抗衰老机制

抗衰老机制（精选六篇）

抗衰老机制 篇1

1 对自由基的清除作用

衰老原本是自然界存在的一种生物学法则, 是机体随着时间推移在多种因素作用下出现的退行性变化过程, 是个体在发育成熟以后所出现的细胞、组织、器官功能逐渐减退的状态。人体也不例外, 关于人体衰老目前有多种学说, 其中自由基学说正日益受到重视。所谓自由基是具有一个以上的不成对电子的分子或原子的总称, 它是人体正常代谢的中间产物, 也可能来自环境。即自由基带有未配对电子的基团, 主要包括:超氧化物自由基、氢氧自由基、一氧化氮自由基等, 反应活性较强, 对核酸、蛋白质、脂质等大分子物质具有明显破坏性。在生理状态下, 人体细胞内自由基的产生与清除保持相对平衡, 一般不会对细胞造成损害。但在自由基产生过多或清除自由基能力减退的情况下, 过多的自由基可使体内脂质发生过氧化, 导致细胞功能衰退或丧失, 引起人体衰老以及多种疾病的发生, 包括肿瘤、心脑血管病、早老性痴呆、动脉硬化、糖尿病及并发症、帕金森病等。

有研究显示, 松针含有多种抗衰老作用的成分, 例如花青素、儿茶素、多种氨基酸和维生素、植物纤维素、植物生长激素、脂肪等, 特别是松针还含有多种水溶性黄酮, 有些成分随着季节时令的不同亦有所差异[1]。近年来研究表明, 黄酮类化合物具有的多酚结构, 能够提供活泼的质子, 与自由基结合成比较稳定的产物, 可以阻断脂类的自动氧化过程, 而松针中即含有丰富的黄酮类化合物, 有研究显示可显著提高运动小鼠体内自由基清除剂———超氧化物歧化酶 (SOD) 的活性, 明显降低脂质过氧化作用的终产物丙二醛 (MDA) 的含量。松针既能减轻脂质过氧化物对组织或细胞的损伤, 又能增加机体对自由基损伤的保护作用。对以高糖高脂饮食诱导大鼠造成肥胖氧化应激状态的动物实验显示, 松针总黄酮能提高饮食诱导的肥胖大鼠心肌、骨骼肌抗氧化酶活性, 降低MDA含量, 因而松针总黄酮可显著改善肥胖大鼠的氧化应激状态, 保护心肌和骨骼肌[2]。马尾松松针多种提取物均具有一定抗氧化活性, 且呈现显著的量效关系, 其中马尾松松针正丁醇和水提取物清除1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼 (DPPH) 自由基的能力大于还原型谷胱甘肽;马尾松松针乙酸乙酯、正丁醇和水提取物清除O2-自由基的能力强于氧化型谷胱甘肽, 而弱于还原型谷胱甘肽, 显示出马尾松松针乙酸乙酯、正丁醇和水提取物是天然抗氧化剂的良好来源[3]。

松针提取物原花青素具有超强的抗氧化活性, 研究显示, 原花青素对DPPH自由基的抗氧化效果显著优于维生素C, 对DPPH自由基的清除效果随着其浓度的提高而增强[4]。松针提取物能保护肺主动脉上皮细胞不受叔丁基过氧化氢诱导的脂质氧化影响, 避免氧化应激引起的细胞毒作用。松针提取物可抑制线粒体反应性氧体系, 这一过程可能是通过影响谷胱甘肽水平及增强其还原酶活性来实现的。谷胱甘肽是重要的内皮抗氧化剂, 维持着细胞内硫醇以及过氧化物降解之间的动态平衡, 参与脂质过氧化产生的细胞毒物质的代谢, 对各种底物与谷胱甘肽转移酶的连接也起着重要作用, 而老年人的许多疾病皆可测出谷胱甘肽水平的下降。大鼠动物实验显示, 松针提取物对谷胱甘肽具有保护作用, 并增强其还原酶的活性, 提高SOD和催化酶的活性[5]。

2 对脏器的保护作用

脏器的健康状况直接决定了人的长寿与否, 正如《本草纲目》所说, 松针可“安五脏”。许多研究显示, 松针提取物对人体心、肝、肾等主要脏器具有明显保护作用[6,7,8]。

血管内皮的结构和功能对维持血管的弹性和血流畅通缺一不可, 反之, 则增加心脑血管病的风险。血管内皮细胞合成并释放一氧化氮, 以促进血管壁松弛, 抑制血小板聚集, 限制血浆纤维蛋白进入动脉血管壁, 促进其溶解, 并抑制炎症细胞浸润, 防止或延缓动脉粥样硬化。研究显示, 松针所含的花青素可明显改善血管内皮功能, 松弛动脉血管壁和增加毛细血管阻力, 增加外周血流量和改善微循环[7]。胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸是构成血管内壁和皮肤真皮组织的重要成分, 对维持血管及皮肤弹性、防止血管壁功能减退至关重要, 而胶原酶、弹性酶、透明质酸酶和葡萄糖醛酸苷酶及自由基能够分解这些重要成分, 因而可破坏血管弹性纤维及内皮细胞, 导致血管硬化或脆性增加, 产生各种心脑血管疾病、皮肤老化等。研究表明, 松针所含之花青素对弹性酶、透明质酸梅、胶原酶的活性具有抑制作用, 并可保持胶原蛋白、弹性蛋白和透明质酸等大分子物质的完整性。花青素不仅影响胶原蛋白和弹性纤维等细胞外基质的成分, 还可对构成细胞膜和某些间质细胞骨架的结构成分产生影响, 因而可保护血管内皮细胞, 维持血管壁的正常功能。

有研究显示, 以四氯化碳和醋氨酚造成大鼠急性肝损伤模型, 马尾松针提取液能降低大鼠血清谷丙转氨酶水平, 减轻肝脏组织病理损伤, 表明该提取液对大鼠肝损伤具有明显的保护作用[8]。松针所含的针叶聚戊烯醇可以明显降低肝损伤大鼠血清透明质酸、Ⅳ型胶原和MDA水平以及脾淋巴细胞增殖能力, 显著升高血清超氧化物歧化酶水平, 有效改善肝功能指标和肝组织形态, 针叶聚戊烯醇对大鼠慢性免疫性肝损伤导致的肝纤维化有明显治疗作用[9]。松针总黄酮能提高肝脏抗氧化酶活性, 降低MDA含量, 显著改善肥胖大鼠肝脏氧化应激状态[10]。松针叶绿素———胡萝卜素软膏能显著降低染汞模型组大鼠血清尿素氮以及尿汞、肾皮质汞和肝脏汞含量, 提示松针叶绿素———胡萝卜素软膏具有改善肾脏功能和去除体内汞蓄积的作用[11]。

3 对脑细胞的保护作用及对认知功能的改善

关于人体的衰老, 大脑衰退学说认为, 大脑是全身衰老的控制中心, 脑细胞是不能进行有丝分裂的细胞, 从出生至18岁, 脑细胞数量变化不太大, 而功能发育迅速, 直至成年处于相对稳定状态。但成年以后脑细胞由于衰老死亡而逐渐减少, 这也是引起人体内环境平衡失调和有关脏器功能低下的重要原因之一。研究显示, 松针制剂对脑细胞均有保护作用, 其作用机制主要为减少反应氧体系的生成、中和超氧化物歧化酶和谷胱甘肽氧化酶的活性以及降低乙醇介导的催化酶的活性等, 此外松针制剂可有效减少阿尔茨海默病患者的神经细胞的凋亡[12]。松针提取物对于过氧化产生的大鼠肾溶酶体膜损伤具有一定的保护作用[13]。

