；铜≤ 5mg/kg；致病菌不得检出。

蛋白质研究技术 篇7

1 双向电泳技术的历史

双向电泳技术自诞生以来,一直在不断的发展、改进。1975年O`Farrell对大肠杆菌、老鼠及几尼猪蛋白质的研究中首次采用了双向电泳技术,称为ISO-DALT(等电点-道尔顿)。其第一向是将载体两性电解质(CA)添加到丙烯酰胺凝胶中,凝胶聚合后在电场作用下形成连续的p H梯度进行等电聚焦;第二向是聚焦后的凝胶在含有SDS的缓冲液中平衡后,用琼脂糖包埋到垂直板SDS凝胶的浓缩胶上,形成不连续的SDS梯度凝胶电泳[4]。这种双向电泳蛋白质由于上样量低,溶解性较差,可能会造成负性部分碱性蛋白丢失。另外,两性电解质在凝胶中扩散相对较容易,形成不够稳定的p H梯度,造成分辨率低,重复性差,此为经典双向电泳技术。

为克服经典双向电泳技术中出现的问题,Gorg A等于1985年研究出固相IPG-DALT(p H梯度-道尔顿)系统双向电泳技术,该技术以固相p H梯度为基础,使双向电泳技术有了质的飞跃。固相p H介质是一类丙烯酰胺化合物,与聚丙烯酰胺共价结合后可形成一定范围的p H梯度。与传统的双向电泳相比,IPG-DALT系统双向电泳技术具有上样量大、不产生阴极漂移、重复性较好、p H梯度稳定、分辨率高等优点。目前,IPG-DALT系统双向电泳技术在各国应用广泛。

荧光双向电泳技术(fluorescent two dimensional differential gel electrophoresis,DIGE)在近年出现,是双向电泳技术的又一次飞跃,是一种对不同样品间蛋白质差异表达进行系统分析的技术。主要用于大样品蛋白质的差异鉴定。

2 双向电泳技术的原理及步骤

2.1 双向电泳技术的主要原理

双向电泳技术是目前蛋白质组研究中最常用的蛋白分离平台,是最高效、最直观的复杂蛋白质组分离技术。它利用各种蛋白质具有不同的分子量、等电点(p I)分离复杂蛋白质组,分辨率、灵敏度较高。其原理为:首先通过电荷分离蛋白质,利用一向等电聚焦将蛋白质沿p H梯度分离至各自等电点;然后沿垂直的方向通过非连续十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,根据蛋白质分子量大小差别来达到分离的目的。所得的蛋白双点是基于电荷分离和分子质量大小分离的正交组合,从而分布于整个二维凝胶图谱上,每个点代表其中一个或数个蛋白质,而蛋白质的分子量、等电点在样品中的含量也可显现出来。

DIGE的原理是将需要比较的样品在电泳前用不同的荧光染料进行标记,被差异标记蛋白的等电点和相对分子质量基本不受影响,然后将其混合到一块胶内进行分离,并用相应波长来检测不同的荧光标记蛋白,最后用全自动蛋白质表达分析软件进行分析。它的出现有效地提高了双向电泳技术的重复性和定量的准确性。

2.2 双向电泳技术的主要操作步骤

双向电泳技术的体系较为复杂,通过多次摸索才能找到适合体系。IPG-DALT双向电泳技术的主要操作步骤如下。

2.2.1 蛋白质的提取。

蛋白质提取的质量直接影响双向电泳试验最终结果,不同植物、不同组织蛋白应采取不同的提取方法。

2.2.2 蛋白浓度的测定。采用Bradford法测定蛋白质浓度。

2.2.3 第一向IEF电泳。

在进行一向等电聚焦前应将相应的蛋白质与水化液加入样品槽,IPG胶条覆盖在样品上,最后覆上甘油。胶条水化时间应不少于12 h。

2.2.4 第二向SDS-PAGE。

配制相应的凝胶电泳进行二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。注意:等电聚焦电泳结束后应将其放入平衡液Ⅰ中,缓慢震荡15 min。第1次平衡结束后,取出胶条,擦干净背面的液体,然后放入平衡液Ⅱ,缓慢震荡15 min。凝胶应在前一天晚上配,使其充分凝固;压胶条时应避免胶条与凝胶之间产生气泡。

2.2.5 显色。

SDS-PAGE电泳跑完后可用考马斯法或银染法染色。银染法虽然分辨率高,但由于操作方法比较复杂,掌握较困难,且对后续质谱分析等产生影响。考马斯亮蓝法分辨率较低,但操作简单,应用者比较容易掌握,是一种传统的蛋白质染色法。综合考虑,考马斯亮蓝法比较常用。

