卵母细胞成熟

卵母细胞成熟（精选八篇）

卵母细胞成熟 篇1

1 犬卵泡发育的生理特性

卵泡是哺乳动物卵巢结构和功能的基本单位,卵母细胞在卵泡中发育成熟。犬卵泡发育历时170 d(由原始卵泡到排卵),卵泡最后增长开始于排卵前60～100 d,即休情期卵泡已开始增长[2]。犬卵泡颗粒细胞(GC)出现LH受体的时间比其他哺乳动物早。通常哺乳动物卵泡直径达到排卵前二分之一时才有LH受体的表达(例如牛卵泡直径达到1 cm时出现LH受体,2 cm时排卵[3]),而犬卵泡直径达到800 μm,即排卵卵泡直径的四分之一时就可检测到LH结合位点[4]。

犬卵泡黄体化不是发生在排卵后,在排卵前LH峰出现时,颗粒细胞已转化成大小黄体细胞。在发情早期(排卵前36～50 h)血清中,孕酮浓度为2 ng/mL,排卵时达到6 ng/mL。

犬多卵卵泡发生比例较高,1～2岁的雌犬中多卵卵泡的发生比例高达14%,7～11岁的雌犬中多卵卵泡的发生比例还维持在5%。由于从输卵管中冲出的卵母细胞数量大于卵巢表面黄体的数量,推测多卵卵泡可以排卵。尽管多卵卵泡可以排出多个卵母细胞,这些卵母细胞是否具有成熟、受精的能力还未被证实。通过对多个多卵卵泡卵丘卵母细胞复合体(COC)的形态及卵丘扩展现象评估,证实每个多卵卵泡中包含一个高质量的卵母细胞[5,6]。

2 犬卵母细胞成熟的生理特性

犬卵母细胞早期发育的许多超微结构变化与其他哺乳动物卵母细胞相同,但犬卵母细胞卵黄内含有大量脂类,使卵母细胞在镜下呈现黑色。卵泡生长时犬卵母细胞开始合成脂类物质,这也是卵母细胞开始成熟的标志。排卵后,犬卵母细胞外仍包裹卵丘细胞,卵母细胞在输卵管内停留较长时间,在此期间几乎不发生卵丘扩展,即使受精后放射冠仍然贴附在卵母细胞表面。

在犬、狐狸及其他犬科动物发生排卵时,卵母细胞处在第1次减数分裂前期,也就是说生发泡完整、第一极体还未排出时已排卵,因此犬卵母细胞离开卵泡后存活时间较长。排卵后卵母细胞成熟程序在输卵管内恢复,排卵后2～3 d卵母细胞成熟。

犬科动物卵母细胞卵泡外成熟时间,即在输卵管内存活的时间有种属特异性。犬卵母细胞在输卵管内长时间存活,经历成熟、受精(在输卵管峡部)、受精卵发育至胚泡期,因此至少在输卵管内滞留8.5～9 d,而不是其他哺乳动物的3～4 d。犬卵母细胞排出4 d后仍具有受精能力,因此排卵前2,3天到排卵后1周犬都可以配种,卵母细胞成熟过程中精子已可结合到卵丘卵母细胞复合体上。犬精子可在雌犬生殖道内存活11 d。

犬排卵时卵母细胞处于减数分裂前期Ⅰ,排卵后不立即恢复减数分裂。许多哺乳动物排卵前几小时,LH峰诱导生长卵泡卵丘扩展,卵母细胞减数分裂恢复(从前期Ⅰ到MⅡ期)。然而犬排卵前LH峰的功能还不清楚,LH峰持续24～72 h,LH峰后36～50 h排卵,见图1[6]。

3 犬排卵的生理特性

确定犬排卵的方法有几种,各种方法准确程度差别很大。最常用的方法是阴道涂片法,但这种方法的准确度不高。观察犬行为变化也是判断其是否排卵的一种方法,研究表明犬排卵发生在雌犬接受交配后的24～48 h。然而交配和排卵间时间差距因个体差异变化很大,通常排卵前5天到排卵后3天雌犬都接受交配。因此,依据雌犬行为不能精确判断排卵时间。

犬排卵的确切时间可以根据LH和孕酮浓度推断,LH峰的出现与排卵间的时间差距约为2 d(36～50 h)。然而LH峰的监测既耗时又昂贵,因此检测血清中孕酮浓度成为判断犬排卵的常用方法,排卵时血清中孕酮浓度为5～7 ng/mL。剖腹手术是另一种准确检测犬排卵的方法,可以打开腹腔观察卵巢表面卵泡发育情况,但这种方法对犬身体有伤害,需要麻醉,还有可能影响排卵。目前,比较常用的方法是腹腔超声波诊断法,对犬身体没有影响还可以准确检测卵泡的发育,但是临近排卵时需要每天观察2～3次。

排卵前,经一系列内源性LH峰的刺激,围绕在卵母细胞周围的紧实的卵丘细胞发生扩展,这种现象称为卵丘扩展或黏液化。犬LH峰后很短时间即发生卵丘扩展,直径为4～4.5 mm的卵泡具备发生卵丘扩展的能力[6],但是排卵后2～3 d仍有2～3层颗粒细胞紧紧包裹卵母细胞不发生扩展[6]。这说明颗粒细胞在犬卵母细胞减数分裂恢复过程中可能起重要作用。

犬排卵时,卵母细胞连同2～3 mL卵泡液排出卵泡,进入输卵管伞。排卵后44小时,卵母细胞位于输卵管中部,仍处于前期Ⅰ。排卵后48小时,卵母细胞恢复减数分裂(见图1),此时可观察到MⅠ期的卵母细胞,成熟的卵母细胞出现在排卵后48～54 h。犬卵母细胞在MⅡ期发生受精作用,但体内未成熟卵母细胞也可发生受精作用,只是比例很低(例如30只雌犬有112个MⅠ期卵母细胞发生受精作用)。犬MⅡ期卵母细胞在排卵后92～127 h降解,排卵后7天卵母细胞仍具备受精能力,9天时丧失受精能力[7]。

4 生殖激素对卵母细胞成熟的影响

卵巢内、外及卵泡内调节因子参与卵母细胞成熟,但这些调节因子是如何起作用的机理不清。哺乳动物卵泡生长主要受LH、类固醇激素作用,发情期血清中LH和类固醇激素浓度的变化能影响位于卵泡内的卵母细胞。犬发情期前血中卵泡刺激素(FSH)浓度约为100 ng/mL,排卵前LH峰出现时FSH浓度也增加。由于雌二醇负反馈作用,发情前期LH浓度非常低,几乎检测不到。排卵LH峰出现前1～2 d LH增加到8～50 ng/mL(平均20 ng/mL),雌激素水平变化很大,在发情期前或发情早期浓度达到50～110 pg/mL。

犬不同于其他家养动物的显著特点就是卵母细胞所处的卵泡内分泌环境,因排卵前卵泡颗粒细胞黄体化,孕酮浓度显著高于其他动物。犬排卵前卵泡液平均孕酮浓度(LH峰之后,血清中LH浓度达到6 ng/mL)达到7 700 ng/mL。

发情期,血清中雌激素浓度降低,孕酮浓度增加[从发情前期很低的浓度(0.8 ng/mL),到排卵前LH峰前急速增加(>1 ng/mL)]。犬血清中高浓度孕酮出现的时间与卵母细胞减数分裂恢复时间一致,因此孕酮可能在犬卵母细胞成熟过程中起重要作用,但其排卵前卵泡黄体化及孕酮分泌机制尚不清楚。一些研究表明,孕酮在卵母细胞减数分裂恢复过程中不起作用,这是由于犬卵母细胞体外成熟(IVM)时添加孕酮不能提高减数分裂恢复率[8],并且卵母细胞完全成熟时输卵管液中孕酮浓度很低。

雌激素能调节输卵管中分泌细胞的形态和功能,分泌依赖于雌激素的高分子糖蛋白,此糖蛋白是排卵、受精、胚胎早期发育时输卵管腔中主要的非血清蛋白。研究证实,犬编码输卵管中三部分糖蛋白的RNA与其他哺乳动物输卵管糖蛋白RNA高度相似。目前,输卵管糖蛋白在生殖过程中的功能还不清楚,只知道输卵管糖蛋白能导致精子获能、超激活,促进精子穿卵。