在人体老化过程中, 认知功能的减退占有十分重要的地位, 主要包括记忆力和对事物的认识、分析能力。大脑内的乙酰胆碱是与学习、记忆密切相关的重要神经递质, 而胆碱乙酰转移酶和乙酰胆碱酯酶是乙酰胆碱合成分解代谢的关键酶。研究显示, 松针乙酰乙酯提取物可明显提高大鼠脑细胞膜中的乙酰胆碱酯酶的活性, 改善细胞膜流动的活性, 表明该提取物对学习和记忆障碍具有积极改善作用。此外松针丁醇提取物也显示了可显著增加细胞膜中乙酰胆碱和胆碱乙酰转移酶和乙酰胆碱酯酶的活性, 提示该提取物在抗衰老、改善学习和记忆方面具有积极作用[14]。

4 对人体代谢有较好的调节作用

血糖、血脂异常升高对人体健康长寿的影响日益受到重视, 有动物实验显示, 松针提取物PNE可使该型糖尿病模型大鼠血清中超氧化物歧化酶SOD活性明显上升, 可使脂质过氧化的终极产物MDA含量降低。一氧化氮是一种难溶于水的脂溶性物质, 可与氧自由基结合生成毒性更强的过氧亚硝基, 促进脂质过氧化反应而加速糖尿病的进程。松针提取物可显著降低2型糖尿病大鼠的空腹血糖、三酰甘油 (TG) 及总胆固醇 (TC) 水平, 明显降低血清一氧化氮, MDA水平, 同时可提高血清SOD活性.表明PNE可显著降低2型糖尿病大鼠血糖和血脂水平, 对糖尿病大鼠具有一定的治疗作用, 其机制可能与松针抗氧化作用有关[15]。此外, 松针提取物还明显提高胰岛素敏感性, 松针可能通过改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗, 增加靶组织对胰岛素的敏感性而发挥降糖作用[16]。

松针提取液对高脂血症模型大鼠的降脂作用明显, 在饲以松针提取物后, 大鼠的TC、TG和低密度脂蛋白胆固醇均明显降低[17], 还可明显抑制大鼠脑细胞线粒体和微粒体胆固醇[18]。松针总黄酮能提高饮食诱导肥胖大鼠肝脏抗氧化酶活性, 降低MDA含量, 即松针总黄酮可显著改善肥胖大鼠的氧化应激状态, 并具有调血脂作用[19]。此外, 松针原花青素还可减缓高脂血症大鼠动脉粥样硬化的形成[20]。对实验性高脂血症家兔的研究也取得类似结果[21]。

5 对血管紧张素转化酶的调节作用

血压的正常与否直接关系到人的寿命的长短, 血管紧张素转化酶可将无活性的血管紧张素Ⅰ转化为有血管收缩活性的血管紧张素Ⅱ, 是影响血压的关键酶之一。正常情况下, 血管内皮分泌的抑制动脉硬化的物质占优势。但在病理情况下, 尤其是当血管壁已出现动脉粥样硬化病理改变时, 则血管紧张素酶Ⅱ的生成可持续增加, 反过来进一步加重动脉硬化和血压的持续升高。

花青素能够抑制血管紧张素转化酶的活性, 并可拮抗组织胺或前列腺素E诱导的的动脉收缩, 因而可存在降压作用, 而其作用方式较蛋白-多酚作用更特异。花青素的降压作用动在物实验已得到证实:以松针提取物制成的中成药可纠正高血压大鼠主动脉环对去甲肾上腺素和乙酰胆碱酯酶的异常反应, 对动脉血管有内皮依赖的舒张作用, 对钙离子的代谢具有调节作用, 因而能够调节升高的血压[22], 临床上在治疗高血压及稳定血压方面也显示出了明显的效果[23]。

6 其他作用

有研究显示, 樟子松松针中分离得到的新二萜化合物有抗肿瘤活性, 其对人类肿瘤细胞具有很强的抑制作用[24]。松针叶绿素-胡萝卜素软膏能抑制小鼠移植性S180肉瘤生长, 提高环磷酰胺化疗效果, 其机制可能与增强机体免疫功能有关[25]。马尾松针不同部位提取物对人肝癌细胞、人乳腺癌细胞、人前列腺癌细胞的细胞增殖均有一定抑制作用, 其中石油醚部位对肿瘤细胞增殖的抑制作用较强[26]。

松针的挥发油具有良好的抗菌活性, 研究显示, 赤松松针挥发性成分对大肠埃希菌、蜡状芽孢杆菌ATCC11778、鼠伤寒沙门菌、副溶血弧菌、单核细胞增生李斯特菌和金葡菌的生长均有抑制作用[27]。马尾松针水提物可破坏G+菌的细胞膜, 加大了细胞膜的通透性, 细胞内物质渗漏, 从而抑制细菌的增殖与生长[28]。红松松叶对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等均有抑制作用, 其中乙醇提取物的抗菌活性则明显强于水提取物[29]。其他如湿地松、黑松也得提取物也被发现有类似作用[30]。

7 小结

我国有丰富的松叶资源, 且再生能力强, 对其不同成分以及药效进行深入的实验研究, 具有很好的理论及实用价值。松针提取物含有多种生物活性成分, 药理作用广泛, 但目前进入临床应用的松针制剂仍然较少。随着我国老龄化程度的日益加深, 有必要对其作用机制进行更为深入的研究, 以期在老年疾病的防治过程中做出更大的贡献。

摘要：松树不仅自身长寿, 松针 (即松树的叶) 药用于人还具有抗衰老的作用。本文对松针清除自由基、保护脏器、改善认知、调节人体代谢及血压等作用进行了概述, 认为松针提取物含有多种生物活性成分, 药理作用广泛, 有必要对其作用机制进行更为深入的研究。

中医药抗衰老作用机制研究进展 篇2

1 衰老作用机制

1.1 现代医学对衰老的认识

随着医学水平的飞速发展,关于衰老的研究也有了重大突破,目前衰老的有关学说可达数十种,比如遗传程序学说(生物钟学说)、自由基学说、内分泌学说、交联学说、基因调节学说、剩余信息学说、差误成灾学说、免疫学说、DNA缺陷修复学说等。然而衰老是机体复杂的生命过程,目前国际上尚没有一种学说能阐释和涵盖衰老的作用机制和原因。但我们可以通过这些学说的生理生化指标来进行抗衰老的研究与观察评价。

1.2 中医学对衰老的认识

历代中医都非常重视研究肾精、脏腑功能和经络气血的盛衰与衰老的关系。肾精不足,或气血不足,经络之气运行不畅,脏腑功能减退,将引起机体阴阳失衡,导致并加快衰老。《素问·上古天真论》提及肾中精气充足与否和衰老有密切关系。《素问·金匮真言论》记载:“夫精者,身之本也。”《灵枢·本神》篇记载:“故生之来谓之精。”《灵枢·平人绝古》篇记载:“故神者,水谷之精气也。”朱丹溪在《格致余论》中列举了老人各种衰老征象,认为原因在于精血俱耗;宋·陈直认为老人气血渐衰,真阳气少,精血耗竭,神气浮弱。从古至今,人们一直在探索健康长寿的奥秘。中医从整体出发,“虚者补之”,研制出大量经典的中药复方,如六味地黄丸、金匮肾气丸、左归丸、右归丸等,为保持青春长驻、延年益寿的愿望提供了坚实的基础。