3 双向电泳技术在植物蛋白质组学研究中的应用

3.1 双向电泳技术在玉米蛋白质组学研究中的应用

Von Wiren等通过比较铁摄取缺陷型、野生型突变体玉米的蛋白质双向电泳图谱,从中发现4个与铁离子跨膜运输有关的多肽。李冠军等对干旱胁迫下玉米叶片蛋白质经行了双向电泳分析,选出在3个时段下的干旱处理中均有诱导表达的3个差异蛋白点,经过对比分析,3个点的数据库对比结果均达到显著,最后得出结论,玉米可能通过叶组织的木质化,降低水分的散失量,使细胞膨压得到维持,从而提高玉米的耐旱性。王彦玲等[4]利用双向电泳技术对郑单958及其亲本在缺磷条件下进行蛋白质组学分析,得出郑单958可能在磷胁迫的环境适应方面有杂种优势。付忠军等利用双向电泳技术对亲和性转换前后花丝与花粉差异表达蛋白质经行分析,首先摸索到了适合自己的双向电泳体系。最后得到了9个在不同亲和阶段表达差异的蛋白质点。朱畇昊[5]以玉米花粉为材料,建立了相应的玉米花粉双向电泳体系,然后选择成熟的花粉和离体萌发1小时花粉经行双向电泳,得到28个差异显著的蛋白点。

3.2 双向电泳技术在水稻、小麦蛋白质组学研究中的应用

王经源[6]对汕优63及其双亲苗期第3叶蛋白质组进行定量比较,得到1 667个以上的蛋白质点。发现有23个蛋白质点在3个品系间存在显著差异。丁伟等用双向电泳对水稻叶片全蛋白经行鉴定,发现与干旱等胁迫相关蛋白,且有4个是首次发现。陈卫卫等对耐高温性差异明显的3个品种作为研究材料,经双向电泳分析及质谱鉴定,得出可能为水稻苗期耐高温相关的鉴定蛋白。

朱宏等以普通小麦叶片为试验材料,通过优化双向电泳的关键步骤,在小麦叶片可溶性蛋白的分析中获得满意的双向电泳图谱。刘丽等利用SDS-PAGE、2-DE和MALDI-TOF-MS分析LMW-GS组成,建立了LMW-GS亚基的标准命名系统。孙正娟等以太谷核不育小麦不同时期的幼穗为材料进行双向电泳,得出的结果表明不同时期表达的与育性相关的蛋白不同。

3.3 其他作物蛋白质组学中双向电泳技术的应用

Kubis等基于DIGE蛋白质组学,阐明了前蛋白质输入叶绿体的机制。Sybille在分离制备拟南芥叶绿体时,运用荧光差异凝胶电泳分析突变型、野生型植物叶绿体中蛋白的差异性。通过比对多种TOC易位子亚基的野生型和突变性拟南芥的叶绿体蛋白,探究各种易位子复合物对输送蛋白类型的特异性。林金科等研究了茶树芽叶蛋白质提取纯化及双向电泳技术的改进,探索出一种重复性好,清晰度高的蛋白双向电泳技术体系,并发现一种辨别茶树蛋白质样品质量好坏的简便方法。郭春芳等应用差异蛋白质组学方法分析了铁观音茶树幼苗在聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)胁迫下叶片蛋白质组的变化。

黄华宏等应用双向电泳蛋白质组学对矮化杉木的突变机理进行研究,得到29个差异蛋白质可能与杉木矮化的突变有关。张小静等在深入研究块茎蛋白质发育过程中的差异表达中,建立了马铃薯块茎蛋白质的双向电泳技术体系,并对与其发育相关蛋白质的进行了分析。

综上所述,双向电泳技术在植物发育过程中蛋白质的数量、组成的检测上应用广泛,可为研究者提供不同发育阶段基因表达和调控的特点。

4 面临的问题及展望

双向电泳技术通过研究生物与非生物、植物器官、组织的胁迫蛋白质变化,探讨其病理或生理变化,从而对蛋白质组学的发展研究产生了明显的推动作用。另外,通过与其他蛋白质组技术进行互补、整合,从而进一步拓宽了生命科学研究的途径[7,8]。目前,关于不同条件下植物蛋白表达谱的研究逐渐增加,使大量与逆境、基因发育、突变、植物与微生物互作的新蛋白被发现,但关于这些蛋白质的功能研究目前比较少。因此,在今后一段时间内,植物蛋白质组学的主要研究方向之一为运用生物化学、功能基因组学、生物信息学等方法证实新蛋白质的功能。

