致病特性（精选五篇）
致病特性 篇1
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 猪血清
来源于4个市临床上经高致病性猪蓝耳病灭活疫苗免疫的健康猪血清计400份, 原始编号分别为H61～H160、G61～G160、P61～P160、M61～M160。
1.1.2 检测仪器、设备
低温高速离心机、微量移液器、BIO-RAD iQ5 Multicolor Real-Time PCR仪、酶标仪等。
1.1.3 主要检测试剂
猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 (Nsp2 1594—1680变异株) 荧光RT-PCR试剂盒 (北京生科尚仪生物技术公司生产, 批号:20080501) , 猪蓝耳病ELISA抗体检测试剂盒 (北京爱德士元亨生物科技有限公司, 批号:094118-EE358) , 猪蓝耳病ELISA抗体检测试剂盒 (法国LSIVET SUIS PRRS A/S生产, 批号:7s3w) 。
1.2 方法
1.2.1 应用猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 (Nsp21594-1680变异株) 荧光RT-PCR试剂及方法, 对400份血清样品进行分子生物学检测, 记录并选择阳性样品备用;
1.2.2 应用二种ELISA抗体检测试剂和方法 (爱德士元亨公司和法国LSI) , 对分子生物学检测结果阳性样品进行平行检测, 记录并计算相应的检测结果。
1.2.3 对分子生物学荧光RT-PCR检测结果与对应的ELISA抗体检测结果进行比对与分析。
2 结果
2.1 荧光RT-PCR结果
分子生物学荧光RT-PCR检测血清样品400份, 结果检出猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 (Nsp2 1594-1680变异株) 核酸阳性样品33份, 编号为H126、H127、H130、H135-H137、H139、H142、H144、H149、H150、H151、H153-H157、G101、G102、G105、G106、G109、G114、G115、、P86、P87、P95、M121、M124、M125、M129、M130、M154, 具体结果记录见图1～5。
(H126、H127、H130、H135-H137、H139、H142、H144、H149、H150、H151、H153-H157)
(G101、G102、G105、G106、G109)
(G114、G115)
(P86、P87、P95)
(M121、M124、M125、M129、M130、M154)
2.2 ELISA试验结果
应用爱德士元亨公司ELISA抗体检测试剂和方法, 检测分子生物学阳性样品33份, 结果抗体阳性样品22份、阴性样品11份, 阳性率为22/33;应用法国LSI公司ELISA抗体检测试剂和方法, 检测分子生物学阳性样品33份, 结果抗体阳性样品22份、阴性样品11份, 阳性率为22/33。具体结果见表1。
3 讨论与小结
3.1 对33份高致病性猪蓝耳病病毒核酸阳性样品进行两种ELISA抗体检测, 结果22份样品均为抗体阳性, 阳性率为22/33, 表明高致病性猪蓝耳病病原与抗体在猪血清中可同时检出。据此推断, 高致病性猪蓝耳病病毒抗原与抗体在猪体内未发生通常性的免疫学反应, 而是彼此共存、互不干扰。这种共存问题的机制至今尚未搞清, 笔者根据掌握的资料分析, 认为抗原与抗体共存的原因可能有如下4个方面: (1) 检测的2种抗体均不具有与病毒抗原结合的能力; (2) 病毒抗原隐藏于感染的靶细胞内, 不能直接与抗体作用; (3) 由于某种干扰因素如抗原决定簇相互排斥作用, 使猪体内的抗体, 特别是中和抗体, 不能识别并结合相应的抗原; (4) 存在抗体依赖性病毒增强作用 (ADE作用) , 使抗原与抗体之间的关系变得不是相互排斥, 而是相互促进。
注:I PRC值>20时, 判为抗体阳性, I PRC值≤20时, 判为抗体阴性;S/P值≥0.4时, 判为抗体阳性, S/P值<0.4时, 判为抗体阴性。
3.2 应用爱德士元亨公司ELISA试剂检测的抗体类型主要是高致病性猪蓝耳病病毒的核衣壳抗体, 即N抗体;应用法国LSI公司的ELISA试剂检测的主要抗体类型是病毒囊膜蛋白诱导产生的、具有中和作用的GP5抗体;2种抗体诱导产生的时期不尽相同, 其中N抗体在感染或免疫后早期可以检出, 而GP5抗体一般在感染或免疫后3～4周才可检测到。从2种抗体检测方法的结果分析, 被检猪只可能为临床建康带毒 (感染带毒或免疫后带毒) 猪, 而且带毒至少达3周以上。