5 细胞因子对犬卵母细胞成熟的影响

多种细胞因子参与调控卵母细胞核、细胞质成熟。LH峰驱动的细胞间联系、细胞内离子组成的改变、细胞信号通路的启动导致卵母细胞核成熟启动和完成。促成熟因子(MPF)和丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)是细胞周期活化的2个主要因子。触发犬排卵后减数分裂恢复的因子还不清楚,几乎没有关于犬卵母细胞信号通路机制的报道。已有研究证实,犬卵母细胞生发泡破裂(GVBD)时MPF有活性,随后染色质重排时MPF与微观组织者有关。因此,尽管犬排卵过程很特别,但其卵母细胞成熟的生化环境仍与其他哺乳动物有很多相似之处。

通常人们认为,哺乳动物卵母细胞减数分裂恢复是颗粒细胞内高浓度的cAMP通过缝隙连接进入卵母细胞质,导致DNA去凝缩,抑制减数分裂恢复。LH峰后颗粒细胞和卵母细胞间的缝隙连接消失,卵母细胞内cAMP浓度降低,减数分裂恢复,即LH峰后卵丘细胞和卵母细胞解偶联触发减数分裂恢复[9],但犬卵母细胞减数分裂恢复的机制尚不清楚。

在犬卵丘卵母细胞复合体中,放射冠细胞发出缝隙连接通过透明带到达卵膜[10],甚至能达到核附近。犬排卵后2～3 d,卵丘颗粒细胞仍紧紧地黏附在卵母细胞周围,排卵后第2天缝隙连接开始萎缩,第3天完成颗粒细胞、卵母细胞解偶联[11]。在体外培养时,卵母细胞自发脱离,减数分裂恢复,卵母细胞中期率增加[12]。在培养液中,添加蛋白激酶A抑制因子RpAMPc和cAMP类似物——双丁酰环磷酸腺苷(dibutyryl cAMP) 都不能使卵母细胞中期率增加,因此颗粒细胞在犬卵母细胞减数分裂恢复过程中发挥重要作用,但不是以cAMP为介质。

犬卵母细胞减数分裂恢复延迟可能因缺乏某种因子导致,这种因子来源于输卵管液或卵母细胞自身合成。同其他哺乳动物一样,排卵时犬卵母细胞转录失活,排卵后27～33 h核结构重排,转录启动。基因活动时间恰巧出现在减数分裂恢复之前,有助于更好地理解犬卵母细胞减数分裂恢复。

6 结语

许多哺乳动物包括人在内,可通过体外成熟、体外受精(IVF)技术获得胚胎。然而,目前尚无通过体外受精技术获得的幼犬。犬卵母细胞体外成熟技术不成熟是限制犬科动物辅助生殖技术发展的主要原因。犬卵母细胞体外培养时多数细胞胞质发育不成熟,导致体外成熟比例非常低,只有10%～20%的卵母细胞能达到MⅡ期,其余的卵母细胞都退化了。对犬科动物卵泡发育和卵母细胞减数分裂恢复机制的深入研究将有助于体外成熟技术的发展。

参考文献

[1]CONCANNON P W.Endocrinologic control of normal canine ovari-an function[J].Reprod Domest Anim,2009,44(Suppl 2):3-15.

[2]ENGLAND G C W,RUSSO M,FREEMAN S L.Follicular dynam-ics,ovulation and conception rates in bitches[J].Reprod DomestAnim,2009,44(Suppl 2):53-58.

[3] MONNIAUX D, CARATY A, CLE’MENT F,et al.Développ ement folliculaire ovarien et ovulation chez les mammifères[J]. INRA Prod Anim, 2009, 22(2): 59-76.

[4]SAINT-DIZIER M,JAFFRN,Reynaud K,et al.Expression offollicle-stimulating hormone and luteinising hormone binding sitesin the bitch ovary during the follicular phase[J].Reprod FertilDev,2008,20(8):925-934.

[5]PAYAN-CARREIRA R,PIRES M A.Multioocyte follicles in do-mestic dogs:a survey of frequency of occurrence[J].Theriogenolo-gy,2008,69(8):977-982.

[6]REYNAUD K,VIARIS de LESEGNO C V,CHEBROUT M,et al.Follicle population,cumulus mucification and oocyte chromatin con-figuration during the periovulatory period in the female dog[J].Theriogenology,2009,72(8):1120-1131.

[7] TSUTSUI T,TAKAHASHI F, HORI T,et al.Prolonged duration of fertility of dog ova[J]. Reprod Domest Anim, 2009, 44(Suppl 2):230-233.

[8]VANNUCCHI C I,FAUSTINO M,MARQUES M G,et al.Effects ofgonadotropin-exposed medium with high concentrations of proges-terone and estradiol-17beta on in vitro maturation of canine oocytes[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim,2009,45(7):328-333.

[9]EDRY I,SELA-ABRAMOVICH S,DEKEL N.Meiotic arrest of oo-cytes depends on cell-to-cell communication in the ovarian folli-cle[J].Mol Cell Endocrinol,2006,2(1/2):102-106.

[10]LEESE H J,HUGENTOBLER S A,GRAY S M,et al.Female re-productive tract fluids:composition,mechanism of formation andpotential role in the developmental origins of health and disease[J].Reprod Fertil Dev,2008,20(1):1-8.

[11]DeLESEGNO C V,REYNAUD K,PECHOUX C,et al.Ultrastruc-ture of canine oocytes during in vivo maturation[J].Mol ReprodDev,2008,75(1):115-125.

卵母细胞成熟 篇2

关键词：绵羊；卵丘细胞；卵母细胞；RT-PCR

中图分类号： S8263文献标志码： A

文章编号：1002-1302（201412-0236-04

准确判断卵母细胞的发育能力是提高各类辅助生殖成功的必要条件，从形态学上观察卵母细胞的厚度及卵丘细胞包裹的紧密程度是评估卵母细胞质量的常用手段[1-2]，这种标准并不能真正预测胚胎的健康，需要从分子角度鉴定预测卵母细胞的功能。卵丘细胞是指在卵母细胞外周并与之进行代谢联系的颗粒细胞群，对于卵母细胞成熟有极其重要的作用，主要表现在卵丘细胞参与维持卵母细胞减数分裂阻滞、诱导卵母细胞减数分裂恢复并支持卵母细胞细胞质的成熟。卵丘细胞形态和卵丘细胞扩展影响卵母细胞成熟的同时，卵母细胞对卵丘细胞的分化及发育也起着中心调节作用。Li等研究证明卵母细胞对卵丘细胞表型和生存有重要的调节作用，对卵丘细胞增殖、扩散、分化及细胞死亡、类固醇激素分泌有显著影响[4-5]。最近，Ledda等提出，卵泡液和卵丘细胞可贮存及释放某些生长因子和某些特定蛋白质，在卵母细胞成熟及胚胎发育过程中按一定顺序表达，或通过选择性地扩散来调节胚胎生长发育[6]。鉴于卵丘细胞与卵母细胞双边通信的作用，可以推断卵母细胞的发育能力变化很可能影响卵丘细胞的表型或者基因的表达，从而通过调节这些基因的表达来提高卵母细胞的发育能力。

本研究通过RT-PCR方法，检测绵羊不同直径卵泡卵丘细胞FSHR、EGFR、GHR、bFGF、[WTBX][STBX]CYP19A[WTB][STB]、AMH基因的mRNA表达差异，以推断这些基因对卵母细胞发育能力的影响，对预测卵母细胞体外发育能力有着重要的意义。RT-PCR方法克服了通过表观参数而选择卵母细胞的不可靠性，是一个非侵入性辨别卵母细胞质量的新方法。

1材料与方法

11材料

111药品及试剂RNeasy Micro RNA提取试剂盒、QIAEX II 琼脂糖凝胶回收试剂盒，均购于QIAGEN；反转录试剂盒RNA LA-PCR（AMV、荧光实时定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex Taq、Taq DNA聚合酶、pMD19-T载体，均购于大连宝生物公司；培养用胎牛血清 （FBS、非必需氨基酸（NEAA，均购自Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA，购自Bovogen公司。

112绵羊卵泡采集绵羊卵巢来源于新疆维吾尔自治区乌鲁木齐当地屠宰场。将采集的卵巢放入37 ℃、含有09%生理盐水的保温瓶中，2 h内运回实验室；用生理盐水将成年绵羊卵巢洗涤3～4次，置于烧杯内，用注射器抽吸直径为10～20 mm、21～50 mm和>50 mm的卵泡，收集于盛有抽卵液的90 mm培养皿中。

12方法

121卵母细胞的体外成熟培养将成年绵羊GV期卵丘卵母细胞复合体（COCs按不同直径移入预先平衡好的成熟液中，在386 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下进行成熟培养，以卵母细胞周围卵丘细胞扩展程度并排出第一极体作为卵母细胞成熟的标准。