近年来,许多新型技术方法被应用到植物差异蛋白质组学研究中,比如荧光差异双向电泳、同位素亲和标记等。荧光双向电泳技术现已得到应用,并且已经成为商品化,但其价格仍然很高,还不能成为一种普及性的技术。综上所述,通过分析双向电泳技术在植物蛋白质组学研究中的应用现状,发现植物蛋白质学研究中的主要发展趋势是技术手段的多样化、分析层次的多元化,并与其他学科的紧密融合。

参考文献

[1]兰彦,钱小红,王阁,等.蛋白质组分析中蛋白质分步提取方法的建立[J].生物化学与生物物理进展,2001(3):415-418.

[2]贾宇峰,林秋霞,郭尧君,等.蛋白质双向电泳图像分析[J].生物化学与生物物理进展,2001(2):246-250.

[3]张国庆,廖杰,于力方.双向电泳技术在蛋白质组研究中的应用[J].标记免疫分析与临床,2003(3):171-173.

[4]王彦玲.我国玉米核心种质磷胁迫蛋白质表达差异和基因组SSR分析[D].郑州:郑州大学,2010.

[5]朱畇昊.玉米花粉萌发的比较蛋白质组学研究[D].郑州:河南农业大学,2010.

[6]王经源.杂交稻苗期杂种优势的比较蛋白质组学研究[D].福州:福建农林大学,2008.

[7]ZHANG Peng-Yi,LI Yue-Zhong,WU Zhi-Hong.Establishment of Sora-ngium cellulosum So0157-2 Proteome Database Using Optimized Two-dimens-ional Electrophoresis Protocol[J].生物化学与生物物理进化,2012,39(1):86-94.

蛋白质研究技术 篇8

1 蛋白组学技术

蛋白组学技术研究主要是围绕两种蛋白组学进行研究探讨。一种是表达蛋白质组学, 这主要是应用在生命科学的基础研究;另一种是功能蛋白质组学, 主要是研究与疾病有关的患者出现个体差异的表达蛋白质。对于临床上研究, 主要针对功能蛋白质组学进行一系列相关的研究。临床蛋白质组学主要是针对以下几个方法进行探讨, 其中包括疾病模型蛋白质组学研究、疾病生物标记物的研究、药物蛋白质靶向药物的研究。低丰度蛋白质在人体生命活动调节中起着重要的作用, 因此蛋白质组学的研究热点以及研究的难点主要是对低丰度蛋白质的分离以及鉴别。目前对于低丰度蛋白质的研究测定主要是通过两种分析技术进行分析研究, 最常用的是双电泳技术以及质谱分析技术。这两种技术共同特点是能够分离样品中的杂质同时能够定量测定样品中目标物质的含量。由于蛋白质的分子相对较大, 而且较容易变形, 因此对于蛋白质的研究, 样品的前处理是相对较为关键的步骤[2]。双电泳技术主要是通过凝胶电泳将蛋白质进行高效的分离后, 得到转录后的蛋白质异构体, 然后通过数据的查询对比, 以及根据测定样品的等电位点以及分子量等信息, 分析样品的生物活性以及根据斑块的大小等进行定量分析。而质谱技术主要是对样品进行离子化, 对蛋白质样品进行蛋白质的分子量以及氨基酸序列的分析。质谱技术属于半定量的分析方法, 可以串联其他技术与质谱技术一起进行分析定量鉴别使用。

2 骨关节蛋白组学研究

人体关节中一般包括有三大标本部分, 分别是软骨标本、关节液标本以及滑膜标本。不同的标本类型有着不同的处理方法。在蛋白组学中样品的前处理是整个研究过程中较为关键的环节。以下将对各种不同关节类型的样品的前处理进行分析讨论。

2.1 软骨关节前处理

其中软骨标本包括软骨细胞以及软骨蛋白组学的研究。其中软骨细胞分离主要是在胰蛋白酶或者胶原酶在接近人体体温37℃进行软骨细胞的分离, 然后在DMEM以及10%的FCS的条件下进行软骨细胞的培养。培养后需要手机软骨细胞进行原代培养, 主要是利于胰蛋白酶的消化作用进行收集以及培养。然后在采用尿酸溶解缓冲液提取蛋白质, 即可完成前处理。而软骨蛋白质组学的研究则主要是在-80℃的条件下进行粉碎, 然后在Na CL以及HEPES的缓冲液中进行蛋白质的提取, 采用CPC沉淀的方法将聚集蛋白聚糖去除, 然后进行蛋白质的沉淀, 经过DOC以及TCA的样本洗涤后, 在尿酸溶解缓冲液中溶解, 然后进行软骨的蛋白质组学研究[3]。