3.3 检测表明, 单一以高致病性猪蓝耳病抗体检测的方法和结果, 作为评价猪群高致病性猪蓝耳病免疫效果的标准, 具有不确定性, 不能说明猪或猪群的实际健康状态, 只能作为感染或疫苗免疫后抗体阳转与否的提示或参考;而进行该病的病原学监测, 是评价该病防控效果的一种较为客观的方法。
3.4 试验研究提示, 进行高致病性猪蓝耳病灭活疫苗免疫的效果具有一定的局限性, 主要体现在疫苗免疫后, 虽有抗体产生, 但不能有效阻止病毒入侵。由此可见, 在该病免疫上, 如何建立起细胞免疫机制十分重要。
致病特性 篇2
关键词：鲈鱼；可疑性致病真菌；分离鉴定；生物学特性
中图分类号： S917.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0187-03
收稿日期：2013-05-08
基金项目：贵州省科技创新人才团队建设项目[编号：黔科合人才团队（2012）4004]；贵州省遵义市科技局项目[编号：遵市科合社字（2009）26号]。
作者简介：魏福伦（1964—），男，贵州习水人，高级实验师，主要从事经济动物饲养及病害预防的教学和研究工作。E-mail：1050089863@qq.com。
通信作者：王庆容，副教授，主要从事鱼类分子生物学及病害预防的研究工作。E-mail：wqr_1025@163.com。鲈鱼（Lateolabrax japonicus）属于脊索动物门、鱼纲，别称花鲈、鲈板、花寨、鲈子鱼，为常见的经济鱼类之一，也是发展海水养殖的品种[1]。它主要生活在近岸浅海中下层，常栖息于河口咸淡水处，也可生活于淡水中。春夏间幼鱼有成群溯河习性，冬季返归海中，主食鱼、虾类。真菌性疾病是困扰鲈鱼养殖较严重的病害之一[1]，其危害遍及鲈鱼身体的各个部分，但最常见的危害部位是体表，所以对鲈鱼体表寄生的真菌进行分离和鉴定显得尤为重要。
真菌是与人们的生产和生活密切相关的类群，许多种类可以食用和药用，但也有有害的一面，如引起人、畜中毒，尤其是引起皮肤病和内脏病等。为了更好地开发利用或预防它们，对它们作出准确的鉴定尤为必要。大部分菌物的种类多、分布广、形态特征复杂，且少数生理生化指标和形态特征会随着环境的变化而不稳定，导致鉴定费时费力并且不准确。随着生物技术的发展，尤其是分子生物学和生物信息学等相关学科的迅速发展，一系列分子生物学方法逐渐被应用到真菌的分类鉴定中[2]，其中rDNA序列分析是目前真菌分类鉴定中常用的方法，它通过测定真菌rDNA序列的一级结构，将其输入GenBank数据库与同源序列比较来确定其种属关系。将传统分类方法与分子鉴定相结合，可以使真菌分类鉴定更加快速、稳定、可靠。本研究以患病鲈鱼为材料，先扩增分离所得菌株的18S rRNA基因，测定其序列，将测序结果输入GenBank数据库，通过同源性比对确定该菌株所在的属，再根据其形态特征和显微结构鉴定到种。在此基础上，初步研究它们在不同温度和pH值的生长状况，为更好地开发利用或预防它们提供理论基础。
1材料与方法
1.1材料
乌江偏岩河段网箱养殖场的病害鲈鱼。
1.2菌株的分离和培养
选取几条体表有真菌侵害症状的鲈鱼，分别用无菌水清洗后，用灭菌棉签蘸取损伤部位，用划线法接种到的PDA平板上（每次接种设3个重复）。25 ℃培养，待其长出菌落后，挑取菌落划线转接到另一PDA平板上，多次转板直到培养基上只生长1种菌落。
1.3菌株的分子鉴定
1.3.1真菌DNA的提取将筛选出的真菌接种于PDA平板培养基上常温下培养3 d，从平板上挑取新鲜菌丝放于研磨锅中，加入700 μL的2%CTAB溶液，用灭菌石英砂研磨菌丝体，转移于2 mL的EP管中，在恒温水浴锅上于65 ℃下保温30 min（每10 min振荡1次），离心加等体积氯仿-异戊醇混合液（氯仿 ∶异戊醇体积比24 ∶1）轻轻充分摇匀，4 ℃ 12 000 r/min 离心10 min。取上清液至一新EP管中，加等体积的异丙醇在常温下静置30 min，12 000 r/min离心10 min。取上清液至一新EP管中，加2倍體积的75%乙醇沉淀DNA，7 500 r/min 离心5 min，倒去上清液后，在室温下晾干，将DNA溶解于50 μL TE缓冲液中，-20 ℃保存备用。