122卵丘细胞的分离在体视镜下，选取形态完好的COCs放入01%透明质酸酶中，用玻璃管在成熟培养液中反复吹打机械分离卵丘细胞；将含有卵丘细胞的成熟培养液，收集在装有15 mL PBS的离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重复1次；将卵丘细胞转入裂解液中，储存在-80 ℃冰箱中，待RT-PCR检测分析。

123卵母细胞孤雌激活挑选有极体且细胞质均匀的卵母细胞，在含5 μmol/L离子霉素（ionomycin的激活液中激活4 min；经2 mmol/L 6-DMAP培养液洗2次，移入含 6-DMAP 的培养液内培养2 h；培养液洗涤3次，移入含有600～700 μL体外培养液的四孔培养板中，CO2箱培养48 h，统计卵裂率，统计6～8 d囊胚率。CO2箱培养条件为 386 ℃、5% CO2、5% O2、90%N2及饱和湿度。

124RNA提取与cDNA逆转录合成根据QIAGEN RNeasy Micro it操作步骤提取总RNA，溶解于14 μL RNase-free水，按照大连宝生生物公司（TaaRa反转录试剂盒进行反转录：RNA 1 μL，随机引物（表11 μL，加RNAse-free水至 15 μL；置于PCR仪中75 ℃ 10 min，4 ℃ 暂停取出；立即冰浴2 min，加入Inhibitor 05 μL、5×M-MLV buffer 2 μL、dNTP mixture（each 25 mmol/L 75 μL、M-MLV酶 1 μL，42 ℃ 1 h、70 ℃ 10 min，-20 ℃保存备用。

卵母细胞成熟 篇3

关键词：绵羊,卵母细胞,体外成熟培养

自从1935年发现兔卵母细胞脱离原来的卵泡环境后会在体外自发成熟以后, 科学家便模拟体内的生长环境来促使卵母细胞在体外成熟, 拉开了卵母细胞体外培养的序幕。截止到目前, 已经通过大量的试验对许多影响因素进行了分析和研究, 并获得了有效的结果。卵母细胞的成熟质量影响着胚胎工程和体外受精等生物技术的成功与否, 如何改善卵母细胞体外成熟的质量是当前体外培养技术的一个热点。卵母细胞体外成熟是在许多因素作用下完成的, 当其中某个因素发生变化时都有可能影响卵母细胞的成熟质量。该文就影响绵羊卵母细胞体外成熟的主要因素:季节因素、绵羊年龄、卵母细胞来源、培养条件和方法、成熟培养液及其添加成分等方面进行综述, 旨在为提高绵羊卵母细胞的成熟质量和动物生物技术的研究提供全面的理论依据。

1 季节因素和绵羊年龄

1.1 季节因素

绵羊是季节性发情动物, 季节因素对卵母细胞的影响主要表现在采集卵母细胞个数多少和成熟质量方面。发情季节采集的绵羊卵母细胞数多于乏情季节, 体外成熟率也显著高于乏情季节, 这一点与许多报道的研究结果一致[1]。其主要原因是绵羊为季节性发情动物, 在发情季节有大量的卵泡生长, 并且卵泡内的FSH、LH和E2高于乏情季节, 这对卵母细胞的体外成熟培养有积极的影响作用。

1.2 绵羊年龄

对性成熟前绵羊与成年绵羊卵母细胞成熟研究结果表明, 年龄对卵母细胞体外成熟率影响无显著差异, 这与O’Brien等的研究结果一致, 但其胞质成熟是否存在差异还有待进一步研究[2]。对性成熟前绵羊与成年绵羊卵母细胞体外受精后发育潜力研究发现, 囊胚发育率成年绵羊极显著高于性成熟前绵羊[3], 其原因有待进一步研究。

2 卵母细胞来源

2.1 卵巢的贮存时间和温度

从屠宰场采集卵巢到运回实验室取卵培养, 一般最佳时间间隔为1~4h, 卵巢在体外保存温度一般为20~25℃, 在这个温度下保存对卵母细胞的体外成熟无明显影响。在4~10℃时则会显著降低卵母细胞成熟的质量, 这对卵母细胞来说是一个低温刺激, 卵母细胞会发生冷休克, 对卵母细胞发育产生明显的有害影响。朱士恩在研究不同温度保存的卵巢对绵羊卵母细胞发育能力的影响中得到了相同的结论[4]。

2.2 卵母细胞的采集方法

目前常用的方法是抽吸法和剖切法, 试验利用这两种采集方法采集绵羊卵巢卵母细胞进行体外成熟培养, 对其效果进行了对比研究。结果表明:剖切法获得的卵子数显著高于抽吸法, 而所用时间则无显著差异, 获取的优质卵母细胞的比例在剖切法中显著高于抽吸法, 剖切法中卵丘扩散率和第一极体排出率要显著高于抽吸法, 因此采集绵羊卵母细胞多用剖切法。

2.3 卵泡的大小

卵泡的大小对卵母细胞的成熟和发育能力影响比较大, 经过对来自不同直径卵泡的绵羊卵母细胞进行体外成熟研究, 大于3mm的卵泡的卵母细胞成熟率显著高于直径低于1mm卵泡的卵母细胞, 因为只有当卵泡直径达到3mm以后, 卵母细胞才具备体外成熟的能力, 才能保证完成细胞核的最后成熟和向细胞质中贮存RNA、蛋白质及其它因子。

2.4 细胞的类型和形态

大量试验结果表明, A级和B级卵母细胞具有较高的成熟率和胚胎卵裂率。裸露卵母细胞或卵丘细胞很少的绵羊卵母细胞, 成熟率为30%左右, A级和B级卵母细胞成熟率达70%以上, 这说明卵丘细胞的多少对卵母细胞体外成熟有影响, 其原因在于卵母细胞体表比要比其它细胞大的多, 单凭简单的物质扩散无法将其营养物质供应给卵母细胞, 必须借助外层的卵丘细胞以及它们之间的联结完成能量供应。

3 培养方法和条件

卵母细胞体外成熟培养多采用四孔板培养法, 将50~60个卵母细胞放入含有500μL的成熟培养液中, 培养液至少在培养箱中平衡2~4h, 最好保证将卵母细胞均匀地分散在培养液滴中。培养温度对卵母细胞体外成熟的影响很大, 在研究家畜卵母细胞体外成熟过程中, 温度大都采用38.5℃的温度环境。用5%CO2气相环境来维持培养液的酸碱度。绵羊卵母细胞在体外培养成熟时间为24h, 此时也是进行绵羊卵母体外受精的最佳时期。

4 成熟培养液及其添加成分

绵羊卵母细胞体外成熟培养体系目前以TCM-199的应用较为广泛, 应用TCM-199对绵羊的卵母细胞进行体外培养, 成熟率可达79%。通常在培养体系中添加血清、激素、卵泡液、抗氧化物质、维生素和生长因子及其它添加成分。

4.1 血清

在卵母细胞成熟中, 血清为颗粒细胞提供营养, 并防止透明带硬化。目前在体外成熟中常用的血清有胎牛血清、新生牛血清、发情牛血清和牛血清白蛋白。众多研究结果表明, 胎牛血清优于牛血清白蛋白, 而发情牛血清又优于胎牛血清。在使用胎牛血清和新生牛血清时, 要求有较高浓度的激素, 而在使用发情牛血清时需要的激素浓度较低或不需要激素。在绵羊卵母细胞成熟时用5%发情牛血清添加低浓度的激素, 或是10%的胎牛血清中添加低浓度的激素就能满足需求, 且能提高成熟质量[5]。发情牛血清中含有一定浓度的激素和促成熟因子, 能促进卵母细胞的成熟, 并且最容易获得。

4.2 激素

在卵母细胞体外成熟培养时, 培养液中添加的激素主要为FSH或LH亦或是两者的混合物, 并且证明这些激素可以促进卵母细胞的体外成熟。绵羊卵母细胞体外成熟所需的FS和LH激素浓度和绵羊所处的生理周期有密切关系, 在发情季节里低浓度的FSH和LH可以提高卵母细胞的成熟率。关于雌激素对卵母细胞体外成熟的影响, 多数学者认为E2是促进胞质成熟的重要成分, 它能促进卵母细胞成熟分裂的复始。关于激素对绵羊卵母细胞体外成熟影响的报道中, 一般是同时添加适量的FSH (10μg·mL-1) , LH (10μg·mL-1) 和E2 (1μg·mL-1) 以促进卵母细胞质的成熟[6]。