一般对于关节炎病理的研究主要是采用动物模型。一般采用小鼠作为实验动物, 这是由于小鼠的个体差异较少, 并且其对照较好, 因此主要应用在骨关节炎的研究中。目前一些研究已经在病理状态下以及正常状态下找到两者蛋白质的差异, 对于发病机制等仍需要进一步研究探索。

2.2 关节液的蛋白质组学研究

对于关节液的前处理, 主要有以下几步。采集关节液的标本后, 需要采用亲和力较强的色谱进行白蛋白以及Ig G的去除。然后采用DOC/TCA对样本进行洗涤沉淀蛋白后将样品溶解在尿素溶解缓冲液中, 将蛋白质溶解, 即可进行关节液的蛋白质组学研究。

关节液主要是在骨关节中起到润滑的作用, 关节液中含有部分从软骨关节中释放的蛋白质。这部分蛋白质会随着关节液和血液之间的交换将部分的软骨细胞以及基质带到血液中。因此对于关节液的研究, 还可以从血浆中进行。目前已经有研究证实[9]在关节液以及血液中能够发现部分的关节炎症的标记物。这对于靶向药物的开发等有着重要的提示意义。一旦骨关节炎标记物能在血液中被鉴定, 能提高骨关节炎的诊断的速度以及准确率。因此, 蛋白质组学技术对于骨关节炎症的诊断也有一定的积极意义。

2.3 滑膜蛋白质组学研究

滑膜同样也分为滑膜细胞以及滑膜蛋白质组学研究。其中滑膜细胞的研究需要在胰蛋白酶的作用下, 在37℃的反应条件下进行滑膜细胞的分离, 然后在RPMI以及10%的FCS的条件下进行软骨细胞的培养, 然后在胰蛋白酶的消化下进行软骨细胞的收集以及原代培养, 然后在尿素溶解缓冲溶液中进行蛋白质的提取, 即可进行滑膜细胞蛋白质组学的研究[5]。而对于滑膜蛋白质组学的研究则主要是在-80℃的条件下进行粉碎, 然后在飞例子裂解缓冲液中进行蛋白质的提取, 然后采用DOC/TCA对样本进行洗涤将蛋白质进行沉淀, 然后在尿素溶解缓冲液中将蛋白质进行溶解, 随即可开始滑膜蛋白质组学的研究[6]。

3 骨关节炎炎症细胞的研究

临床上已经证实, 前炎性细胞因子, 肿瘤坏死因子是导致骨关节炎发病的主要的炎症致病因子。蛋白组组学的其中一种技术是将这些导致发生骨关节炎的因子对软骨细胞进行刺激以及移植, 观察软骨发病以及退变的过程, 这对于研究软骨发病以及退变的机制研究有着重要的意义。同时在小鼠的软骨移植物种出现有类似的组织生长因子碎片。在动物骨关节炎模型中, 可以观察到组织生产因子在骨关节炎中的关节炎软骨以及关节液的表达中会受到一定的反馈性调剂。

4 讨论

由于人体组成含有大量的蛋白质, 蛋白质组学技术的应用越来越广泛, 并且在骨关节炎的研究中取得相应的成效, 对于骨关节炎的发病机制以及相应的治疗手段仍处于初步的研究开发阶段。目前主要是以发现差异蛋白为主。另外对于蛋白质组学在骨关节炎的研究分析手段、研究方法以及数据处理等方面仍需要进一步的发展。蛋白质组学为日后骨关节炎研究、骨关节炎的发病机制以及值得相应的药物和治疗方案中均具有积极重大的意义。

摘要：目的 通过了解骨关节炎的发病机理, 针对性提出相应的治疗方案, 使得骨关节炎能够得到更好的治疗, 取得满意的临床效果。该文主要是对蛋白质组学技术应用在骨关节炎中进行研究讨论。方法 通过探讨蛋白质组学的研究方法以及各种类型骨关节样本的前处理方法以及应用情况等。初步了解蛋白质组学技术在骨关节炎中的应用情况。通过蛋白质组学技术初步研究骨关节炎, 能进一步明确骨关节炎的发病机制以及相应的有效的治疗方法。

关键词：蛋白质组学,骨关节炎,应用

参考文献

[1]安丙辰, 戴尅戎.蛋白质组学技术在骨关节炎研究中的应用[J].国际骨科学杂志, 2010 (4) :197-199.