2 常用经典中药复方抗衰老作用机制

2.1 六味地黄丸

六味地黄丸是滋补肾阴的经典代表名方,已有研究表明调节免疫功能是六味地黄丸的主要作用之一。有研究[1]表明LWDHW的活性成分能够促使衰老小鼠脾细胞和抗体生成细胞的增殖,促进IgG的分泌,提高环磷酰胺处理的小鼠脾细胞γ干扰素的mRNA表达水平,提高佐剂性关节炎大鼠脾淋巴细胞的mRNA表达水平。试验[9]结果表明,中药复方能提高小鼠组织中GSH-Px的活性,具有较强的抗氧化和抗衰老作用。六味地黄丸通过协调肾上腺素系统和中枢胆碱能系统的作用来改善D-半乳糖致衰老大鼠学习障碍,并能改善[10]皮质酮功能紊乱。国内外研究结果报道对LWDHW改善高级神经功能,延缓衰老的作用给予了肯定。

2.2 金匮肾气丸

动物实验[3]发现:模型对照组与正常对照组比较,呈现出明显衰老的体征,体重增长缓慢(P<0.01),血清T-AOC降低极显著(P<0.01)。灌服金匮肾气丸水煎液后,模型衰老小鼠在食欲、毛色、临床与生化指标等方面得到了明显改善。推测提高小鼠体内端粒酶含量及TERT基因的表达水平可能是其抗衰老的重要原因之一。作为中药复方的金匮肾气丸,化学成分较复杂,还需进一步探讨其作用机制。

2.3 左归丸

左归丸是滋阴补肾、填精益髓的名方,亦是公认的抗衰老古方。有实验[4]采用D-半乳糖致亚急性衰老大鼠模型模拟衰老的病理变化,多方位地研究左归丸延缓衰老的作用机理,通过调节衰老相关的基因表达,具有提高免疫力、抗氧化、调节内分泌、提高应激水平、补充微量元素等作用。左归丸能改善机体氧化应激状态[5],逆转亚急性衰老大鼠总抗氧化能力(T-AOC)和过氧化氢酶GAT水平及抑制超氧阴离子自由基能力下降,降低过氧化氢(H2O2)含量,下调P16蛋白表达水平,从而具有抗衰老功效。

2.4 右归丸

有实验[6]表明,与正常小鼠相比,衰老模型Tn、Th1的比例以及BMD(骨密度仪检测股骨骨密度)明显降低(P<0.05),BMD与Tn呈显著相关;右归丸干预后,T细胞的免疫衰老程度与破骨细胞的增殖密切相关,右归丸逆转GC诱导的T细胞亚群失衡引起破骨细胞异常分化。观察自然衰老大鼠下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴功能变化,通过右归丸干扰下丘脑CRH基因表达的结果[7],与青年对照组比较,老年对照组大鼠下丘脑CRHmRNA及其多肽表达均显著增高(P<0.05)。补肾方药右归丸干预后,大鼠下丘脑CRHmRNA及其多肽、血浆ACTH及血清CORT含量显著下降,说明右归丸可能通过降低大鼠下丘脑CRH表达,进而降低肾上腺皮质分泌的CORT,起到抗衰老作用。

3 其他中药抗衰老研究进展

中药抗衰老的治疗目前主要通过药物的补泻开合作用实现,抗衰老单味中药实验研究亦较多:如独活[8]能改善D-半乳糖脑老化模型大鼠大脑皮层、海马等部位的膜老化指数,降低脑组织细胞凋亡率而增强记忆学习的能力。丹参能延长D-半乳糖致衰老小鼠的游泳时间和耐缺氧时间,从而达到延缓衰老的目的。枸杞子多糖具有改善血流速度和血液质量、降低血糖浓度,具有延缓衰老、抗氧化和抗疲劳作用。何首乌提取物可降低自然衰老大鼠的海马、心肌及血清中的MDA和LPF的含量,增加相关组织中的MnSOD活性以促进抗氧化能力,清除自由基,减少过氧化有毒物质对组织细胞的损害,从而延缓衰老过程。GSH-Px活性降低代表机体清除代谢产物的能力下降,标志衰老加快和老年疾病增多。相应剂量的补肾益寿片有较强的体外抗氧化和DNA保护功效,并且清除体内自由基等[13],补肾益寿片是否对人体也有延缓衰老的作用,值得进一步研究。小柴胡汤[14]能明显提高亚急性衰老模型大鼠血清与海马组织中的SOD活性,降低MDA和心肌LPF的含量,表明小柴胡汤具有一定抗衰老作用。滋肾益肝方[15]可清除体内的自由基,提高机体的自身抗氧化活性,减缓D-半乳糖致小鼠的衰老,提高衰老小鼠的学习记忆能力。天冬古方[16]与补气类、补阴类、补血类中药配伍应用,临床延缓衰老更加有效。紫河车[17]为人体胎盘经烘制而成,为血肉有情之品,有补肾填精、益气养血、延年益寿之功能。延寿的中药复方[11]倾向于通过TK22线虫的抗氧化胁迫,发挥抗衰老的作用机制也各异。深入开展中药及中药复方的抗衰老研究对进一步阐明中药复方抗衰老作用原理以及发掘有确切延寿疗效的补益方剂有重要意义。

4 结语

衰老是一个持续的变化过程,有机体内在因素和环境等外在因素的影响。现代人们不断适应着快节奏紧张的生活,加之一些不良的作息规律,都是加快衰老的重要原因。机体稳态的内环境是无法改变的,但通过外界条件,合理地控制引导好生活节奏,养成良好的作息习惯,为人类减缓自身衰老提供了一定的科学依据。中药复方及单味药治疗能调节脂质代谢紊乱,调整体内激素,增强机体抗氧化活力,提高神经体液免疫功能,改善能量代谢水平等,达到有效的延缓衰老、延年益寿的功效。

中医药抗衰老实验研究是目前研究的热点,但也存在一些问题。如衰老的诊断和疗效判定标准不统一;实验研究设计不太规范;动物的辨证分型与人不完全一致,使可信度降低;复方药味组成较多,使组分研究和作用靶点等机制研究的难度增大。今后可以重点研究衰老的辨证治疗与疗效的关系,将抗衰老的中医药研究同现代医学技术相结合,挖掘疗效显著的经方作用机制,为临床运用提供依据。

摘要：随着人们生活水平的不断提升,对生活质量的要求也越来越高,对如何抗衰老的认识也在进一步加深。中医药抗衰老有几千年的丰富经验,从古至今人们都在追求如何长生不老、延年益寿、青春永驻,并总结出大量独具特色的理论体系和方法。有些经典的中医药方仍然沿用至今。通过收集现代医学和中药学等关于抗衰老作用机制的文献,对近年来中药复方抗衰老研究进展进行总结。

抗衰老机制 篇3

1 材料与方法

1.1 材料

野生型秀丽线虫N2(Caenorhabditis elegans):雌雄同体,由北京生命科学研究所王晓晨实验室惠赠。

E.coli OP50:由Caenorhabditis Geneties Center (University of Minnesota,St. Paul,MN,CGC) 惠赠。该菌株不含任何抗性,是尿嘧啶合成缺陷菌株,在线虫标准培养基上生长缓慢,在显微镜下观察线虫时不会影响视野的清晰度。

槲皮素,购于中国医院集团上海化学试剂公司;五氟尿嘧啶(FUDR):SIGMA;DMSO、胰蛋白胨等其他试剂均为国产。

主要仪器设备:生化培养箱,哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;双目生物显微镜,欧林巴斯公司; 离心机,上海安亭电子仪器厂;pH计,Mettler To ledo公司;回转式恒温调速摇瓶柜,上海欣蕊自动化设备有限公司;立式压力蒸汽灭菌锅,上海华线医用核子仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 线虫的培养