4.3 卵泡液

多数研究认为, 在卵母细胞体外成熟液中添加卵泡液, 能提高卵母细胞的成熟率, 原因在于卵泡液是卵母细胞体外发育的介质, 含有来自血清的生长因子和卵母细胞的分泌因子, 能提高卵母细胞质成熟的质量, 增加胚胎的发育能力。但是用于体外培养时会表现出对卵母细胞成熟的促进和抑制两种相反的作用, 要通过控制卵泡液的添加浓度, 清除其对卵母细胞成熟的抑制作用。孙风俊等在绵羊卵母细胞的体外成熟培养液中添加绵羊的卵泡液, 提高了成熟率[7]。

4.4 抗氧化物质

在卵母细胞体外成熟过程中, 会产生对卵母细胞成熟和胚胎发育有害的ROS, 这是引起细胞死亡的一个重要原因。ROS在细胞内的水平由过氧化物歧化酶 (SOD) 、谷胱甘肽 (GSH) 等物质中介的代谢过程控制。添加谷氨酰胺 (glutamine) 有利于细胞充分利用那些终止或降低有害氧化反应的代谢途径。半胱氨酸是合成谷胱甘肽的前体物质, 成熟液中添加半胱氨酸增加了成熟卵母细胞内谷胱甘肽的量, 提高了卵母细胞及其随后胚胎的抗氧化能力, 增强了卵母细胞的发育能力。在卵母细胞的成熟培养液中添加这些物质, 能保护细胞免受ROS的侵害, 研究结果表明添加100μmol·L-1半胱胺能显著提高绵羊卵母细胞细胞核和细胞质的成熟能力[8]。

4.5 生长因子

近年来研究生长因子对卵母细胞的成熟影响的报道比较多, 研究较多的生长因子主要有上皮细胞生长因子 (EGF) 、转化生长因子 (TGF) 、胰岛素类生长因子I (IGF-I) 和血管内皮生长因子 (VEGF) 等, 研究表明, 生长因子对卵母细胞的成熟质量有一定的促进作用。

4.5.1 上皮细胞生长因子

刘丑生等人研究证明在培养液中添加10~40ng·mL-1的EGF对绵羊卵母细胞体外成熟无显著的影响, 添加50ng·mL-1的EGF可以显著提高绵羊卵母细胞的体外成熟率和卵裂率[9]。Lorenzo[10]等认为EGF作用在于促进卵母细胞的减数分裂使其成熟。Park[11]等研究证明EGF浓度低于30ng·mL-1时对卵母细胞体外成熟没有作用。

4.5.2 转化生长因子

TGF是一组具有生物活性的多肽类物质, 这些多肽因子能诱发本来着壁依赖生长的正常细胞出现可逆性转化的表型以促使细胞生长, 也能诱导指示细胞产生可逆转化。它主要分两大类:α型TGF和β型TGF, 研究结果预示着TGFa改善了卵母细胞的成熟质量, 能够提高卵母细胞受精后进一步的发育潜能。然而TGF对卵母细胞起作用的确切机制还不是完全清楚, 它们通过相同的受体均促进了核的成熟转变和α-微管蛋白的正常分布以及CG的迁移, 与血清中某些成分相似, 改善了卵母细胞成熟的质量, 但这些还需进一步通过体外受精实验以及进一步的研究来阐明它们在卵母细胞成熟过程中的具体作用。

4.5.3 胰岛素类生长因子 (IGF-1和IGF-II)

IGF-I能增加葡萄糖和氨基酸的吸收, 抑制蛋白质降解, 刺激各种细胞的增殖和分化[12]。刘丑生等人研究证明IGF-I对绵羊卵母细胞的成熟具有双向作用, 低浓度的IGF-I对卵母细胞成熟具有促进作用, 高浓度的IGF-I对卵母细胞的成熟有抑制作用, 在成熟培养液中添加40ng·mL-1的IGF-I可以显著提高卵母细胞的成熟率和卵裂率。添加100ng·mL-1的IGF-I时, 成熟率和卵裂率显著降低[9]。

4.5.4 血管内皮生长因子

VEGF是一种促进内皮细胞增生、细胞迁徙、抑制细胞凋亡, 提高血管和微血管对大分子物质通透性的生长因子。动物试验表明其作为血管形成最关键的始动因子, 作用在早期的诱生阶段, 诱导血管内皮细胞分裂增生, 形成未完全连接的不成熟、欠稳定的原始血管, 通过血管生成素1和ephrinB2的协同作用使该血管重塑而成熟[13]。VEGF在哺乳动物生殖调控中也起着重要作用。在牛上的研究结果证明, 在培养液体中添加适量VEGF可以提高黑白花牛卵母细胞体外成熟率。在绵羊卵母细胞体外成熟培养液中添加5ng·mL-1的VEGF能有效地促进卵母细胞成熟、体外受精和胚胎早期发育[14]。但有关VEGF促进卵母细胞成熟以及胚胎体外发育的作用机理以及VEGF基因表达在不同生长时期的差异研究结果还有待于进行深入研究。

5 结论

卵母细胞成熟 篇4

1卵巢获取

通常卵巢从屠宰场获取,用含双抗的磷酸盐缓冲液( PBS) 或生理盐水在尽可能短的时间内运回实验室。卵巢的保存温度及贮存时间影响卵母细胞的体外成熟。E. M. Walters等[1]研究了不同保存温度及不同贮存时间对猪卵母细胞体外成熟的影响,结果发现,不管采用哪种温度,随着贮存时间的延长,卵母细胞的成熟率都会下降。而L. R. Abeydeera[2]研究发现,采用25 ℃运输,在5 h内卵母细胞的成熟及发育能力没有受到影响。综合分析国内外学者的研究结果,共同认可的方法是于25 ~37 ℃贮存,尽可能在短时间内将卵巢运回实验室,这对卵母细胞体外成熟影响不大。

2卵母细胞的来源

一般采用抽吸法、剖解法和机械破碎法获得卵母细胞。抽吸法一般用带18号针头的10 mL注射器抽吸直径为3 ~ 8 mm的卵泡; 剖解法是用手术刀片对卵巢表面所有卵泡进行纵横方向切剖; 机械破碎法则是用眼科剪将卵巢皮质破碎为大小在0. 5 mm以下的碎片。在3种采集方法中,抽吸法所用时间显著低于机械法和剖解法,并且剖解法和机械破碎法所获得的卵丘细胞最完整; 在体外成熟培养中,剖解法获得的卵母细胞扩散比例显著好于另外两种方法,但抽吸法获得的卵母细胞第一极体的排出比例要显著高于另外两种方法[3]。综合分析,国内外学者一般采用抽吸法获取卵母细胞。

3卵泡直径

卵母细胞只有达到一定体积才具有恢复减数分裂的能力,来自小腔卵泡的卵母细胞在核成熟方面存在缺陷,故卵泡直径的大小对卵母细胞的体外成熟也有影响。田长永等[4]研究发现: 卵泡直径在对羊卵母细胞回收效果的影响中,随着卵泡直径的增大,可用卵的比率显著升高; 并且大卵泡卵母细胞的体外成熟率显著高于小卵泡和中卵泡。说明卵泡直径对卵母细胞的体外成熟影响显著。

4培养时间

体外成熟培养的目的之一就是提供大量可供体外受精用的卵母细胞。在众多影响猪卵母细胞体外成熟的因素中,培养时间是一个很重要的因素。

在体内,猪卵母细胞于促黄体素峰出现后36 ~ 42 h达到成熟,体外培养正是建立在这一基础上的, 但培养时间因研究者的不同而存在差异,从36 h到48 h,有的甚至长达50 h。殷骏等[5]研究发现: 在进行卵母细胞体外成熟试验中,A级卵母细胞适宜培养时间为48 h; B级卵母细胞适宜培养时间为50 h; 过早成熟率和卵裂率较低,过晚则老化率较高。为探讨猪卵母细胞体外成熟的最佳时间,S. Jaroslaw等[6]研究发现,培养40 ~48 h与培养30 ~36 h比较,成熟率差异显著。这与绝大多数学者采用40 ~44 h培养大体一致。

5培养条件

培养条件主要指培养的气相、湿度和温度。目前,卵母细胞常用的培养条件为5% CO2、饱和湿度和38. 5 ~ 39. 0 ℃ 。CO2是维持培养液pH值的缓冲条件,培养液pH值一般在7. 2 ~7. 4之间,5% CO2刚好够维持pH值所需; 饱和湿度是为了避免培养液中水分的挥发而导致培养体系渗透压的变化; 卵母细胞的培养温度一般跟动物体内的温度一致,国内外学者一般都采用38. 5 ~ 39. 0 ℃。D. S. Shi等[7]研究显示: 在不同温度梯度下( 37. 0 ℃、38. 5 ℃) ,随着温度从37. 0 ℃ 增加到38. 5 ℃ ,卵母细胞成熟到MⅡ期的比例显著升高; 而且,在38. 5 ℃ 时更多的卵母细胞在0 ~ 10 h内卵裂并发育到囊胚和桑葚胚,而37. 0 ℃ 时卵母细胞在10 ~24 h才发生此现象。王超等[8]研究发现: 在37. 0 ℃和39. 0 ℃两种培养温度条件下,卵母细胞成熟率差异极显著; 37. 0 ℃ 的卵母细胞体外培养成熟率与38. 5 ℃相比差异显著,38. 5 ℃的卵母细胞成熟率与39. 0 ℃ 相比差异不显著。李兵等[9] 在辽宁绒山羊的试验中也得出类似结果。说明在卵母细胞体外成熟过程时,温度范围控制在动物的体温变化范围内适合卵母细胞的体外成熟。