[2]黄玉佳.类风湿关节炎患者血清转甲状腺素蛋白化学修饰的蛋白质组学分析[J].国际检验医学杂志, 2011 (21) :135-136.

[3]梁清华, 蒋勇前, 熊新贵, 等.痹肿消汤干预类风湿关节炎患者外周血单个核细胞蛋白质组学研究[J].中国中西医结合杂志, 2010 (11) :1160-1164.

[4]万春友, 冯强, 张福江, 等.类风湿关节炎患者血清转甲状腺素蛋白化学修饰的蛋白质组学分析[J].检验医学, 2011 (3) :185-189.

[5]王建光.类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的比较蛋白质组学研究[D].上海:第二军医大学, 2011.

蛋白质研究技术 篇9

1 中药注射剂ADR概况

与传统中药丸剂、散剂、膏剂、丹剂相比,中药注射剂临床使用时间相对较短,中药注射剂的品种、规格越来越多,随之而来的是相关不良反应(ADR)报告呈逐年增加的趋势。国家食品药品监督管理局发布的第1~11期《药品不良反应信息通报》中涉及的中成药有14种,包括壮骨关节丸、感冒通(片剂)、龙胆泻肝丸、克银丸、白蚀丸、含马兜铃酸中药、清开灵注射液、双黄连注射剂、葛根素注射液、穿琥宁注射液、参麦注射液、鱼腥草注射液、莪术油注射液、莲必治注射液,其中注射剂品种达8种之多,占通报中药品种总数的57.14%[3]。在临床应用过程中发现部分品种其ADR出现的频率极高,如在1030例ADR中列入前三名的药物分别为双黄连注射液342例,占33.2%,清开灵注射液139例,占13.5%,鱼腥草注射液85例,占8.3%[4]。鱼腥草注射液临床应用中不良反应甚多,尤其以药疹,喉头水肿为常见,其中较严重的为过敏性休克[5]。如清开灵引起的过敏反应,消化系统、神经系统反应以及本身引起的不良反应等[6]。中药提取物中的鞣质,可使患者出现食欲减退、恶心、头疼皮下出血,甚至黄疸和肝坏死等临床症状[7]。过敏体质者使用中药注射剂时易发生各种过敏反应。其中以体质虚弱肝、肾功能障碍者,婴幼儿、老年人和过敏体质者为多。用药时空腹、饥饿、精神紧张、过度疲倦也易发生不良反应[8]。相比之下,中药口服制剂却鲜有类似的严重不良反应报道[9]。

2 蛋白质组学概述

蛋白质组(proteome)是从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态,了解蛋白质间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律,是研究细胞内的全部蛋白质及其行为方式的一门学科[10]。其目的是从整体的角度研究生物机体、组织、细胞甚至细胞器基因编码的全部蛋白质,包括蛋白的组成、种类、分布、功能、代谢特征及其动态变化规律等[11]。药物几乎都是通过蛋白质发挥作用,在药学研究应用中,蛋白质组学在药物作用靶点的识别与验证、药物耐药机制的探索、药物毒理学研究等方面已显示出巨大的潜力。

蛋白质组学的三大关键核心技术包括蛋白质双向凝胶电泳技术(2-DE)、质谱技术和计算机图像数据处理与蛋白质组数据库(蛋白质信息学)[12]。2-DE-MS是目前蛋白质组学研究最常用的技术平台,首先通过双向聚丙烯酰胺凝胶电泳按等电点和相对分子质量不同对蛋白质进行分离;建立2-DE电泳图谱,利用软件进行图像分析;再将感兴趣的蛋白点从胶上切下来,酶消化后得到肽片段混合物,进行质谱鉴定;最后进行生物信息学分析[13]。

3 蛋白质组学技术在药物毒性研究中的应用

在药物毒理机制的研究中,传统的毒理学研究方法通常以动物模型为基础,以生化指标和组织病理结果作为毒性检测终点,这些指标多缺乏高灵敏性和特异性,且描述性指标多、提示毒性机制的内容缺乏。与传统方法相比较,蛋白质组学在鉴定药物毒理机制上具有广阔的应用前景,能更准确地预测药物在人体中所发生的毒性[14]。在毒性机制研究的基础上,蛋白质组学更适用于药物毒性筛选和预测,确立毒性作用和蛋白质标志物之间的关系就意味着可以利用这些标志物进行新化合物的毒性筛选,应用灵敏的蛋白质组学技术可以在比传统方法剂量更低,时间更短的情况下鉴定出毒性作用[15]。用这种方法评价药物毒副作用更客观、准确而且花费较少。Aicher等比较了对环孢素A肾毒性耐受型和敏感型家系的肾脏蛋白质组,发现了介导其肾毒性的重要蛋白-钙结合蛋白(calbindin-D28K)表达下调,导致Ca2+在肾脏的异常沉积,引起肾损伤[16]。