参照Brenner S等[6]的方法,少量传代时挑取处于产卵期的单个雌雄同体的线虫于铺有E.coli OP50的线虫标准培养基(Nematode Growth Medium,NGM)中,20℃培养;大量传代时可使用经灼烧灭菌的手术刀片,切一块含有线虫较多的培养基,转移到新的铺有E.coli OP50的NGM培养基上,线虫会自动由食物较少的培养基边缘爬到食物较多菌苔中去。由于线虫非常容易通过培养基表面空隙钻入琼脂内,培养线虫时,尽量选择表面光滑,无气泡、划痕的培养板。

1.2.2 寿命实验

参见Lakowski B等的方法[7],将同期化后的线虫置于含或不含受试物的NGM板中,发育为L4期后的线虫转入相应浓度实验板中,每组实验样本数不少于60条,此时记为寿命实验day0;隔天探视线虫,并记录线虫生存、死亡及剔除出实验的条数。对线虫死亡判断标准:无移动及吞咽动作,轻触后仍无任何反应。剔除标准:①逃离至平皿壁或盖上而干死;②虫卵在体内孵化而成袋样虫;③钻入琼脂中。实验板中含12.5 mg·L-15-Fu及不同浓度受试物。DMSO在实验中终浓度

1.2.3热应激试验

在正常培养条件下同期培养线虫至L4期,将一定数量的雌雄同体野生型线虫挑取到NGM实验板中,NGM实验板含有高剂量的槲皮素,E.coli OP50菌体(OD600=0.2～0.3),50 μmol·L-1 5-FUdR(阻止子代线虫生长),空白组为不含槲皮素的培养基,将实验板放入35℃培养箱中培养。每隔1 h记录线虫存活、死亡、剔除的数目,直至线虫全部死亡,死亡标准同寿命实验。实验重复2～3次,取平均值做为最后结果。

1.2.4紫外照射试验

将同期化至L4期的线虫的实验培养板固定在紫外灯下进行照射,分别照射0 s、5 s、10 s、20 s、40 s、80 s,每天记录线虫死亡、存活数目。线虫死亡标准同寿命实验。紫外线波长为254 nm,紫外灯距离培养板的高度为15 cm,功率为30 w。

紫外氧化损伤实验选择照射时间40 s进行,实验分组为空白组和含有高剂量的槲皮素组,同标题1.2.2寿命实验。

1.2.5统计学分析

实验至少重复3次。结果以均值和标准差的形式给出。显著性检验以t检验为主。所有数据统计分析和制图使用Excel和SPSS16.0软件,在计算机上进行。

2 结果与讨论

2.1 寿命实验

按照1.2.2实验方法,研究槲皮素作用效果,结果见图1及表1。与空白组比较,槲皮素高、低剂量组均能使线虫的生存曲线右移并延长线虫的平均寿命及最大寿命,但低剂量组效果不显著;对照组维生素E组与空白组相比平均寿命有所提高,但最大寿命并没有显著差别;槲皮素高剂量组作用效果优于同剂量的维生素E组(p<0.05),且具有显著性差异,提高平均寿命和最大寿命百分率分别为35.97%、20%,见表1。

注:★最大寿命为群体最后生存10%的平均寿命,计算时四舍五入;与空白组比较: *p<0.001,** p<0.05;与VE组比较:△p<0.05

2.2 生殖能力实验

按照1.2.3实验方法,研究槲皮素对线虫生殖能力是否有影响,结果见图2。空白组与槲皮素组高剂量组每条虫产出的总子代数目分别为205.2±22.9(n=10),212.4±23.8(n=10)。实验组虽然高于正常对照组但并无统计学差别(p>0.05),但空白组与槲皮素高剂量组的子代总数目比较均无统计学差异。线虫在性成熟后第二天和第三天进入生殖高峰期,实验测得生殖高峰期子代数目正常对照组为114.0±4.2(n=10),槲皮素组为119.5±3.9(n=10),两组相比没有统计学差异(p>0.05),表明槲皮素对线虫的生殖能力没有影响。

2.3 氧化应激实验

研究发现,线虫高剂量槲皮素处理的同时进行35℃培养,实验组与对照组相比较,差异不显著;而槲皮素经20℃培养48 h后, 35℃进行培养则能够明显提高线虫的耐热能力。对于野生型线虫,给药48 h后35℃进行培养能够明显提高线虫的寿命(图3)。采用紫外照射40 s进行氧化损伤实验,线虫经槲皮素作用48 h后,再进行紫外照射,然后继续在含有槲皮素的培养基中培养,从图4中可知,槲皮素对紫外照射氧化损伤有一定的保护作用。

机体在压力环境下的抵抗能力被称作压力应激,寿命的延长与在压力应激状态下生存率提高具很强的正相关性[8],热应激实验和紫外辐射氧化损伤实验主要考察线虫对急性氧化损伤的抵抗能力,实验结果表明,槲皮素能显著提高线虫在两种压力环境下平均生存时间,由此推测,提高线虫在压力环境下的应激能力可能是槲皮素延长线虫寿命的作用机理之一。

Harman于1956年提出的自由基衰老理论一直在众多衰老理论中占主导地位。该理论认为衰老是细胞成份累积性氧化损伤的结果,是由自由基反应引起的,自由基参与环境、疾病和固有衰老过程有关的衰老性改变。如果某些化合物延长线虫寿命的作用与其提高线虫在氧化应激下的生存时间相关,可以推测槲皮素延缓线虫衰老效果与减少自由基形成,增加自由基清除相关。

3 结论

本文引入模式生物秀丽线虫,利用其在寿命和衰老研究上的优势,评价了槲皮素延缓线虫衰老的作用,并对其可能的作用机制进行了初步的探索。结果表明,槲皮素高剂量组能显著提高线虫的平均寿命和最大寿命,百分率分别为35.97%和20%,并且其延缓衰老的作用不以损害生殖能力为代价;提高线虫压力应激能力是其延缓线虫衰老的可能作用机理之一。

参考文献

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针灸延缓衰老的机制研究进展 篇4

1 抗自由基损伤

研究证明,衰老的主要原因是自由基导致脂质过氧化,引起细胞破裂和进行性病变,维持体内适当水平的抗氧化剂和自由基清除剂能延缓衰老。针灸能够通过提高体内的抗氧化剂和自由基清除剂水平来延缓衰老。临床研究发现,隔药灸脐法能够改善衰老的临床症状,提高血清超氧化物歧化酶(SOD)含量,降低丙二醛(MDA)含量,提示隔药灸脐法能明显延缓衰老,其机制与改善体内SOD、MDA含量有关[3]。动物实验研究中,封丽华等[4]建立亚急性衰老小鼠模型,发现艾灸能通过提高衰老小鼠SOD含量,降低MDA含量,改善自由基代谢,提高机体抗氧化能力,达到延缓衰老的目的。孙上明等[5]观察到电针涌泉穴可升高老年大鼠血清和脑组织SOD活性,降低过氧化脂质(LPO)含量,以提高内源性抗氧化能力,改善自由基代谢,而延缓衰老。林庶茹[6]通过针刺肾俞、关元穴能提高大鼠肾组织中SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,减少MDA的产生,抑制脂质过氧化反应。韦良玉等[7]研究结果显示,艾炷灸可以通过提高D-半乳糖衰老小鼠脑组织总SOD、铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)的活力,保护脑细胞免受一氧化氮(NO)自由基损害,提高学习记忆能力,延缓脑组织老化。杨春英等[8]发现针灸足三里穴能够降低皮肤组织MDA含量,增强GSH-Px活力,升高羟脯氨酸(Hyp)含量,而达到拮抗衰老小鼠皮肤衰老的目的。