6基础培养液

在卵母细胞的体外成熟试验中,mTCM和mNC- SU是最常用的基础培养液。卢晟盛等[10]研究发现, 利用mTCM +10% 猪卵泡液( pFF) 和mNCSU + 10% pFF体外培养的猪卵母细胞成熟效果优于mNCSU + 10% 胎牛血清,但这3种组成液对卵母细胞的卵丘细胞扩散和受精后的早期胚胎发育的影响差异不显著。 G. M. Mariana等[11]研究发现,在猪卵母细胞体外成熟培养中,TCM效果优于NCSU23,而且在TCM培养液中添加pFF的效果优于添加PVA。

7卵泡液和血清

卵泡液是卵泡中血清渗出物经代谢产生的物质。 在体内,卵母细胞是在卵泡内发育成熟的,作为卵母细胞生长的环境,卵泡液对卵母细胞的成熟和受精后发育潜力起着至关重要的作用。卵泡液在猪卵母细胞体外成熟试验中效果优于胎牛血清[10],不同来源的血清对卵母细胞成熟的影响也不同,在山羊卵母细胞体外成熟过程时,发情山羊血清( EGS) 效果优于胎牛血清( FBS) 。C. H. Pawshe等[12]研究显示,EGS和FBS效果没有显著差异。一些报道认为,血清的作用可能与基础培养体系及体细胞的存在有关。唐业刚等[13]在水牛卵母细胞体外成熟试验中发现,血清对水牛卵母细胞的体外成熟率没有影响,但血清对卵母细胞的早期胚胎发育有重要影响,可能是血清成分比较复杂,含激素、生长因子、细胞因子等物质。因此, 添加血清虽能普遍提高卵母细胞的体外成熟率,但可能会由于一些特性未明成分的存在而有一些固有的缺点。近年来,无血清培养体系的研究较为活跃。

8激素类添加成分

目前,绝大多数研究者在卵母细胞的体外成熟培养中,都添加各种激素或激素的混合物。在体外成熟培养的前20 h,促卵泡素( FSH) 能够延缓胚泡破裂并提高卵母细胞进入MⅡ期的比例,在猪卵母细胞体外培养48 h,前24 h在培养液中加入激素[孕马血清促性腺激素( PMSG) 和人绒毛膜促性腺激素( hCG) ], 后24 h不加激素,卵母细胞的成熟率最高,极显著高于前24 h不加激素,后24 h添加激素培养的成熟率; 也显著高于不含激素的培养液连续培养48 h的成熟率; 但与添加激素连续培养48 h组比较成熟率差异不显著,并且添加量为1 IU/mL时,成熟效果最理想[14]。在卵母细胞的体外成熟培养过程中,添加瘦素能提高卵母细胞进入MⅡ期的比率,并且能提高卵母细胞受精后发育到囊胚和桑葚胚的比例。R. M. Delos等人研究发现,在卵母细胞体外成熟培养的后半段去除激素,可以提高卵母细胞的体外成熟率。

9其他物质

卵母细胞成熟 篇5

1 材料及方法

1.1 卵巢卵母细胞的采集

将采集的卵巢置于30℃含硫酸庆大霉素的灭菌生理盐水的保温瓶, 3 h内运回实验室。用预温的生理盐水清洗卵巢, 用10 mL注射器吸取卵巢表面2～5 mm大小的卵泡, 卵泡液收集于60 mm培养皿中, 待用。

1.2 卵丘-卵母细胞复合体的体外成熟培养

1.2.1成熟液

TCM-199+ 10% FBS成熟培养基作为对照组, 分别用10、20、30、40、50 ng·μL-1EGF的成熟液培养COCs, 统计其卵母细胞的成熟率。实验结果重复3次以上。

1.2.2 收集可用于成熟培养的卵丘-卵母细胞复合体 (Cumulus Oocyte Complexes, COCs)

将收集的COCs (见图1) 在分别用5种不同的成熟液清洗3遍, 然后置于含成熟培养液的35 mm培养皿中, 在38.5℃、5%CO2和饱和湿度的CO2培养箱中培养。

1.3 成熟卵的检查

将成熟培养后22 h的COCs置于含0.2%透明质酸酶和5%FBS的H-M199中, 用100 μL的微量移液器反复吹吸, 去掉成熟卵母细胞表面的卵丘细胞, 用含5% FBS的H-M 199洗涤3次, 以排出第一极体为成熟标准, 然后于显微镜下检查成熟率。

1.4 卵母细胞的孤雌激活及发育培养

选择成熟卵母细胞, 放入含5 mmol·L-1离子霉素的H-M199中激活5 min, 然后在含2 mmol·L-16-DMAP的H-SOF培养液中, 于38.5℃、5%CO2和饱和湿度条件下培养4 h, 用SOFaa培养液洗涤3次, 然后移入以贴壁颗粒细胞为滋养层的含10%FBS的SOFaa培养液中共培养48 h, 检查卵裂率, 培养7 d后检查囊胚率。

2 结果与讨论

2.1 EGF对奶牛卵母细胞体外成熟的影响

比较了在成熟液中添加不同浓度 (0、10、20、30、40、50 ng·mL-1) EGF对奶牛卵母细胞体外成熟的影响 (见表1) 。实验发现是否添加EGF对牛卵母细胞体外成熟影响很大, 与对照相比, 添加10 ng·mL-1的EGF就可以明显提高牛卵母细胞体外成熟率和其后的囊胚率。随着EGF浓度的上升, 卵母细胞的成熟率和受精后的囊胚率也随之上升。但EGF水平的提高, 对卵母细胞成熟率的提高作用要要高于对后期胚胎发育的作用。40 ng·mL-1的EGF的卵母细胞成熟率明显高于30 ng·mL-1时的成熟率, 但囊胚率未见明显提高。

2.2 讨论

其中EGF在卵巢上主要由黄体和内膜细胞产生, 是非胚胎产生的促进胚胎发育的因子, 广泛分布于哺乳动物的多种组织, 是一种卵泡卵母细胞成熟的诱导剂[3]。EGF在卵母细胞的成熟过程中起调节作用, 它对卵母细胞的成熟分裂启动、极体排出以及受精后的卵裂均具有促进作用[4]。现已证实, EGF能诱导猪、奶牛卵丘膨胀和促进核成熟, 但对裸卵的核则不起作用[5]。Wang等[6]也认为这种作用是由卵丘细胞所介导的, 因为培养裸卵时, 添加EGF没有效果。EGF的作用机理可能与其阻断卵母细胞与卵丘细胞的联系, 从而中断cAMP的运输, 导致成熟分裂复始或者直接作用于卵母细胞。G.N.Purohit[7]等的研究证明浓度为10 ng·mL-1的EGF对水牛卵母细胞体外成熟有促进作用。本实验也发现, 少量的EGF即能提高牛卵母细胞体外成熟率。而且, 在本实验添加EGF浓度范围内, 卵母细胞的成熟率一直随EGF量的增长而提高。Coskun[8]等报道, EGF 能显著提高牛成熟卵母细胞原核的形成率、卵裂率及发育至4～8 细胞的比率。在本实验中。随着EGF浓度的上升, 体外培养卵母细胞激活后卵裂率及发育至囊胚的比率也随之上升, 但对后期发育的促进效果没有对成熟率的提高明显。在30～50 ng·mL-1浓度的EGF成熟的卵母细胞孤雌激活后囊胚率未见明显差异提高。由此看来, EGF可以显著的提高牛卵母细胞的成熟率和孤雌激活后的发育能力, 但对两者的促进能力并不完全一致。

注:同一列数字标注不同字母表示差异显著 (P<0.05) ;相同字母表示差异不显著 (P>0.05) 。

摘要：研究表明:表皮生长因子 (EGF) 对牛卵母细胞的成熟和孤雌激活后发育有促进作用。与对照相比, 添加10 ng.mL-1的EGF就可以明显提高牛卵母细胞体外成熟率、激活后的卵裂率和囊胚率。但EGF水平的提高, 对提高卵母细胞成熟率的作用要高于提高后期胚胎发育的作用。40 ng.mL-1的EGF的卵母细胞成熟率明显高于30 ng.mL-1时的成熟率, 但囊胚率未见明显提高。

关键词：牛,孤雌激活,体外培养,表皮生长因子

参考文献

[1]张晓建, 安志兴.不同添加成分对绵羊卵母细胞体外成熟的影响[J].动物医学进展, 2008, 29 (6) :28-31.