3.1 毒性蛋白标志物筛选

蛋白质组学技术通过比较特定细胞、组织或器官在毒物作用前后的蛋白质表达谱的变化,在短时间内筛选出毒物相关的特征性表达蛋白,这些差异蛋白很可能代表着毒物引起机能损伤的执行分子,而且其出现一般要远早于目前应用的病理学终点,再通过抗体分析技术可很快地发现新的毒性蛋白标志物。蛋白质组学对毒理学的研究,一般通过比较正常组织和用于研究的药物处理过的组织细胞的蛋白质组,寻找药物所具毒副作用的迹象。如Chen等利用这个方法,找到了抗MCF-7人乳腺癌药物阿霉素的一个作用靶热休克蛋白27(Hsp27)[17]。Hanash等用2-DE技术分析急性淋巴细胞性白血病(ALL)后,发现HSP27有高水平的表达。该2-DE图谱还显示HSP27在婴幼儿患者和其他年龄层次的患者中的存在形式不同,HSP27在后者的磷酸化水平更高[18]。Kennedy S等用大鼠尿液蛋白质组分析发现,动物使用庆大霉素60mg/(kgod)2、3、8d后,尿液中NAG(acetylglucosaminidase),GGT(r-glu-yltransferase)显著升高,而血清中不增加,这种变化与肾脏近曲小管表皮细胞刷状缘脱落同时出现,庆大霉素40mg/(kgod)剂量组尿液中NAG、GGT无此变化。故作者认为NAG和GGT可作为庆大霉引起肾损伤的早期分子标志。Meneses-Lorente等[19,20]对药物诱导的肝脂肪变性进行了研究,发现早在给药后6 h就有蛋白发生表达变化,一些差异蛋白与肝脂肪变性潜在的毒性机制相一致,但差异蛋白的丰度改变比传统的生化标志物或组织病理改变出现得更早,表明这些蛋白可作为药物诱导的肝脂肪变性的预测性生物标志物。可见检测经药物刺激的组织细胞的蛋白质组,可以帮助我们了解的毒理学机制,并建立可用于评估它们的安全性的生物标志物[21]。

3.2 药物作用组织的毒性机制研究

比较正常组织细胞和药物处理后的组织细胞的差异蛋白质组,寻找药物所具有不良作用的蛋白质结构,并对其进行改进和修饰[22]。通过药物蛋白质组学的研究,使许多药物的毒副作用得到准确而快速的揭示。Steiner等[23]通过环孢菌素A对小鼠肾脏组织影响的蛋白质组学研究,发现用药后小鼠肾脏组织蛋白质组中的钙结合蛋白(细胞内的一种钙转运蛋白)消失,肾小管钙累积,从而阐明了环孢菌素A肾毒性机理。Nordvarg等[24]运用动物实验对药物进行了吸收、分布、新陈代谢、排泄和毒性的对照蛋白质组研究,发现差异蛋白质可以用于药物代谢研究的靶点或者作为毒性的标志。运用蛋白质组学技术还可以对具体药物含量进行测定,如对吗啡药物依赖性患者的吗啡含量进行测量[25]、烟碱治疗后纹状体烟碱含量测定[26]及蝰蛇蛇毒的分析[27]等。另外,进行已知药物毒理学蛋白质组分析,可以鉴定和积累特定组织损伤的蛋白质标志物,为药物临床前安全性评价提供指标,实现新药毒性预测,减少药物临床试验的风险。