1.3.218S rRNA基因的PCR扩增扩增使用的引物是通用引物NS1与NS6[3]，NS1引物序列为5′-ACCGGAATTCGCCTGAGAAACGGCTACCAC-3′，NS6引物序列为5′-ACCGGAATTCGGCAGGAGCGTAATCAACGC-3′。PCR 扩增体系（50 μL）：10 μmol/L引物各2 μL，Taq 酶 0.5 μL，dNTP 4 μL，10× buffer 5 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 34.5 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，59 ℃复性 50 s，72 ℃ 延伸1 min，35 个循环；72 ℃再延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送上海生工生物工程有限公司测序，测序引物为扩增引物，测序方法为引物行走法。
1.3.3菌株的分子鉴定将菌株的18S rRNA基因序列输入GenBank数据库，用BLAST工具对序列进行同源性比对分析，同时用MEGA 5.1进行分子发育系统树的构建。
1.4菌株的形态学鉴定
将真菌接种到PDA培养基上，25 ℃恒温培养3～12 d，每天观察菌落形态与颜色，再在显微镜下观察其产孢结构、分生孢子梗着生情况及孢子形态、大小、颜色等。
1.5菌株的生物学特性初步研究
nlc202309041843
1.5.1菌株在不同温度的生长状况将真菌接种在PDA培养基上，在不同温度（5、10、15、20、25、30、35 ℃）下培养3～12 d，观察菌株的生长状况。
1.5.2菌株在不同pH值下的生长状况将真菌接种在pH值4、5、6、7、8、9，10、11的PDA培养基上，在25 ℃下培养 3～12 d，观察菌株的生长状况。
2结果与分析
2.1鲈鱼体表可疑性致病真菌的分离结果
从鲈鱼体表一共分离出7株可疑性致病真菌，根据菌落形态及颜色选择3株，分别编号为鲈体表1、鲈体表3、鲈体表7。
2.2菌株18S rRNA基因的PCR扩增及分子鉴定结果
3个菌株18S rRNA基因的PCR扩增结果见图1，3个菌株都扩增出约1 500 bp的片段。将3个菌株18S rRNA基因序列提交到GenBank数据库中（鲈体表1的登录号为KC977560，鲈体表3的登录号为KC977562，鲈体表7的登录号为KC977559），分子鉴定结果见表1。将3个菌株18S rRNA基因序列与NCBI数据库中的同源序列用MEGA 5.1软件构建系统发育树（图2）。从表1和图2可以看出，鲈体表1属于枝孢属，鲈体表3和鲈体表7属于毛霉属。
2.3菌株的形态观察
2.3.1鲈体表1的形态特征在PDA培养基上，菌落直径为1.30～1.45cm，鼠灰色绒毛状，中央高凸，呈纽扣状，表面
有不规则皱褶，37℃生长良好。在Sabouand培养基上，菌落稍大，灰棕色绒毛状，背面黑色（图3-a）。菌丝灰棕色，丛
生，不分隔（图3-b）。分生孢子椭圆形、枝孢梨形、链生，形成弯曲的芽生孢子短链（图3-c、图3-d）。依据形态学特征，结合分子鉴定结果，初步鉴定该菌株为丛梗孢目（Miniliales）、暗色孢科（Dematiaceae）、枝孢属（Cladosporium）的斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum）[4]。2.3.2鲈体表3的形态特征在PDA培养基上，菌丝生长迅速，无假根，孢子囊梗不成束，单生，繁密成层，直立，孢子囊梗分枝，全部顶生孢子囊（图4-a）；菌丛较高，软弱，先呈白色，后变灰色或褐色；孢子囊梗多分枝，常无菌丝孢子，囊膜易融化，主梗不作轴状分枝。孢子囊多孢子，灰褐色，有囊轴（图4-b）；孢子囊大，球形，孢囊孢子形状不规则，卵形至圆形，壁薄，平滑（图4-c）。依据形态学特征，结合分子鉴定结果，初步鉴定该菌株为毛霉目（Mucorales）、 毛霉科（Mucoraceae）、 毛霉属（Mucor Micheli ex Fries）的变孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）[5]。
2.3.3鲈体表7的形态特征在PDA培养基上培养 3～12 d，菌丝萌发时白色，后变为黄色转褐色，背面砖红色。菌丝生长迅速，无假根，孢囊梗不成束，單生，繁密成层，直立，菌丝全部顶生孢子囊，褐色，孢子囊梗长，合轴分枝（图5-a）；孢子囊大，球形，顶生，囊柄易凋萎（图5-b）；孢子囊多孢子，球形，含孢子甚多，灰褐色，有囊轴；孢囊孢子椭圆形，壁薄，平滑（图5-c）。依据形态学特征，结合分子鉴定结果，初步鉴定该菌株为毛霉目（Mucorales）毛霉科（Mucoraceae）、毛霉属（Mucor Micheli ex Fries）的锈色毛霉（Mucor rufescens Fischer）[5]。