[2]王建辰.家畜生殖内分泌学[M].北京:农业出版社, 2003.

[3]Keskintepe L, Brackett B G.In vitro developmental competence of invitro matured bovine oocytes fertilized and cultured in completely de-fined media[J].Biol Reprod, 1996, 55 (2) :333-339.

[4]Lorenzo P L, Illera M J.Enhancement of cumulus expansion and un-clear maturation during bovine occyte maturation on in vitro by theaddition of epidermal growth factor and insulin like growth factor[J].J Reprod Fertil, 1994, 101 (3) :697-701.

[5]李朝军, 王斌, 范必勤.EGF促进小鼠卵母细胞体外减数分裂启动机制的研究[J].实验生物学报, 1995, 28 (2) :131-135.

[6]Wang W, Niwa K.Synergetic effects of EGF factor and gonadotropinson the cytoplasmic maturation of pig oocytes in a serum-freemedium[J].Zygot, 1995 (3) :345-350.

[7]Purohit G N, Brady M S, Sharma S S.Influence of epidermal growthfactor and insulin-like growth factor 1 on nuclear maturation and fer-tilization of buffalo cumulus oocyte complexes in serum free media andtheir subsequent development in vitro[J].Animal Reproduction Sci-ence, 2005, 87:229-239.

卵母细胞成熟 篇6

1 材料与方法

1.1 卵巢的采集

在屠宰场将被屠宰的猪卵巢立即取下,用生理盐水冲洗干净,保存于25～35℃含有青霉素(100 IU/mL)和链霉素(100 IU/mL)的生理盐水的保温瓶中,在3 h内运回实验室。预热的生理盐水洗涤卵巢至无血水为止,选择排卵点多且直径在3～6 mm卵泡的卵巢,带进无菌实验室。

1.2 卵母细胞的采集和成熟培养

使用配有12号针头的10 m L注射器从3～6 mm卵泡中抽吸卵母细胞,采卵液为TCM-199(Hank's),成熟液为自配成熟液,自配成熟液成份为TCM-199(Earle's)液0.1%,PVA 3.05 mM,D-glucose0.91 mM sodium,pyruvate 75 mg/mL,penicillin 50 mg/mL,streptomycin50 mg/mL,在每次使用之前加入药品:0.57 mM cysteine,0.5 mg/mL LH,0.5 mg/mL FSH,10 ng/mL EGF。将成熟液在培养皿中作成50 L的微滴,将卵母细胞放入成熟滴在5%CO2、38.5℃、饱和湿度的CO2培养箱中培养44 h。

1.3 实验设计

1.3.1 不同激活方法的比较

卵母细胞成熟44 h后,经消化后挑选出成熟的卵母细胞分别用2种方法进行激活。

方法1:离子酶素+6-DAMP激活法,选择排出第一极体的卵母细胞,在含5 mol/L离子霉素的TCM-199中激活5 min,用H液洗3次后,在含2 mmol/L 6-DMAP加7.5 g/mL细胞松弛素(CB)的培养液中培养4 h。取出卵母细胞用培养液洗3次,移入胚胎培养液中培养。44 h后检查卵裂率。

方法2:离子酶素+放线菌酮(CHX)激活法,选择排出第一极体的卵母细胞,在含5 mol/L离子霉素的TCM-199中激活5 min,用H液洗3次后,在含10 mmol/L CHX加7.5 g/mL细胞松弛素(CB)的培养液中培养4 h。取出卵母细胞用培养液洗3次,移入胚胎培养液中培养。44 h后检查卵裂率。

1.3.2 不同激活时间的比较

卵母细胞成熟44 h后,经消化后挑选出成熟的卵母细胞进行激活,先在5 mol/L离子酶素中作用5 min,然后在2 mmol/L 6-DMAP加7.5 g/mL CB的培养液中分别培养3 h、4 h、5 h,然后转入胚胎培养液中培养,44 h后观察卵裂,以后每24 h观察1次胚胎的发育情况并换液。

1.3.3 滋养层细胞对胚胎发育的影响

将孤雌激活后的成熟卵母细胞用成熟操作液洗涤3次,然后再用胚胎培养液洗涤3次,再分别转入添加滋养层细胞的胚胎培养盘和未添加滋养层细胞的胚胎培养盘中进行培养。48 h后观察胚胎发育情况并换液,以后每24 h观察1次胚胎的发育情况并换液。

2 结果与分析

注:均值比较时同一列无相同字母者差异显著(a-b<0.05)。

由表2可以看出,使用6-DMAP激活3 h的卵裂率、囊胚率要低于4 h和5 h组,且差异显著;但4 h与5 h组之间卵裂率和囊胚率无显著差异。

注:均值比较时同一列无相同字母者差异显著(a-b<0.05)。

由表3可以看出,在卵裂率、8细胞率和囊胚率上,添加滋养层细胞组与未添加滋养层细胞组之间无显著差异,但添加vero细胞后效果略好。

3 讨论

3.1 不同激活方法的比较

在猪上,目前常用的激活方法有钙离子载体(A23187和Ionomyein)、6-DMAP、CB、CHX、DTT、Ethanol、直流电脉冲等。离子霉素(ionomycin)是另一种Ca2+载体,由于离子霉素可以瞬间Ca2+浓度的变化,而这种变化可能会使MPF得到暂时的升高,因此须加蛋白抑制剂(如6-DMAP等)来保持MPF的较低水平。6-二甲氨基嘌呤(6-dimethylaminopurine,6-DMAP)是一种蛋白质磷酸化专一抑制剂,能够抑制蛋白磷酸化,从而降低MPF和CSF活性。细胞松弛素B(CB)是胞质分裂抑制剂,可增加细胞骨架的弹性。CHX是一种蛋白质合成抑制剂,通过作用80S的核糖体抑制肽链的转移,从而抑制蛋白质的合成[1]。单独的CHX不能使猪IVM卵母细胞活化,只有与其他刺激激素联合使用时,才能起到促进作用。这也说明,CHX是通过抑制有关蛋白质新的合成起到促进作用的。尽管各种激活方法激活卵母细胞的作用不同,但最终可能都是通过灭活卵母细胞内的MAPK激酶而诱发卵母细胞进入分裂间期的。

本研究采用不同的化学方法对猪体外成熟后的卵母细胞进行孤雌激活,结果表明,猪成熟卵母细胞采用Ionomycin+6-DAMP加CB化学激活法效果较好。

3.2 6-DMAP不同激活时间的比较

6-二甲氨基嘌呤(6-dimethylaminopurine,6一DMAP)是一种蛋白质磷酸化专一抑制剂,能够抑制蛋白磷酸化,从而降低MPF和CSF活性。也正是它抑制磷酸化作用使得纺锤体失去能量[2],从而抑制了第二极体的排放。本实验结果显示,6-DMAP作用过短或过长时间对卵母细胞的激活后的发育效果都较低,本实验确定猪卵母细胞激活后在6-DMAP中作用的适宜时间为4 h。

3.3 猪卵母细胞体外培养的研究

目前,影响哺乳动物早期胚胎体外培养的主要因素就是发育阻滞。采用细胞共同培养,能在一定程度上克服胚胎体外发育阻滞[3]。细胞的重要性可能在于:产生促有丝分裂因子;产生细胞外基质成分,促进胚胎细胞分化;可代谢或去除培养液中的胚胎毒性因子。Waston等认为,共培养的体细胞都会分泌一种与细胞类型无关的相同成分,同时又会分泌与细胞类型相关的特异性因子共同作用,促进胚胎发育,从而使得体细胞的促胚胎发育作用表现出与体细胞类型相关的特异性。本试验结果表明,单纯的PZM-5培养液与添加vero细胞的PZM-5培养液对早期胚胎发育的影响并不显著,但添加vero细胞后的效果略好。

参考文献

[1]陈大元.受精生物学-受精机制与生殖工程[M].北京:科学出版社,2000.

[2]张运海,潘登科.猪体外受精胚胎、孤雌激活胚胎以及体细胞核移植胚胎的体外培养[J].中国农业科学,2007,40(3):588～593.