3.3 毒性预测和蛋白质组数据库的建立

由于特定蛋白质与毒性损伤机制具有一定的关系,因此通过确立蛋白质标志物和毒性作用之间的关系,可以在一定程度上鉴定、区分和预测药物的毒性。毒理蛋白质组学对毒性的预测主要是通过比较未知毒物与已知的蛋白表达模式的相似性来进行,这离不开相应数据库的支持,建立有效的毒理蛋白质组数据库将有助于提高蛋白质组学技术对毒性的预测能力[15]。蛋白质组学在药物毒性研究中的应用,通常是将正常组织细胞和经待研究药物处理过的组织细胞的蛋白质组进行蛋白点差异比较,这些差异通常与药物毒性有关,进而揭示其机制和规律。如Moller A等对胰腺癌细胞经较高剂量的细胞毒性药柔红霉素(daunorubicin,DRc)处理后的蛋白质组的改变进行了研究,发现许多蛋白在DRC处理后都有上调趋势,而这些改变用RT-PCR却无法检测到。Anderson等[28]研究了不同药物作用于动物肝脏后的蛋白质表达谱,建立了肝脏毒性蛋白质组库,利用这个肝脏毒性蛋白质组库,在一定程度上可以鉴定、区分和预测药物的肝脏毒性,,因为鉴定出的特定蛋白质与毒性损伤机制具有一定的关系。由此可见,对经药物刺激的组织细胞的蛋白质组进行检测,建立其蛋白质组数据库,为我们认识和了解它们的毒理学机制提供了很大的帮助。

4 展望

蛋白质研究技术 篇10

1 蛋白质组与蛋白质组学

蛋白质组 (proteome) 一词是由澳大利亚学者Wilkins等于1994年提出, 并于1995年7月在《Biotech&Genetic Engineering Rev》杂志上发表。目前认为蛋白质组的定义为:由一个细胞、一个组织或一个个体的基因组所表达的全部相应的蛋白质, 也可以说是细胞、组织或机体全部蛋白质的存在及其活动方式。因机体基因组的表达具有时空性和可调节性, 所以蛋白质组的种类和数量在同一机体的不同细胞中是不相同的;即使是同一细胞在不同时期、不同条件下, 其蛋白质组也是处于不断改变之中;因此蛋白质组是一个动态的概念。

蛋白质组学是随着蛋白质组的提出而产生的, 是以蛋白质组为研究对象, 从整体上阐明生物体全部蛋白质的表达模式与功能模式。蛋白质组学的核心在于大规模地对某种物种、个体、器官、组织或细胞的全部蛋白质的表达水平、结构、分布、功能、丰度变化、翻译后修饰、细胞内定位、蛋白质与蛋白质的相互作用、蛋白质与疾病的关联性等性质进行综合分析, 最终对全部蛋白质的功能做出精细和准确的阐述, 明确机体全部蛋白质组成与调控及其功能的活动规律。蛋白质组学的研究内容主要包括结构蛋白质组学和功能蛋白质组学两部分。结构蛋白质组学主要是蛋白质表达模式的研究, 是蛋白质组学研究的基础内容, 主要研究特定条件下某一细胞或组织所表达蛋白质的氨基酸序列组成和空间结构。功能蛋白质组学主要是蛋白质功能模式的研究, 也是蛋白质组学研究的最终目标, 主要研究蛋白质的相互作用、蛋白质结构与功能的关系以及基因结构与蛋白质结构/功能的关系。

2 蛋白质组学研究中的主要技术方法

目前, 蛋白质组学技术主要包括双向凝胶电泳 (2-DE) 、生物质谱及生物信息学。

双向凝胶电泳技术由意大利生化学家O Farrell于1975年发明, 是将高分辨率的等电聚焦 (IEF) 电泳和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 联合组成的电泳技术, 其目的是根据蛋白质的等电点和分子质量不同而将蛋白质分离。双向凝胶电泳技术的基本原理是:第一向基于蛋白质等电点的不同在p H梯度胶内等电聚焦;第二向则沿着与一向垂直的方向根据分子量大小的不同再次将蛋白质进行分离, 把复杂的蛋白质混合物在二维平面上分开。经过2-DE以后, 二维平面上每一个点一般代表一种蛋白质, 这样成千种不同的蛋白即可被分离, 有关蛋白质的等电点、相对分子质量及每种蛋白质的数量信息也可以得到。

生物质谱技术是利用质谱仪分析分离后蛋白质的基础信息 (分子量、分子式、氨基酸组成和分子结构等) , 需通过三个步骤进行。首先通过离子化装置将蛋白质分子转化为气态离子, 接着通过质谱分析器按照离子质荷比 (m/z) 的不同进行分离, 最后转化到离子检测装置, 获得不同质荷比的谱线, 即质谱。目前, 用来分析蛋白质样品的质谱技术的主要是基质辅助激光解吸吸附质谱技术 (MALDI) 和电喷雾质谱技术 (ESI-MS) 。