2 调节细胞周期和凋亡

细胞周期是细胞生命活动的基本过程,细胞经历周期时相变迁进入增殖、分化、衰老和死亡等生理过程。细胞阻滞于G1期,不能进入S期,细胞停止增殖而衰老,失去对有丝分裂原的反应能力和合成DNA的能力[9,10],细胞的衰老最终导致机体衰老。因此,调控细胞G1/S期可能能延缓机体衰老。研究发现,艾灸肾俞可明显提高D-半乳糖诱导的亚急性衰老模型大鼠肝脏细胞蛋白激酶C(PKC)、蛋白磷酸酶2A(PP2A)的表达,使肝组织G0/G1期细胞比例降低,增殖指数(PI)增高[11]。临床研究亦显示,温和灸肾俞、关元穴可降低老年人外周血单核细胞G0/G1期细胞比例,升高PI[12]。提示艾灸可能通过降低细胞周期G0/G1期比例,升高PI,进而增加有丝分裂原的反应能力和合成DNA的能力,促使细胞进入S期而发挥延缓细胞衰老的目的。

增龄过程中由于细胞凋亡调节机制异常,使细胞凋亡加快,促进机体老化和疾病发生。抑制细胞凋亡,延缓神经元的老化可能是针灸延缓衰老的重要机制。杜艳军等[13,14]研究显示艾灸能明显降低老年大鼠海马线粒体膜电位、神经元凋亡的数量,降低海马及皮质半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的蛋白表达,有效抑制细胞凋亡的发生,延缓神经元的老化。赵果毅等[15]研究提示艾灸神阙穴能有效改善衰老,可能是通过促进衰老大鼠海马神经元Bcl-2的表达,降低Bax的表达,进而抑制细胞的凋亡,减少神经元的丢失来实现的。原淑娟等[16]观察到电针干预能显著增强大鼠脑海马组织中凋亡抑制基因Bcl-2蛋白的表达而抑制神经细胞凋亡,进而延缓衰老。王志强等[17]研究发现针灸足三里穴能上调快速衰老小鼠脑组织Bcl-2基因mRNA的表达,而抑制细胞凋亡。

3 减轻DNA损伤

DNA损伤与细胞衰老是现代生物学研究的热点。DNA如果持续损伤能引起DNA复制或翻译错误,从而导致点突变或染色体重排及经由各种信号途径引起应激反应致使细胞衰老[18]。张遵真等[19]应用臭氧照射雄性小鼠制造衰老模型,以彗星试验对小鼠肝、脾细胞拖尾率和尾长进行检测,结果发现针灸能够降低异常增加的肝、脾细胞拖尾率和尾长,提示针灸能提高机体保护DNA的能力从而起到延缓衰老的作用。研究艾灸对衰老模型鼠外周血淋巴细胞DNA损伤程度影响的实验亦显示,艾灸能够通过减轻淋巴细胞DNA的损伤程度,从而达到延缓衰老的目的[20]。此外,对增龄相关的线粒体DNA含量进行研究发现,D-半乳糖衰老大鼠肝细胞线粒体DNA含量明显增加,温和灸能减少衰老大鼠异常增加的肝细胞线粒体DNA含量而延缓衰老[21]。

4 提高免疫功能

随着年龄增长,机体免疫功能不断衰退,各种免疫相关性疾病发病率逐步提高。而针灸在防病治病、延缓衰老方面,在很大程度上是通过调节机体的免疫功能来实现的。赵粹英等[22]采用隔药饼灸治疗223例老年人,结果老年人经灸治后,衰老积分明显下降,在临床症状改善的同时细胞免疫功能增强,T淋巴细胞总数增加,CD4+/CD8+比值恢复正常,白细胞介素2(IL-2)合成分泌增加;β内啡肽(β-EP)作为免疫调节的神经介质,灸治后明显提高,提示衰老过程与免疫功能密切相关,艾灸能纠正异常免疫状态、稳定机体内环境达到延缓衰老之目的。钟兰等[23]研究显示,电热隔药贴灸神阙穴能提高老年前期大鼠红细胞C3b受体花环率(RBC-C3bRR),降低红细胞免疫复合物花环率(RBC-ICR),从而提高红细胞免疫功能,起到延缓衰老的作用。高希言等[24]研究发现艾灸督脉穴能增加小鼠的胸腺、脾脏重量,提高胸腺、脾脏指数,有效地延缓了小鼠免疫器官的萎缩退化;且能增高小鼠T细胞亚群中CD3+、CD4+,降低CD8+,升高CD4+/CD8+比率和红细胞C3b受体花环率而增强机体的免疫机能。李佳等[25]电针关元、足三里穴能升高亚急性衰老大鼠下丘脑室旁核(PVN)神经肽Y信使核糖核酸(NPYmRNA),降低血清白细胞介素6(IL-6)、PVN区IL-6R的水平,达到调节神经免疫功能的作用,进而延缓衰老。谢甦等[26]观察到艾灸衰老小鼠的关元、足三里穴能明显升高血清IL-2水平、淋巴细胞转化率、脾脏指数,降低血清IL-6水平而增强衰老机体的免疫器官功能,提高淋巴细胞转化率,从多个途径增强或改善机体免疫功能。刘建民等[27]的研究显示电针强壮穴能通过提高T细胞增殖能力、T细胞分泌IL-2及其受体水平,以及提高CD8+T细胞表面分子CD28表达等而达到调节T细胞免疫,延缓衰老的目的。

5 调节中枢神经递质

中枢神经递质的含量变化是神经系统衰老的重要标志。随着增龄,生物体中枢内胆碱能神经系统功能逐渐衰退,表现为代谢失调,受体数目和亲和力的变化,导致中枢神经生理异常[28]。艾灸能够通过调节中枢神经递质达到延缓衰老的作用。DU Yan-jun等[28]的研究发现艾灸能有效升高衰老大鼠基底神经节、海马、大脑皮质乙酰胆碱(Ach)的含量,提高乙酰胆碱转移酶(ChAT)的活性,从而达到对中枢胆碱能损害的修复作用,延缓脑老化。钟兰等[29]研究提示电热隔药贴灸“神阙”和药饼灸均能显著提高老年前期大鼠大脑皮质5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)的含量,说明灸法能通过提高大脑皮质单胺类神经递质含量而达到延缓衰老的目的。梁欣等[30]研究发现耳针、艾灸能提高D-半乳糖大鼠血清褪黑素(MT)含量,增大MT昼夜节律性振幅而发挥其抗氧化、调节免疫及生物钟等功能,从而延缓衰老;进一步的研究提示耳针延缓衰老的机制之一可能是通过减少松果体中脂褐素(LF)的积累而干预松果体的氧化损伤,延缓松果体衰退进程,从而在一定程度上延缓机体衰老[31]。王彤等[32]研究显示调补气血针法能显著提高快速老化大鼠SAMP10脑组织中的DA、5-HT、Ach含量,进而影响SAMP10脑中枢神经作用,而改善了SAMP10的神经损害,起到延缓脑衰老的作用。

6 调节内分泌

针灸对衰老机体生殖内分泌系统具有良好的调节作用。辛保玉等[33]发现天灸可增加快速老化小鼠SAMP10血清睾酮(T)含量,使E2/T比值下降,初步阐释了天灸延缓衰老的内分泌机制。刘晓艳[34]报道针灸衰老小白鼠“气海”穴,能促进性腺激素分泌,增加性腺器官重量;在调节性腺激素、性腺重量方面,针与灸无显著差异,只有经穴才是有效刺激点。李晓泓[35]的研究显示逆灸关元穴对更年期大鼠子宫退行性改变具有延缓作用,这种保护作用可能与逆灸调节子宫局部E2、孕酮(P)及雌激素受体(ER-α)表达有关。