卵母细胞成熟 篇7

1 材料与方法

1. 1 绵羊卵巢的收集与运输

从河北省保定市唐县屠宰场收集成年绵羊卵巢,浸泡于含有100 IU/m L青霉素和100 IU/m L链霉素的生理盐水中,约2 h运回实验室。

1. 2 培养方法( 微滴法)

在3. 5 cm培养盘中做7 个滴,100 μL成熟液/滴,50 μL发育液/滴,上覆盖3 m L左右石蜡油,每滴液中放10 ~ 15 个卵丘- 卵母细胞复合体( COCs) 或胚胎。CO2培养箱参数设置为38. 5 ℃、5% CO2、饱和湿度。

1.3卵母细胞体外成熟及胚胎发育相关溶液配制

采卵液:9.5 g/L TCM-199+5 mmol/L NaH CO3+10 mmol / L HEPES + 10 mmol / L HEPES - Na +0. 01 g / L肝素钠+ 20 m L / L胎牛血清( FBS ) +100 IU / m L青霉素+ 100 IU / m L链霉素。

卵母细胞成熟培养液: 9. 5 g /L TCM - 199 + 10%FBS + 10 mg / L卵泡刺激素( FSH) + 10 mg / L促黄体生成素( LH) + 1 mg /L雌二醇( E2) + 20 μg /L表皮生长因子( EGF ) + 1 mmol/L L - 谷氨酰胺+100 μmol / L半胱氨酸+ 0. 04 mol / L丙酮酸钠。

冻精洗涤液: 高氧液( HSOF) + 10 μg /m L肝素钠+ 3 mg /m L牛血清蛋白( BSA) 。

精子获能与受精液: 氧液( SOF) + 20% FBS +10 μg / m L肝素钠。

胚胎发育液: SOF + 1% 必需氨基酸( EAA) + 1%非必需氨基酸( NEAA) + 20 μg/L EGF + 1 mmol/L L - 谷氨酰胺+ 8 g / L BSA。

0. 1% 透明质酸酶液: 用杜氏磷酸缓冲液( DPBS)溶解透明质酸酶至其浓度为0. 1% 。

胚胎染色液: 用DPBS ( 含3% BSA) 溶解Hochest33342 配制成1 mg / m L的储存液,- 20 ℃ 保存,使用时再用DPBS稀释至其终浓度为10 μg /m L。

配制上述试剂后均使用0. 22 μm孔径针头滤器过滤除菌后分装。除特殊要求外,均于- 20 ℃冰箱中保存。E -64 对绵羊卵母细胞成熟及胚胎发育能力的影响试验所用药品除特别说明外,均购自Sigma公司。

1. 4 试验步骤

1.4.1卵母细胞的收集与培养

将卵巢浸泡于医用乙醇中5 min左右,用生理盐水清洗3次,转移至抽卵液中,采用切割法分离、收集卵母细胞。所有卵母细胞均取自直径为2~6 mm的卵泡,挑选有数层致密卵丘细胞、细胞质均匀的COCs分别放入含有0,1,5,10μmol/L E-64的成熟液中,置于培养箱中培养24 h。卵母细胞成熟以卵丘细胞扩展良好并排出第一极体作为判定标准。

1.4.2卵母细胞的体外受精

在每30μL受精液滴中放入体外成熟去掉部分卵丘的COCs,再加入终浓度为(1~3)×106/mL的获能精子,放入培养箱中精卵共孵育24 h。

1.4.3胚胎的体外发育

受精24 h后,将假定受精卵移入发育液中,培养条件为5%CO2、90%N2、饱和湿度,受精后第3天统计卵裂率,第7天统计囊胚率,试验重复4次。

1.4.4囊胚的细胞染色

将体外受精后第8天的孵化和扩张囊胚放入DPBS中洗涤3次,随后转入工作浓度为10μg/mL的Hoechst33342微滴中,于38.5℃、避光条件下染色10 min,之后用DPBS洗涤3次,转入10μL小滴中置于载玻片上,将盖玻片4个角分别涂少量凡士林压片后在暗光环境中用荧光显微镜观察染色情况,统计囊胚细胞数。

1. 5 数据的统计分析

采用SPSS 16. 0 进行单因素方差分析,利用LSD进行多重比较。

2 结果与分析

2. 1 不同浓度E - 64 对绵羊卵母细胞体外成熟效果的影响( 结果见表1)

注: 同列数据肩标小写字母相同表示差异不显著( P > 0. 05) 。

由表1 可知,对照组( 0 μmol/L ) 与1,5,10 μmol / L E - 64 试验组的卵母细胞体外成熟率分别为85. 36% 、87. 93% 、88. 81% 、87. 17% ,各组间差异不显著( P > 0. 05) ,说明在成熟液中添加E - 64 对卵母细胞成熟效果没有显著影响。

2. 2 不同浓度E - 64 对绵羊卵母细胞体外发育能力的影响(结果见表2)

%

注: 同列数据肩标大写字母完全不同表示差异极显著( P <0. 01) ,含相同大写字母表示差异不显著( P > 0. 05 ) ; 小写字母不同表示差异显著( P < 0. 05) ,小写字母相同表示差异不显著( P > 0. 05) 。

由表2 可知,对照组绵羊与各试验组相比,卵母细胞体外受精后的卵裂率差异不显著( P > 0. 05) ,但1 μmol / L E - 64 的囊胚率显著高于对照组( P <0. 05) ,5,10 μmol / L E - 64 的囊胚率极显著高于对照组( P < 0. 01) ,显著高于1 μmol/L E - 64 组( P <0. 05) ,但5,10 μmol / L E - 64 组间的囊胚率差异不显著( P >0. 05) 。说明1 μmol/L E -64 对提高胚胎发育能力具有显著作用,添加5,10 μmol/L E - 64 效果更加显著,当E - 64 浓度为10 μmol/L时对其没有影响。

2. 3 不同浓度E - 64 对囊胚细胞数的影响( 结果见表3)

注: 同列数据肩标小写字母相同表示差异不显著( P > 0. 05) 。

由表3 可知,囊胚经染色后,试验组囊胚细胞数分别为109. 67 个、113. 33 个、110. 55 个,与对照组( 114. 20 个) 相比差异不显著( P > 0. 05) 。

3 讨论

3. 1 不同浓度E - 64 与绵羊卵母细胞成熟、发育的关系

与对照组相比,虽然在成熟液中添加1,5,10 μmol / L E - 64未提高绵羊卵母细胞体外成熟率及体外受精后的卵裂率,但分别显著和极显著提高体外受精后的囊胚率。本试验结果与A. Bettegowda等[5]在牛卵母细胞体外成熟液中添加1 μmol/L、10 μmol / L E - 64 发现,其对孤雌激活胚胎和体外受精胚胎的囊胚率均有显著提高的结论一致。E - 64的浓度由5 μmol/L升高到10 μmol/L并没有进一步提高囊胚率,说明体外成熟体系的最佳浓度为5 μmol / L,因为E - 64 有低毒性,以防高浓度的E -64 对胚胎造成不良影响。 陆应林等[7]研究发现,0. 1 mmol / L E - 64 对组织蛋白酶B有强烈的抑制作用,加入0. 1 mmol/L E - 64 后组织蛋白酶B相对酶活性仅为0. 78% ,基本失活,说明E - 64 可以很好地抑制组织蛋白酶的活性。A. Bettegowda等[5]通过Real - time RT - PCR的方法揭示了组织蛋白酶mRNA的表达含量与牛卵母细胞体外发育能力呈负相关关系。而E - 64 对绵羊卵母细胞成熟及胚胎发育能力的影响试验中,添加E - 64 提高了绵羊卵母细胞的囊胚率,但其作用原因是不是通过降低组织蛋白酶的表达及活性,还需要进一步测定不同浓度E - 64处理后组织蛋白酶家族各基因mRNA的表达量、酶活性以及卵丘细胞的凋亡率等试验进行验证。

3. 2 不同浓度E - 64 对绵羊胚胎质量的影响

一般评判体外胚胎质量的优劣及后期发育潜力好坏的主要指标为: 显微镜下观察胚胎在特定发育时期的形态是否正常、发育过程是否符合培养日龄、胚胎卵裂率及囊胚发育率等,但是单纯数量上的差异及形态学上的观察并不能完全达到质控的要求。孟令君等[8]研究表明,仅从外形上观察并不能很好地评价囊胚质量,从外观上看似很好的囊胚经过同样的双重荧光染色处理后结果不同,囊胚细胞数是体现胚胎质量的重要标准之一,尤其是对囊胚内细胞团( ICM) 和滋养层细胞( TE) 的双重染色,分别计数,更能体现胚胎的质量[9]。E - 64 对绵羊卵母细胞成熟及胚胎发育能力的影响,试验采用囊胚细胞计数法进一步评判胚胎的质量,结果表明,与对照组相比,不同浓度的E - 64 对囊胚质量无显著影响,说明E - 64在体外成熟体系中并无毒副作用而且能提高绵羊卵母细胞的后续发育能力。