生物信息学分析是是蛋白质组学研究的核心技术, 是指借助蛋白质组数据库和生物信息学工具软件对蛋白质的详细信息 (序列、结构、构象、功能、翻译后修饰、突变体、相互作用及调控网络等) 进行全面阐释。目前可利用的蛋白质组数据库有基于双向电泳图谱的数据库 (主要有SWISS-2DPAGE、ECO-2DBASE、HSC-2DPAGE和SIEN-A-2DPAGE等) 、基于蛋白序列信息的数据库 (主要有蛋白质信息资源数据库 (PIR) 、SWISS-PROT数据库、蛋白质序列数据库 (NRL-3D) 和Tr EMBL等) 和其他蛋白质组数据库 (主要有PDB蛋白结构数据库、Predictome蛋白质功能预测数据库、PROSITE蛋白质家族和功能域数据库以及MSDB数据库) 。蛋白质组学研究的工具软件主要有蛋白质性质预测工具 (Prot Param工具 (预测物理化学性质) 、Prot Scale (疏水性分析) 、Predict Protein (二级结构预测) ) 、序列比对软件 (SE-QUEST和Aacomp ldent等) 和蛋白质结构与功能预测软件 (Findmod等) 。

3 蛋白质组学在绒山羊产业中的应用

绒山羊以其独特的绒毛产品成为重要的经济动物, 而绒毛的生长依赖于皮肤毛囊的周期性发育, 其中毛囊细胞合成的各种蛋白质与毛囊的周期性发育密切相关, 并决定着绒毛的产量和质量。因此, 开展绒山羊皮肤毛囊蛋白质组学的研究就非常必要。但目前关于绒山羊毛囊蛋白质组学的研究鲜有报道, 仅有有资料显示, 内蒙古农业大学李金泉教授的项目组已经开展内蒙古绒山羊皮肤蛋白质双向电泳及图谱建立研究, 但尚无进一步的研究结果报道。本实验室在辽宁省教育厅的资助下也开展了辽宁绒山羊皮肤毛囊3个发育周期的蛋白质组学初步研究, 共筛选除了400个左右的差异表达蛋白质, 并成功鉴定了30个蛋白质, 经生物信息学分析确定出13种蛋白质可能与毛囊的周期性发育有关, 现在正进行下一步的验证工作。

鉴于目前对绒山羊皮肤毛囊蛋白质组学的研究仍处于初级阶段, 本项目组认为可将蛋白质组学研究技术应用于绒山羊产业研究的以下4方面: (1) 构建不同月份皮肤毛囊参考蛋白质组图谱并进行蛋白质表达的差异研究, 系统分析和比较不同月份皮肤蛋白质表达的特点和规律, 帮助了解绒山羊皮肤蛋白质的表达及分布情况, 为分析绒毛发育机制奠定基础。 (2) 系统分析差异表达蛋白的详细信息, 尤其是确定蛋白质之间的相互关系和表达调控规律, 完全揭示毛囊周期性发育和绒毛生长的机制。 (3) 发现决定毛囊周期性发育和绒毛生长的相关稳定蛋白质, 为绒山羊的选育提供科学依据。 (4) 通过人工调控技术改变相关蛋白质的表达, 从而提高羊绒的产量和质量。

摘要：随着生命科学研究进入后基因组时代, 蛋白质组学研究已成为新的研究热点, 相关研究技术也已被应用到多种产业研究中, 并发挥了重要的作用。本文就蛋白质组学的概念、研究内容、相关研究技术方法及其在绒山羊产业研究中的潜在应用作了简要概述和分析。

关键词：蛋白质组学,技术方法,潜在应用,绒山羊

参考文献

[1]Wilkins M R, et al.Progress with proteome projects:why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it[J].Biotech&Genetic Engineering Rev, 1995, 13:19-50.

[2]Anderson N.L, et al.Proteome and proteomics:new technologies, new concepts, and new words[J].Electrophoresis, 1998, 19:1853-1861.

[3]Nilofer S A, et al.Proteomics in clinical trials and practice:present uses and future promise[J].Mol Cell Proteomics, 2006, 5:1819-1829.

[4]PandeyA, Mann M.Proteomics to study genes and genomes[J].Nature, 2000, 405 (6788) :837-846.

[5]O'FARREL P H.High resolution Two-dimensional electrophoresis of proteins[J].J Biol chem, 1975, 20:4007.

[6]Corg A, et al, The current state of two-dimension electrophore sis with immobilized Ph gradient[J].Electrophoresis, 2000, 21 (6) :1187-1201.

[7]Quadroni M, James P.Proteomics and automation[J].Electrophoresis, 1999, 20 (45) :664-677.

[8]马袁君, 等.生物信息学及其在蛋白质组学中的应用.生物信息学, 2008, 6 (1) :37-38, 48.

[9]Boguski M S, et al.Biomedical informatics for proteomics[J].Nature, 2003, 422 (6928) :233-237.