7 调控衰老基因的表达

现已确定的与衰老和长寿相关的基因已达几十种。温廷益[36]研究显示针刺能升高快速老化鼠脑、肝细胞核活性基因、提高基因转录水平。付于等[37]发现,小鼠脑衰老与热休克蛋白84 (HSP84)、热休克蛋白86(HSP86)基因表达异常有关,针刺可以通过上调SAMPl0鼠全脑、皮层、海马中HSP84、HSP86基因表达增强细胞保护、抵抗氧化应激、抑制细胞凋亡,从而起到延缓衰老的作用。丁晓蓉等[38]对快速老化小鼠施予“益气调血,扶本培元”针法后,能逆转或部分逆转与脑老化相关的基因表达,而达到延缓脑老化的作用。于涛等[39]应用cDNA阵列技术观察到针刺能下调快速老化小鼠SAMP10中谷胱甘肽S转移酶、热休克蛋白86、成纤维细胞生长因子8、NF-kappa-B转录因子P65亚单位4个与氧化应激反应有关的基因的表达,改善氧化应激水平延缓脑衰老。樊小农等[40]的实验研究发现,醒脑开窍法针刺能提高快速老化小白鼠SAMP10脑钙调神经磷酸酶(CaN)mRNA表达水平,起到良性调节脑老化的作用。付于等[41]的进一步研究显示针刺能上调SAMP10小鼠NF-E2、YB-1、LRG47在全脑、皮层、海马中的表达,增强红细胞系统功能和细胞增殖,提高细胞抗菌免疫,从而起到延缓衰老的作用。于建春等[42]研究发现真核生物翻译起始因子EIF3-P66的表达伴增龄发生规律性的变化,可伴快速老化表达增加,而针刺可下调其表达,成为针刺延缓衰老的可能机制之一。张卫等[43]研究显示针刺对衰老大鼠37条基因的表达有显著调节,其中蛋白质合成相关基因5条,针刺通过调节衰老过程中与蛋白质合成相关基因的表达量,调节机体蛋白质的含量与组成比例,起到改善机体功能状态延缓衰老的作用。

8 调节细胞衰老信号通路

细胞衰老是指可增殖细胞在信号通路的调控下,不可逆地脱离细胞周期后进入的一种相对稳定的状态。细胞衰老是借助于信号调控机制来实现的,其中P19ARF/P53/P21CiP1和P16/Rb两条信号通路是比较公认的细胞衰老信号转导途径。处于衰老诱导信号转导途径核心位置的几个抑癌基因的产物,主要包括Rb、P53、P16INK4a、P19ARF、P21Cip1抑癌蛋白等[44]。当这些途径中的关键调节因子发生突变,细胞将发生早老或绕过衰老程序继续增殖。近年来对衰老相关通路的研究得到一定的发展,主要是从细胞衰老诱导途径中核心位置的几个抑癌基因的产物着手研究。如杜艳[45]研究发现艾炷灸能降低D-半乳糖衰老小鼠大脑皮质P16蛋白表达,增强PRb的表达而达到延缓衰老的目的。李珉等[46]电针涌泉穴能下调抑癌蛋白P53基因表达以延缓衰老;由P53控制的细胞衰老信号途径至关重要,下调P53基因的表达能有效延缓衰老。本课题组的研究发现温和灸亚急性衰老大鼠“肾俞”穴,能显著降低其肝组织中羰基蛋白的含量,并下调肝组织P19ARF、P53mRNA的表达,提示温和灸“肾俞”穴可能是通过有效调节细胞衰老P19ARF/P53/P21CiP1通路中的关键因子而达延缓衰老之目的[47]。

9 结语

针灸延缓衰老具有悠久的历史,早在《黄帝内经》中对针灸延缓衰老的理论和应用就有详细记载,其作用确切,值得深入系统地进行研究。综上所述,近十年来针灸在延缓衰老的机制研究方面得到了快速的发展,主要集中在抗自由基损伤,调节细胞周期和凋亡,修复DNA损伤,调节免疫功能,调节中枢神经递质,调节内分泌,调控衰老相关基因和衰老相关信号通路等方面,可以发现针灸延缓衰老是多靶点、多方位的,因此从不同角度、不同方面系统全面地阐释针灸延缓衰老的效应机制,仍是我们今后的研究方向。

在针灸延缓衰老的机制研究中,衰老动物模型是研究的关键。衰老模型的多样化、无法统一使得研究结果的可重复性得到质疑,衰老模型的研究亦有待于进一步开展;衰老的观察指标繁多,针灸干预衰老选穴处方亦不统一,探寻针灸延缓衰老的关键效应指标、优选穴位处方,对于针灸延缓衰老机制的阐明具有重要意义。此外,目前针灸延缓衰老的研究主要以在体实验为主,细胞离体培养的衰老相关研究相对较少;针灸调节细胞衰老信号通路的研究刚刚开展;今后针灸延缓衰老的研究,在注重在体实验研究的同时应加强离体实验研究;还要从细胞周期及其细胞衰老信号通路等方面进一步推进针灸延缓衰老的分子机制研究,丰富和发展针灸理论。

针灸延缓衰老的研究期待新的理论基础与实验技术方法的突破,不断应用现代医学的研究方法和成果进一步深入研究针灸延缓衰老的作用机制,将有助于针灸延缓衰老作用机制的全面阐明,促进针灸疗法在延缓衰老中的进一步应用与推广。

摘要：近十年来针灸延缓衰老的机制研究取得了较大进展。本文从抗自由基损伤,调节细胞周期和凋亡,减轻DNA损伤,调节免疫功能,调节中枢神经递质,调节内分泌,调控衰老相关基因和衰老相关信号通路等方面对针灸延缓衰老的作用机制进行综述,以期为针灸延缓衰老提供思路和研究证据,促进针灸疗法在延缓衰老中的进一步应用与推广。

抗衰老机制 篇5

本研究中实验人员成功培养原代人正常角化细胞,并用此细胞模型为代表研究电离辐射对人正常上皮细胞的影响,以期探讨放射治疗引起口腔黏膜炎的可能作用机制。

1 资料与方法

1.1 人正常角化细胞原代培养

收集浙江大学附属邵逸夫医院手术切除的新鲜包皮组织,参照以前发表的方法建立原代培养人正常角化细胞[3],即PBS冲洗组织,剪成小块,加入0.25%Dispase(美国GIBCO),37℃消化2 h后取上皮层加入0.25%胰蛋白酶消化液中,37℃振荡消化5 min,加小牛血清终止消化,用吸管吹打成单细胞悬液。细胞培养于专用角化细胞培养液(美国GIB-CO),置37℃5%二氧化碳饱和湿度细胞培养箱中培养。

1.2 β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老

采用碧云天公司的细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒,按照试剂盒说明操作。衰老时β-半乳糖苷酶活性水平上调而对衰老细胞进行染色检测的试剂盒。

1.3 活性氧检测

细胞用PBS清洗后,加入荧光染料CM-H2DCFDA(美国Invitrogen公司)染色30 min,CM-H2DCFDA被胞内ROS氧化产生荧光,其荧光强度可代表ROS产生水平,可在荧光显微镜(Olympus BH2-RFCA)下观察。

1.4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测

胰酶消化收集细胞,用PBS清洗后,用RNeasy Mini kit(Qiagen)按试剂说明提取RNA,用Superscript II(Invitrogen)按试剂说明进行逆转录获得c DNA,按文献3的方法检测Gp91-phox、p22-phox、p47-phox的表达情况。

1.4 免疫荧光染色

细胞用10%福尔马林固定10 min,PBS清洗后用0.5%Triton X100破膜,10%羊血清封闭1 h,分别与一抗anti-γH2AX(美国Millipore公司)和二抗Alex FluorR 488羊抗鼠IgG(美国Invitrogen公司)反应1 h,DAPI染细胞核后在荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 电离辐射引起人正常角化细胞衰老