2.4可疑性致病真菌的生物学特性
2.4.1不同温度对3种真菌生长速率的影响由表2可以看出，不同温度条件下不同真菌的生长速率不同：3种菌株在5 ℃时都基本不萌发，在一定温度范围内，随着温度升高，真菌生长速率加快，25 ℃左右是真菌生长的最适温度。37 ℃以上时，枝孢属的鲈体表1生长旺盛，生长速率几乎不受影响，而毛霉属的鲈体表3和鲈体表7几乎不能生长。
表2不同温度对3种真菌生长速率的影响
菌株编号1不同温度下的生长速率（cm/d）5 ℃110 ℃115 ℃120 ℃125 ℃130 ℃137 ℃鲈体表11—1—10.2310.2510.3810.3710.40鲈体表31—10.5211.2211.5412.4511.831—鲈体表71—10.5111.1211.4012.0111.731—
2.4.2不同pH值对3种真菌生长速率的影响由表3可以看出，不同pH值条件下不同真菌的生长速率不同：3种菌株在pH值为4～7时均能生长，鲈体表1和鲈体表7在pH值为5时生长最快，鲈体表3在pH值为6时生长最快，在其他pH值条件下生长速率有所下降。总体来说，分离到的3种菌
3讨论
从患病鲈鱼体表中共分离出7株真菌，根据菌落形态及颜色选择3株，分别编号为鲈体表1、鲈体表3、鲈体表7，根据分子鉴定结果和系统发育分析，初步鉴定出鲈体表1属于枝孢属（Cladosporium），鲈体表3和鲈体表7属于毛霉属（Mucor Micheli ex Fries）。再结合形态学特征和显微结构特点，进一步确定鲈体表1为斑替枝孢霉（Cladosporium bantianum），鲈体表3为变孢毛霉（Mucedo alboater Naumov）， 鲈体表7为锈色毛霉（Mucor rufescens Fischer）。真菌的种类多、分布广、形态特征复杂，且少数形态特征和生理生化指标随着环境的变
化而不稳定，可能造成鉴定结果有一定偏差，增加了鉴定难度，今后可以尝试用多种培养基进行培养，以求增加鉴定结果的可靠性。
对分离并鉴定的3种菌株进行生物学特性的初步研究，将菌株接种到PDA培养基上，在不同温度下恒温培养，发现毛霉生长的最适温度是25 ℃左右，低于5 ℃或高于37 ℃均不生长；低于10 ℃时枝孢霉菌丝不萌发生长，而高于37 ℃对其生长影响不大。将菌株接种到不同pH值的PDA培养基上，于25 ℃恒温培养，发现分离到的3种菌株生长的最适pH值是中性偏酸性。
鲈鱼体表常见的真菌性疾病是水霉病，病原是水霉科的某些种类[6]。本研究从鲈鱼体表的病害部位采集标本，共分离到7种菌株，根据肉眼观察菌落形态进行取舍，在筛选出的3种菌株中没有水霉，可能人为取舍时将水霉丢掉了，也可能是因培养基种类的原因而没有分离到水霉。筛选出的3种菌株中，斑替枝孢霉在人体主要引起脑部的暗色丝孢霉病，肺部和皮肤感染较少见[7]，也没有见到在鱼体上分离到的报道。毛霉属的某些种类能引起人类或其他动物患皮肤病，但变孢毛霉和锈色毛霉是否能引起鲈鱼患皮肤病还有待于进一步确认。
参考文献：
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致病特性 篇3
一、梨黑斑病的侵染与发生规律
1. 侵染途径与症状
(1) 侵染途径
经花侵入途径。从花序伸出期至果实采收期, 定期对花组织、萼心室间及心室进行分离培养, 统计带菌情况结果表明, 在花序伸出期, 边花上已带菌, 在初花期的萼片上先发现链格孢, 随后便在花瓣、花柱中分离出来, 并且随着暴露时间的延长, 花带菌率迅速增高。落花后对果实的萼筒至心室组织分段分离培养, 发现萼室间和心室依次出现链格孢, 其带菌率也随着果实的发育而逐渐升高, 至采收期萼室间和心室的链格孢带菌率分别达到95%和45%[6]。各段组织带菌率以萼筒段最多, 萼室间次之, 心室最少从花和果实各段组织发病时期和带菌率的增长过程可以看出, 链格孢先定殖于花柱, 随后经萼室间组织蔓延进入果心[6、7]。
经果皮侵入途径。花后2周果实果皮中已开始带菌, 而引起苹果梨黑斑病的链格孢只有到果实膨大前期才迅速增加[6]。开始, 萼端和梗端果皮链格孢带菌率分别为16%和4%, 随着果实进一步发育, 果皮带菌率均增加。其中梗端果皮带菌率在果实膨大期间增长缓慢, 在膨大至采收过程中, 其带菌率大大增加, 由原来的10%迅速增长到48%, 比采收期萼端 (40%) 和胴部 (24%) 均高, 而胴部果皮带菌率平稳增长。果肉组织只有萼端部位在果实膨大期出现链格孢, 并且其带菌率无明显规律性。苹果梨黑斑病菌链格孢自果实膨大期定殖, 随着果实发育潜伏于果皮组织, 只有很少一部分进入果肉组织[6]。李永才等[13,14,15]发现粘附于皮孔的孢子首先萌发产生菌丝, 随后菌丝进一步发展, 使皮孔表层细胞解体, 同时侵入点表皮及内侧3~4层细胞迅速栓化。