4 结论

卵母细胞成熟 篇8

1 材料与方法

1.1 猪卵母细胞的采集

猪卵巢收集于上海市长宁区复兴屠宰场, 将卵巢置于装有25～37 ℃含有双抗的生理盐水的保温瓶中, 2 h 内送回实验室。无菌条件下, 用37 ℃含双抗的生理盐水冲洗1 次, 37 ℃水浴保存, 待用。用带有18 号针头的20 mL注射器抽吸卵巢上3～6 mm 卵泡的卵泡液, 注入无菌捡卵杯中, 在实体显微镜下用捡卵针挑选出细胞质, 并将包裹有2 层以上致密卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体 (COCs) 用DPBS-PVA 洗卵液清洗2 次, 再用成熟培养液清洗3 次。

1.2 猪卵母细胞的体外成熟培养

将COCs 放入已经平衡4 h 的成熟培养液中, 按每400 mL成熟培养液中50～100 个COCs的标准置于四孔板培养皿, 放入39 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中, 前22 h 在含HCG (人绒毛膜促性腺激素) 、PMSG (孕马血清促性腺激素) 的成熟培养液中培养, 后 (20±2) h在不含激素的成熟培养液中培养。卵母细胞的成熟以排出第一极体为标准。

1.3 成熟培养后颗粒细胞的去除

将成熟后的猪卵母细胞放到0.1%的透明质酸酶中, 在37 ℃ 的培养箱中消化2 min, 用移液枪头反复吹打, 去除卵丘细胞。用捡卵针吸出裸卵, 在洗卵液中清洗几次, 挑选已排出第一极体且形态良好的成熟卵母细胞。

1.4 数据处理

利用回归分析及方差分析对数据做统计学分析。

2 结果

2.1 在不同成熟培养液中添加不同的物质对猪卵母细胞体外成熟的影响

猪卵泡液 (PFF) 、胎牛血清 (FBS) 与TCM-199、NCSU-23 二种基础培养液的不同组合对猪卵母细胞进行44 h体外成熟培养, 比较对卵母细胞成熟率的影响, 结果见表1。

在NCSU-23+10% FBS 和 NCSU-23+10% FBS+10% PFF 中培养的卵母细胞成熟效果最好, PFF与2种成熟液组合的成熟效果明显高于FBS 和空白对照组 (仅含TCM-199或NCSV-23) (P<0.05) ;从表1中还可以看出, NCSU-23 作为基础培养液成熟效果要比TCM-199 好 (P>0.05) 。

注:卵母细胞成熟率=MⅡ卵母细胞数/卵母细胞数;同列数据肩标字母完全不同表示差异显著 (P<0.05) , 含相同字母表示差异不显著 (P>0.05) ;括号内数据为成熟率。

2.2 添加不同的生长因子对猪卵母细胞成熟效果的影响

在NCSU-23+10% PFF的成熟液中分别添加10 ng/mL EGF、20 ng/mL IGF-1 或10 ng/mL EGF+20 ng/mL IGF-1作为成熟培养液, 研究EGF和IGF-1对猪卵母细胞成熟效果的影响, 结果见表2。

注:卵母细胞成熟率=MⅡ卵母细胞数/卵母细胞数;同行数据肩标字母相同表示差异不显著 (P>0.05) ;括号内数据为成熟率。

在成熟液中加入EGF + IGF-1 的成熟率最高, 达到了84.11%, 但是各组之间差异不显著。同时可以看出EGF对猪卵母细胞的成熟效果比IGF-1 的明显, 但是不如两者的联合使用效果更好。

3 讨论

体外基础培养液的选择关系到卵母细胞成熟率的高低, NCSU-23和TCM-199是当前应用最广、最成功的二种基础培养液, 此外还有一种较好的培养液NCSU-37[2]。试验首先比较了NCSU-23和TCM-199二种成熟培养液对猪卵母细胞成熟率的影响, 发现NCSU-23比TCM-199的成熟效果好, 但相差不大, 这与Hyun S H等[3]的结果一致。

在构成完全成熟培养液时, 还要添加一些生长因子、激素、卵泡液或者其他成分, 基础培养基和这些物质搭配后的互作对卵母细胞的生长成熟影响很大[4]。在其他条件一致的情况下, 首先比较了FBS 和PFF 2种液体与NCSU-23 和TCM-199 的配合使用对卵母细胞成熟的影响。结果发现NCSU-23 比TCM-199 理想, 特别是NCSU-23 与PFF 配合使用时效果最明显。在成熟液中添加猪卵泡液能显著提高猪卵母细胞的核成熟率、正常受精率和卵裂率[5]。孟庆刚等[6]报道用含猪卵泡液的培养液培养的猪卵泡卵母细胞的核成熟率显著高于不含猪卵泡液的对照组, 这与本试验结果相符。在无血清的培养液中培养小鼠卵母细胞, 卵母细胞的透明带硬度是在有血清培养液中的4倍, 不利于体外受精, 虽然胎牛血清对卵母细胞的成熟率没有显著影响, 但可以显著提高体外受精后的卵裂率和囊胚率[7]。Naito等报道在猪卵母细胞成熟液中添加胎牛血清, 猪卵母细胞受精后的雄原核形成率不改变甚至下降。据Zheng Y S等报道, 与不含胎牛血清 (含牛血清白蛋白) 相比, 含胎牛血清的成熟液可提高卵母细胞的核成熟率, 并提高精子穿入卵母细胞的效率, 但不影响多精子受精率。试验也对加血清和不加血清作了对比, 在其他试验条件都相同的情况下, 两者对猪卵母细胞的成熟率并没有显著差异。

另外, 发育卵泡中存在多种促生长因子及其受体, 它们同时影响卵膜细胞和颗粒细胞的增殖和分化, 并参与调节卵母细胞的成熟。在猪的卵母细胞体外成熟培养中, 使用较为广泛的是表皮生长因子、转化生长因子等。试验比较了EGF 和IGF-1 2种因子对猪卵母细胞的影响。EGF 具有多功能效应, 是一个很强的促细胞分裂因子, 可刺激多种细胞在体内和体外的增殖, 现已证实, EGF 能诱导猪卵母细胞卵丘膨胀和促进核成熟。IGF-1 是一个独特的既能刺激生长又能促进分化的多肽。

摘要：为了研究不同体外基础培养液对猪卵母细胞体外成熟的影响, 采用回归分析和方差分析的方法。结果表明:在NCSU-23+10%胎牛血清 (FBS) 和NCSU-23+10%胎牛血清 (FBS) +10%猪卵泡液 (PFF) 中培养的卵母细胞成熟效果最好, PFF与2种成熟液组合的成熟效果明显高于FBS和空白对照组 (P<0.05) 。以NCSU-23作为基础培养液成熟效果要比TCM-199好, 但差异不显著 (P>0.05) ;在成熟液中加入EGF+IGF-1的成熟率 (84.11%) 最高, 表皮生长因子 (EGF) 对猪卵母细胞的成熟效果比IGF-1明显, 但是不如两者的联合使用效果好。

关键词：猪,卵母细胞,体外成熟培养,生长因子

参考文献

[1]SUN Q Y, NAGAI T.Molecular mechanisms underlying pig oocytematuration and fertilization[J].Reproduction Development, 2003, 49:347-359.

[2]FUNAHASHI H, DAY B N.Advances in in vitro production of pigembryos[J].J Reprod Fertil Suppl, 1997, 52:271-283.

[3]HYUN S H, LEE G S.Effect of maturation media and oocytes de-rived from sows or gilts on the development of cloned pig embryos[J].Theriogenology, 2003, 59:1641-1649.

[4]ABEYDEERA L R, WANG W H, CANTLEY T C, et al.Develop-ment and viability of pig oocytes matured in a protein-free mediumcontaining epidermal growth factor[J].Theriogenology, 2000, 54:787-797.

[5]YOSHIDAM, ISHIZAKI Y, KAWAGISHI H, et al.Effects of pig fol-li-cular fluid on maturation of pig oocytes in vitro and on their subse-quent fertilizing and developmental capacity in vitro[J].J ReprodFertil, 1992, 95 (2) :481-488.

[6]孟庆刚, 张成林, 张永忠, 等.猪小腔卵泡卵母细胞体外成熟研究[J].畜牧兽医学报, 2001, 32 (3) :213-219.