角化细胞是一种需复杂营养的,在一般合成培养基中不易生长的细胞。实验人员用含胰岛素、上皮细胞生长因子等营养成分的专用角化细胞培养液(无血清),成功培养人正常角化细胞,细胞为多角形,散布较大的不均一细胞,β-半乳糖苷酶染色后为蓝绿色,表明是衰老细胞,占总细胞数的1%(见图1A)。2 Gy、5 Gy、10 Gy辐射后6 d,细胞体积变大,衰老死亡率分别为总细胞数的15%、60%和78%。根据常用临床放射治疗剂量,选用5 Gy作为正常组织单次治疗的耐受剂量进行以后的机制研究。

2.2 电离辐射诱导人正常角化细胞活性氧产生

电离辐射可激发水分子产生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),可以间接引起DNA损伤[4]。荧光染料CM-H2DCFDA被胞内ROS氧化产生荧光,其荧光强度可代表ROS产生水平,实验人员观察到人正常角化细胞在未受到辐射时,除少数细胞外,大部分细胞胞内CM-H2DCFDA荧光强度很弱,而在5 Gy辐射后2 h,即可见所有细胞内荧光强度增强(图2),8 h后荧光强度进一步增强,24 h后荧光强度达到峰值,72 h后仍维持较强荧光强度。这些结果表明电离辐射诱导人正常角化细胞内活性氧大量持续产生。

2.3 电离辐射诱导人正常角化细胞氧化酶基因表达增高

氧化酶基因调节细胞内活性氧产生,实验人员用PR-qPCR方法检测正常人角化细胞5 Gy电离辐射1 d后(活性氧产生达到峰值)氧化酶基因表达情况发现,Gp91-phox表达为对照细胞的9.2倍,p22-phox表达为对照细胞的10.5倍,p47-phox表达为对照细胞的35.3倍。

2.4 电离辐射诱导人正常角化细胞DNA双链断裂产生

电离辐射通过对生物大分子的直接作用和间接作用导致各种类型的DNA损伤,其中DNA双链断裂又被公认为是电离辐射导致细咆死亡的主要损伤因素。γ-H2AX对DNA双链断裂快速敏感的反应使γ-H2AX分析用于检测早期DNA双链损伤。实验人员用γ-H2AX分析方法检测电离辐射后人正常角化细胞DNA双链断裂情况发现,人正常角化细胞在未受到辐射时,细胞核染色均一,没有DNA双链损伤;而在5 Gy辐射后1 h,可见所有细胞内γ-H2AX foci荧光强度显著增强(图3)。这些结果表明电离辐射诱导人正常角化细胞内DNA双链断裂大量产生。

3 讨论

不同类型的细胞对IR的反应不同,从造血细胞、淋巴和生殖细胞等来源的肿瘤细胞对IR的反应是细胞凋亡,某些上皮来源的细胞对IR的反应是细胞衰老[4]。细胞衰老有两种不同机理:一个是复制性衰老(replicative senescence),与细胞分裂过程中端粒长度丧失相关[5];另一个是压力引起的早熟衰老(stress-induced premature senescence,SIPS),与端粒变短无关[6]。本研究表明电离辐射后正常人角化细胞大部分衰老死亡,表明正常人角化细胞对电离辐射的反应主要为细胞衰老。

放射治疗引起的口腔黏膜炎与上皮细胞损伤直接相关。DNA分子是细胞内对放射线最敏感的靶分子,在细胞辐射损伤中起重要作用。电离辐射(IR)损伤DNA有直接和间接的作用,直接作用是DNA直接吸收射线能量而遭损伤,间接作用是指细胞内水和其它分子放射性电离产生具有很高反应活性的自由基(如活性氧ROS)进而损伤DNA。

最近研究表明氧化酶Nox亚单位成员在细胞辐射反应中起重要作用。X光照射Hela细胞可引起剂量依赖的Gp91表达,导致活性氧产生引起细胞死亡[7]。紫外线照射角化细胞可激活Nox相关的氧化酶表达,引起活性氧产生[8]。本研究发现正常人角化细胞电离辐射后氧化酶基因Gp91-phox、p22-phox和p47-phox表达显著增高,同时活性氧大量产生,提示氧化酶基因高表达与细胞大量活性氧产生相关,可能与辐射引起的细胞衰老有关。

IR可引起多种DNA损伤:碱基变化(如形成AP位点)、脱氧核糖变化、双链断裂(double strand breaks,DSBs)及单链断裂(single strand breaks,SS-Bs)等[9]。DSBs为最常见和最初始的DNA损伤[10]。DSBs一旦产生,就会激活DSB修复通路和细胞周期监测点,如ATM/ATR和DNA-PK蛋白等[11]。DSBs可通过同源重组(homologous recombination,HR)修复或非同源末端连接(nonhomologous end joining,NHEJ)修复,无法修复会引起细胞凋亡或衰老死亡,这是导致细胞放射性损伤的主要原因[12]。

由于衰老细胞复制能力的丧失不可逆转,口腔表皮基底层细胞衰老导致组织再生能力丧失,延缓电离辐射后的愈合过程,这可能是放射治疗后口腔黏膜炎产生的主要原因,其机体分子作用机制仍需要深入研究。

参考文献

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抗衰老机制 篇6

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用18月龄的自然衰老雌性昆明小鼠为实验组, 体重 (40±2) g;4月龄青年雌性昆明小鼠为青年对照组, 体重 (18±1) g, 均由哈尔滨医科大学实验动物中心黄小义博士提供。将昆明小鼠做阴道细胞涂片, 连续检查2个动情周期, 无规律性周期变化者确定为自然衰老昆明小鼠, 随机分为四组, 分别为衰老对照组和白藜芦醇小、中、大剂量 (40、120、180 mg/ml) 组, 连续腹腔注射9周, 青年对照组注射等量生理盐水。

1.2 实验材料

白藜芦醇 (Sigma公司) 用二甲基亚砜 (DMSO) 配制;RPMI-1640 (Gibco/BRL公司, USA) ;Bcl-2兔抗鼠多克隆抗体、Bax兔抗鼠多克隆抗体 (武汉博士德生物工程有限公司) ;SABC (兔Ig G) -POD试剂盒 (武汉博士德生物工程有限公司) ;MTT (上海华舜生物工程有限公司) 。

1.3 实验标本采集与制备

雌性昆明小鼠末次给药24 h后, 实验动物眶内静脉取血, 取血后昆明小鼠断头处死, 迅速摘取肝细胞, 一侧置于10%甲醛溶液中固定, 常规石蜡包埋切片。

1.4 血清总SOD活力和MDA含量的测定

冰台上迅速取肝脏, 放于Carnoy溶液固定后, 制作石蜡切片, 用PBS液 (0.01 mol/L, p H 7.4) 冲洗3次, 每次5 min。H2O2室温孵育10 min, 以消除内源性过氧化物酶的活性, 室温下孵育10 min, 蒸馏水冲洗, PBS浸泡5 min。10%正常山羊血清 (PBS稀释) 封闭, 室温孵育10 min。倾去上清液, 勿洗, 滴加1∶100比例稀释的一抗, 37℃孵育1 h。PBS冲洗, 5 min×3次。滴加第二代生物素标记过的二抗工作液, 37℃或室温孵育30 min。PBS冲洗, 5 min×3次。滴加第二代辣根酶标记的链霉卵白素工作液, 37℃孵育30 min。PBS冲洗, 5 min×3次。显色剂 (DAB) 显色, 使用DAB显色试剂盒, 取1 ml蒸馏水, 加A、B、C试剂各1滴, 混匀后加至切片上, 室温显色, 镜下控制反应时间。自来水充分冲洗, 苏木精复染, 封片。治疗组除用PBS代替一抗外, 其他步骤相同。昆明小鼠处死后马上剥离肝脏, 加入组织裂解液 (50 mmol/L, Tris-HCl缓冲液, p H 7.4, 10 g/L PMSF, 0.5 mol/L EDTA) , 制成匀浆, 4℃离心30 min, 用2.5%戊二醛固定, 继续用2%四氧化锇固定, 脱水、包埋、切片和染色按常规处理, 观察拍照, 检测SOD、MDA的活性。