(2) 主要症状
由于每一个病原菌能产生独特的寄主专化性毒素, 因而不同的病原菌有不同的寄主范围[17], 梨黑斑病主要为害果实、叶片和新梢。
叶片病症。幼嫩的叶片一般最早发病, 开始先出现针头大、圆形黑色斑点, 后斑点逐渐扩大或呈近圆形、不规则形, 中心灰白色, 边缘黑褐色, 叶片如有多个病斑常愈合成不规则形状大斑, 潮湿时, 病斑表面产生黑斑, 叶片畸形, 严重时引起早期落叶[6]。
果实病症。幼果受害, 先在果面上产生一个至数个黑色圆形针头状斑点, 随后逐渐扩大, 呈圆形或椭圆形, 病部略凹陷, 其上有黑霉, 由于病健部发育不均匀, 果面常发生龟裂, 有时裂口纵横交错或呈“丁”字形, 在裂隙内会产生很多黑霉, 病果早期掉落。成熟果受害, 早期症状与幼果相似, 但病斑较大, 黑褐色在重病果上常数个病斑合并成大病斑, 甚至使全果变成为漆黑色表面密生墨绿色至黑色的霉, 随后果实软化、腐烂脱落[6]。
新梢病症。病斑早期黑色、椭圆形, 稍凹陷, 后扩大为长椭圆形, 凹陷更明显, 淡褐色, 病部与健部分界处常产生裂缝[5]。
2. 发生规律
病菌在病叶、病梢及病果上越冬, 翌年春天病部产生分生孢子, 借风雨传播, 由表皮气孔或伤口侵染。病斑可以产生分生孢子, 进行多次重复再侵染, 整个生长季节都可以发病[20]。一般在4月中旬平均气温达13~15℃.叶片初展时, 开始出现病斑, 5月份随气温增高, 病斑逐渐增加。适宜发病气温为24~28℃。如遇连续阴雨, 有利于病害发生蔓延, 6月至7月初如遇多雨高温, 病斑急剧增加, 进入发病盛期。果实于4月下旬开始出现针头大圆形黑色斑点, 5月上旬出现少量黑色的病斑, 有光泽, 微下陷, 5月下旬病斑增大, 6月上旬果实龟裂, 6月下旬病果开始脱落, 7月上中旬, 病果脱落最多, 特别是新世纪梨发病较严重, 易造成早熟梨劣质、减产[5], 发病严重时会引起大量裂果和早期落叶落果, 导致减产, 并引起病害流行, 最终导致树体衰弱, 缩短结果年限[12、18、19]。
二、梨黑斑病病原菌的生物学特性
1. 梨黑斑病病原菌的分离及鉴定
苹果梨黑斑病病原分离结果表明, 其病原种群包括链格孢属、黑曲霉Aspergillus niger V.Tiegh、粉红单端孢Trichothecium rosenum Bull. (Link) 、镰刀菌Fusarium sp.等多种真菌[6]。其中优势潜伏侵染菌为链格孢。链格孢作为优势潜伏侵染菌已在海南番木瓜[28]、芒果[29]、深州蜜桃[30]、哈密瓜[31]等水果及瓜上有研究[6]。该菌分生孢子梗曲膝状, 有多个孢痕, 绿褐色至褐色, 丛生;产孢方式为孔生产孢, 形成长链并分支;孢子倒棍棒形至椭圆形, 褐色至黑色, 大小:10~48μm×5~13μm, 大都具有喙, 长4~12米, 具纵横隔膜, 横隔1~5个, 纵隔0~3个[6、7]。由于链格孢属Alternaria形态易受生长环境的影响而发生变化, 给分类鉴定工作造成困难。李多川等[9]对链格孢属的数值分类研究有助于改进分类鉴定手段, 在今后梨黑斑病菌鉴定中可以试用, 真菌的鉴定参照植物病原真菌和真菌分类手则进行鉴定[16]。
2. 温度对病原菌菌丝生长及孢子萌发的影响
高温、低温均不利于梨黑斑病病原菌菌丝生长, 但在15℃和35℃的条件下病原菌仍有生活力;菌丝在15~30℃范围内均生长良好, 最适温度为28℃;低温和高温均不适合孢子萌发, 5℃、10℃时孢子不萌发, 在15~35℃时孢子均能萌发, 8℃时孢子有较高的萌发率。但也曾有报道该病原菌菌丝生长最低温度为10~12℃[8]。
3. 湿度对病原菌菌丝生长及孢子萌发的影响
当相对湿度在50%~100%范围内相对湿度的变化对病原菌菌丝生长的影响不大, 但相对湿度低于50%时, 菌丝生长将受到明显抑制。分生孢子萌发对相对湿度的要求非常严格, 在相对湿度达到98%时, 分生孢子的萌发率仅为60%, 相对湿度为100%时分生孢子萌发率为68.9%。在有水膜的条件下分生孢子萌发率为78%, 在自由水下的情况下, 分生孢子萌发率为84%[7]。也曾有报道[8], 相对湿度在50%~100%范围内, 湿度对病原菌菌丝生长的影响不大, 差异显著性分析在水平0.05上没有显著差异。但湿度在50%以下病原菌生长不良。病原菌孢子萌发对湿度有很高的要求只有湿度超过98%时, 孢子才能萌发, 尤其在水滴中, 萌发率高[7]。
4. p H值对病原菌菌丝生长及孢子萌发的影响
病原菌菌丝生长对p H值不敏感, 在p H4~12的范围均可生长。试验中发现, 在酸性PSA培养基 (p H4、5、6) 上, 菌丝生长较快较稳定, 平均生长速率为8.5毫米/天;在碱性PSA培养基上 (p H8、9、10、11、12) 培养, 培养前菌丝生长较慢, 平均生长速率为7.1毫米/天;第4天, 菌丝生长速率提高, 平均5-8天生长速率达到了8.8毫米/天[7]。
病原菌孢子萌发对p H值的适应范围较宽, p H4~12时均可萌发, 最适p H值为7~8[7]。
5. 不同碳源对病原菌菌丝生长及孢子萌发的影响
在不同碳源对病原菌菌丝生长的试验中, 不加碳源作为对照。结果表明:蔗糖作为碳源最有利于病原菌菌丝生长, 其次为麦芽糖;D-甘露糖、甘油和葡萄糖会抑制菌丝生长, 抑制率分别为5.9%、9.1%和27%, 该结果表明不同营养条件对梨黑斑病病原菌菌丝体生长有显著影响[6]。
三、致病性
1. 室内致病性的测定
目前, 室内致病性的测定方法有涂抹法, 菌丝块接种法、不同保湿法、不同温度法[21]。
(1) 涂抹法接种对致病性的影响
采用涂抹法接种的离体叶片显症始期为接种后6天, 接种6天后有明显的小黑斑出现在叶面上。此后病斑迅速扩大, 病斑边缘伴有白色绒毛状菌丝, 发病率逐渐增高;用菌丝块接种的叶面, 接种后20天叶面仍未出现病斑, 菌落也未生长。比较叶面和叶背接种效果, 涂抹法接种, 叶面接种发病率高于叶背接种;叶背接种显症始期为接种后10天, 叶面接种显症始期为接种后6天;叶背接种后, 病斑扩展慢, 发病率低菌碟法接种后无论是叶面还是叶背接种均未发病[21]。
(2) 不同保湿方法对接种的离体叶发病的影响
用2%水琼脂保湿效果优于滤纸保湿。滤纸保湿几乎不发病, 接种后7天叶片枯黄, 接种后15天叶片枯死;而2%水琼脂保湿, 发病症状明显, 接种后6天出现明显病斑, 且病斑迅速扩大, 接种后10天时部分叶片微黄, 接种后20天内叶子仍有绿色, 少数叶片病斑周围嫩黄, 有的叶片中脉嫩黄, 采用2%水琼脂具有较好的保湿效果[21]。
(3) 温度对接种的离体叶发病的影响
高温、低温时病情指数均较低, 均不利于发病, 适宜发病的温度范围为25~30℃, 最适发病温度为28℃[21]。
2. 室外致病性的测定
梨斑病病原菌的致病性研究现正处于初始阶段[21]。在江苏省农业科学院园艺研究所梨园曾经采用过涂抹法和喷雾法接种, 接种后侵染效果同室内不同温度法结果相同。李永才等[2、22、23、24]比较系统地研究了苹果梨黑斑病病菌的潜伏侵染及其侵染过程, 但未见对梨黑斑病病菌叶片离体接种和田间人工接种致病性测定的报道。
四、预防与防治途径
1. 彻底清园, 减少越冬菌源
由于病害初侵染来自组织和病残体, 在梨树萌芽前彻底清扫果园, 剪除有病枝梢, 并将落叶、落果病枝集中烧毁或深埋, 以消灭越冬菌源[20]。
2. 强栽培管理, 壮树健果
推广深翻改土, 树盘内覆草和行间种植绿肥或生草的土壤管理模式。施肥以有机肥为主化肥为辅, 提倡配方施肥控制化肥使用量, 促进根系和树体健壮, 增加树平衡施肥抗病力, 同时做好病虫预防为全年的防治打好基础。在萌发前喷波美可喷5度石硫合剂, 杀死越冬病菌, 减少病菌越冬基数。发芽后至开花期加强各种病虫害的控制, 可喷80%大生M45与10%百树得混合液、辛硫磷等, 对历年黑斑病发生严, 7~10天后再喷1次1∶2∶200倍波尔多液以控制危害果园[20], 冬季修剪时应适当疏枝增强树冠内通风透光条件, 地势洼果园做好开沟排水[5]。
3. 果实套袋
果实套袋能阻止黑斑病菌对果实的侵害可以明显减轻病情, 但生产中由于套袋时间偏迟或果袋质量太差往往达不到套袋的目的。因此要严格按套袋规程进行套袋。应在花后1个月左右5月上中旬, 在疏果的基础上进行, 套袋前喷1次杀菌剂药剂用1.5%多抗霉素WP300~500倍液或代森锰锌等。梨果套袋技术也是生产绿色果品的有效途径[5、20]。
4. 药剂防治
发芽前喷0.3%~0.5%五氯酚钠加5度石硫合剂混合液做铲除剂, 杀死枝干上的越冬菌原;花后可喷10%的多氯霉素可湿性粉剂0.1%~1.5%的溶液;生长期可结合防治梨黑星病、梨轮纹病用1∶3∶200倍波尔多液或50%退菌特0.16%~0.125%的溶液、50%代森铵0.1%、65%代森锌可湿性粉剂0.2%、80%敌菌丹0.1%、50%敌菌清0.16%、80%大生M-450、125%、50%苯菌灵可湿性粉剂0.1%~0.12%等溶液等交替轮换使用。另外在药液中加入粘着剂 (0.2%大豆浆、0.1%皮胶、0.1%的6501) 可增加粘着性, 提高药效[5、20]。