1.5 肝组织中Bcl-2及Bax的测定

用免疫组织化学SABC法, Bcl-2定位于核膜、粗面内质网和线粒体膜上, Bax定位于胞质。免疫细胞化学结果判定采用组织化学评分法。阳性染色为胞质内出现棕黄色颗粒, 以i代表染色深浅, 根据细胞着色的强弱分为4个等级:无着色0分, 淡黄色1分, 棕黄色2分, 棕褐色3分。该评分法可反映单个细胞是否具有阳性表达及表达强弱, 更客观地评价细胞蛋白的表达情况。

1.6 统计学分析

数据以均数±标准差 (x±s) 表示, 采用SPSS 11.0软件分析, 实验结果采用t检验, P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 昆明小鼠血清SOD活力和MDA含量的变化

40、120、180 mg/ml各组白藜芦醇与衰老对照组比较, SOD水平有升高趋势, 但差异无统计学意义, 衰老对照组昆明小鼠SOD水平低于青年对照组 (P<0.05) 。衰老对照组MDA含量显著高于青年对照组, 各白藜芦醇剂量组MDA含量均显著低于衰老对照组 (P<0.05) 。见表1。

与衰老对照组比较, *P<0.05

2.2 昆明小鼠肝细胞Bcl-2及Bax的表达情况 (图1、2)

青年对照组中昆明小鼠肝组织肝细胞形态清晰, 胞质丰富, 细胞核大而圆, 细胞生长旺盛 (图1A) ;衰老对照组中可以见到肝组织中肝细胞界限不清, 细胞核深染, 胞质中可以见到染色深的棕黄色结构 (图1B) ;白藜芦醇中剂量组可见肝组织Bcl-2表达量少的组织中棕黄色颗粒较少, Bax表达肝组织中棕黄色颗粒较多 (图1D、图2D) ;提示衰老对照组Bcl-2表达降低, Bax表达升高, 胞质中棕黄色的颗粒较多 (图2B) , Bcl-2/Bax比值明显减小, 白藜芦醇剂量组Bcl-2表达有升高趋势, 而Bax表达低于衰老对照组 (P<0.05) , 各白藜芦醇剂量组之间差异有统计学意义, 白藜芦醇剂量组Bcl-2/Bax比值高于衰老对照组 (P<0.05) , 提示120 mg/ml白藜芦醇可调控凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达和对抗自由基对肝细胞的损伤。

图1昆明小鼠肝细胞Bcl-2的表达情况 (A.青年对照组;B.衰老对照组;C.白藜芦醇小剂量组D.白藜芦醇中剂量组;DAB显色, ×400)

图2昆明小鼠肝细胞Bax的表达情况 (A.青年对照组;B.衰老对照组;C.白藜芦醇小剂量组;D.白藜芦醇中剂量组;DAB显色, ×400)

2.3 昆明小鼠肝细胞Bcl-2及Bax的表达水平

见表2。

与衰老对照组比较, *P<0.05

从表2中可以看出, 昆明小鼠衰老后Bcl-2/Bax比值减小, 昆明小鼠处于青壮年后Bcl-2/Bax比值增大, 提示肝细胞的老化与Bcl-2/Bax密切相关。白藜芦醇中剂量组 (120 mg/ml) 作用于衰老昆明小鼠后Bcl-2/Bax升高明显, 提示白藜芦醇作用于昆明小鼠肝组织后, 可以改善Bcl-2/Bax, 对衰老小鼠有一定的治疗作用。

3 讨论

白藜芦醇分子式为C14H12O3, 分子量为228.25 D, 是许多植物中存在的一种活性非黄酮类多酚化合物, 呈白色针状晶体, 难溶于水, 能溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮、DMSO等极性强的溶剂中。单药应用对晚期乳腺癌、肺癌、头颈部癌、食管癌、淋巴瘤均有一定的疗效, 被认为是一种广谱抗癌药物, 联合其他常用抗肿瘤药物, 疗效明显提高, 成为最有效的抗肿瘤药之一。自1940年该成分被发现以来, 一直受到医药界的重视。研究表明, 白藜芦醇具有抗肿瘤、抗心血管疾病、抗氧化、抗菌、抗感染、抑制血小板聚集、调节免疫等作用, 已成为科学家们高度重视的天然活性成分, 具有很大的药用价值和市场前景[4,5,6]。

细胞是否发生凋亡与凋亡抑制因子和凋亡活化因子之间的平衡密切相关。其中重要的有凋亡抑制因子Bcl-2、Bcl-XL和凋亡活化因子Bax、Bad等。bcl-2基因及其表达蛋白可明显延长细胞的存活时间, bcl-2基因位于18q21上, 约230 kb, 该基因有3个外显子和2个启动子, 指导Bcl-2蛋白的合成。Bcl-2蛋白是一个线粒体外膜蛋白, 其C端由19个氨基酸组成疏水段, 使Bcl-2蛋白可以铆钉于核膜、粗面内质网和线粒体膜上, 可能在核的运输、核微孔复合物的形成和核膜的维持等方面起重要作用。bax与bcl-2基因具有40%的同源性, 位于19号染色体, 长约4.5 kb, 有6个外显子, 指导Bax蛋白的合成。Bax增高, 促进细胞凋亡;Bcl-2增高, 抑制细胞凋亡, Bcl-2与Bax的相互作用是其中心环节[7,8]。白藜芦醇作用于衰老昆明小鼠后Bcl-2/Bax升高明显, 提示白藜芦醇作用于昆明小鼠肝组织后, 可以改善Bcl-2/Bax, 对衰老小鼠有一定的治疗作用。

SOD是体内最重要的抗氧化酶, 可明显增加O2-的歧化反应速度, 从而清除细胞内过多的氧自由基, 以减少氧自由基对细胞的损伤。如果SOD活性不足, 不能及时发挥抗氧化作用, 细胞就会受到氧自由基的攻击, 引起细胞损伤。自由基对生殖功能有很大的影响, 动物实验证实, 抗氧化酶活性下降, 氧自由基含量增多, 会导致黄体细胞凋亡, 引起黄体萎缩和凋亡, 引起卵泡闭锁[9,10]。MDA是脂质过氧化物的代谢产物, 如果细胞内氧自由基增多, 可以与细胞质膜上磷脂中的多价不饱和脂肪酸发生过氧化反应, 产生过氧化物, 过氧化物进一步裂解成具有细胞毒性的MDA。MDA有很强的生物活性, 而且化学性质较稳定, 在很低的浓度下即可明显抑制细胞内许多酶的功能, 通常用MDA来反映机体脂质过氧化的程度, 间接反映氧自由基对细胞的损伤程度[11,12]。实验发现, 衰老对照组血清SOD活力下降, MDA含量升高, 表明衰老昆明小鼠有明显的自由基损伤, 给予白藜芦醇后SOD活力虽有所升高, 但差异无统计学意义;MDA含量明显下降, 提示白藜芦醇可能通过抑制自由基的产生或直接清除自由基等途径减少自由基对细胞的损伤。