目前苹果梨采后病害的防治仍以杀菌剂为主。然而, 由于长期使用单一杀菌剂会诱导病, 原物产生抗药性而使得杀菌效果降低[25、26]。同时, 生产上频繁和高浓度的使用化学药剂造成农药在果蔬上的残留量增加而直接威胁着人们的健康。
五、存在问题与展望
目前, 梨黑斑病病菌对梨树的致病性的相关生物学因子研究相对较为缓慢, 而且梨黑斑病病原菌种类较多, 有的也生有小孢子链格孢种, 且分生孢子形态多少与链格孢有些相似, 这些小孢子链格孢种中有的也引起梨黑斑病的发生[13], 这些病原菌的特点为病害的流行增加了可能, 也为该病害的防治形成了客观上的复杂性。梨黑斑病的发生发展与环境条件具有较大关系, 更在一定程度上增加了研究的困难。梨黑斑病病原菌为半知菌亚门丝孢纲丝孢目链格孢属真菌Simmons[11]曾用试验证明产生寄主专化性毒素的能力可以作为此病原菌种级分类标准。分离和鉴定梨黑斑病病菌, 对明确梨黑斑病病菌的危害特点具有重要意义。随着科技的飞速发展和仪器设备的不断先进, 对梨黑斑病的研究将会更为深入和具体, 这将为梨产业的发展带来新的曙光。
摘要：梨黑斑病是梨的三大病害之一, 是一种世界性侵染病害。文章综述了前人对梨黑斑病病原菌生物学特性的研究, 从梨黑斑病的侵染与发生规律、梨黑斑病病原菌的生物学特性及室内、田间的致病性进行了阐述。进行梨黑斑病的生物学特性和致病性研究, 能有效的把握梨黑斑病的发生规律, 掌握防治技术, 对梨业的发展有重大意义。
致病特性 篇4
关键词：禽Ⅰ型副粘病毒,毒株分离,血清学特性,山东半岛
近年来, 由于新城疫疫苗的使用混乱, 病毒毒力变异等, 出现了非典型新城疫[1,2,3,4], 并且范围逐渐扩大, 成为困扰养禽业的一大难题。同时, 禽类饲养密度越来越大, 野毒株的污染、疫苗的选择造成的免疫压力使禽Ⅰ型副粘病毒的遗传物质—核酸发生变异, 从而导致其毒力的变异。为了阐明山东半岛地区地方流行的禽Ⅰ型副粘病毒毒株的毒力变异情况, 笔者从山东省各地方采集10株野毒株, 对其中的4株进行分离和繁殖, 从血清学方面进行初步鉴定, 并进行PMV-Ⅰ试验感染鸡、鸽的比较。
1 材料与方法
1.1 试验材料
病毒株为NDV山东地方株:NDV-ZY、NDV-RZ、PPMV-Ⅰ和NDV-LZ等毒株。NDVF48E8 (强毒) 、NDV-La Sota株购自中国兽药监察所。血清:NDV阳性血清, AIV H5阳性血清;购自中国兽药监察所。试验动物:9日龄SPF鸡胚, 购自日照市畜牧局种鸡厂。试验鸡、鸽饲养于严格消毒和管理的环境中。
1.2 试验方法
1.2.1 病毒的繁殖。
采集各地方疑为患ND强毒株死亡病鸡的肝脏及脑, 置于玻璃匀浆器中, 加少许PBS, 研磨至浆状, 8 000g离心10min, 抽取中间清亮液体, 于0.22μm无菌滤器中过滤除菌, 尿囊腔接种9日龄鸡胚, 0.2mL/只。观察2次/d, 无菌收获24h以后死亡的鸡胚尿囊液, 于EP管中进行分装, 于-20℃保存备用。
1.2.2 病毒的血清学特性研究。
微量血球凝集 (HA) 试验参照Lang[5,6]等的报道, 将收获的各毒株鸡胚尿囊液与0.5%鸡红细胞混合于96孔U形板中做HA试验[7]。微量血球凝集抑制 (HI) 试验参照Lang[5,6]等的报道, 将收获的各毒株鸡胚尿囊液与NDV阳性血清、AIV H5亚型阳性血清在室温分别作用30min, 再与0.5%鸡红细胞混合于96孔U形板中做HI试验。
1.2.3 PMV-Ⅰ试验感染鸡、鸽的观察比较。
将收获的NDV-ZY株, 接种于隔离饲养的35日龄鸡, 并同时接种于隔离饲养的45日龄鸽子, PMV-Ⅰ (鸽瘟病毒) 接种于隔离饲养的45日龄鸽子, 同时设空白对照组[8,9]。攻毒后, 测量其体温 (肛温, 每天早、午、晚测体温的变化) 。详细记录发病症状、发病数、死亡数及剖检病变。
2 结果与分析
2.1 病毒的收获及胚体病变
各毒株接种30～40h后, 鸡胚全部死亡, 整个胚体全身出血, 以致胚体全身呈现红色。解剖胚体可见肝脏严重出血而呈紫色, 脑部出血。
2.2 病毒的血清学特性研究
2.2.1 HA试验结果。由表1可知, 各毒株HA效价较高, 临床致病力较强。
2.2.2 HI试验结果。
各地方强毒株均能被NDV阳性血清特异性抑制, 却不能被AIV H5阳性血清特异性抑制, 同时结合临床和剖检病变, 初步判定这些分离毒株是由于NDV而非AIV所引起。
2.2.3 PMV-Ⅰ试验感染鸡、鸽的结果。
测定体温结果表明, 感染鸡新城疫的鸡、鸽的体温都升高, 鸡感染ND, 体温最高达42.5℃;鸽感染ND, 体温最高达42.3℃。
强毒株感染鸡的主要症状为病初沉郁, 厌食, 闭目, 张口伸颈, 喘气咳嗽, 嗉囊积液, 排绿色稀粪。随后出现歪头、扭颈、腿与翅膀麻痹、站立不稳等神经症状, 最后衰竭而死, 最早死亡时间为攻毒后第3天;共发病死亡5只, 死亡比例100%。主要病变为腺胃黏膜出血, 尤以腺胃乳头点状出血为主, 肌胃角质下层出血, 小肠出血, 盲肠扁桃体肿大、出血、溃疡, 泄殖腔出血溃疡, 多处肠道淋巴集合组织形成钮扣状坏死, 有的气管内黏液增多, 喉头气管黏膜出血, 气囊增厚混浊并有干酪样渗出物。
强毒株感染鸽的主要症状为病初减食, 沉郁, 垂头缩颈, 闭目呆立, 羽毛蓬乱, 嗉囊充满液体, 神经症状不明显, 攻毒后第4天开始死亡;共发病死亡5只, 死亡率为100%。主要病变为眼结膜充血, 眼角膜混浊。额骨、鼻窦骨出血, 口腔内黏液增多, 气管环状出血, 管内有纤维性渗出物, 心冠脂肪、心内外膜、肝脏、肺脏出血, 胰脏有广泛性充血, 充血区有针尖状出血点, 直肠黏膜严重出血, 泄殖腔严重出血。
鸽瘟病毒感染鸽主要症状初为腹泻, 排绿色与白色相间的稀粪, 之后表现明显的神经症状, 如两脚麻痹、扭颈、垂翼等, 单侧或双侧眼结膜炎, 眼睑肿胀, 最后衰竭死亡, 攻毒后第6天开始发病, 至第7天全部死亡, 死亡率100%。主要病变为胸、颈皮下和肌间组织常潴留淡黄色胶冻样物质, 有的局部肌肉呈紫蓝色。颈部皮肤广泛不同程度出血。肝、肺脏出血, 胰脏广泛性充血, 充血区有针尖状出血点。腺胃乳头及乳头间有广泛性出血, 肌胃角质层下有小量粟粒大出血斑。十二指肠弥漫性出血, 腹腔有大量黄色纤维素性渗出物, 直肠、泄殖腔严重出血, 法氏囊水肿呈黄色。
空白对照组未出现任何异常变化。
3 结论与讨论
3.1 病毒的分离与繁殖
试验成功的从山东半岛地区分离了4株NDV地方强毒株, 进行了鸡、鸽试验感染发病情况的观察比较, 其发病率达100%, 死亡率也相当高, HA效价较高, 临床致病力较强, 表明NDV可能由于免疫压力的原因已发生了较大的变异, 表明是野强毒株。近年来, ND发生增多, 特别是非典型ND以神经症状出现有多方面:一是外界环境中NDV强毒数量大幅度上升并持续存在;二是不科学的免疫接种程序及方法;三是无限度的加大疫苗免疫剂量。因为ND抗体不易通过血脑屏障, ND强毒却可畅通无阻的进入脑组织, 并在神经中枢大量增殖, 从而损坏神经产生神经症状, 最终导致死亡, 而ND抗体可到达内脏器官, 因而内脏器官得到保护而不产生可见病变。本研究对山东地区新近分离到的对禽有致病性的禽副粘病毒进行了鉴定, 结果表明, 该病毒能凝集鸡红细胞, 血凝反应能被禽Ⅰ型副粘病毒阳性血清所抑制, 由此初步判定该病毒属于Ⅰ型副粘病毒。
3.2 NDV-LD、PMV-Ⅰ株试验感染鸡、鸽的观察结果比较
小鸡感染NDV-ZY毒株后, 表现速发嗜内脏型ND的所有特征, 值得注意的是试验鸡只同时表现有速发嗜肺脑型ND的症状与病理变化, 包括中枢神经紊乱、喉头气管出血、气管壁增厚。说明传统临床分型的速发嗜内脏型与速发嗜肺脑型, 既与毒株的特性有关, 亦与易感鸡体制等因素有关。
参考文献
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致病特性 篇5
本实验分别以HP-PRRSV强毒HuN-F5株及其传代致弱的疫苗病毒株HuN4-F112为亲本病毒, 利用反向遗传操作技术分别将ORF1a、ORF1b或ORF2-7编码序列在强弱毒之间互换。将6种含有不同嵌合基因的全长病毒基因组的重组质粒体外转录后转染BHK-21细胞, 然后在Marc-145细胞中传代, 拯救的重组病毒经RT-PCR、测序和免疫荧光鉴定, 并分别命名为rHuN4-F5-ORF1a、rHuN4-F5-ORF1b、rHuN4-F5-ORF2-7 (以强毒为骨架) 和rHuN4-F112-ORF1a、rHuN4-F112-ORF1b、rHuN4-F112-ORF2-7 (以弱毒为骨架) 。进一步测定这些病毒在Marc-145上的生长曲线, 结果显示:以强毒为骨架的嵌合病毒rHuN4-F5-ORF1a生长滴度显著高于亲本强毒rHuN4-F5, 而以弱毒为骨架的嵌合病毒rHuN4-F112-ORF1a在细胞上的生长滴度低于其亲本弱毒r HuN4-F112, 其他片段替换对病毒在细胞上的生长没有明显影响。本实验结果提示ORF1a对于PRRSV在体外细胞培养上的生长调节起重要作用。
《中国预防兽医学报》, 2012 (01) :7-11